Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

الأكسجين الناجم عن نموذج اعتلال الشبكية لأمراض الشبكية الإقفاري في القوارض

Published: September 16, 2020 doi: 10.3791/61482
Automatic Translation
1,2, 2, 2, 2, 1, 2, 1,3
1Faculty of Medicine and Health Technology, Tampere University & Tampere University Hospital, 2Experimentica Ltd, 3Eye Centre, Tampere University Hospital

Summary

يمكن استخدام اعتلال الشبكية الناجم عن الأكسجين (OIR) في نموذج أمراض الشبكية الإقفارية مثل اعتلال الشبكية من الخداج واعتلال الشبكية السكري التكاثري ولخدمة كنموذج لدراسات إثبات المفهوم في تقييم الأدوية المضادة للأدوية المضادة للأمراض الوعائية. OIR يحفز neovascularization قوية وقابلة للتكرار في شبكية العين التي يمكن تحديدها كميا.

Abstract

أحد النماذج شائعة الاستخدام لـ اعتلال الشبكية الإقفائي هو نموذج اعتلال الشبكية الناجم عن الأكسجين (OIR). هنا نحن وصف البروتوكولات التفصيلية ل OIR نموذج التعريفي وقراءاته في كل من الفئران والجرذان. يتم حث الشبكية neovascularization في OIR عن طريق تعريض الجراء القوارض إما إلى فرط التأكسج (الفئران) أو مستويات بالتناوب من فرط التأكسج ونقص الأكسجة (الفئران). قراءات الأولية لهذه النماذج هي حجم المناطق النيفا (NV) و avascular (AVA) في شبكية العين. يمكن استخدام هذا النموذج قبل التكين في الجسم الحي لتقييم فعالية العقاقير المضادة للأوعية أو لمعالجة دور جينات محددة في تكوين الأوعية الدموية في الشبكية باستخدام الحيوانات المعالجة وراثيا. النموذج لديه بعض سلالة والمورد الاختلاف محددة في التعريفي OIR التي ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار عند تصميم التجارب.

Introduction

هناك حاجة إلى نماذج تجريبية موثوقة وقابلة للتكرار لدراسة الأمراض الكامنة وراء أمراض العين الوعائية وتطوير علاجات جديدة لهذه الأمراض المدمرة. الأوعية الدموية المرضية هي السمة المميزة للضمور البقعي الرطب المرتبط بالعمر (AMD) وبالنسبة للعديد من أمراض الشبكية الإقفارية بينهم اعتلال الشبكية من الخداج (ROP) ، واعتلال الشبكية السكري التكاثري (PDR) وانسداد الوريد الشبكي (RVO)1،2،3،4. يتبع شبكية العين البشريّة والقوارض نمطاً مماثلاً من التطور، حيث أنّ شبكية العين البشريّة والقوارض من بين آخر الأنسجة التي يتمّ أوعية الأوعية الدموية. قبل أن تتطور الأوعية الدموية الشبكية تماما، يتلقى الشبكية إمداداتها الغذائية من الأوعية الدموية الهيالويد، والتي، بدورها، تتراجع عندما يبدأ الأوعية الشبكية لتطوير1،2. في الإنسان ، يتم الانتهاء من تطوير الأوعية الدموية في الشبكية قبل الولادة ، في حين أن نمو الأوعية الدموية في الشبكية يحدث بعد الولادة في القوارض. منذ تطور الأوعية الدموية الشبكية يحدث بعد الولادة في القوارض، فإنه يوفر نظام نموذج مثالي لدراسة الأوعية الدموية2،3. القوارض حديثي الولادة لديها شبكية العين افاسومية التي تتطور تدريجيا حتى اكتمال تطور شبكية العين الأوعية الدموية يتحقق بحلول نهاية الأسبوع الثالث بعد الولادة4. الأوعية الدموية المتنامية من الماوس الوليدي هي البلاستيك، وأنها تخضع الانحدار خلال hyperoxia التحفيز5.

ROP هو السبب الرئيسي للعمى الطفولة في البلدان الغربية، كما أنه يؤثر على ما يقرب من 70٪ من الأطفال الخدج مع وزن الولادة تحت 1250 ز6،7. يحدث ROP في الرضع الخدج الذين يولدون قبل أن تكمل الأوعية الشبكية نموها الطبيعي. تقدم ROP في مرحلتين: في المرحلة الأولى، تأخر الولادة المبتسرة نمو الأوعية الدموية الشبكية حيث بعد في المرحلة الثانية، فإن الأوعية الدموية غير المكتملة للشبكية النامية تسبب نقص الأكسجة، مما يحفز على التعبير عن عوامل النمو الوعائية التي تحفز نمو الأوعية الدموية الجديدة وغير الطبيعية8. وقد نموذج OIR نموذجا يستخدم على نطاق واسع لدراسة الفيزيولوجيا المرضية من ROP وغيرها من اعتلالات النترية الإقفارية وكذلك لاختبار المرشحين المخدرات رواية2,3,9. ويعتبر على نطاق واسع كنموذج استنساخه لإجراء دراسات إثبات من المفهوم للأدوية المضادة للأمراض المضادة للأمراض الوعائية المحتملة وكذلك غير العين. يختلف نموذجان القوارض أي الفأر والجرذان OIR في نموذجها التعريفي ونمط ظاهري للمرض. نموذج الفئران يحاكي النمط الظاهري ROP أكثر دقة، ولكن نموذج الماوس يوفر نموذج أكثر قوة وسريعة وقابلة للتكرار لneovascularization الشبكية (NV). في نموذج الماوس، يتطور NV إلى شبكية العين المركزية. هذا القراءة المرضية مهم في دراسات فعالية الأدوية للعديد من اعتلالات الشبكية الإقفارية ، مثل PDR و RV و AMD الناضح وكذلك للأمراض غير العينية ، الأوعية الدموية مثل السرطان. وعلاوة على ذلك، فإن توافر الفئران المتلاعب بها وراثيا (المعدلة وراثيا و القاضية) يجعل نموذج OIR الماوس خيارا أكثر شعبية. ومع ذلك، لا الماوس ولا نموذج OIR الفئران يخلق تليف الشبكية، وهو أمر نموذجي في الأمراض البشرية.

أدى الفهم بأن مستويات الأكسجين العالية تساهم في تطوير ROP في10 10،11 إلى تطوير نماذج حيوانية. وقد أجريت الدراسات الأولى حول تأثير الأكسجين على الأوعية الدموية الشبكية في 195012,13,14 وحتى 1990s كانت هناك العديد من التحسينات على نموذج OIR. البحث الذي أجراه سميث وآخرون في عام 1994 وضع معيارا لنموذج OIR الماوس الحالي الذي يفصل بين اعتلال الرحم من اعتلال الشبكية15. اعتماد واسع النطاق لطريقة لتحديد حجم vaso-طمس و NV المرضية من قبل كونور وآخرون (2009) زادت منشعبيتها 16. في هذا النموذج، يتم وضع الفئران في 75٪ الأكسجين (O2)لمدة 5 أيام في P7، تليها 5 أيام في ظروف نورموكسيك. يسبب فرط التأكسج من P7 إلى P12 انتفاخ الأوعية الشبكية إلى التراجع في شبكية العين المركزية. عند العودة إلى الظروف نورموكسيك, الشبكية avascular يصبح نقص الأكسجة (الشكل 1A). بسبب المحفزات نقص الأكسجة من الشبكية المركزية أفاسيتشال, بعض الأوعية الدموية الشبكية تنبت نحو الزجاجة, تشكيل ما قبل البروتينال NV, دعا قبل الخزامينات2,3. هذه الخصلات غير ناضجة، وفرط في الفرط. كمية من قمم NV في P17، وبعد ذلك يتراجع. الشبكية هي إعادة الأوعية الانعاشية بالكامل و NV هو تراجع تماما من قبل P23 - P25 (الشكل 2A)2،3.

وقد وصفت أول نموذج O 2 O (باستخدام مستويات متفاوتة من O2) في 1990s تبين أن مستويات O2 متفاوتة في 80٪ و 40٪ تسبب NV أكثر وضوحا من أقل من 80٪ O2 التعرض المستمر17. في وقت لاحق اكتشف أن نموذج نقص الأكسجة المتقطعة، حيث يتم تدوير O2 من فرط التأكسج (50٪) إلى نقص الأكسجة (10-12٪), أسباب أكثر من NV 80/40٪ O2 نموذج18. في نموذج 50/10٪ ، تتعرض الجراء الفئران إلى 50 ٪ لمدة 24 ساعة ، تليها 24 ساعة في 10 ٪ O2. واستمرت هذه الدورات حتى P14، عندما يتم إرجاع الجراء الفئران إلى الظروف normoxic(الشكل 1B). كما هو الحال في المرضى ROP الإنسان، في نموذج الفئران المناطق avascular تطوير إلى أطراف الشبكية بسبب شبكية العين غير ناضجة plexus الأوعية الدموية (الشكل 3).

في كلا النموذجين، المعلمات الرئيسية التي عادة ما يتم قياسها كميا هي حجم AVA و NV. ويتم تحليل هذه المعلمات عادة من يتصاعد الشبكية شقة حيث تسمى الخلايا البطانية4،16. في السابق تم تقييم كمية ما قبل الطمث NV من أقسام عرضية شبكية العين عن طريق عد الأوعية الدموية أو نواة الخلايا الوعائية الممتدة إلى الزجاجي فوق الغشاء الداخلي المحدد. والقيود الرئيسية التي تحد من هذا النهج هي أنه لا يمكن تحديد كميّة الـ AVAs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد تمت الموافقة على البروتوكول المذكور هنا من قبل اللجنة الوطنية لأخلاقيات الحيوان في فنلندا (البروتوكول رقم ESAVI/9520/2020 و ESAVI/6421/04.10.07/2017).

1. الحيوانات التجريبية والفأر OIR نموذج التعريفي

ملاحظة: استخدم الحيوانات التي تتزاوج وقتًا، مثل فئران C57BL/6J شائعة الاستخدام، للحصول على الجراء التي تولد في نفس اليوم. استخدام السدود الحاضنة، مثل 129 سلالة (129S1/SvImJ أو 129S3/SvIM) السدود المرضعة، لإرضاع الجراء أثناء وبعد تحريض فرط التأكسج. بدلا من ذلك، تأكد من وجود سدود المرضعات إضافية متوفرة في حالة السدود التمريض تحتاج إلى استبدال بسبب الإرهاق. تقييد حجم القمامة إلى 6-7 الجراء لكل سد عند استخدام C57BL/6J الفئران / السدود (إذا كانت القمامة أكبر من أن الجراء تميل إلى أن يكون الحد من زيادة الوزن)16.

  1. تسجيل وزن الحيوانات قبل وبعد التعريفي hyperoxia، وفي وقت التضحية.
  2. تأكد من وجود ما يكفي من الطعام في الجزء السفلي من القفص، وبالتالي فإن السدود لديها سهولة الوصول إلى الغذاء.
  3. إضافة الجير الصودا مع مؤشر اللون إلى الجزء السفلي من الغرفة لامتصاص CO2 الزائدة عندما لا يتم استخدام نظام الترشيح.
  4. مراقبة الرطوبة ودرجة الحرارة داخل الغرفة والحفاظ على الرطوبة بين 40 إلى 65٪. زيادة الرطوبة في الغرفة، إذا لزم الأمر، عن طريق وضع أطباق مع الماء في الجزء السفلي من الغرفة (على سبيل المثال، أطباق بيتري).
  5. معايرة استشعار O2 مع 100٪ O2 والهواء غرفة عادية.
  6. ضع فئران P7 في غرفة واقامة مستوى O2 إلى 75٪. إبقاء الفئران في الغرفة لمدة 5 أيام، حتى P12. تجنب فتح الغرفة أثناء تحريض فرط التأكسج. تحقق من ضغط الغاز من اسطوانة O2 واستبدال الاسطوانة عند الحاجة. مراقبة الحيوانات أثناء الاستقراء.
  7. خذ أقفاص الماوس من الغرفة وتزن كل الجراء. مجموعة الجراء على أساس الوزن بحيث كل مجموعة تجريبية لديها توزيع الوزن مماثلة في الجراء.

2. الحيوانات التجريبية والجرذان OIR نموذج التعريفي (باستخدام نظام شبه مغلق)

ملاحظة: استخدام الحيوانات تزاوج الوقت للحصول على الجراء ولدت في نفس اليوم. بالنسبة لـ OIR الفئران، استخدم حجمًا متزايدًا للقمامة، حوالي 18 جراء/سد، للحصول على إدخال NV كافٍ في نموذج الفئران. الجراء بركة من عدة القمامة للحصول على ما يكفي من الجراء لكل القمامة.

  1. تسجيل وزن الحيوانات قبل وبعد التعريفي، وفي وقت التضحية.
  2. تأكد من وجود ما يكفي من الطعام في الجزء السفلي من القفص، وبالتالي فإن السدود لديها سهولة الوصول إلى الغذاء.
  3. إضافة الجير الصودا مع مؤشر اللون إلى الجزء السفلي من الغرفة لامتصاص CO2 الزائدة عندما لا يتم استخدام نظام الترشيح.
  4. مراقبة الرطوبة ودرجة الحرارة داخل الغرفة. امتصاص الرطوبة الزائدة (ولدت من عدد من الفئران) عن طريق إضافة هلام السيليكا على الجزء السفلي من الغرفة.
  5. معايرة استشعار O2 مع 100٪ N2 والهواء غرفة عادية.
  6. وضع الفئران في الغرفة في P0 (بضع ساعات بعد الولادة). تعيين مستوى O2 إلى 50٪ وربط O2 اسطوانة إلى الغرفة لمدة 24 ساعة. بعد ذلك، قم بتبديل الإعدادات إلى 10٪ O2 وتوصيل النيتروجين (N2)اسطوانة إلى الغرفة لمدة 24 ساعة. مواصلة ركوب الدراجات 24 ح بين 50٪ و 10٪ O2 المستويات لمدة 14 يوما.
  7. مراقبة استهلاك الغاز ورفاهية الحيوانات خلال الدراسة. افتح الغرفة أثناء التغيير بين 50/10٪ O2 وأضف المزيد من الطعام والماء إذا لزم الأمر. تغيير أقفاص الحيوانات لتنظيف منها أثناء الاستقراء.
  8. أخرجي أقفاص الفئران من الغرفة ووزّن كل الجراء مجموعة الجراء على أساس الوزن بحيث كل مجموعة تجريبية لديها توزيع وزن مماثل في الجراء.

3. إدارة المخدرات (اختياري)

ملاحظة: عادة ما تستخدم طريقة إدارة المخدرات في OIR عن طريق العلاج داخل في الواقع (ivt)، في P12-P14 للفئران وP14 للفئران. تحديد يوم العلاج على أساس الإعداد التجريبي. عندما يتم استخدام العديد من القمامة من الجراء في التجارب، وتقسيم مجموعات العلاج للحصول على الحيوانات من جميع القمامة. ويفضل، حقن المخدرات إلى عين واحدة فقط، والحفاظ على العين contralateral كتحكم.

  1. وزن الحيوانات وجعل علامات تحديد الهوية إلى الذيل و / أو الأذن.
  2. تخدير الحيوان إما بالتخدير عن طريق الحقن (على سبيل المثال خليط الكيتامين وdedetomidine، 30 ملغم/كغ و0.4 ملغم/كغ للفئران) أو مع التخدير الاستنشاقي (ايزوفلوران في 2-3.5٪ isoflurane و 200-350 مل/ دقيقة تدفق الهواء). تحقق من عمق التخدير عن طريق قرص أصابع. إبقاء الحيوان على وسادة التدفئة أثناء العلاج.
  3. للتخدير الموضعي، ضع قطرة مسكن على الجفن. فتح الجفن بعناية مع ملقط قبل أداء ivt، كما الفئران والجرذان فتح عيونهم حول P14. تطبيق قطرة مسكن (مثل هيدروكلوريد أوكسيبوبروكاين) على القرنية.
  4. تطبيق قطرة من اليود قبل إجراء حقنة ivt.
  5. لحقن ivt استخدام حقنة زجاجية مع إبرة 33-34 G المرفقة. اضغط على الجفون لأسفل وgrap مقلة العين مع ملقط. جعل الحقن الخلفي إلى limbus، تقريبا في 45درجة إبرة زاوية مشيرا نحو العصب البصري.
  6. تجنب حقن أكثر من 1.0 ميكرولتر في الفضاء داخل داخلي. الحفاظ على الإبرة في مكان لمدة 30 s بعد حقن المخدرات لتجنب ارتجاع المحلول عن طريق الحقن.
  7. فحص العين (على سبيل المثال، مع منظار العيون) لأي مضاعفات، مثل النزيف أو تلف الشبكية، بعد إزالة الإبرة. تطبيق مرهم المضادات الحيوية على رأس القرنية بعد الحقن.
    ملاحظة: يجب أن يكون حجم حقن ivt للفئران 0.5 – 1.0 ميكرولتر.
  8. عكس التخدير (على سبيل المثال مع خصم α2 لdedetomidine (2.5 ملغ / كغ) والعودة الجرو إلى القفص. بيت القمامة عادة حتى نهاية الدراسة.

4. في التصوير في الجسم الحي والتصوير الكهربائي (اختياري)

  1. إذا رغبت في ذلك، السلوك في التصوير الجسم الحي على الحيوانات الحية خلال فترة المتابعة لتسجيل التغيرات التي تتطور في شبكية العين خلال الاستجابات angiogenic. على سبيل المثال، قم بإجراء تصوير الأوعية الفلورية (FA) أو المسح الضوئي مجهر19 بالليزر لتصور الأوعية الدموية(الشكل 4). استخدام التصوير المقطعي التناسق البصري المجال الطيفي (SD-OCT) لتصور طبقات الشبكية في الجسم الحي(الشكل 4).
  2. إذا رغبت، التحقيق في التغيرات الوظيفية في مختلف مجموعات خلايا شبكية العين بعد الحث OIR باستخدام الكهربائي (ERG) (الشكل 5).

5. جمع الأنسجة وإعداد يتصاعد شقة شبكية العين

ملاحظة: جمع الأنسجة وفقا لفرضية البحث المطلوب. بالنسبة للفئران، قم بجمع العينات على سبيل المثال عند P12 (لدراسة طمس الماوس بعد مرحلة فرط الأكسدة) أو في فترة نقص الأكسجين (P13-P17). جمع عينات الماوس OIR في P17، والذي هو نقطة الوقت الأكثر شيوعا لأخذ العينات، للكشف عن الذروة في كمية NV. في الفئران OIR، وجمع العينات في P18-P21 لمراقبة أكبر قدر من NV(الشكل 3).

  1. وزن الحيوانات قبل أخذ العينات.
  2. لتسمية الأوعية الدموية الشبكية، يمكن أن تكون الحيوانات المهينة بعمق مُزوَّرة عبر القلب مع FITC-dextran. (بدلا من ذلك، وصمة عار على شبكية العين مسطحة يتصاعد مع Isolectin في وقت لاحق).
  3. التضحية بالحيوانات باستخدام إما جرعة زائدة من أدوية التخدير (على سبيل المثال خليط من الكيتامين وdedetomidine، 300 ملغم / كجم و 4 ملغ / كجم للفئران) أو استنشاق CO2.
  4. جمع عيون الحيوانات عن طريق الاستيلاء على وراء مقلة العين مع ملقط منحنية، وقطع الأنسجة حول العينين ورفع العين من المدار.
  5. احتضان مقل العيون في الطازجة، تمت تصفيتها 4٪ شبهformaldehyde (في الفوسفات العازلة المالحة، برنامج تلفزيوني) لمدة 1-4 ساعة. إزالة المثبت وغسل مقل العيون 3 × 10 دقيقة مع برنامج تلفزيوني. تشريح شبكية العين على الفور أو تخزينها في برنامج تلفزيوني في +4 درجة مئوية.
    تنبيه: البارفورمالديهايد سام عن طريق الاستنشاق، في ملامسة الجلد وإذا ابتلع. يرجى قراءة ورقة بيانات السلامة قبل العمل معها.
    ملاحظة: لا تضغط على مقلة العين أثناء أخذ العينات أو أي مرحلة من مراحل معالجة الأنسجة من أجل تجنب انفصال الشبكية، إذا تم إجراء أقسام عرضية من مقل العيون بأكملها.
  6. إعداد شبكية العين مسطحة يتصاعد لتحديد كمية NV وحجم AVAs. بدلا من ذلك، معالجة مقل العيون / شبكية العين لعلم الأنسجة، أو الحمض النووي الريبي أو تحليل البروتين. تشريح الشبكية تحت مجهر ستيريو باستخدام مقص صغير والملقط.
    1. ضع مقلة العين في PBS لإبقائها رطبة وثقب مقلة العين في ليفوس مع إبرة (23G) وقطع حول limbus مع مقص صغير منحني لإزالة القزحية والقرنية.
    2. ضع بعناية طرف المقص بين الصلصلة وشبكية العين وقطع سكّر نحو العصب البصري. تفعل الشيء نفسه على الجانب الآخر من مقلة العين، وقطع بعناية / المسيل للدموع sclera حتى يتعرض كوب شبكية العين. سحب العدسة من كأس شبكية العين وإضافة برنامج تلفزيوني إلى الكأس.
    3. إزالة جميع الأوعية الهيالويد، الزجاجي والحطام دون الإضرار شبكية العين. غسل الشبكية عن طريق إضافة PBS إلى كأس الشبكية. قم بإجراء أربعة شقوق (في الساعة 12 و3 و6 و9) إلى شبكية العين مع مقص صغير مستقيم لصنع بنية تشبه الزهور. اختياريا، وجعل التخفيضات مع شفرة الجراحية قبل تركيب العينات. ارفع الشبكية باستخدام فرشاة طلاء ناعمة إلى لوحة جيدة لتلطيخها.
  7. تسمية الأوعية الدموية الشبكية باستخدام ايزولكتين B4 الذي يلطخ سطح الخلايا البطانية (إذا لم تكن الحيوانات مطعّمة مع FITC-dextran). احتضان شبكية العين في عازلة سد (10٪ NGS + 0.5٪ تريتون في TBS) ل 1 ساعة وغسل مع 1٪ NGS + 0.1٪ تريتون في TBS لمدة 10 دقيقة. احتضان شبكية العين مع صبغة الفلورسنت مترافق Isolectin B4 (5-10μg/ml) في 1٪ NGS + 0.1٪ تريتون في TBS بين عشية وضحاها في +4 درجة مئوية في حين محمية من الضوء.
    ملاحظة: إذا رغبت في ذلك، وتسمية الخلايا الأخرى مثل الخلايا الالتهابية وخصبات باستخدام أجسام مضادة محددة.
  8. غسل شبكية العين 3x لمدة 10 دقيقة مع 1٪ NGS + 0.1٪ تريتون في TBS ورفع شبكية العين على شريحة مجهرية، الشبكية الداخلية التي تواجه صعودا. انتشرت بعناية خارج شبكية العين باستخدام فرشاة الطلاء الناعمة وإزالة أي أوعية أو الحطام الهيالويد المتبقية. أضف متوسطة التركيب إلى زلة الغطاء ووضعها فوق شبكية العين. تخزين شبكية العين في +4 درجة مئوية وحماية من الضوء.

6. تحليل يتصاعد شقة

  1. التقاط صور للشبكية المسطحة يتصاعد باستخدام المجهر fluorescence مع الهدف 10x. التركيز على الضفيرة الوعائية السطحية وعلى النيوفاكوسال ما قبل الارتحال. جعل صورة مسح البلاط لالتقاط الشبكية بأكملها ودمج مسح البلاط
  2. كمّيّة الصور بقياس AVAs، منطقة NV ومنطقة شبكية العين الكلية باستخدام برنامج معالجة الصور (انظر جدول المواد).
    1. رسم AVAs ومنطقة شبكية العين الكلية باستخدام أداة رسم اليد الحرة وحدد المناطق neovascular باستخدام أداة التحديد. يقيس البرنامج المناطق ذات الأهمية في وحدات البكسل ، ويمكن استخدام مناطق AVA و NV (المعبر عنها بالبكسل) لحساب نسبتها المئوية بالنسبة إلى منطقة شبكية العين الكلية. أيضا ، بعض أدوات البرمجيات المتاحة لتحديد كمية NV.
      ملاحظة: في الآونة الأخيرة، تم إدخال برامج مفتوحة المصدر ومؤتمتة بالكامل من أجل القياس الكمي للقيم الرئيسية لصور OIR باستخدام شبكات التعلم العصبي العميق وتوفر أداة موثوقة للتكميم الكمي من اڤا وايفا الشبكية (على سبيل المثال، https://github.com/uw-biomedical-ml/oir/tree/bf75f9346064f1425b8b9408ab792b1531a86c64)20،21.
  3. إذا كان استخدام الأجسام المضادة للكشف المناعية البيوكيميائية من مجموعات الخلايا الفردية، كميا عدد الخلايا الملطخة (مثل microglia، الشكل 2B)من شبكية العين مسطحة يتصاعد باليد أو عن طريق أنظمة تحليل الصور الآلي إذا رغبت في ذلك.

7 - الإحصاءات

  1. تحليل البيانات الموزعة عادة من قبل الطالب تي اختبار أو ANOVA اتجاه واحد تليها دونيت أو توكي في المقارنات متعددة اختبار، حسب الاقتضاء. استخدم الاختبارات غير القياسية مثل اختبار مان-ويتني U أو اختبار Kruskal Wallis للبيانات غير الموزعة بشكل طبيعي. النظر في الاختلافات ذات دلالة إحصائية في مستوى P < 0.05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

والنتيجة الرئيسية للنموذج هي النمط الظاهري الوعائي: حجم مركبات AVAs وكمية NV. في نموذج OIR الماوس، وvao-طمس يحدث في شبكية العين المركزية (الشكل 2A)، بينما في نموذج الفئران يتطور في المحيط، أي، على غرار ROP الإنسان22 (الشكل 3A). وذلك لأن الضفيرة الوعائية السطحية قد تطورت بالفعل عندما تتعرض الفئران لفرط التأكسج ، في حين أن الشبكية في نموذج الفئران هي أفاوسكولا في وقت تحريض OIR (P0). يحدث النماء قبل الطوري بالقرب من المناطق افاسكال، أي الشبكية المركزية في الماوس، والأطراف في الفئران(الشكل 2A والشكل 3A).

يمكن إجراء التحليل النسيجي باستخدام المقاطع العرضية أو التصاعدات المسطحة لتقييم التغيرات المورفولوجية في شبكية العين OIR أو وجود أنواع الخلايا من الاهتمام ، على سبيل المثال الخلايا الالتهابية(الشكل 2B). بالإضافة إلى شبكية العين، العين الكاملة أو العين الزجاجية يمكن جمعها لمزيد من الجينات والبروتين تحليل التعبير في نقاط زمنية مختلفة خلال نموذج OIR. يمكن تحليل مستويات التعبير الجيني أو البروتيني باستخدام الطرق القياسية، مثل RT-qPCR أو النشاف الغربي.

اختياريا، يمكن إجراء غير الغازية في التصوير الجسم الحي خلال فترة المتابعة OIR. يمكن تصور شبكية العين والأوعية الدموية الهيالويد مع FA (الشكل 4A). SD-OCT يمكن استخدامها لتقييم التغيرات الهيكلية في شبكية العين (الشكل 4B). يمكن قياس التغيرات الوظيفية في شبكية العين بواسطة ERG (الشكل 5).

مثبطات عامل النمو البطانية الوعائية (VEGF) تستخدم عادة في علاج أمراض العين الوعائية البشرية. وهكذا، غالباً ما يستخدم المضادة لـ VEGF كمركب مرجعي في OIR. Aflibercept, أن يعمل كفيرف الذوبان فخ, يمنع كل من NV وإعادة الأوعية الدموية الفسيولوجية في OIR في كل من الجرعات العالية والمنخفضة (حقن في P14). عيون OIR حقن في P14 مع جرعة عالية من aflibercept كان أكبر AVAs الشبكية من العيون غير المعالجة(الشكل 6). وهذا يشير إلى أن كتل aflibercept أيضا revascularization الشبكية الفسيولوجية التي يقودها نقص الأكسجة. ويمكن استخدام كل من الفئران ونماذج الفئران لتقييم تأثير مختلف العوامل المضادة للأوعية على شبكية العين NV وrevascularization الفسيولوجية للشبكية(الشكل 3B والشكل 6).

Figure 1
الشكل 1: نظرة عامة رسومية لتصميم دراسة OIR القياسية للفئران والجرذان. (A) تم حث نموذج OIR الماوس عن طريق تعريض الفئران إلى 75٪ O2 من P7 إلى P12 وعاد إلى الهواء العادي للغرفة. وقد شوهدت ذروة ما قبل الطمث في P17، والتي عادة ما تكون نقطة أخذ العينات للتجربة. (B) تم حث نموذج OIR الفئران عن طريق تعريض الفئران إلى مستويات O2 بالتناوب (50/10 ٪ O2) من P0 إلى P14 وعاد إلى الظروف نورموكسيك. عادة ما يتم التضحية بالجرذان في P20 ، عندما بلغت كمية NV ذروتها. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: النمط الظاهري الوعائي في نموذج OIR للفأر. تم إنشاء طراز ماوس OIR كما هو موضح في الشكل 1. (أ) الضفيرة الوعائية السطحية التي تطورت في الفئران العادية بينما تعرضت فئران OIR إلى 75٪ O2 من P7 إلى P12. خلال هذا الوقت، وطمس الأوعية الدموية المتقدمة في شبكية العين المركزية (ملحوظ باللون الأزرق في P12 و P17 في الصور كمي). عادت الفئران إلى هواء الغرفة العادي ، وأصبحت الشبكية افاسكومية ، مما أدى إلى إعادة نمو الأوعية الوظيفية في شبكية العين و NV المرضية (ملحوظ باللون الأحمر عند P17 في اللوحة السفلية). وضعت الخصلات ما قبلية النفزية بين الأوعية الدموية والمناطق افاسكال في وسط الشبكية. بلغت كمية NV ذروتها في P17 وتراجعت بعد ذلك. تم إعادة الأوعية الدموية الشبكية بالكامل وتراجع NV حول P24-P25. (B) مثال على التلطيخ المناعي للتلوين الصباغي من شبكية العين شقة جبل يظهر شبكية العين Iba-1 ميكروغليا الملون (الأخضر) و GS-IB4 أوعية دموية ملونة (أحمر) في P12 و P17. (C) المقطع من العين OIR الماوس في P17، حيث خصلات ما قبل البروتين (السهام) كانت تنبت نحو الزجاجة. كما شوهد ترقق الطبقة النووية الداخلية (INL) والطبقة الضبيجية الخارجية (OPL). أشرطة مقياس هي 1 مم في A، 50 ميكرومتر في B، و 100 ميكرومتر في C. ILM = غشاء الحد الداخلي، GCL = طبقة خلية العقدة، IPL = طبقة شبكية داخلية، INL = طبقة نووية داخلية، OPL = طبقة شبكية خارجية، ONL = الطبقة النووية الخارجية، RPE = ظهارة صبغ الشبكية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: النمط الظاهري الوعائي وتطوره في نموذج OIR الفئران. (أ)المناطق الافا (ملحوظ باللون الأزرق) و NV (ملحوظ باللون الأحمر) وضعت في محيط الشبكية، على غرار ROP الإنسان. (B) AVAs شوهدت في شبكية العين OIR، ولكن ليس في الضوابط نورموكسيك. (ج)أظهر القياس الكمي لمنطقة NV اتجاهًا نحو ذروة مقدار NV عند P20 ، ولكن الفرق لم يكن مهمًا إحصائيًا مقارنة بـ P18 و P21 في OIR. (الطالب t-اختبار، بين الوقت مطابقة normoxic و OIR شبكية العين، ** ف ≤ 0.01، *** ف ≤ 0.001، وكلا العينين من الحيوانات المرسومة في الرسم البياني). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: التصوير في الجسم الحي باستخدام تصوير الأوعية الفلورية (FA) والتصوير المقطعي البصري للتماسك الطيفي للمجال (SD-OCT) في نموذج OIR للفئران. (أ)وقد شوهد tortuosity (رؤوس الأسهم) في الصور التي اتخذت من شبكية العين المركزية (الصف العلوي) في P18 وP20 في الفئران OIR مقارنة بالجرذان P19 normoxic. NV (الأسهم) وAVAs (النجمة) المتقدمة إلى أطراف الشبكية (الصف الأوسط) كما رأينا في شبكية العين P18 و P20 OIR. تم التقاط أوعية الهيالويد (الصف السفلي) التراجعية من قبل FA. (B) لوحظ نمو الأوعية الدموية نحو الزجاجي كتكيثان على طبقة الألياف العصبية (NFL) وطبقة خلية العقدة (GCL) في شبكية العين OIR (السهم). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: يمكن قياس وظائف الخلايا العصبية الشبكية باستخدام التصوير الكهربائي للفلاش (fERG). (A) تم اشتقاق الموجات من مخروط شبكية العين وقضبان photoreceptors وانخفضت إلى حد كبير السعات في نموذج OIR الفئران. زاد التأثير مع كثافة الضوء أعلى، مما يشير إلى أن العيوب كانت تؤثر على وظائف مستقبلات ضوئية مخروط في المقام الأول. (B)تم تقليل السعات من B-wave من الحيوانات OIR مقارنة بضوابط نوروكسيكو. تم اشتقاق موجات B من الخلايا الثنائية القطب على المدى والخلايا Müller. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: برنامج تلفزيوني حقنها بشكل حقيقي يقلل من NV و AVAs في نموذج OIR الماوس. (أ)صور تمثيلية من شبكية العين يتصاعد شقة من غير المعالجة، وaflibercept-المعالجة (20 ميكروغرام في P14) وPBS حقن عيون OIR في P17. زيادة جرعة عالية من aflibercept (20 ميكروغرام) حجم AVAs بنسبة 47٪ (مبينة باللون الأبيض) وتمنع NV بنسبة 98٪ (الأسهم) مقارنة بالضوابط غير المعالجة. انخفض حقن PBS AVAs بنسبة 31٪ وNV بنسبة 42٪ مقارنة بالضوابط غير المعالجة. أيضا، ثقب من sclera تشبه ivt أنتجت تأثيرات مماثلة حقن ivt من برنامج تلفزيوني، ولكن الاختلافات لم تكن ذات دلالة إحصائية. نقاط Arrowhead في الأوعية الهيالويد التي لم تتم إزالتها أثناء تشريح. (ANOVA واحد الاتجاه ، * ف ≤ 0.05 ؛ ** ص ≤ 0.01 ، *** ف ≤ 0.001 ، **** ف ≤ 0.0001). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

شدة النمط الظاهري للمرض يعتمد على كل من سلالة وحتى البائع في كل من الفئران والجرذان OIR نماذج23. وهذا يشير إلى أن هناك تبايناً جينياً واسعاً في تطور علم الأمراض. بشكل عام ، تتطور القوارض المصطبغة نمطًا ظاهريًا أكثر حدة من تلك المهق. على سبيل المثال، الأوعية الدموية الشبكية من ألبينو ألبين/ج revascularizes بسرعة بعد hyperoxia ولا تتطور NV في جميع24. وبالمثل ، في الفئران ، تظهر فئران النرويج البني المصطبغة أمراضًا أكثر شدة من الفئران الهربية Sprague Dawley (SD)25. فئران SD شائعة الاستخدام سلالة، وقد تم الإبلاغ عن الاختلافات ذات الصلة بائع في النمط الظاهري OIR داخل سلالة. على سبيل المثال، الجرذان SD من نهر تشارلز تنتج أكثر بكثير NV من الفئران من هارلان أو زيفيك ميلر23. C3H / HeJ الفئران، بدورها، التي لديها طفرة في انحطاط الشبكية 1(Rd1)الجينات، لديها شبكية العين رقيقة، ولا تتطور NV26. بسبب هذه الأسباب وتوافر خطوط الفئران المعدلة وراثيا، وC57BL/6J الأصيلة هي سلالة الماوس الأكثر استخداما لدراسات OIR. ومع ذلك ، هناك معدل وفيات مرتفع بين السدود C57BL/6J بسبب التعرض للتضخم ، لذلك يجب النظر في رفاهية الفئران عند تصميم الدراسة ورصدها أثناء التجارب. وعلاوة على ذلك، وينظر إلى زيادة الضرر في المستقبلات الضوئية في C57BL/6 الفئران مقارنة بالصابرة BALB / ج27.

من أجل ضمان سلامة الفئران وبقاء السدود والجراء ، يجب أن يبقى حجم القمامة صغيرًا (6-7 جرو / سد). وهذا مهم بشكل خاص عند استخدام C57BL/ 6 الفئران، والتي هي أكثر عرضة للإجهاد فرط الأكسدة27،28. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي توفير الغذاء الدعم يمكن الوصول إليها بسهولة (وضعت على الجزء السفلي من القفص) للفئران. بعض الباحثين استخدام السدود البديلة لاستبدال السدود في الغرفة مع صحية منها بعد الايكسجين التعريفي. ومع ذلك، فإن معظم الباحثين استخدام البدائل فقط إذا تم استنفاد السد22،29. ويوصى باستخدام السدود البديلة إذا استخدمت أحجام أكبر من القمامة. وقد نشرت أن الفئران 129S3/SvIM تنتج أكثر NV من C57BL/6 والحفاظ على نحو أفضل التغييرات الناجمة عن مستويات الأكسجين متفاوتة28. وتجدر الإشارة إلى أن السدود المستخدمة في OIR هي غير مُنَخلة بعد الحث على الـ OIR ولا ينبغي استخدامها لأغراض تربية أخرى22. يؤثر زيادة الوزن بعد الولادة للجراء على شدة أمراض OIR. الجراء مع ضعف الوزن بعد الولادة (< 5 ز في P17) تظهر تأخر التعبير عن VEGF وبالتالي مرحلة طويلة من اعتلال الشبكية بالمقارنة مع الجراء مع العادي (5 - 7.5 غرام في P17) أو زيادة الوزن واسعة النطاق (> 7.5 ز في P17)29. وعلاوة على ذلك، الجراء الفئران وزنها أكثر من 5 ز في P7 لا تظهر المناطق التي طمس vaso بعد OIR التعريفي30. وبالتالي ، من المهم وزن الجراء أثناء التجربة. يمكن استخدام العين غير المعالجة اللاتينية كضوابط داخلية لضمان أن الحالة الغذائية للفئران لا تؤثر على النتائج. والحالة مماثلة في الجرذان؛ أصغر الجراء هي، وأكثر شدة OIR النمط الظاهري أنها تطوير31. وهكذا، من المستحسن أن يتم استخدام حجم القمامة الكبيرة (حوالي 18 الجراء) لنموذج OIR الفئران.

يمكن أن يتم إدخال نموذج OIR باستخدام إما نظام مغلق بالكامل ، حيث توجد دائرة مغلقة مع مضخة تقوم بتعميم الهواء من خلال نظام تصفية (الجير الصودا والكربون المنشط) إلى الغرفة. خيار آخر هو نظام شبه مغلق، حيث تضمن التهوية إزالة الأيض الزائد من الغرفة. لضمان إزالة ثاني أكسيد الكربونالزائد 2، يمكن وضع الجير الصودا (خليط هيدروكسيد الكالسيوم مع هيدروكسيد الصوديوم أو هيدروكسيد البوتاسيوم) في الجزء السفلي من الغرفة. إزالة CO2 إلزامي كما ارتفاع CO2 مستويات تفاقم النمط الظاهري للمرض في الفئران32. وينبغي للمرء أن نتذكر أيضا أن إعادة معايرة جهاز استشعار الأكسجين من الغرفة بانتظام لأنها تميل إلى الانجراف مع مرور الوقت، ويمكن أن توفر تركيز الأكسجين خاطئ من واحد المقصود.

وقد أفيد أن حقن السيارة (PBS) وحدها أو حتى مجرد ثقب في الفضاء intravitreal له تأثير على معدل إعادة الأوعية الدموية وكمية NV (الشكل 6)33,34,35,36. وقد تم التكهن ما إذا كان التأثير الذي شوهد مع برنامج تلفزيوني / حقن السيارة يمكن أن يكون بسبب التغيرات في الضغط داخل العين أثناء الحقن، أو بسبب إصابة في هياكل العين التي تزيد من مستويات عوامل النمو الوعائية فيما بينها عامل النمو المشتق من ظهارة الصباغ34،37. وعلاوة على ذلك، فقد ثبت أن مجرد حقن تحت الوريتينال التجريبية وحدها (ثقب في الفضاء تحت الريتينال) لها آثار على النمط الظاهري الوعائي والوظيفي في OIR بالمقارنة مع الفئران غير المعالجة38. هذه النتائج تسلط الضوء على أهمية الضوابط السلبية السليمة في دراسات OIR أو حتى الإدارة النظامية للمركبات المختبرة، فضلا عن أرقام ن كبيرة بما فيه الكفاية في كل مجموعة دراسة. حقيقة أن حقن السيارة يعزز بالفعل معدل إعادة الأوعية الدموية في شبكية العين هو عامل مقيد رئيسي حيث أن معدل إعادة الأوعية وتشكيل الخصلات قبل الارتهانية المرضية مرتبطان في نموذج OIR: إذا تم تسريع معدل إعادة التسارع ، فإنه يؤدي إلى التنظيم التنازلي التعويضي للخصلات المعوزية والعكس بالعكس. وهكذا, تتأثر كلا من قياسات النتائج الأولية من نموذج OIR بحقن السيارة.

وقد أحدثت مثبطات VEGF ثورة في العلاج AMD وD. تم استخدام نموذج OIR لإثبات فعاليتها قبليا. فيما يتعلق مثبطات VEGF في OIR ، أظهرت دراسة تقارن بين مختلف مضادات VEGFs و Anti-PlGFs (عامل نمو المشيمة) (حقن في P12) أن مكافحة VEGF وحدها أدت إلى مناطق صغيرة من avascular ، في حين أن العيون المعالجة المضادة لـ PIGF كان لها مناطق أفاسية أكبر33. وكان أفليبيليبت أكبر AVAs بالمقارنة مع غيرها من العلاجات المخدرات33. ومن المعروف أن Aflibercept لربط كل من VEGF وPlGF39، يمكن أن يكون ذلك تثبيط PlGF في OIR يؤدي إلى منع تولد الأوعية الفسيولوجية.

يوفر التصوير غير الباضع في الجسم الحي أداة لمراقبة الأوعية الدموية الشبكية40 وطبقات الشبكية وبنيتها خلال فترة المتابعة. باستخدام FA، يمكن قياس المعلمات مثل كثافة الأوعية الدموية وتورتوسية الشرايين والتمدد الوريدي (يسمى مرض زائد، الشكل 4A)40،41. SD-OCT يمكن استخدامها لتقييم التغيرات الهيكلية وقياس سمك شبكية العين خلال فترة المتابعة OIR42,43. يتم استخدام ERG لقياس التغيرات الوظيفية في شبكية العين. تنتج أنواع الخلايا المختلفة إمكانات كهربائية بعد التحفيز الضوئي ، ويمكن قياس هذه الإشارات أو "الموجات" باستخدام ERG. Photoreceptors تنتج السلبية A-الموجة، وعلى الخلايا الثنائية القطب وخلايا مولر هي المسؤولة أساسا عن ب موجة44. فقدان وظيفة الشبكية هو نموذجي في الفئران OIR والجرذان45،46 ( الشكل5). التغيرات طويلة الأمد لا تزال مستمرة في شبكية العين والتغيرات الوظيفية والتغيرات في مستوى البروتين وقد تم الإبلاغ عن في شبكية العين OIR حتى بعد revascularization و NV الانحدار34,47.

لتصور الأوعية الدموية الشبكية، يمكن أن تكون الفئران الحية إما pered مع dextran المسمى FITC أو يتصاعد شقة شبكية العين يمكن أن تكون ملطخة مع صبغة الفلورسنت المسمى Isolectin B4. يحتاج المرء إلى فهم الفرق بين الأصباغ الفلورية; القذف مع FITC-dextrans تسميات فقط لومن من السفن، في حين Isolectin B4 بقع سطح الخلايا البطانية. وهكذا، فإن الأوعية الدموية الوظيفية مع التجويف السليم فقط أن يكون تصور مع فيتC-dextran perfusion، في حين أن المنطقة الإجمالية من NV يبدو أكبر في ايسوليكتين B4 لطخت الشبكية مما كانت عليه في FITC-dextran الحيوانات perfused، لأن Isolectin B4 تلتقط أساسا حتى الخلايا البطانية التي لم تشكل التجويف الوظيفي بعد48. وهناك خيار أكثر حداثة لتصور كامل شبكية العين / الكرة العين في شكل 3-D هو تصوير الأنسجة العميقة عن طريق المجهر الفلوري فوتون اثنين(49).

نموذج OIR القوارض ، وكذلك النماذج الحيوانية بشكل عام ، لا يمثل سوى جزئيًا خصائص الأمراض البشرية. الفرق الرئيسي المتعلق بـ OIR هو أن النيوفاسكلارية الشبكية لا يرتبط بالتليف في ألياف الشبكية ، في حين أن عملية النيوفاكوسلارية الشبكية تؤدي عادة إلى الانتشار الليفي في أمراض الشبكية النيوفاسية البشرية. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تكون الظروف التي تسبب OIR مقابل الأمراض البشرية على العكس تقريبا. يحتاج المواليد الخدج الذين يعانون من ROP إلى أكسجين إضافي مع دعم تنفسي ، ويختبرون نوبات نقص السكر في الدم وفرط الoxemic المتقطعة في كثير من الأحيان بسبب انقطاع النفس المتكرر ، لكنهم لا يتعرضون لمستويات عالية من الأكسجين. لتقليل الضرر الدائم، يتم تجنب كسور عالية من O2 المستوحاة. وفي هذا الصدد، لا نموذج الماوس مع التعرض المستمر ل 75٪ O2 لمدة 5 أيام ولا نموذج الفئران 50/10 تشبه التسبب في ROP الإنسان. وعلاوة على ذلك، هناك أيضا اختلافات بين الفئران والفأر OIR نماذج. ويتراجع النيوفاكوسلارية في نموذج الماوس مع إعادة إنشاء الأوعية العادية بواسطة P24 ، في حين أن الحالة تزداد سوءًا في نموذج OIR للفئران (على غرار ROP البشري). على الرغم من أن نموذج OIR الفئران يظهر السمات ذات الصلة سريريا من ROP مثل تأخر تطوير الأوعية الدموية الشبكية وneovascularization المرضية اللاحقة، ويقتصر استخدامه من قبل غياب كامل تقريبا من سلالات الفئران المعدلة وراثيا، وارتفاع تكاليف الصيانة وأقل NV مما كانت عليه في نموذج OIR الماوس.

معا، على الرغم من الاختلافات بين اعتلال الشبكية الإقفارية البشرية و نماذج OIR القوارض، وسهولة التي يمكن أن تستحث NV، إلى جانب التصور السهل والكمية من شبكية العين، وجعل نماذج OIR شعبية لدراسة الآليات الجزيئية والعلاجات المحتملة لارتوئيبات الريتينوئية التكاثرية الإقفارية. ومن المثير للاهتمام، والتعرض فرط التأكسج في نموذج OIR الماوس أيضا يحفز خلل التنسج القصبي، وهو مرض آخر الناجم عن العلاج بالأكسجين التكميلي في الرضع الخدج الإنسان، وتبين أن نموذج OIR يمكن استخدامها لاستكشاف أهداف جديدة لكل من ROP والانتفاخ القصبي البرني في وقت واحد50.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

المؤلفان ماريا فاتهاتوبا، دكتوراه، نيينا ياسكيلينن، مارك سيرارادا- خيمينيز، دكتوراه، روبينا ثابا هم موظفون في شركة Experimentica Ltd.

المؤلف Giedrius Kalesnykas، دكتوراه، هو موظف (الرئيس والمدير التنفيذي) والمساهم في Experimentica المحدودة التي تقدم خدمات البحوث العقد باستخدام نماذج قبل الظهرية المستخدمة في هذه المادة.

تيرو يارفينن، دكتوراه، دكتوراه، وهانيل أوسيتالو-جارفينين، دكتوراه، دكتوراه، ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

نشكر ماريان كارلسبرغ، آن ماري هابانييمي، بايفي بارتانين وآن كانكونين على الدعم الفني الممتاز. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل أكاديمية فنلندا، ومؤسسة بايفيككي وساكاري سهلبرغ، ومؤسسة تامبيري للسل، والمؤسسة الطبية الفنلندية، ومؤسسة بحوث منطقة مستشفى بيركانما، وصندوق أبحاث مستشفى تامبيري الجامعي.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
33 gauge, Small Hub RN Needle Hamilton Company 7803-05, 10mm, 25°, PS4 For intravitreal injection
Adobe Photoshop Adobe Inc. For image analysis
Air pump air100 Eheim GmbH & Co. KG. 143207 For inhalation anaesthesia
Anaesthesia unit 410 AP Univentor Ltd. 2360309 For inhalation anaesthesia
AnalaR NORMAPUR Soda lime VWR International Ltd 22666.362 For CO2 control during model induction
Attane Vet 1000 mg/g VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY vnr 17 05 79 For inhalation anaesthesia
Brush For preparation of flat mounts
Carbon dioxide gas For sacrifice
Celeris D430 ERG system Diagnosys LLC 121 For in vivo ERG
Cell culture dishes Greiner Bio-One International GmbH 664 160 For preparation of flat mounts
Cepetor Vet 1 mg/mL VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY vnr 08 78 96 For anaesthesia
Cover slips Thermo Fisher Scientific 15165452 For preparation of flat mounts
O2 Controlled InVivo Cabinet, Aninal Filtrarion System and Dehumidifier Coy Laboratory Products Closed system for disease model induction, optional for semi-closed system
E702 O2 sensor BioSphenix, Ltd. E207, 1801901 For oxygen level measurement
Envisu R2200 Spectral Domain Optical Coherence Tomograph (SD-OCT) Bioptigen, Inc. BPN000668 For in vivo imaging
Eye spears Beaver-Visitec International, Inc. 0008685 For intravitreal injection and in vivo imaging
Flexilux 600LL Cold light source Mikron 11140 For intravitreal injection or tissue collection
Fluorescein sodium salt Merck KGaA F6377-100G For in vivo imaging
Gas Exhaust unit (+Double 3-way valve, mouse and rat face masks, UNOsorb filter) UNO Roestvaststaal BV GEX 17015249 For inhalation anaesthesia
Glass syringe, Model 65 RN Hamilton Company 7633-01 For intravitreal injection
HRA2 Retina angiograph (FA) Heidelberg Engineering GmbH Spec-KT-05488 For in vivo imaging
Isolectin GS-IB4, Alexa Fluor 488 Conjugate Thermo Fisher Scientific I21411 For labeling retinal vasculature on flat mounts
Ketaminol Vet 50 mg/mL Intervet International B.V. vnr 51 14 85 For anaesthesia
Medicinal Oxygen gas For disease model induction
Mice C57BL/6JRj Janvier Labs Also other strains possible
Microscope slides Thermo Fisher Scientific J1800AMNZ For preparation of flat mounts
Minims Povidone Iodine 5% (unit) Bausch & Lomb U.K Limited vnr 24 11 304 For intravitreal injection
Nitrogen gas For disease model induction (rat)
Oftan Chlora 10 mg/g Santen Pharmaceutical Co., Ltd. vnr 55 01 11 For intravitreal injection
Oftan Metaoksedrin 100 mg/ml Santen Pharmaceutical Co., Ltd. vnr 55 03 43 For in vivo ERG
Oftan Obucain 4 mg/ml Santen Pharmaceutical Co., Ltd. vnr 55 03 50 For intravitreal injection
Oftan Tropicamid 5 mg/ml Santen Pharmaceutical Co., Ltd. vnr 04 12 36 For in vivo imaging
ProOx Model 110 O2 controller and animal chamber BioSphenix, Ltd. 803 For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system
ProOx Model P360 O2 controller and animal chamber BioSphenix, Ltd. 538 For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system
Rats CD(SD) Charles River Laboratories Also other strains possible
Revertor 5 mg/mL VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY vnr 13 04 97 For anaesthesia reversal
Silica gel For humidity control during model induction
Systane Ultra 10ml Alcon Tamro 2050250 For hydration of the eye
Systane Ultra unit 0.7ml Alcon Tamro 2064871 For hydration of the eye
Transfer pipette Thermo Fisher Scientific 1343-9108 For preparation of flat mounts
VENTI-Line VL 180 PRIME Drying oven VWR VL180S 170301 For drying silica gel
VisiScope SZT350 Stereomicroscope VWR 481067 For intravitreal injection or tissue collection

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chase, J. The evolution of retinal vascularization in mammals. A comparison of vascular and avascular retinae. Ophthalmology. 89 (12), 1518-1525 (1982).
  2. Sun, Y., Smith, L. E. H. Retinal vasculature in development and diseases. Annual Review of Vision Science. 4, 101-122 (2018).
  3. Vähätupa, M., Järvinen, T. A. H., Uusitalo-Järvinen, H. Exploration of oxygen-induced retinopathy model to discover new therapeutic drug targets in retinopathies. Frontiers in Pharmacology. 11, 873 (2020).
  4. Stahl, A., et al. The mouse retina as an angiogenesis model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (6), 2813-2826 (2010).
  5. Benjamin, L. E., Hemo, I., Keshet, E. A plasticity window for blood vessel remodelling is defined by pericyte coverage of the preformed endothelial network and is regulated by PDGF-B and VEGF. Development. 125 (9), 1591-1598 (1998).
  6. Bashinsky, A. L. Retinopathy of prematurity. North Carolina Medical Journal. 78 (2), 124-128 (2017).
  7. Ludwig, C. A., Chen, T. A., Hernandez-Boussard, T., Moshfeghi, A. A., Moshfeghi, D. M. The epidemiology of retinopathy of prematurity in the united states. Ophthalmic Surgery, Lasers and Imaging Retina. 48 (7), 553-562 (2017).
  8. Hartnett, M. E. Pathophysiology and mechanisms of severe retinopathy of prematurity. Ophthalmology. 122 (1), 200-210 (2015).
  9. Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. Animal models of ocular angiogenesis: From development to pathologies. FASEB Journal. 31 (11), 4665-4681 (2017).
  10. Szewczyk, T. S. Retrolental fibroplasia; etiology and prophylaxis. American Journal of Ophthalmology. 35 (3), 301-311 (1952).
  11. Szewczyk, T. S. Retrolental fibroplasia and related ocular diseases; classification, etiology, and prophylaxis. American Journal of Ophthalmology. 36 (10), 1336-1361 (1953).
  12. Gerschman, R., Nadig, P. W., Snell, A. C. Jr, Nye, S. W. Effect of high oxygen concentrations on eyes of newborn mice. American Journal of Physiology. 179 (1), 115-118 (1954).
  13. Gyllnesten, L. J., Hellström, B. E. Experimental approach to the pathogenesis of retrolental fibroplasia. III. changes in the eye induced by exposure of newborn mice to general hypoxia. British Journal of Ophthalmology. 39 (7), 409-415 (1955).
  14. Curley, F. J., Habegger, H., Ingalls, T. H., Philbrook, F. R. Retinopathy of immaturity in the newborn mouse after exposure to oxygen imbalances. American Journal of Ophthalmology. 42 (3), 377-392 (1956).
  15. Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).
  16. Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: A model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4 (11), 1565-1573 (2009).
  17. Penn, J. S., Tolman, B. L., Lowery, L. A. Variable oxygen exposure causes preretinal neovascularization in the newborn rat. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 34 (3), 576-585 (1993).
  18. Penn, J. S., Henry, M. M., Tolman, B. L. Exposure to alternating hypoxia and hyperoxia causes severe proliferative retinopathy in the newborn rat. Pediatric Research. 36 (6), 724-731 (1994).
  19. Ritter, M. R., et al. Three-dimensional in vivo imaging of the mouse intraocular vasculature during development and disease. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (9), 3021-3026 (2005).
  20. Xiao, S., et al. Fully automated, deep learning segmentation of oxygen-induced retinopathy images. Journal of Clinical Investigation Insight. 2 (24), 97585 (2017).
  21. Mazzaferri, J., Larrivee, B., Cakir, B., Sapieha, P., Costantino, S. A machine learning approach for automated assessment of retinal vasculature in the oxygen induced retinopathy model. Scientific Reports. 8 (1), 22251-22257 (2018).
  22. Kim, C. B., D'Amore, P. A., Connor, K. M. Revisiting the mouse model of oxygen-induced retinopathy. Eye and Brain. 8, 67-79 (2016).
  23. Barnett, J. M., Yanni, S. E., Penn, J. S. The development of the rat model of retinopathy of prematurity. Documenta Ophthalmologica. 120 (1), 3-12 (2010).
  24. Ritter, M. R., et al. Myeloid progenitors differentiate into microglia and promote vascular repair in a model of ischemic retinopathy. Journal of Clinical Investigation. 116 (12), 3266-3276 (2006).
  25. Floyd, B. N., et al. Differences between rat strains in models of retinopathy of prematurity. Molecular Vision. 11, 524-530 (2005).
  26. Scott, A., Powner, M. B., Fruttiger, M. Quantification of vascular tortuosity as an early outcome measure in oxygen induced retinopathy (OIR). Experimental Eye Research. 120, 55-60 (2014).
  27. Walsh, N., Bravo-Nuevo, A., Geller, S., Stone, J. Resistance of photoreceptors in the C57BL/6-c2J, C57BL/6J, and BALB/cJ mouse strains to oxygen stress: Evidence of an oxygen phenotype. Current Eye Research. 29 (6), 441-447 (2004).
  28. Chan, C. K., et al. Differential expression of pro- and antiangiogenic factors in mouse strain-dependent hypoxia-induced retinal neovascularization. Laboratory Investigation. 85 (6), 721-733 (2005).
  29. Stahl, A., et al. Postnatal weight gain modifies severity and functional outcome of oxygen-induced proliferative retinopathy. American Journal of Pathology. 177 (6), 2715-2723 (2010).
  30. Liegl, R., Priglinger, C., Ohlmann, A. Induction and readout of oxygen-induced retinopathy. Methods in Molecular Biology. 1834, 179-191 (2019).
  31. Holmes, J. M., Duffner, L. A. The effect of postnatal growth retardation on abnormal neovascularization in the oxygen exposed neonatal rat. Current Eye Research. 15 (4), 403-409 (1996).
  32. Holmes, J. M., Zhang, S., Leske, D. A., Lanier, W. L. The effect of carbon dioxide on oxygen-induced retinopathy in the neonatal rat. Current Eye Research. 16 (7), 725-732 (1997).
  33. Heiduschka, P., Plagemann, T., Li, L., Alex, A. F., Eter, N. Different effects of various anti-angiogenic treatments in an experimental mouse model of retinopathy of prematurity. Journal of Clinical and Experimental Ophthalmology. 47 (1), 79-87 (2019).
  34. Tokunaga, C. C., et al. Effects of anti-VEGF treatment on the recovery of the developing retina following oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (3), 1884-1892 (2014).
  35. Tokunaga, C. C., Chen, Y. H., Dailey, W., Cheng, M., Drenser, K. A. Retinal vascular rescue of oxygen-induced retinopathy in mice by norrin. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (1), 222-229 (2013).
  36. Vähätupa, M., Uusitalo-Järvinen, H., Järvinen, T. A. H., Uusitalo, H., Kalesnykas, G. Intravitreal injection of PBS reduces retinal neovascularization in the mouse oxygen-induced retinopathy model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. Abstract Issue. 57 (12), 3649 (2016).
  37. Penn, J. S., et al. Angiostatic effect of penetrating ocular injury: Role of pigment epithelium-derived factor. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (1), 405-414 (2006).
  38. Becker, S., Wang, H., Stoddard, G. J., Hartnett, M. E. Effect of subretinal injection on retinal structure and function in a rat oxygen-induced retinopathy model. Molecular Vision. 23, 832-843 (2017).
  39. Sophie, R., et al. Aflibercept: A potent vascular endothelial growth factor antagonist for neovascular age-related macular degeneration and other retinal vascular diseases. Biological Therapy. 2, (2012).
  40. Mezu-Ndubuisi, O. J. In vivo angiography quantifies oxygen-induced retinopathy vascular recovery. Optometry and Vision Science. 93 (10), 1268-1279 (2016).
  41. Mezu-Ndubuisi, O. J., et al. In vivo retinal vascular oxygen tension imaging and fluorescein angiography in the mouse model of oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (10), 6968-6972 (2013).
  42. Dailey, W. A., et al. Ocular coherence tomography image data of the retinal laminar structure in a mouse model of oxygen-induced retinopathy. Data in Brief. 15, 491-495 (2017).
  43. Mezu-Ndubuisi, O. J., Taylor, L. K., Schoephoerster, J. A. Simultaneous fluorescein angiography and spectral domain optical coherence tomography correlate retinal thickness changes to vascular abnormalities in an in vivo mouse model of retinopathy of prematurity. Journal of Ophthalmology. 2017, 9620876 (2017).
  44. Pinto, L. H., Invergo, B., Shimomura, K., Takahashi, J. S., Troy, J. B. Interpretation of the mouse electroretinogram. Documenta Ophthalmologica. 115 (3), 127-136 (2007).
  45. Nakamura, S., et al. Morphological and functional changes in the retina after chronic oxygen-induced retinopathy. PLoS One. 7 (2), 32167 (2012).
  46. Dorfman, A. L., Polosa, A., Joly, S., Chemtob, S., Lachapelle, P. Functional and structural changes resulting from strain differences in the rat model of oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (5), 2436-2450 (2009).
  47. Vähätupa, M., et al. SWATH-MS proteomic analysis of oxygen-induced retinopathy reveals novel potential therapeutic targets. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (8), 3294-3306 (2018).
  48. Campos, M., Amaral, J., Becerra, S. P., Fariss, R. N. A novel imaging technique for experimental choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (12), 5163-5170 (2006).
  49. Yanez, C. O., et al. Deep Vascular Imaging in Wounds by Two-Photon Fluorescence Microscopy. PLos One. 8 (7), 67559 (2013).
  50. Wickramasinghe, L. C., et al. Lung and eye disease develop concurrently in supplemental oxygen-exposed neonatal mice. American Journal of Pathology. , 30287 (2020).

Tags

الطب قضية 163 تولد الأوعية neovascularization اعتلال الشبكية الناجم عن الأكسجين OIR نقص الأكسجين اعتلال الشبكية من الخداج ROP اعتلال الشبكية السكري الحقن داخل فيريال تحليل الصور الذكاء الاصطناعي الذكاء الاصطناعي
الأكسجين الناجم عن نموذج اعتلال الشبكية لأمراض الشبكية الإقفاري في القوارض
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vähätupa, M.,… More

Vähätupa, M., Jääskeläinen, N., Cerrada-Gimenez, M., Thapa, R., Järvinen, T., Kalesnykas, G., Uusitalo-Järvinen, H. Oxygen-Induced Retinopathy Model for Ischemic Retinal Diseases in Rodents. J. Vis. Exp. (163), e61482, doi:10.3791/61482 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter