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Medicine

Sauerstoffinduzierte Retinopathie-Modell für ischämische Netzhauterkrankungen bei Nagetieren

Published: September 16, 2020 doi: 10.3791/61482
Automatic Translation
1,2, 2, 2, 2, 1, 2, 1,3
1Faculty of Medicine and Health Technology, Tampere University & Tampere University Hospital, 2Experimentica Ltd, 3Eye Centre, Tampere University Hospital

Summary

Die sauerstoffinduzierte Retinopathie (OIR) kann verwendet werden, um ischämische Netzhauterkrankungen wie Retinopathie der Frühreife und proliferative diabetische Retinopathie zu modellieren und als Modell für Proof-of-Concept-Studien zur Bewertung antiangiogener Medikamente für neovaskuläre Erkrankungen zu dienen. OIR induziert eine robuste und reproduzierbare Neovaskularisation in der Netzhaut, die quantifiziert werden kann.

Abstract

Eines der am häufigsten verwendeten Modelle für ischämische Retinopathien ist das sauerstoffinduzierte Retinopathie-Modell (OIR). Hier beschreiben wir detaillierte Protokolle für die INduktion des OIR-Modells und deren Auslesungen bei Mäusen und Ratten. Die retinale Neovaskularisation wird in OIR induziert, indem Nagetierwelpen entweder Hyperoxia (Mäuse) oder abwechselnden Hyperoxia- und Hypoxie-Werten (Ratten) aussetzen. Die primären Auslesungen dieser Modelle sind die Größe der neovaskulären (NV) und avaskulären (AVA) Bereiche in der Netzhaut. Dieses präklinische In-vivo-Modell kann verwendet werden, um die Wirksamkeit potenzieller antiangiogener Medikamente zu bewerten oder um die Rolle bestimmter Gene in der retinalen Angiogenese durch den Einsatz genetisch manipulierter Tiere zu thematisieren. Das Modell weist eine gewisse Belastungs- und herstellerspezifische Variation in der OIR-Induktion auf, die bei der Gestaltung der Experimente berücksichtigt werden sollte.

Introduction

Zuverlässige und reproduzierbare experimentelle Modelle sind erforderlich, um die Pathologie hinter angiogenen Augenerkrankungen zu untersuchen und neue Therapeutika für diese verheerenden Krankheiten zu entwickeln. Die pathologische Angiogenese ist das Kennzeichen für die nasse altersbedingte Makuladegeneration (AMD) und für viele ischämische Netzhauterkrankungen, darunter Retinopathie der Frühreife (ROP), proliferative diabetische Retinopathie (PDR) und Netzhautvenenverschluss (RVO)1,2,3,4. Menschliche und Nagetier Netzhaut folgen einem ähnlichen Muster der Entwicklung, da sowohl menschliche und Nagetier Netzhaut gehören zu den letzten Geweben, die vaskularisiert werden. Bevor sich die Netzhautvaskulatur vollständig entwickelt hat, erhält die Netzhaut ihre Nährstoffzufuhr aus der hyaloiden Vaskulatur, die wiederum nachlässt, wenn die Netzhautvaskulatur beginnt,1,2zu entwickeln. Bei der menschlichen, retinalen Gefäßentwicklung wird vor der Geburt abgeschlossen, während bei Nagetieren das Wachstum der netzretinalen Vaskulatur nach der Geburt auftritt. Da die retinale Gefäßentwicklung postnatal bei Nagetieren auftritt, bietet sie ein ideales Modellsystem, um die Angiogenese2,3zu untersuchen. Die neugeborenen Nagetiere haben eine avaskuläre Netzhaut, die sich allmählich entwickelt, bis die vollständige vaskuläre Netzhautentwicklung bis zum Ende der dritten postnatalen Woche4erreicht ist. Die wachsenden Blutgefäße der neonatalen Maus sind plastisch, und sie durchlaufen Regression während Hyperoxia Stimulus5.

ROP ist die Hauptursache für Kinderblindheit in westlichen Ländern, da es fast 70% der Frühgeborenen mit Geburtsgewicht unter 1.250 g6,7betrifft. ROP tritt bei Frühgeborenen auf, die geboren werden, bevor Netzhautgefäße ihr normales Wachstum vollenden. ROP schreitet in zwei Phasen voran: In Phase I verzögert die Frühgeburt das retinale Gefäßwachstum, wobei nach Phase II die unvollendete Vaskularisation der sich entwickelnden Netzhaut Hypoxie verursacht, die die Expression angiogener Wachstumsfaktoren induziert, die das Wachstum neuer und abnormaler Blutgefäße stimulieren8. Das OIR-Modell ist ein weit verbreitetes Modell, um die Pathophysiologie von ROP und anderen ischämischen Retinopathien zu studieren sowie neuartige Wirkstoffkandidaten2,3,9zu testen. Es wird weithin als reproduzierbares Modell für die Durchführung von Proof-of-Concept-Studien für potenzielle antiangiogene Medikamente für Augen- und Nicht-Augenerkrankungen angesehen. Die beiden Nagetiermodelle, d.h. Maus und Ratte OIR unterscheiden sich in ihrem Modell Induktion und Krankheit Phänotyp. Das Rattenmodell imitiert den ROP-Phänotyp genauer, aber das Mausmodell bietet ein robusteres, schnelleres und reproduzierbareres Modell für die retinale Neovaskularisation (NV). Im Mausmodell entwickelt sich NV zur zentralen Netzhaut. Diese pathologische Auslesung ist wichtig in pharmakologischen Wirksamkeitsstudien für viele ischämische Retinopathien, wie PDR, RV und exsudative AMD sowie für nicht-okuläre, angiogene Erkrankungen wie Krebs. Darüber hinaus macht die Verfügbarkeit von genetisch manipulierten (transgenen und Knockout) Mäusen das Maus-OIR-Modell zu einer beliebteren Option. Allerdings erzeugt weder das OIR-Modell der Maus noch der Ratte eine Netzhautfibrose, die typisch für menschliche Krankheiten ist.

Das Verständnis, dass ein hoher Sauerstoffgehalt zur Entwicklung von ROP in den 1950er Jahren10,11 führte zur Entwicklung von Tiermodellen. Die ersten Studien über die Wirkung von Sauerstoff auf die Netzhautvaskulatur wurden 195012,13,14 durchgeführt und bis in die 1990er Jahre gab es viele Verfeinerungen des OIR-Modells. Die Forschung von Smith et al. im Jahr 1994 setzte einen Standard für das aktuelle Maus-OIR-Modell, das Hyaloidopathie von Retinopathietrennt 15. Eine breite Anwendung der Methode zur Quantifizierung von Vaso-Obliteration und pathologischer NV durch Connor et al. (2009) steigerte seine Popularitätweiter 16. In diesem Modell werden Mäuse bei 75% Sauerstoff (O2) für 5 Tage bei P7 platziert, gefolgt von 5 Tagen unter normoxischen Bedingungen. Hyperoxia von P7 bis P12 bewirkt, dass die Netzhautvaskulatur in der zentralen Netzhaut zurückgeht. Nach der Rückkehr zu normoxischen Bedingungen wird die avaskuläre Netzhaut hypoxisch (Abbildung 1A). Aufgrund der hypoxischen Reize der avaskulären zentralen Netzhaut sprießen einige der retinalen Blutgefäße in Richtung des Glaskörpers und bilden präretinale NV, sogenannte präretinale Büschel2,3. Diese Büschel sind unreif und hyperpermeable. Die NV-Spitzenmenge bei P17, danach geht sie zurück. Die Netzhaut ist vollständig reaskularisiert und NV wird vollständig durch P23 - P25 (Abbildung 2A)2,3zurückgedrängt.

Das OIR-Modell der Ratte (mit unterschiedlichenO2-Werten)wurde erstmals in den 1990er Jahren beschrieben und zeigte, dass unterschiedlicheO2-Werte bei 80 % und 40 % eine ausgeprägtere NV verursachen als unter 80 %O2 konstante Exposition17. Später wurde entdeckt, dass das intermittierende Hypoxie-Modell, bei demO2 aus Hyperoxia (50%) Hypoxie (10-12 %), verursacht noch mehr NV als das 80/40% O2 Modell18. Im 50/10%-Modell sind Rattenwelpen 20 % lang 50 % ausgesetzt, gefolgt von 24 Stunden in 10 % O2. Diese Zyklen werden bis P14 fortgesetzt, wenn die Rattenwelpen an normoxische Bedingungen zurückgegeben werden (Abbildung 1B). Wie bei menschlichen ROP-Patienten entwickeln sich im Rattenmodell die avaskulären Bereiche aufgrund eines unreifen retinalen Gefäßplexus zur Peripherie der Netzhaut (Abbildung 3).

In beiden Modellen sind die Hauptparameter, die normalerweise quantifiziert werden, die Größe von AVA und NV. Diese Parameter werden in der Regel von retinalen flachen Halterungen analysiert, wo die Endothelzellen mit4,16beschriftet sind. Zuvor wurde die Menge an präretinalen NV aus Netzhautquerschnitten durch Zählen von Blutgefäß- oder Gefäßzellkernen, die sich über der inneren grenzenden Membran bis hin zu Glaskörpern ausdehnten, ausgewertet. Die Hauptbeschränkung dieses Ansatzes besteht darin, dass es nicht möglich ist, die AVAs zu quantifizieren.

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Protocol

Das hier beschriebene Protokoll wurde von der Finnischen Tierschutzkommission (Protokollnummer ESAVI/9520/2020 und ESAVI/6421/04.10.07/2017) genehmigt.

1. Versuchstiere und Maus OIR Modell Induktion

HINWEIS: Verwenden Sie zeitgepaarte Tiere, z. B. häufig verwendete C57BL/6J-Mäuse, um Welpen am selben Tag zur Welt zu bringen. Verwenden Sie Pflegedämme, z. B. 129 Stamm (129S1/SvImJ oder 129S3/SvIM) laktierende Dämme, um die Welpen während und nach der Induktion von Hyperoxia zu pflegen. Alternativ können Sie auch sicherstellen, dass zusätzliche laktierende Dämme zur Verfügung stehen, falls die Pflegedämme aufgrund von Erschöpfung ausgetauscht werden müssen. Beschränken Sie die Wurfgröße auf 6-7 Welpen für jeden Damm, wenn C57BL/6J Mäuse/Dams verwendet werden (wenn die Würfe größer sind als die Welpen tendenziell eine eingeschränkte Gewichtszunahme haben)16.

  1. Zeichnen Sie das Gewicht der Tiere vor und nach der Hyperoxia-Induktion und zum Zeitpunkt des Opfers auf.
  2. Stellen Sie sicher, dass es genügend Nahrung auf dem Boden des Käfigs gibt, damit die Dämme einen einfachen Zugang zu Nahrung haben.
  3. Fügen Sie Sodakalk mit Farbanzeige an der Unterseite der Kammer hinzu, um überschüssiges CO2 zu absorbieren, wenn kein Filtersystem verwendet wird.
  4. Überwachen Sie die Luftfeuchtigkeit und Temperatur in der Kammer und halten Sie die Luftfeuchtigkeit zwischen 40 und 65%. Erhöhen Sie die Feuchtigkeit der Kammer, wenn nötig, indem Sie Geschirr mit Wasser auf den Boden der Kammer (z.B. Petrischalen) legen.
  5. Kalibrieren Sie den O2-Sensor mit 100%O2 und normaler Raumluft.
  6. Legen Sie die P7-Mäuse in eine Kammer und richten Sie die O2-Ebene auf 75% ein. Halten Sie die Mäuse in der Kammer für 5 Tage, bis P12. Vermeiden Sie das Öffnen der Kammer während der Hyperoxia-Induktion. Überprüfen Sie den Gasdruck des O2-Zylinders und ersetzen Sie den Zylinder bei Bedarf. Überwachen Sie die Tiere während der Induktion.
  7. Nehmen Sie die Mauskäfige aus der Kammer und wiegen Sie alle Welpen. Gruppieren Sie die Welpen nach dem Gewicht, so dass jede Versuchsgruppe eine ähnliche Gewichtsverteilung in Welpen hat.

2. Versuchstiere und Ratten-OIR-Modellinduktion (mit halbgeschlossenem System)

HINWEIS: Verwenden Sie zeitgebundene Tiere, um die Welpen am selben Tag zur Welt zu bringen. Verwenden Sie für Ratten-OIR eine erhöhte Wurfgröße von ca. 18 Welpen/Damm, um eine ausreichende NV-Induktion im Rattenmodell zu erhalten. Pool Welpen aus mehreren Würfen, um genügend Welpen zu jedem Wurf zu erhalten.

  1. Zeichnen Sie das Gewicht der Tiere vor und nach der Induktion und zum Zeitpunkt des Opfers auf.
  2. Stellen Sie sicher, dass es genügend Nahrung auf dem Boden des Käfigs gibt, damit die Dämme einen einfachen Zugang zu Nahrung haben.
  3. Fügen Sie Sodakalk mit Farbanzeige an der Unterseite der Kammer hinzu, um überschüssiges CO2 zu absorbieren, wenn kein Filtersystem verwendet wird.
  4. Überwachen Sie die Luftfeuchtigkeit und Temperatur in der Kammer. Absorbieren Sie zusätzliche Feuchtigkeit (erzeugt von mehreren Ratten) durch Zugabe von Kieselgel auf der Unterseite der Kammer.
  5. Kalibrieren Sie den O2-Sensor mit 100% N2 und normaler Raumluft.
  6. Legen Sie die Ratten in die Kammer bei P0 (wenige Stunden nach der Geburt). Stellen Sie den O2-Pegel auf 50% ein und schließen Sie den O2-Zylinder für 24 h an die Kammer an. Danach schalten Sie die Einstellungen auf 10% O2 und verbinden Stickstoff (N2) Zylinder mit der Kammer für 24 h. Fahren Sie 14 Tage lang mit dem 24-Stunden-Radverkehr zwischen 50% und 10% O2-Stufen fort.
  7. Überwachen Sie den Gasverbrauch und das Wohlbefinden der Tiere während der Studie. Öffnen Sie die Kammer während des Wechsels zwischen 50/10%O2 und fügen Sie bei Bedarf mehr Nahrung und Wasser hinzu. Ändern Sie die Käfige der Tiere, um sie während der Induktion zu reinigen.
  8. Nehmen Sie die Rattenkäfige aus der Kammer und wiegen Sie alle Welpen. Gruppieren Sie die Welpen nach dem Gewicht, so dass jede versuchsweise Gruppe eine ähnliche Gewichtsverteilung in den Welpen hat.

3. Arzneimittelanwendung (optional)

HINWEIS: Häufig verwendete Arzneimittelverabreichungsroute in OIR erfolgt durch intravitreale Behandlung (ivt), bei P12-P14 für Mäuse und bei P14 für Ratten. Bestimmen Sie den Behandlungstag basierend auf dem Versuchsaufbau. Wenn mehrere Würfe von Welpen in Experimenten verwendet werden, teilen Sie die Behandlungsgruppen, um Tiere von allen Würfen zu haben. Vorzugsweise, injizieren Sie das Medikament auf nur ein Auge, und halten Sie das kontralaterale Auge als Kontrolle.

  1. Wiegen Sie die Tiere und machen Sie Identifikationszeichen an Schwanz und/oder Ohr.
  2. Anästhesieren Sie das Tier entweder mit injizierbarer Anästhesie (z. B. Mischung aus Ketamin und Medetomidin, 30 mg/kg und 0,4 mg/kg für Mäuse) oder mit Inhalationsanästhesie (Isofluran bei 2-3,5% Isofluran und 200-350 ml/min Luftstrom). Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie die Zehen kneifen. Halten Sie das Tier während der Behandlung auf einem Heizkissen.
  3. Für lokalanästhesien, tragen Sie einen Tropfen Schmerzmittel auf das Augenlid. Öffnen Sie das Augenlid vorsichtig mit Zange, bevor Sie die ivt durchführen, wie Mäuse und Ratten öffnen ihre Augen um P14. Tragen Sie einen Tropfen Schmerzmittel (z. B. Oxybuprocainhydrochlorid) auf die Hornhaut auf.
  4. Tragen Sie einen Tropfen Jod auf, bevor Sie die ivt-Injektion durchführen.
  5. Für die ivt-Injektion eine Glasspritze mit einer 33-34 G Nadel verwenden. Drücken Sie die Augenlider nach unten und grasen Sie den Augapfel mit Zangen. Machen Sie die Injektion nachtränk an den Limbus, etwa in 45° Winkelnadel, die auf den Sehnerv zeigt.
  6. Vermeiden Sie es, mehr als 1,0 l in den intravitrealen Raum zu injizieren. Halten Sie die Nadel an Ort und Stelle für 30 s nach der Injektion des Medikaments, um Reflux der injizierten Lösung zu vermeiden.
  7. Untersuchen Sie das Auge (z. B. mit einem Ophthalmoskop) auf Komplikationen wie Blutungen oder Netzhautschäden nach dem Entfernen der Nadel. Nach der Injektion antibiotikaische Salbe auf Hornhaut auftragen.
    HINWEIS: Das ivt-Injektionsvolumen für Mäuse sollte 0,5 – 1,0 l betragen.
  8. Umkehren Sie die Anästhesie (z.B. mit einem 2-Antagonisten für Medetomidin (2,5 mg/kg) und geben Sie den Welpen in den Käfig zurück. Den Müll normalerweise bis zum Ende der Studie unterbringen.

4. In-vivo-Bildgebung und Elektroretinographie (optional)

  1. Auf Wunsch führen Sie während der Nachbeobachtungszeit in vivo-Bildgebung an lebenden Tieren durch, um Veränderungen aufzuzeichnen, die sich in der Netzhaut während der angiogenen Reaktionen entwickeln. Führen Sie beispielsweise fluorescein-Angiographie (FA) oder Scanning-Laser-Konfokalmikroskopie19 durch, um die Vaskulatur zu visualisieren (Abbildung 4). Verwenden Sie die optische Kohärenztomographie (SD-OCT) der Spektraldomäne, um Netzhautschichten in vivo zu visualisieren (Abbildung 4).
  2. Auf Wunsch untersuchen Sie funktionelle Veränderungen in verschiedenen Netzhautzellpopulationen nach der INduktion durch DIE Verwendung der Elektroretinographie (ERG) (Abbildung 5).

5. Gewebesammlung und Vorbereitung von Retinal-Flachhalterungen

HINWEIS: Sammeln Sie das Gewebe gemäß der gewünschten Forschungshypothese. Bei Mäusen die Proben z.B. bei P12 (zur Untersuchung der Vaso-Obliteration nach der hyperoxischen Phase) oder in der hypoxischen Periode (P13-P17) sammeln. Sammeln Sie die Maus-OIR-Samples bei P17, dem häufigsten Zeitpunkt für die Probenahme, um den Peak in NV-Menge zu erkennen. In Ratte OIR, sammeln Sie die Proben bei P18-P21, um die höchste Menge an NV zu beobachten (Abbildung 3).

  1. Wiegen Sie die Tiere vor der Probenahme.
  2. Um die Netzhautvaskulatur zu kennzeichnen, können tief anästhesierte Tiere mit FITC-Dextran transkardial durchlässig werden. (Alternativ färben Sie die Retinal flach mit Isolectin später).
  3. Opfern Sie die Tiere entweder mit einer Überdosierung von Anästhesiemedikamenten (z. B. Mischung aus Ketamin und Medetomidin, 300 mg/kg und 4 mg/kg für Mäuse) oder CO2-Inhalation.
  4. Sammeln Sie die Augen der Tiere, indem Sie hinter dem Augapfel mit gekrümmten Zangen greifen, schneiden Sie das Gewebe um die Augen und heben Sie das Auge aus der Umlaufbahn.
  5. Inkubieren Sie die Augäpfel in frisch gemachtem, gefiltertem 4% Paraformaldehyd (in phosphatgepufferter Saline, PBS) für 1-4 h. Entfernen Sie die Fixierung und waschen Sie die Augäpfel 3 x 10 min mit PBS. Sezieren Sie die Netzhaut sofort oder lagern Sie sie in PBS bei +4 °C.
    VORSICHT: Paraformaldehyd ist durch Einatmen, Hautkontakt und Verschlucken giftig. Bitte lesen Sie das Sicherheitsdatenblatt, bevor Sie damit arbeiten.
    HINWEIS: Nehmen Sie während der Probenahme oder einer Phase der Gewebeverarbeitung keinen Druck auf den Augapfel auf, um eine Netzhautablösung zu vermeiden, wenn Querschnitte von ganzen Augäpfeln durchgeführt werden.
  6. Bereiten Sie retinale flache Halterungen vor, um die Menge an NV und die Größe von AVAs zu quantifizieren. Alternativ können Sie die Augäpfel/Retinas für die Histologie oder RNA- oder Proteinanalyse verarbeiten. Sezieren Sie die Netzhaut unter einem Stereomikroskop mit Mikroschere und Zange.
    1. Legen Sie den Augapfel in PBS, um ihn feucht zu halten und den Augapfel am Limbus mit einer Nadel (23G) zu durchstechen und mit einer gekrümmten Mikroschere um den Limbus zu schneiden, um Iris und die Hornhaut zu entfernen.
    2. Legen Sie die Spitze der Schere vorsichtig zwischen Sklera und Netzhaut und schneiden Sie Sklera in Richtung des Sehnervs. Tun Sie das gleiche auf der anderen Seite des Augapfels, und schneiden/reißen Sie die Sklera sorgfältig, bis der Netzhautbecher ausgesetzt ist. Ziehen Sie die Linse aus der Netzhautschale und fügen Sie PBS in die Tasse.
    3. Entfernen Sie alle Hyaloidgefäße, Glaskörper und Schmutz, ohne die Netzhaut zu beschädigen. Waschen Sie die Netzhaut, indem Sie PBS in die Netzhauttasse einfügen. Führen Sie vier Einschnitte (bei 12, 3, 6 und 9 Uhr) zur Netzhaut mit gerader Mikroschere aus, um eine blütenähnliche Struktur zu bilden. Optional können Sie die Schnitte mit chirurgischer Klinge vor der Montage der Proben vornehmen. Heben Sie die Netzhaut mit einem weichen Pinsel auf eine well-Platte für die Färbung.
  7. Beschriften Sie die Netzhautvaskulatur mit Isolectin B4, das die Oberfläche von Endothelzellen färbt (wenn die Tiere nicht mit FITC-Dextran durchdrungen waren). Inkubieren Sie die Netzhaut im Blockierpuffer (10% NGS + 0,5% Triton in TBS) für 1 h und waschen Sie mit 1% NGS + 0,1% Triton in TBS für 10 min. Inkubieren Sie die Netzhaut mit fluoreszierendem Farbstoff konjugiertes Isolectin B4 (5-10g/ml) in 1% NGS + 0,1% Triton in TBS über Nacht bei +4 °C, während sie vor dem Licht geschützt sind.
    HINWEIS: Beschriften Sie auf Wunsch andere Zellen wie Entzündungszellen und Pericyten mit spezifischen Antikörpern.
  8. Waschen Sie die Netzhaut 3x für 10 min mit 1% NGS + 0,1% Triton in TBS und heben Netzhaut auf einem mikroskopischen Schiebeschlitten, innere Netzhaut nach oben gerichtet. Verteilen Sie die Netzhaut vorsichtig mit weichem Pinsel und entfernen Sie alle verbleibenden Hyaloidgefäße oder Schmutz. Fügen Sie das Montagemedium zu einem Decksschlupf hinzu und legen Sie es auf die Netzhaut. Netzhaut bei +4 °C lagern und vor Licht schützen.

6. Analyse der Flachhalterungen

  1. Nehmen Sie Bilder der retinalen flachen Halterungen mit einem Fluoreszenzmikroskop mit 10-fachem Objektiv auf. Fokus simpere sich auf den oberflächlichen Gefäßplexus und die präretinale Neovaskularisation. Erstellen Sie ein Kachelscanbild, um die gesamte Netzhaut zu erfassen und die Kachelscans zusammenzuführen
  2. Quantifizieren Sie die Bilder, indem Sie die AVAs, den NV-Bereich und den gesamten Netzhautbereich mit einem Bildverarbeitungsprogramm messen (siehe Tabelle der Materialien).
    1. Zeichnen Sie die AVAs und den gesamten Netzhautbereich mit einem Freihand-Zeichnungswerkzeug und wählen Sie die neovaskulären Bereiche mit einem Auswahlwerkzeug aus. Die Software misst die Bereiche, die für Pixel von Interesse sind, und die AVA- und NV-Bereiche (ausgedrückt in Pixel) können verwendet werden, um ihren Prozentsatz im Verhältnis zur gesamten Netzhautfläche zu berechnen. Außerdem stehen einige Software-Tools zur Quantifizierung von NV zur Verfügung.
      HINWEIS: Kürzlich wurden ein Open-Source-Programm zur Quantifizierung von Schlüsselwerten von OIR-Bildern mit Deep Learning-Neuralnetzen eingeführt und bieten ein zuverlässiges Werkzeug für die reproduzierbare Quantifizierung von retinaler AVA und NV (z. B. https://github.com/uw-biomedical-ml/oir/tree/bf75f9346064f1425b8b9408ab792b1531a86c64)20,21.
  3. Wenn Sie Antikörper für den immunhistochemischen Nachweis einzelner Zellpopulationen verwenden, quantifizieren Sie die Anzahl der gefärbten Zellen (wie Mikroglia, Abbildung 2B) von den retinalen Flachhalterungen von Hand oder auf Wunsch durch automatisierte Bildanalysesysteme.

7. Statistik

  1. Analysieren Sie normal verteilte Daten nach Student es t Test oder One-Way ANOVA, je nach Dunnetts oder Tukeys Mehrfachvergleichstest. Verwenden Sie nichtparametrische Tests wie Mann-Whitney U-Test oder Kruskal Wallis-Test für nicht normal verteilte Daten. Berücksichtigen Sie die statistisch signifikanten Unterschiede auf der Ebene P < 0,05.

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Representative Results

Das Hauptergebnis des Modells ist der vaskuläre Phänotyp: die Größe der AVAs und die Menge an NV. Im Maus-OIR-Modell tritt die Vaso-Obliteration in der zentralen Netzhaut auf (Abbildung 2A), während sie sich im Rattenmodell in der Peripherie entwickelt, d.h. ähnlich wie der menschliche ROP22 (Abbildung 3A). Dies liegt daran, dass sich der oberflächliche Gefäßplexus bereits entwickelt hat, wenn Mäuse Hyperoxie ausgesetzt sind, während im Rattenmodell die Netzhaut zum Zeitpunkt der OIR-Induktion (P0) avaskulär ist. Die präretinale Neovaskularisation entwickelt sich in der Nähe der avaskulären Bereiche, d.h. der zentralen Netzhaut bei der Maus, und der Peripherie bei Ratten (Abbildung 2A und Abbildung 3A).

Histologische Analysen mit Querschnitten oder flachen Halterungen können durchgeführt werden, um morphologische Veränderungen in oir Netzhaut oder das Vorhandensein von Zellarten von Interesse, z. B. Entzündungszellen (Abbildung 2B). Neben der Netzhaut können während des OIR-Modells ganze Augen- oder Glaskörperproben für weitere Gen- und Proteinexpressionsanalysen in unterschiedlichen Zeitpunkten gesammelt werden. Gen- oder Proteinexpressionsniveaus können mit Standardmethoden wie RT-qPCR oder Western Blotting analysiert werden.

Optional kann während der OIR-Nachbeobachtungszeit nicht-invasive In-vivo-Bildgebung durchgeführt werden. Netzhaut- und Hyaloidvaskulatur kann mit FA visualisiert werden (Abbildung 4A). SD-OCT kann verwendet werden, um strukturelle Veränderungen in der Netzhaut zu bewerten (Abbildung 4B). Funktionelle Veränderungen der Netzhaut können mit ERG gemessen werden (Abbildung 5).

Inhibitoren des vaskulären endotheliaalen Wachstumsfaktors (VEGF) werden häufig bei der Behandlung von angiogenen Augenerkrankungen beim Menschen eingesetzt. Daher wird Anti-VEGF häufig als Referenzverbindung in OIR verwendet. Aflibercept, das als lösliche VEGF-Falle wirkt, hemmt sowohl NV als auch physiologische Revaskularisation bei OIR in hohen und niedrigen Dosen (injiziert bei P14). OIR Augen inJiziert bei P14 mit hoher Dosis von Aflibercept hatte noch größere retinale AVAs als unbehandelte Augen(Abbildung 6). Dies deutet darauf hin, dass Aflibercept blockiert auch physiologische netzretinale Revaskularisation durch Hypoxie angetrieben. Sowohl Maus- als auch Rattenmodelle können verwendet werden, um die Wirkung verschiedener antiangiogener Wirkstoffe auf die netzretinale NV und die physiologische Revaskularisation der Netzhaut zu bewerten (Abbildung 3B und Abbildung 6).

Figure 1
Abbildung 1: Grafische Übersicht eines Standard-Oir-Studiendesigns für Mäuse und Ratten. (A) Das Maus-OIR-Modell wurde induziert, indem die Mäuse 75%O2 von P7 bis P12 aussetzten und in normale Raumluft zurückgeführt wurden. Der Höhepunkt der präretinalen NV wurde bei P17 gesehen, das normalerweise die Probenahmestelle für das Experiment ist. (B) Das Ratten-OIR-Modell wurde durch die Exposition der Ratten auf abwechselndeO2-Spiegel (50/10 % O2) von P0 bis P14 induziert und kehrte zu normoxischen Bedingungen zurück. Ratten werden in der Regel bei P20 geopfert, wenn die Menge an NV ihren Höhepunkt erreichte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Vaskulärer Phänotyp im OIR-Modell der Maus. Maus OIR-Modell wurde generiert, wie in Abbildung 1 beschrieben. (A) Der oberflächliche Gefäßplexus entwickelte sich bei normalen Mäusen, während die OIR-Mäuse 75%O2 von P7 bis P12 ausgesetzt waren. Während dieser Zeit entwickelte sich die vaskuläre Auslöschung in der zentralen Netzhaut (in den quantifizierten Bildern blau markiert bei P12 und P17). Mäuse wurden in die normale Raumluft zurückgebracht, und die avaskuläre Netzhaut wurde hypoxisch, was zu einem funktionellen Gefäßwachstum in der Netzhaut und pathologischen NV führte (rot bei P17 im unteren Bereich markiert). Präretinale neovaskuläre Büschel entwickelten sich zwischen den vaskulären und avaskulären Bereichen in der zentralen Netzhaut. Die NV-Menge erreichte ihren Höhepunkt bei P17 und ging danach zurück. Die Netzhaut wurde vollständig revaskularisiert und die NV um P24-P25 zurück. (B) Ein Beispiel für die immunhistochemische Färbung von retinalen flachen Halterungzeigten, die retinale Iba-1-gefärbte Mikroglia (grün) und GS-IB4-gefärbte Blutgefäße (rot) an P12 und P17 zeigen. (C) Querschnitt eines Maus-OIR-Auges bei P17, wo präretinale Büschel (Pfeile) in Richtung des Glaskörpers sprießen. Außerdem wurde eine Ausdünnung der inneren Kernschicht (INL) und der äußeren Plexiformschicht (OPL) beobachtet. Die Skalenstäbe sind 1 mm in A, 50 m in B und 100 m in C. ILM = innere Grenzmembran, GCL = Ganglienzellschicht, IPL = innere Plexiformschicht, INL = innere Kernschicht, OPL = äußere Plexiformschicht, ONL = äußere Kernschicht, RPE = retinale Pigmentepithel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Vaskulärer Phänotyp und seine Entwicklung im OIR-Modell der Ratte. (A) Avaskuläre Bereiche (blau markiert) und NV (rot markiert) entwickelten sich in der Peripherie der Netzhaut, ähnlich wie beim menschlichen ROP. (B) AVAs wurden in OIR-Retinas gesehen, aber nicht in normoxischen Kontrollen. (C) Die Quantifizierung der NV-Fläche zeigte einen Trend zu einem Spitzenwert in der NV-Menge bei P20, aber der Unterschied war statistisch nicht signifikant im Vergleich zu P18 und P21 in OIR. (Schüler-t-Test, zwischen der Zeit abgestimmt normoxische und OIR Netzhaut, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001, beide Augen der Tiere in der Grafik geplottet). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: In-vivo-Bildgebung mittels Fluorescein-Angiographie (FA) und spektraler Domänen-Optische Kohärenztomographie (SD-OCT) im RATTEN-OIR-Modell. (A) Vaskuläre Tortuosität (Pfeilspitzen) wurde in den Bildern von der zentralen Netzhaut (obere Reihe) bei P18 und P20 bei OIR-Ratten im Vergleich zu normoxischen P19-Ratten gesehen. NV (Pfeile) und AVAs (Sternchen) entwickelten sich zur Peripherie der Netzhaut (mittlere Reihe), wie in P18 und P20 OIR Netzhaut gesehen. Regressierende Hyaloidgefäße (untere Reihe) wurden von FA erfasst. (B) Das Blutgefäßwachstum in Richtung des Glaskörpers wurde als Verdickung der Nervenfaserschicht (NFL) und Ganglienzellschicht (GCL) in den OIR-Retinas (Pfeil) beobachtet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Die Funktionalität von Netzhautneuronen kann mit Hilfe der Flash-Elektroretinographie (fERG) gemessen werden. (A) a-Wellen wurden von Netzhautkegel- und Stabphotorezeptoren abgeleitet und ihre Amplituden wurden im RATTEN-OIR-Modell signifikant verringert. Der Effekt nahm mit einer höheren Lichtintensität zu, was darauf hindeutet, dass die Defekte in erster Linie kegel-photoreceptor Funktionen beeinflussten. (B) B-Wellenamplituden von OIR-Tieren wurden im Vergleich zu normoxischen Kontrollen verringert. B-Wellen wurden von ON-bipolaren Zellen und Müller-Zellen abgeleitet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Intravitreally injizierte PBS reduziert NV und AVAs im Oir-Modell der Maus. (A) Repräsentative Bilder von retinalen Flachhalterungen von unbehandelten und mit Aflibercept behandelten (20 g bei P14) und PBS injizierten OIR-Augen bei P17. Die hohe Dosis von Aflibercept (20 g) erhöhte die Größe der AVAs um 47 % (weiß umrissen) und hemmte Die NV um 98 % (Pfeile) im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen. Die PBS-Injektion verringerte die AVAs um 31 % und die NV um 42 % im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen. Auch die Punktion der Sklera ähnlich ivt erzeugte ähnliche Effekte wie die ivt-Injektion von PBS, aber die Unterschiede waren statistisch nicht signifikant. Pfeilspitze zeigt auf Hyaloidgefäße, die während der Zerlegung nicht entfernt wurden. (One-Way ANOVA, * p ≤ 0,05; ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001, **** p ≤ 0,0001). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Die Schwere des Krankheitsphänotyps hängt sowohl vom Stamm als auch vom Anbieter sowohl in den MOper- als auch in der Muhr der OIR-Modelle23ab. Dies deutet darauf hin, dass es eine breite genotypische Variabilität in der Pathologieentwicklung gibt. Im Allgemeinen entwickeln pigmentierte Nagetiere einen schwereren Phänotyp als die Albino-Nagetiere. Zum Beispiel, die netzhautvaskulatur von albino BALB/c revaskularisiert schnell nach Hyperoxien und entwickelt nV überhaupt nicht24. In ähnlicher Weise zeigen bei Ratten pigmentierte Braun-Norwegen-Ratten eine schwerere Pathologie als Albino Sprague Dawley (SD) Ratten25. SD-Ratten sind häufig verwendete Stamm, und Anbieter-bezogene Unterschiede im OIR-Phänotyp wurden innerhalb des Stammes berichtet. Zum Beispiel produzieren SD-Ratten aus Charles River deutlich mehr NV als Ratten aus Harlan oder Zivic-Miller23. C3H/HeJ-Mäuse wiederum, die eine Mutation im Netzhautdegeneration-Gen 1 (Rd1) haben, dünne Netzhaut haben und nV26nicht entwickeln. Aus diesen Gründen und der Verfügbarkeit transgener Mäuselinien ist der inzuchtierte C57BL/6J der am häufigsten verwendete Mausstamm für OIR-Studien. Allerdings gibt es eine ziemlich hohe Sterblichkeit unter den C57BL/6J-Staudämmen aufgrund der hyperoxischen Exposition, so dass das Wohlbefinden der Mäuse bei der Gestaltung der Studie berücksichtigt und während der Experimente überwacht werden muss. Darüber hinaus ist eine erhöhte Photorezeptorschädigung bei C57BL/6-Mäusen im Vergleich zu BALB/c-Mäusen27zu beobachten.

Um das Wohlbefinden der Mäuse und das Überleben der Muttertiere und Welpen zu gewährleisten, sollte die Wurfgröße klein gehalten werden (6-7 Welpen/Damm). Dies ist besonders wichtig bei der Verwendung von C57BL/6-Mäusen, die anfälliger für hyperoxischen Stress27,28sind. Darüber hinaus sollten den Mäusen leicht zugängliche Stützfutter (auf der Unterseite des Käfigs) zur Verfügung gestellt werden. Einige Forscher verwenden Ersatzdämme, um die Dämme in der Kammer nach der Sauerstoffinduktion durch gesunde zu ersetzen. Die meisten Forscher verwenden jedoch Surrogate nur, wenn der Damm erschöpft ist22,29. Es wird empfohlen, Ersatzdämme zu verwenden, wenn größere Abfallgrößen verwendet werden. Es wurde veröffentlicht, dass 129S3/SvIM-Mäuse mehr NV produzieren als C57BL/6 und die Veränderungen, die durch unterschiedliche Sauerstoffgehalte verursacht werden, besser erhalten28. Es sei darauf hingewiesen, dass die in OIR verwendeten Dämme nach der OIR-Induktion unfruchtbar sind und nicht für weitere Zuchtzwecke verwendet werden sollten22. Postnatale Gewichtszunahme der Welpen wirkt sich auf die Schwere der OIR-Pathologie aus. Welpen mit schlechter postnataler Gewichtszunahme (<5 g bei P17) zeigen eine verzögerte Expression von VEGF und damit eine verlängerte Phase der Retinopathie im Vergleich zu Welpen mit normaler (5 - 7,5 g bei P17) oder einer umfangreichen Gewichtszunahme (>7,5 g bei P17)29. Darüber hinaus zeigen Mäusewelpen mit einem Gewicht von über 5 g bei P7 nach der OIR-Induktion30keine vaso-ausgelöschten Bereiche. Daher ist es wichtig, die Welpen während des Experiments zu wiegen. Das kontralaterale unbehandelte Auge kann als interne Kontrolle verwendet werden, um sicherzustellen, dass der Ernährungszustand der Mäuse die Ergebnisse nicht beeinflusst. Ähnlich verhält es sich bei Ratten; Je kleiner die Welpen sind, desto schwerer entwickeln sie den OIR-Phänotyp31. Daher wird eine große Wurfgröße (ca. 18 Welpen) für das Ratten-OIR-Modell empfohlen.

Die INduktion des OIR-Modells kann entweder mit einem vollständig geschlossenen System erfolgen, bei dem es einen geschlossenen Kreislauf mit einer Pumpe gibt, der die Luft durch ein Filtersystem (Sodakalk und Aktivkohle) zurück in die Kammer zirkuliert. Eine weitere Möglichkeit ist ein halbgeschlossenes System, bei dem die Belüftung dafür sorgt, dass die überschüssigen Metaboliten aus der Kammer entfernt werden. Um sicherzustellen, dass überschüssigesCO2 entfernt wird, kann Sodakalk (Mischung aus Calciumhydroxid mit Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid) auf den Boden der Kammer gelegt werden. Die Entfernung vonCO2 ist obligatorisch, da die hohenCO2-Werte den Krankheitsphänotyp bei Ratten verschlechtern32. Man sollte auch daran denken, den Sauerstoffsensor der Kammer regelmäßig neu zu kalibrieren, da sie dazu neigen, im Laufe der Zeit zu driften und eine falsche Sauerstoffkonzentration von der beabsichtigten liefern können.

Es wurde berichtet, dass die Fahrzeuginjektion (PBS) allein oder auch nur die Punktion in den intravitrealen Raum einen Effekt für die Revaskularisationsrate und die Menge an NV hat (Abbildung 6)33,34,35,36. Es wurde spekuliert, ob der Effekt bei der PBS/Fahrzeuginjektion auf Veränderungen des Augeninnendrucks während der Injektion oder auf eine Verletzung der Augenstrukturen zurückzuführen sein könnte, die das Niveau der angiogenen Wachstumsfaktoren unter ihnen den Pigmentepithel-abgeleiteten Wachstumsfaktor34,37erhöht. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass nur eine subretinale Pilotinjektion (Punktion in den subretinalen Raum) im Vergleich zu den unbehandelten Ratten38Auswirkungen auf den vaskulären und funktionellen Phänotyp bei OIR hat. Diese Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung geeigneter Negativkontrollen in den OIR-Studien oder sogar der systemischen Verabreichung getesteter Verbindungen sowie ausreichend n-Zahlen in jeder Studiengruppe. Die Tatsache, dass die Fahrzeuginjektion tatsächlich die Revaskularisationsrate in der Netzhaut erhöht, ist ein wichtiger begrenzender Faktor, da die Revaskularisierungsrate und die Bildung pathologischer präretinaler Büschel im OIR-Modell miteinander verknüpft sind: Wenn die Revaskularisationsrate beschleunigt wird, führt sie zu einer kompensatorischen Downregulation von neovaskulären Büscheln und umgekehrt. Somit sind beide primären Ergebnismaßnahmen des OIR-Modells von der Fahrzeuginjektion betroffen.

VEGF-Inhibitoren haben die Behandlung AMD und DR revolutioniert. OIR-Modell wurde verwendet, um ihre Wirksamkeit präklinisch zu demonstrieren. In Bezug auf VEGF-Inhibitoren in OIR zeigte eine Studie zum Vergleich verschiedener Anti-VEGFs und Anti-PlGFs (Plazentawachstumsfaktor) (injiziert bei P12), dass Anti-VEGF allein zu kleinen avaskulären Bereichen führte, während Anti-PIGF-behandelte Augen größere avaskuläre Bereichehatten 33. Aflibercept hatte die größten AVAs im Vergleich zu anderen medikamentösen Behandlungen33. Aflibercept ist dafür bekannt, sowohl VEGF als auch PlGF39zu binden, es könnte sein, dass die Hemmung von PlGF in OIR zur Blockierung der physiologischen Angiogenese führt.

Die nichtinvasive In-vivo-Bildgebung bietet ein Werkzeug zur Überwachung der Netzhautvaskulatur40 und der Netzhautschichten und -struktur während der Nachbeobachtungszeit. Mit FA können Parameter wie Gefäßdichte und arterielle Tortuosität und venöse Dilatation (genannt Plus-Krankheit, Abbildung 4A)gemessen werden40,41. SD-OCT kann zur Bewertung von Strukturveränderungen und zur Messung der Netzhautdicke während der OIR-Nachbeobachtungszeit42,43verwendet werden. ERG wird verwendet, um die funktionellen Veränderungen in der Netzhaut zu messen. Verschiedene Zelltypen erzeugen elektrische Potenziale nach Lichtreiz, und diese Signale oder "Wellen" können mit ERG gemessen werden. Photorezeptoren produzieren die negative a-Welle, und ON-bipolare Zellen und Müller-Zellen sind hauptsächlich für die B-Welle44verantwortlich. Der Verlust der Netzhautfunktion ist typisch bei OIR-Mäusen und Ratten45,46 (Abbildung 5). Langanhaltende Veränderungen bestehen in der Netzhaut fort und sowohl funktionelle Veränderungen als auch Veränderungen des Proteinspiegels wurden in oir-Retinas auch nach Revaskularisation und NV-Regression34,47berichtet.

Um die Netzhautvaskulatur zu visualisieren, können die lebenden Mäuse entweder mit FITC-markiertem Dextran durchdrungen werden oder die retinalen flachen Halterungen können mit Fluoreszenzfarbstoff mit der Bezeichnung Isolectin B4gefärbt werden. Man muss den Unterschied zwischen den fluoreszierenden Farbstoffen verstehen; die Perfusion mit FITC-dextrans beschriftet nur das Lumen der Gefäße, während Isolectin B4 die Oberfläche von Endothelzellen färbt. So werden funktionelle Blutgefäße mit richtigem Lumen nur mit FITC-Dextran-Perfusion visualisiert, während die Gesamtfläche von NV in Isolectin B4 gebeizten Netzhaut größer erscheint als bei FITC-dextran perfundierten Tieren, da Isolectin B4 im Wesentlichen sogar Endothelzellen aufnimmt, die noch keine funktionellen Lumen gebildet haben48. Eine neuere Option zur Visualisierung ganzer Netzhaut/Augenkugel im 3D-Format ist die Tiefengewebe-Bildgebung mittels zweiphotoner Fluoreszenzmikroskopie(49).

Das Nagetier-OIR-Modell sowie die Tiermodelle im Allgemeinen stellen die Merkmale menschlicher Krankheiten nur teilweise dar. Der Hauptunterschied zu OIR ist, dass retinale Neovaskularisation nicht mit Fibrose bei Nagetieren OIR verbunden ist, während retinale Neovaskularisation häufig zu fibrovaskulären Proliferation bei menschlichen neovaskulären Netzhauterkrankungen führt. Darüber hinaus können die Bedingungen, die OIR vs. menschliche Krankheiten verursachen, fast gegensätzlich sein. Die Frühzeit-Neonate mit ROP erfordern zusätzlichen Sauerstoff mit Atemunterstützung, Erfahrung häufig intermittierenden hypoxemischen und hyperoxämischen Episoden durch wiederkehrende Apnoe verursacht, aber sie sind nicht auf hohem Sauerstoffgehalt ausgesetzt. Um den dauerhaften Schaden zu minimieren, werden hohe Fraktionen von inspiriertemO2 vermieden. In dieser Hinsicht ähneln weder das Mausmodell mit konstanter Exposition gegenüber 75% O2 für 5 Tage noch das 50/10 Rattenmodell einer Pathogenese des menschlichen ROP. Darüber hinaus gibt es auch Unterschiede zwischen der Ratte und der Maus OIR-Modelle. Die Neovaskularisation regressiert sich im Mausmodell mit der Wiederherstellung normaler Gefäße durch P24, während sich der Zustand im RATTEN-OIR-Modell (ähnlich dem menschlichen ROP) verschlechtert. Obwohl das RATTEN-OIR-Modell klinisch relevante Merkmale von ROP wie die verzögerte retinale Gefäßentwicklung und die anschließende pathologische Neovaskularisation aufweist, ist seine Anwendung durch fast vollständiges Fehlen transgener Rattenstämme, höhere Wartungskosten und weniger NV als im Maus-OIR-Modell begrenzt.

Zusammengenommen, trotz der Unterschiede zwischen humanen ischämischen proliferativen Retinopathien und Nagetier-OIR-Modellen, macht die Leichtigkeit, durch die die NV induziert werden kann, gepaart mit einer einfachen Visualisierung und Quantifizierung der Netzhaut, die OIR-Modelle beliebt, um die molekularen Mechanismen und potenziellen Therapeutika für ischämische proliferative Retinopathien zu untersuchen. Interessanterweise induziert die Hyperoxia-Exposition im Oir-Modell der Maus auch bronchopulmonale Dysplasie, eine weitere Krankheit, die durch zusätzliche Sauerstofftherapie bei menschlichen Frühgeborenen verursacht wird, was zeigt, dass das OIR-Modell verwendet werden könnte, um neue Ziele für ROP und bronchopulmonale Dysplasie gleichzeitig zu erforschen50.

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Disclosures

Die Autoren Maria Vähätupa, PhD, Niina Jääskeläinen, Marc Cerrada-Gimenez, PhD, und Rubina Thapa sind Mitarbeiter der Experimentica Ltd.

Der Autor Giedrius Kalesnykas, PhD, ist Mitarbeiter (Präsident und Chief Executive Officer) und Aktionär der Experimentica Ltd., die Vertragsforschungsdienstleistungen mit präklinischen OIR-Modellen anbietet, die in diesem Artikel verwendet werden.

Tero Järvinen, M.D., PhD, und Hannele Uusitalo-Järvinen, M.D., PhD, haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Wir danken Marianne Karlsberg, Anne Mari Haapaniemi, Päivi Partanen und Anne Kankkunen für die hervorragende technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von der Akademie Finnlands, der Päivikki and Sakari Sohlberg Foundation, der Tampere Tuberculosis Foundation, der Finnischen Medizinischen Stiftung, der Pirkanmaa Hospital District Research Foundation und dem Tampere University Hospital Research Fund finanziert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
33 gauge, Small Hub RN Needle Hamilton Company 7803-05, 10mm, 25°, PS4 For intravitreal injection
Adobe Photoshop Adobe Inc. For image analysis
Air pump air100 Eheim GmbH & Co. KG. 143207 For inhalation anaesthesia
Anaesthesia unit 410 AP Univentor Ltd. 2360309 For inhalation anaesthesia
AnalaR NORMAPUR Soda lime VWR International Ltd 22666.362 For CO2 control during model induction
Attane Vet 1000 mg/g VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY vnr 17 05 79 For inhalation anaesthesia
Brush For preparation of flat mounts
Carbon dioxide gas For sacrifice
Celeris D430 ERG system Diagnosys LLC 121 For in vivo ERG
Cell culture dishes Greiner Bio-One International GmbH 664 160 For preparation of flat mounts
Cepetor Vet 1 mg/mL VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY vnr 08 78 96 For anaesthesia
Cover slips Thermo Fisher Scientific 15165452 For preparation of flat mounts
O2 Controlled InVivo Cabinet, Aninal Filtrarion System and Dehumidifier Coy Laboratory Products Closed system for disease model induction, optional for semi-closed system
E702 O2 sensor BioSphenix, Ltd. E207, 1801901 For oxygen level measurement
Envisu R2200 Spectral Domain Optical Coherence Tomograph (SD-OCT) Bioptigen, Inc. BPN000668 For in vivo imaging
Eye spears Beaver-Visitec International, Inc. 0008685 For intravitreal injection and in vivo imaging
Flexilux 600LL Cold light source Mikron 11140 For intravitreal injection or tissue collection
Fluorescein sodium salt Merck KGaA F6377-100G For in vivo imaging
Gas Exhaust unit (+Double 3-way valve, mouse and rat face masks, UNOsorb filter) UNO Roestvaststaal BV GEX 17015249 For inhalation anaesthesia
Glass syringe, Model 65 RN Hamilton Company 7633-01 For intravitreal injection
HRA2 Retina angiograph (FA) Heidelberg Engineering GmbH Spec-KT-05488 For in vivo imaging
Isolectin GS-IB4, Alexa Fluor 488 Conjugate Thermo Fisher Scientific I21411 For labeling retinal vasculature on flat mounts
Ketaminol Vet 50 mg/mL Intervet International B.V. vnr 51 14 85 For anaesthesia
Medicinal Oxygen gas For disease model induction
Mice C57BL/6JRj Janvier Labs Also other strains possible
Microscope slides Thermo Fisher Scientific J1800AMNZ For preparation of flat mounts
Minims Povidone Iodine 5% (unit) Bausch & Lomb U.K Limited vnr 24 11 304 For intravitreal injection
Nitrogen gas For disease model induction (rat)
Oftan Chlora 10 mg/g Santen Pharmaceutical Co., Ltd. vnr 55 01 11 For intravitreal injection
Oftan Metaoksedrin 100 mg/ml Santen Pharmaceutical Co., Ltd. vnr 55 03 43 For in vivo ERG
Oftan Obucain 4 mg/ml Santen Pharmaceutical Co., Ltd. vnr 55 03 50 For intravitreal injection
Oftan Tropicamid 5 mg/ml Santen Pharmaceutical Co., Ltd. vnr 04 12 36 For in vivo imaging
ProOx Model 110 O2 controller and animal chamber BioSphenix, Ltd. 803 For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system
ProOx Model P360 O2 controller and animal chamber BioSphenix, Ltd. 538 For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system
Rats CD(SD) Charles River Laboratories Also other strains possible
Revertor 5 mg/mL VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY vnr 13 04 97 For anaesthesia reversal
Silica gel For humidity control during model induction
Systane Ultra 10ml Alcon Tamro 2050250 For hydration of the eye
Systane Ultra unit 0.7ml Alcon Tamro 2064871 For hydration of the eye
Transfer pipette Thermo Fisher Scientific 1343-9108 For preparation of flat mounts
VENTI-Line VL 180 PRIME Drying oven VWR VL180S 170301 For drying silica gel
VisiScope SZT350 Stereomicroscope VWR 481067 For intravitreal injection or tissue collection

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