Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

מודל רטינופתיה הנגרמת על ידי חמצן למחלות רשתית איסכמיות במכרסמים

Published: September 16, 2020 doi: 10.3791/61482
Automatic Translation
1,2, 2, 2, 2, 1, 2, 1,3
1Faculty of Medicine and Health Technology, Tampere University & Tampere University Hospital, 2Experimentica Ltd, 3Eye Centre, Tampere University Hospital

Summary

רטינופתיה הנגרמת על ידי חמצן (OIR) יכולה לשמש למודל מחלות רשתית איסכמיות כגון רטינופתיה של פגות ורטינופתיה סוכרתית מתפשטת ולשמש כמודל למחקרים הוכחת הרעיון בהערכת תרופות אנטי אנגיוגניות למחלות ניאו-שריריות. OIR גורם neovascularization חזק לשחזור ברשתית שניתן לכמת.

Abstract

אחד המודלים הנפוצים עבור רטינופתיות איסכמיות הוא מודל רטינופתיה הנגרמת על ידי חמצן (OIR). כאן אנו מתארים פרוטוקולים מפורטים עבור אינדוקציה מודל OIR ואת הקריאות שלה הן עכברים וחולדות. neovascularization הרשתית הוא המושרה OIR על ידי חשיפת גורי מכרסמים או hyperoxia (עכברים) או לסירוגין רמות של hyperoxia והיפוקסיה (חולדות). הקריאות העיקריות של מודלים אלה הן בגודל של אזורים ניאו-וסקולריים (NV) ו- AVA (AVA) ברשתית. מודל זה preclinical in vivo יכול לשמש כדי להעריך את היעילות של תרופות אנטי אנגיוגניות פוטנציאליות או כדי לטפל בתפקיד של גנים ספציפיים אנגיוגנזה ברשתית באמצעות בעלי חיים מניפולציה גנטית. המודל יש כמה זן וריאציה ספציפית ספק אינדוקציה OIR אשר יש לקחת בחשבון בעת תכנון הניסויים.

Introduction

מודלים ניסיוניים אמינים ומשוחזרים נדרשים כדי לחקור את הפתולוגיה שמאחורי מחלות עיניים אנגיוגניות ולפתח טיפולים חדשניים למחלות הרסניות אלה. אנגיוגנזה פתולוגית היא סימן ההיכר לניוון מקולרי רטוב הקשור לגיל (AMD) ועבור מחלות רשתית איסכמיות רבות ביניהן רטינופתיה של פגות (ROP), רטינופתיה סוכרתית מתפשטת (PDR) וחסימה של ורידים ברשתית (RVO)1,2,3,4. רשתית אנושית ומכרסמים בצע דפוס דומה של התפתחות, כמו רשתית הן אנושי מכרסמים הם בין הרקמות האחרונות כי הם vascularized. לפני כלי הדם ברשתית התפתחה לחלוטין, הרשתית מקבלת את אספקת התזונה שלה מן כלי הדם לשון, אשר, בתורו, רגרסיה כאשר כלי הדם ברשתית מתחיל לפתח1,2. אצל בני אדם, התפתחות כלי הדם ברשתית הושלמה לפני הלידה, ואילו מכרסמים הצמיחה של כלי הדם ברשתית מתרחשת לאחר הלידה. מאז התפתחות כלי הדם ברשתית מתרחשת לאחר הלידה מכרסמים, הוא מספק מערכת מודל אידיאלי ללמוד את אנגיוגנזה2,3. מכרסמים שזה עתה נולד יש רשתית כלי הדם המתפתחת בהדרגה עד פיתוח רשתית כלי הדם המלא מושגת עד סוף השבוע השלישי לאחר הלידה4. כלי הדם הגדלים של עכבר יילודים הם פלסטיק, והם עוברים רגרסיה במהלך גירוי hyperoxia5.

ROP היא הגורם המוביל לעיוורון בילדות במדינות המערב, שכן היא משפיעה על כמעט 70% מהפגים עם משקל לידה מתחת לגיל 1,250גרם 6,7. ROP מתרחשת אצל פגים שנולדים לפני כלי הרשתית להשלים את הצמיחה הרגילה שלהם. ROP מתקדמת בשני שלבים: בשלב I, לידה מוקדמת מעכבת את צמיחת כלי הדם ברשתית שבו לאחר שלב II, כלי הדם הלא גמורים של הרשתית המתפתחת גורמים להיפוקסיה, אשר גורמת לביטוי של גורמי גדילה אנגיוגניים הממריצים צמיחה חדשה ולא תקינה של כליהדם 8. מודל OIR היה מודל נפוץ לחקור את הפתופיזיולוגיה של ROP רטינופתיות איסכמיות אחרות, כמו גם כדי לבדוק מועמדים לתרופה הרומן2,3,9. זה נחשב באופן נרחב כמודל לשחזור לביצוע מחקרים הוכחת הרעיון עבור תרופות אנטי אנגיוגניות פוטנציאליות למחלות עיניים, כמו גם שאינם עינית. שני דגמי מכרסמים כלומר, עכבר וחולדה OIR שונים במודל שלהם אינדוקציה ומחלות פנוטיפ. מודל החולדה מחקה פנוטיפ ROP בצורה מדויקת יותר, אך מודל העכבר מספק מודל חזק יותר, מהיר יותר וניתן לשחזור עבור neovascularization הרשתית (NV). במודל העכבר, NV מפתחת לרשתית המרכזית. קריאה פתולוגית זו חשובה במחקרי יעילות פרמקולוגית עבור רטינופתיות איסכמיות רבות, כגון PDR, קרוואנים ו- AMD אקסוידטיבי, כמו גם למחלות אנגיוגניות שאינן עיניות כגון סרטן. יתר על כן, הזמינות של עכברים שעברו מניפולציה גנטית (מהונדסת ונוקאאוט) הופכת את דגם OIR של העכבר לאפשרות פופולרית יותר. עם זאת, לא עכבר ולא עכברוש מודל OIR יוצר פיברוזיס ברשתית, אשר אופייני במחלות אנושיות.

ההבנה כי רמות חמצן גבוהות תורמות להתפתחות ROP בשנות החמישים10,11 הוביל לפיתוח מודלים של בעלי חיים. המחקרים הראשונים על השפעת החמצן על כלי הדם ברשתית נעשו בשנת 195012,13,14 ועד שנות התשעים היו עידונים רבים למודל OIR. המחקר של סמית ואח 'בשנת 1994 קבע תקן עבור מודל OIR העכבר הנוכחי המפריד בין עצם הלשון לרטינופתיה15. אימוץ רחב של השיטה לכמת vaso-השמדת NV פתולוגי על ידי קונור ואח '(2009) עוד יותר הגדיל את הפופולריות שלה16. במודל זה, עכברים ממוקמים ב 75% חמצן (O2) במשך 5 ימים ב P7, ואחריו 5 ימים בתנאים נורמוקסיים. Hyperoxia מ P7 כדי P12 גורם כלי הדם ברשתית לסגת ברשתית המרכזית. עם החזרה לתנאים הנורמוקסיים, הרשתית הופכת להיפוקסית (איור 1A). בשל הגירויים ההיפוקסיים של הרשתית המרכזית, חלק מכלי הדם ברשתית צומחים לכיוון הזגוגית, ויוצרים NV preretinal, הנקרא tufts preretinal2,3. ציצים אלה אינם בוגרים, ו hyperpermeable. כמות פסגות NV ב P17, לאחר מכן הוא נסוג. הרשתית היא revascularized מלא NV הוא נסוג לחלוטין על ידי P23 - P25 (איור 2A)2,3.

מודל OIR עכברוש (באמצעות רמות משתנות של O2) תואר לראשונה בשנות התשעים מראה כי משתנה O2 רמות ב 80% ו 40% לגרום NV בולט יותר מאשר תחת 80% O2 חשיפה מתמדת17. מאוחר יותר התגלה כי מודל היפוקסיה לסירוגין, שבו O 2 הוא רכב עלאופניים מ hyperoxia (50%) כדי היפוקסיה (10-12%), גורם אפילו יותר NV מאשר 80/40% O2 מודל18. במודל 50/10%, גורי חולדות חשופים ל -50% במשך 24 שעות, ואחריו 24 שעות ב -10% O2. מחזורים אלה נמשכים עד P14, כאשר גורי החולדות מוחזרים לתנאים נורמוקסיים (איור 1B). כמו בחולי ROP אנושיים, במודל החולדה מתפתחים אזורי החוליות לפריפריה של הרשתית בגלל מקלעת כלי דם רשתית לא בוגרת (איור 3).

בשני הדגמים, הפרמטרים העיקריים שבדרך כלל מכמתים הם בגודל של AVA ו- NV. פרמטרים אלה מנותחים בדרך כלל מן תושבות שטוחות ברשתית שבו תאי האנדותל מסומנים4,16. בעבר כמות NV preretinal הוערך חתכים ברשתית על ידי ספירת כלי דם או גרעיני תא כלי הדם המשתרעים זגוגית מעל הממברנה המגבילה הפנימית. המגבלה העיקרית של גישה זו היא שלא ניתן לכמת את ה- AVAs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הפרוטוקול המתואר כאן אושר על ידי הוועדה הלאומית לאתיקה של בעלי חיים בפינלנד (מספר פרוטוקול ESAVI/9520/2020 ו- ESAVI/6421/04.10.07/2017).

1. אינדוקציה של מודל OIR של בעלי חיים ועכבר ניסיוניים

הערה: השתמש בבעלי חיים שהזדווגו בזמן, למשל, עכברי C57BL/6J נפוצים, כדי לקבל גורים שנולדו באותו יום. השתמש סכרים מטפחים, למשל, 129 זן (129S1 / SvImJ או 129S3 / SvIM) סכרים מניקים, כדי לטפל בגורים במהלך ואחרי אינדוקציה של hyperoxia. לחלופין, ודאו שיש סכרים מניקים נוספים למקרה שיהיה צורך להחליף את הסכרים הסיעודיים בשל תשישות. להגביל את גודל המלטה ל 6-7 גורים עבור כל סכר בעת שימוש C57BL / 6J עכברים / סכרים (אם המלטה גדולה יותר מזה הגורים נוטים להיות עלייה במשקל מוגבלת)16.

  1. רשום את משקל בעלי החיים לפני ואחרי אינדוקציה hyperoxia, ובזמן ההקרבה.
  2. ודא כי יש מספיק מזון בתחתית הכלוב, כך הסכרים יש גישה קלה למזון.
  3. הוסף סודה סיד עם מחוון צבע לתחתית התא כדי לספוג CO2 עודף כאשר מערכת סינון אינו בשימוש.
  4. לפקח על הלחות והטמפרטורה בתוך התא ולשמור על הלחות בין 40 ל 65%. הגדל את הלחות של התא, במידת הצורך, על ידי הנחת כלים עם מים על החלק התחתון של התא (למשל, מנות פטרי).
  5. כייל את חיישן O2 עם 100% O2 ואוויר חדר רגיל.
  6. מקם את העכברים P7 לתוך תא ולהגדיר את רמת O2 ל 75%. שמור את העכברים בתא במשך 5 ימים, עד P12. הימנע מפתיחת התא במהלך אינדוקציה hyperoxia. בדוק את לחץ הגז של צילינדר O2 ולהחליף את הצילינדר בעת הצורך. לפקח על בעלי החיים במהלך האינדוקציה.
  7. תוציאו את כלובי העכברים מהתא ותשקול את כל הגורים. קיבוץ הגורים על סמך המשקל כך שלכל קבוצת ניסוי יש חלוקת משקל דומה בגורים.

2. אינדוקציה של מודל OIR של בעלי חיים ניסיוניים וחולדות (באמצעות מערכת סגורה למחצה)

הערה: השתמש בבעלי חיים שהזדווגו בזמן כדי לגרום לגורים להיוולד באותו יום. עבור עכברוש OIR, להשתמש בגודל המלטה מוגברת, כ 18 גורים / סכר, כדי לקבל אינדוקציה NV מספיק במודל החולדה. גורי בריכה מכמה פסולת כדי להשיג מספיק גורים לכל המלטה.

  1. רשום את משקלם של בעלי החיים לפני ואחרי האינדוקציה, ובזמן ההקרבה.
  2. ודא כי יש מספיק מזון בתחתית הכלוב, כך הסכרים יש גישה קלה למזון.
  3. מוסיפים סודה סיד עם מחוון צבע לתחתית התא כדי לספוג CO2 עודף כאשר מערכת הסינון אינה בשימוש.
  4. לפקח על הלחות והטמפרטורה בתוך התא. לספוג לחות נוספת (שנוצר ממספר רב של חולדות) על ידי הוספת ג'ל סיליקה בתחתית התא.
  5. כייל את חיישן O2 עם 100% N2 ואוויר חדר רגיל.
  6. מניחים את החולדות לתוך התא ב P0 (כמה שעות לאחר הלידה). הגדר את רמת O2 ל 50% ולחבר O2 צילינדרים לתא במשך 24 שעות. לאחר מכן, לעבור את ההגדרות 10% O2 ולחבר חנקן (N2)צילינדר לתא במשך 24 שעות. המשך רכיבה על אופניים 24 שעות בין 50% ו 10% O2 רמות במשך 14 ימים.
  7. לפקח על צריכת הגז ואת רווחתם של בעלי החיים במהלך המחקר. פתח את התא במהלך השינוי בין 50/10% O2 ולהוסיף עוד מזון ומים במידת הצורך. לשנות את הכלובים של בעלי החיים כדי לנקות אלה במהלך האינדוקציה.
  8. תוציא את כלובי החולדות מהתא ותשקול את כל הגורים. קיבוץ הגורים על סמך המשקל כך שלכל קבוצת ניסוי יש תפוצת משקל דומה אצל הגורים.

3. מתן תרופות (אופציונלי)

הערה: מסלול מינהל הסמים הנפוץ ב- OIR הוא על ידי טיפול תוך-ורידי (ivt), ב- P12-P14 לעכברים וב- P14 לחולדות. לקבוע את יום הטיפול בהתבסס על ההתקנה הניסיונית. כאשר פסולת מרובה של גורים משמשים בניסויים, לחלק את קבוצות הטיפול יש בעלי חיים מכל המלטה. רצוי, להזריק את התרופה רק לעין אחת, ולשמור על העין הנגדית כפקד.

  1. לשקול את בעלי החיים ולעשות סימני זיהוי לזנב ו / או האוזן.
  2. הרדמה של החיה עם הרדמה להזרקה (למשל תערובת של קטמין ו medetomidine, 30 מ"ג / קילוגרם ו 0.4 מ"ג / קילוגרם לעכברים) או עם הרדמה בשאיפה (isoflurane ב 2-3.5% isoflurane ו 200-350 mL / min זרימת אוויר). בדוק את עומק ההרדמה על ידי צביטת הבהונות. שמור את החיה על כרית חימום במהלך הטיפול.
  3. להרדמה מקומית, יש למרוח טיפת משכך כאבים על העפעף. פתח את העפעף בזהירות עם מלקחיים לפני ביצוע ivt, כמו עכברים וחולדות לפתוח את עיניהם סביב P14. החל טיפה של משכך כאבים (למשל, הידרוכלוריד oxybuprocaine) על הקרנית.
  4. החל טיפה של יוד לפני ביצוע הזרקת ivt.
  5. להזרקת ivt להשתמש במזרק זכוכית עם מחט 33-34 G מחובר. לחץ על העפעפיים כלפי מטה וגרירת גלגל העין עם מלקחיים. הפוך את ההזרקה האחורית לימבוס, בערך 45° מחט זווית הצבעה לכיוון עצב הראייה.
  6. הימנע הזרקת יותר מ 1.0 μL לתוך החלל התוך ורידי. שמור את המחט במקום במשך 30 s לאחר הזרקת התרופה כדי למנוע ריפלוקס של הפתרון מוזרק.
  7. בדוק את העין (למשל, עם רפואת עיניים) עבור כל סיבוכים, כגון דימום או נזק ברשתית, לאחר הסרת המחט. החל משחה אנטיביוטית על גבי הקרנית לאחר ההזרקה.
    הערה: נפח הזרקת ivt לעכברים צריך להיות 0.5 – 1.0 μL.
  8. הפוך את ההרדמה (למשל עם α2-אנטגוניסט עבור medetomidine (2.5 מ"ג / קילוגרם) ולהחזיר את הגור לכלוב. בית המלטה בדרך כלל עד סוף המחקר.

4. דימות ויוו ואלקטרורטינוגרפיה (אופציונלי)

  1. אם תרצה, לנהל הדמיה vivo על בעלי חיים חיים במהלך תקופת המעקב כדי לתעד שינויים המתפתחים ברשתית במהלך התגובות אנגיוגנית. לדוגמה, בצע אנגיוגרפיה פלואורסצנטית (FA) או סריקת מיקרוסקופיית לייזר קונפוקלית19 כדי לדמיין את כלי הדם (איור 4). השתמש בטומוגרפיה קוהרנטית אופטית של תחום ספקטרלי (SD-OCT) כדי לדמיין שכבות רשתית ב- vivo (איור 4).
  2. אם תרצה, בדוק שינויים תפקודיים באוכלוסיות שונות של תאי רשתית לאחר אינדוקציה של OIR באמצעות אלקטרורטינוגרפיה (ERG) (איור 5).

5. איסוף רקמות והכנת תושבות שטוחות ברשתית

הערה: לאסוף את הרקמות על פי השערת המחקר הרצויה. עבור עכברים, לאסוף את הדגימות למשל ב P12 (כדי ללמוד vaso-השמדת לאחר השלב hyperoxic) או בתקופה היפוקסית (P13-P17). לאסוף את העכבר דגימות OIR ב P17, המהווה את נקודת הזמן הנפוצה ביותר עבור דגימה, כדי לזהות את השיא בכמות NV. ב- OIR עכברוש, לאסוף את הדגימות ב P18-P21 כדי לבחון את הכמות הגבוהה ביותר של NV (איור 3).

  1. לשקול את החיות לפני הדגימה.
  2. כדי לתייג את כלי הדם ברשתית, בעלי חיים מורדמים עמוקים יכולים להיות מותזים באופן טרנסקרדיאלי עם FITC-dextran. (לחלופין, כתם את הרשתית שטוח mounts עם Isolectin מאוחר יותר).
  3. להקריב את בעלי החיים באמצעות מנת יתר של תרופות הרדמה (למשל תערובת של קטמין ו medetomidine, 300 מ"ג / קילוגרם ו 4 מ"ג / קילוגרם לעכברים) או CO2 שאיפה.
  4. לאסוף את העיניים של בעלי החיים על ידי תופס מאחורי גלגל העין עם מלקחיים מעוגלים, לחתוך את הרקמה סביב העיניים ולהרים את העין מן המסלול.
  5. דגירה גלגלי העין עשוי טרי, מסונן 4% paraformaldehyde (מלוחים אגירה פוספט, PBS) עבור 1-4 שעות. הסר את התיקון ולשטוף את גלגלי העין 3 x 10 דקות עם PBS. לנתח את הרשתיות מיד או לאחסן אותם PBS ב +4 מעלות צלזיוס.
    התראה: Paraformaldehyde רעיל על ידי שאיפה, במגע עם העור ואם בלע. נא קרא את גליון נתוני הבטיחות לפני שתעבוד איתו.
    הערה: אין להפעיל לחץ על גלגל העין במהלך הדגימה או בכל שלב של עיבוד הרקמה על מנת למנוע ניתוק רשתית, אם חתכים מגלגלי עיניים שלמים נעשים.
  6. הכן תושבות שטוחות ברשתית כדי לכמת את כמות ה- NV ואת גודל ה- AVAs. לחלופין, לעבד את העיניים / רשתית עבור היסטולוגיה, או RNA או ניתוח חלבון. לנתח את הרשתית תחת מיקרוסקופ סטריאו באמצעות מספריים מיקרו מלקחיים.
    1. מניחים את גלגל העין ב- PBS כדי לשמור אותו לח ולנקב את גלגל העין בלימבוס עם מחט (23G) ולחתוך סביב לימבוס עם מספריים מיקרו מעוגלים כדי להסיר את הקשתית ואת הקרנית.
    2. בזהירות למקם את קצה המספריים בין סקלרה רשתית לחתוך סקלרה לכיוון עצב הראייה. לעשות את אותו הדבר לצד השני של גלגל העין, בזהירות לחתוך / לקרוע את הסקלרה עד הרשתית נחשפת. מוציאים את העדשה מכוס הרשתית ומוסיפים PBS לגביע.
    3. הסר את כל כלי לשון, זגוגית ופסולת מבלי לפגוע ברשתית. לשטוף את הרשתית על ידי הוספת PBS לגביע הרשתית. בצע ארבעה חתכים (בשעה 12, 3, 6 ו -9) לרשתית עם מספריים מיקרו ישר לעשות מבנה דמוי פרח. באופן אופציונלי, בצע את החתכים עם להב כירורגי לפני הרכבה הדגימות. הרם את הרשתית באמצעות מברשת צבע רכה לצלחת היטב עבור כתמים.
  7. תווית vasculature הרשתית באמצעות Isolectin B4 אשר מכתים את פני השטח של תאי אנדותל (אם בעלי החיים לא היו חדורים עם FITC-dextran). דגירה הרשתיות במאגר חסימה (10% NGS + 0.5% טריטון ב TBS) עבור 1 שעה לשטוף עם 1% NGS + 0.1% טריטון ב TBS במשך 10 דקות. דגירה הרשתית עם צבע פלואורסצנטי מצומד Isolectin B4 (5-10μg /ml) ב 1% NGS + 0.1% טריטון ב TBS לילה ב +4 מעלות צלזיוס תוך הגנה מפני האור.
    הערה: אם תרצה, לתייג תאים אחרים כגון תאים דלקתיים ו pericytes באמצעות נוגדנים ספציפיים.
  8. לשטוף את הרשתיות 3x במשך 10 דקות עם 1% NGS + 0.1% טריטון ב TBS ולהרים רשתית על שקופית מיקרוסקופית, הרשתית הפנימית פונה כלפי מעלה. בזהירות להפיץ את הרשתית באמצעות מברשת צבע רכה ולהסיר את כל כלי לשון הנותרים או פסולת. מוסיפים מדיום הרכבה לתלוש כיסוי ומניחים אותו על גבי הרשתית. אחסן רשתית ב+4 °C (60 °F) ולהגן מפני אור.

6. ניתוח הרכבות השטוחות

  1. צלם תמונות של תושבות הרשתית השטוחות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מטרה של פי 10. התמקדו בפלקסוס כלי הדם השטחיים ובניבסולריזציה הפרה-רה-רטינלית. יצירת תמונת סריקת אריחים ללכידת הרשתית כולה ומיזוג סריקות האריחים
  2. לכמת את התמונות על ידי מדידת AVAs, אזור NV ואת אזור הרשתית הכולל באמצעות תוכנית עיבוד תמונה (ראה טבלה של חומרים).
    1. ציירו את ה- AVAs ואת אזור הרשתית הכולל באמצעות כלי ציור יד חינם ובחרו באזורים הניאו-וסקולריים בעזרת כלי בחירה. התוכנה מודדת את אזורי העניין בפיקסלים, ואת האזורים AVA ו- NV (לידי ביטוי פיקסלים) ניתן להשתמש כדי לחשב את האחוזים שלהם ביחס לאזור הרשתית הכולל. כמו כן, כלי תוכנה מסוימים זמינים לכימות NV.
      הערה: לאחרונה, קוד פתוח, תוכניות אוטומטיות לחלוטין לכימות ערכי מפתח של תמונות OIR באמצעות רשתות עצביות למידה עמוקה הוצגו ולספק כלי אמין לכימות לשחזור של AVA ברשתית ו- NV (למשל, https://github.com/uw-biomedical-ml/oir/tree/bf75f9346064f1425b8b9408ab792b1531a86c64)20,21.
  3. אם אתם משתמשים בנוגדנים לגילוי אימונוהיסטוכימי של אוכלוסיות תאים בודדים, כימתו את מספר התאים המוכתמים (כגון microglia, איור 2B)מהטענות השטוחות ברשתית ביד או על ידי מערכות ניתוח תמונה אוטומטיות במידת הצורך.

7. סטטיסטיקה

  1. לנתח נתונים מופצים בדרך כלל על ידי מבחן t של סטודנט או ANOVA חד כיווני ואחריו מבחן השוואות מרובות של Dunnett או Tukey, לפי הצורך. השתמש בבדיקות לא פרמטריות כמו מבחן מאן-וויטני U או מבחן קרוסקל וואליס לנתונים שאינם מופצים בדרך כלל. שקול הבדלים מובהקים סטטיסטית ברמת P < 0.05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

התוצאה העיקרית של המודל היא פנוטיפ כלי הדם: גודל AVAs וכמות NV. במודל OIR של העכבר, הוואסו-השמדה מתרחש ברשתית המרכזית(איור 2A),ואילו במודל החולדה שהיא מפתחת בפריפריה, כלומר בדומה ל-ROP22 האנושי(איור 3A). הסיבה לכך היא כי מקלעת כלי הדם השטחית כבר התפתחה כאשר עכברים נחשפים hyperoxia, ואילו במודל החולדה הרשתית היא avascular בזמן אינדוקציה OIR (P0). ניאו-סקולריזציה פרה-רתית מתפתחת בסמוך לאזורים השופעים, כלומר הרשתית המרכזית בעכבר, והפריפריה בחולדות (איור 2A ואיור 3A).

ניתוח היסטולוגי באמצעות חתכים או תושבות שטוחות יכול להיעשות כדי להעריך שינויים מורפולוגיים ברשתיות OIR או נוכחות של סוגי תאים מעניינים, למשל תאים דלקתיים (איור 2B). בנוסף לרשתית, ניתן לאסוף דגימות עיניים שלמות או זגוגיות לניתוחים נוספים של ביטויי גנים וחלבון בנקודות זמן שונות במהלך מודל OIR. ניתן לנתח את רמות ביטוי הגן או החלבון בשיטות סטנדרטיות, כגון RT-qPCR או סופג מערבי.

באופן אופציונלי, הדמיית vivo לא פולשנית יכולה להתבצע במהלך תקופת המעקב של OIR. ניתן לדמיין את כלי הדם ברשתית ובלשון באמצעות FA (איור 4A). ניתן להשתמש ב- SD-OCT כדי להעריך שינויים מבניים ברשתית (איור 4B). שינויים תפקודיים ברשתית ניתנים למדוד על ידי ERG (איור 5).

מעכבי גורם הגדילה האנדותל של כלי הדם (VEGF) משמשים בדרך כלל לטיפול במחלות עיניים אנגיוגניות אנושיות. לכן, אנטי VEGF משמש לעתים קרובות כתרכובת התייחסות OIR. Aflibercept, זה עובד כמו מסיס VEGF-מלכודת, מעכב הן NV ו revascularization פיזיולוגי ב OIR במינונים גבוהים ונמוכים (מוזרק ב P14). עיני OIR שהוזרקו ב-P14 עם מינון גבוה של aflibercept היו AVAs רשתית גדולה עוד יותר מאשר עיניים לא מטופלות(איור 6). זה מרמז כי aflibercept חוסם גם revascularization רשתית פיזיולוגית מונע על ידי היפוקסיה. ניתן להשתמש הן במודל העכבר והן במודל החולדה כדי להעריך את ההשפעה של סוכנים אנטי-אנגיוגניים שונים על רשתית NV ועל רה-וסקולריזציה פיזיולוגית של הרשתית (איור 3B ואיור 6).

Figure 1
איור 1: סקירה גרפית של עיצוב מחקר OIR סטנדרטי עבור עכברים וחולדות. (A)דגם OIR של העכבר נגרם על ידי חשיפת העכברים ל-75% O2 מ- P7 ל- P12 וחזר לאוויר החדר הרגיל. השיא של NV preretinal נראה ב P17, שהוא בדרך כלל נקודת הדגימה של הניסוי. (B)דגם עכברוש OIR נגרם על ידי חשיפת החולדות לסירוגין O2 רמות (50/10 % O2) מ P0 כדי P14 וחזר לתנאים נורמוקסיים. חולדות מוקרבות בדרך כלל ב P20, כאשר כמות NV הגיע לשיא. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: פנוטיפ כלי דם במודל OIR של העכבר. מודל OIR של עכבר נוצר כמתואר באיור 1. מקלעתכלי הדם השטחית התפתחה בעכברים רגילים בעוד עכברי OIR נחשפו ל 75% O2 מ P7 ל P12. במהלך תקופה זו, כלי הדם הושמדו ברשתית המרכזית (מסומן בכחול ב P12 ו P17 בתמונות לכימות). עכברים הוחזרו לאוויר חדר רגיל, והרשתית השופעת הפכה להיפוקסית, מה שהוביל לצמיחה מחודשת של כלי דם פונקציונלי ברשתית וב- NV פתולוגי (מסומן באדום ב- P17 בלוח התחתון). טאפטים ניאו-וסקולריים פרה-רתיים התפתחו בין כלי הדם לאזורי כלי הדם ברשתית המרכזית. כמות ה-NV הגיעה לשיאה ב-P17 ונסוגה לאחר מכן. הרשתית עברה רה-וסקולריות מלאה וה-NV נסוג סביב P24-P25. (B) דוגמה של כתמים אימונוהיסטוכימיים של הר שטוח רשתית מראה רשתית איבה-1 מוכתם microglia (ירוק) ו GS-IB4 כלי דם מוכתמים (אדום) ב P12 ו P17. (ג)חתך רוחב של עין OIR של עכבר ב P17, שם tufts preretinal (חצים) היו צומחים לכיוון הזגוגית. כמו כן, דילול השכבה הגרעינית הפנימית (INL) ושכבת plexiform החיצונית (OPL) נראה. סרגלי קנה המידה הם 1 מ"מ ב- A, 50 מיקרומטר ב- B ו- 100 מיקרומטר ב- C. ILM = קרום מגביל פנימי, GCL = שכבת תא גנגליון, IPL = שכבת plexiform פנימית, INL = שכבה גרעינית פנימית, OPL = שכבת plexiform החיצונית, ONL = שכבה גרעינית חוצה, RPE = אפיתל פיגמנט רשתית. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: פנוטיפ כלי דם והתפתחותו במודל OIR של חולדה. (A)אזורים וסקולריים (מסומנים בכחול) ו- NV (מסומן באדום) שפותחו בפריפריה של הרשתית, בדומה ל- ROP האנושי. (B)AVAs נראו ברשתיות OIR, אך לא בפקדים נורמוקסיים. (C)כימות של אזור NV הראה מגמה לקראת שיא בכמות NV ב P20, אבל ההבדל לא היה מובהק סטטיסטית לעומת P18 ו P21 ב OIR. (מבחן t של התלמיד, בין זמן תואם נורמוקסית רשתית OIR, ** p ≤ 0.01, *** p ≤ 0.001, שתי העיניים של בעלי החיים התווה בגרף). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: דימות In vivo באמצעות אנגיוגרפיה פלואורסצנטית (FA) וטומוגרפיה קוהרנטית אופטית ספקטרלית (SD-OCT) במודל OIR של חולדה. (A)טורטואוזיות כלי דם (ראשי חץ) נראתה בתמונות שנלקחו מהרשתית המרכזית (השורה העליונה) ב- P18 ו- P20 בחולדות OIR בהשוואה לחולדות P19 נורמוקסיות. NV (חצים) ו AVAs (כוכבית) התפתחו לפריפריה של הרשתית (שורה אמצעית) כפי שניתן לראות P18 ו P20 רשתית OIR. כלי לשון נסוגים (שורה תחתונה) נתפסו על ידי FA. (B) צמיחת כלי דם לכיוון זגוגית נצפתה כעיבוי על שכבת סיבי העצב (NFL) ושכבת תא גנגליון (GCL) ברשתיות OIR (חץ). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: ניתן למדוד פונקציונליות של נוירונים ברשתית באמצעות אלקטרורטינוגרפיה של פלאש (fERG). (A)גלי a נגזרו חרוט רשתית ו מוט photoreceptors ואת משרעת שלהם ירדו באופן משמעותי במודל OIR עכברוש. ההשפעה גדלה עם עוצמת אור גבוהה יותר, מה שמרמז כי הפגמים השפיעו על פונקציות פוטורצפטור חרוט בעיקר. (B)משרעת גלי B מחיות OIR הופחתו בהשוואה לבקרות נורמוקסיות. גלי B נגזרו מתאים דו-קוטביים ותאי מולר. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: PBS מוזרק תוך-ורידי מפחית NV ו- AVAs במודל OIR של העכבר. (A)תמונות מייצגות של תושבות שטוחות ברשתית מטיפול לא מטופל, ומטופלים aflibercept (20 מיקרוגרם ב P14) ו PBS הזריק עיני OIR ב P17. מינון גבוה של aflibercept (20 מיקרוגרם) גדל בגודל של AVAs על ידי 47% (מתואר בלבן) ו NV מעוכב על ידי 98% (חצים) לעומת פקדים מטופלים. הזרקת PBS ירד AVAs על ידי 31% ו NV על ידי 42% לעומת פקדים מטופלים. כמו כן, לנקב את הסקלרה הדומה ivt הפיק השפעות דומות כמו הזרקת ivt של PBS, אבל ההבדלים לא היו מובהקים סטטיסטית. ראש חץ מצביע על כלי לשון שלא הוסרו במהלך הניתוח. (ANOVA חד-כיווני, * p ≤ 0.05; ** p ≤ 0.01, *** p ≤ 0.001, **** p ≤ 0.0001). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

חומרת פנוטיפ המחלה תלויה הן בזן ואפילו בספק בדגמי OIR של עכברים וחולדות23. הדבר מצביע על כך שקיימת שונות גנוטיפית רחבה בהתפתחות הפתולוגית. באופן כללי, מכרסמים פיגמנטיים מפתחים פנוטיפ חמור יותר מאשר אלה לבקן. לדוגמה, כלי הדם ברשתית של לבקן BALB / c revascularizes במהירות לאחר hyperoxia ואינו מפתח NV בכלל24. באופן דומה, בחולדות, חולדות נורבגיה בראון פיגמנט להראות פתולוגיה חמורה יותר מאשר לבקן ספראג דולי (SD) חולדות25. חולדות SD משמשים בדרך כלל זן, הבדלים הקשורים לספק פנוטיפ OIR דווחו בתוך המתח. לדוגמה, חולדות SD מנהר צ'ארלס מייצרות באופן משמעותי יותר NV מאשר חולדות מהארלן או זיויק-מילר23. עכברי C3H / HeJ, בתורם, שיש להם מוטציה בגן ניוון הרשתית 1 (Rd1), יש רשתית דקה, ואינם מפתחים NV26. בשל סיבות אלה ואת הזמינות של קווי עכברים מהונדסים, C57BL/6J מולד הוא זן העכבר הנפוץ ביותר עבור מחקרים OIR. עם זאת, יש תמותה גבוהה למדי בין סכרי C57BL / 6J עקב החשיפה hyperoxic, ולכן רווחתם של העכברים צריך להילקח בחשבון בעת תכנון המחקר ומנוטר במהלך הניסויים. יתר על כן, נזק photoreceptor מוגברת נתפסת בעכברים C57BL/6 לעומת עכברי BALB /c27.

על מנת להבטיח את רווחתם של העכברים והישרדותם של הסכרים והגורים, גודל המלטה צריך להישמר קטן (6-7 גורים / סכר). זה חשוב במיוחד בעת שימוש בעכברי C57BL/6, אשר רגישים יותר ללחץ היפראוקסי27,28. בנוסף, מזון תמיכה נגיש בקלות (ממוקם בתחתית הכלוב) צריך להיות מסופק לעכברים. חלק מהחוקרים משתמשים בסכרים פונדקאיים כדי להחליף את הסכרים בתא בסכרים בריאים לאחר אינדוקציה של חמצן. עם זאת, רוב החוקרים להשתמש תחליפים רק אם הסכר הוא מותש22,29. סכרים פונדקאיים מומלץ להשתמש אם נעשה שימוש בגדלים גדולים יותר של פסולת. פורסם כי עכברי 129S3/SvIM מייצרים יותר NV מאשר C57BL/6 ומקיימים טוב יותר את השינויים הנגרמים על ידי רמות חמצן משתנות28. יש לציין כי הסכרים המשמשים OIR אינם עקרים לאחר אינדוקציה OIR ואין להשתמש בהם למטרות רבייה נוספות22. עלייה במשקל לאחר הלידה של הגורים משפיעה על חומרת הפתולוגיה OIR. גורים עם עלייה במשקל לאחר הלידה (<5 g ב P17) להראות ביטוי מושהה של VEGF ובכך שלב ממושך של רטינופתיה בהשוואה גורים עם נורמלי (5 - 7.5 גרם ב P17) או עלייה במשקל נרחב (>7.5 גרם ב P17)29. יתר על כן, גורי עכברים במשקל מעל 5 גרם ב P7 אינם מראים אזורים vaso-הושמד לאחר אינדוקציה OIR30. לכן, חשוב לשקול את הגורים במהלך הניסוי. העין הלא מטופלת הנגדית יכולה לשמש כבקרה פנימית כדי להבטיח כי המצב התזונתי של העכברים אינו משפיע על התוצאות. המצב דומה בחולדות; ככל שהגורים קטנים יותר, כך הם מפתחים פנוטיפ OIR חמור יותר31. לכן, גודל המלטה גדול (כ. 18 גורים) מומלץ לשמש עבור מודל OIR חולדה.

אינדוקציה מודל OIR יכול להיעשות באמצעות מערכת סגורה לחלוטין, שם יש מעגל לולאה סגורה עם משאבה המסתובבת באוויר באמצעות מערכת סינון (סודה סיד ופחמן פעיל) בחזרה לתא. אפשרות נוספת היא מערכת סגורה למחצה, שבה אוורור מבטיח כי מטבוליטים עודף מוסרים מן התא. כדי להבטיח כי עודף CO2 מוסר, סודה סידן (תערובת של סידן הידרוקסיד עם נתרן הידרוקסיד או אשלגן הידרוקסיד) ניתן להציב על החלק התחתון של התא. הסרת CO2 היא חובה כמו רמות CO2 גבוהות להחמיר את פנוטיפ המחלה בחולדות32. יש גם לזכור לכייל מחדש את חיישן החמצן של התא באופן קבוע כפי שהם נוטים להיסחף לאורך זמן ועשויים לספק ריכוז חמצן שגוי מזה המיועד.

דווח כי הזרקת רכב (PBS) לבד או אפילו רק הנקב לחלל התוך-ויווי יש השפעה על קצב revascularization ואת כמות NV (איור 6)33,34,35,36. זה כבר העריכו אם ההשפעה לראות עם PBS / הזרקת רכב יכול להיות בגלל שינויים בלחץ תוך עיני במהלך ההזרקה, או עקב פגיעה במבנים עינית המגבירה את רמות גורמי הגדילה אנגיוגניים ביניהם פיגמנט אפיתל נגזרגורם גדילה 34,37. יתר על כן, רק הזרקת subretinal טייס לבד (לנקב את החלל subretinal) הוכח יש השפעות על פנוטיפ כלי הדם והפונקציונלי ב OIR בהשוואה לחולדות מטופלות38. תוצאות אלו מדגישות את החשיבות של בקרות שליליות נאותות במחקרי OIR או אפילו ניהול מערכתי של תרכובות שנבדקו, כמו גם מספרי n גדולים מספיק בכל קבוצת לימוד. העובדה כי הזרקת רכב אכן משפרת את שיעור revascularization ברשתית היא גורם מגביל מרכזי כמו שיעור revascularization ואת היווצרות של tufts preretinal פתולוגי קשורים זה לזה במודל OIR: אם שיעור revascularization הואץ, זה מוביל לירידה מפצה של tufts neovascular ולהיפך. לכן, שני מדדי התוצאה העיקריים של מודל OIR מושפעים הזרקת רכב.

מעכבי VEGF חוללו מהפכה בטיפול ב-AMD ומודל DR. OIR שימש להדגמת יעילותם באופן טרום-קליני. בנוגע למעכבי VEGF ב- OIR, מחקר המשווה בין אנטי-VEGFs שונים ואנטי-PlGFs (גורם גדילה שליה) (מוזרק ב- P12) הראה כי אנטי VEGF לבדו הוביל לאזורים קטנים, ואילו נגד PIGF עיניים שטופלו היו אזורים עווייתיים גדולים יותר33. Aflibercept היה AVAs הגדול ביותר בהשוואה לטיפולים תרופתיים אחרים33. Aflibercept ידוע לאגד הן VEGF ו PlGF39, זה יכול להיות כי עיכוב PlGF ב OIR מוביל לחסימת אנגיוגנזה פיזיולוגית.

הדמיה in vivo לא פולשנית מספקת כלי לניטור כלי הדם ברשתית40 ושכבות רשתית ומבנה במהלך תקופת המעקב. באמצעות FA, פרמטרים כמו צפיפות כלי דם וריבוי עורקים ו תברכות ורידים (הנקראים פלוס מחלה, איור 4A)ניתן למדוד40,41. SD-OCT יכול לשמש להערכת שינויים מבניים ומדידת עובי הרשתית במהלך תקופת מעקב OIR42,43. ERG משמש למדידת השינויים הפונקציונליים ברשתית. סוגי תאים שונים מייצרים פוטנציאל חשמלי לאחר גירוי אור, ואותות או "גלים" אלה ניתן למדוד עם ERG. פוטורצפטורים מייצרים את הגל השלילי, ותאים דו-קוטביים ותאי מולר אחראים בעיקרלגל-b-wave 44. אובדן תפקוד הרשתית אופייני לעכברי OIR וחולדות45,46 (איור 5). שינויים ארוכי טווח נמשכים ברשתית ושינויים תפקודיים ושינויים ברמת החלבון דווחו ברשתיות OIR גם לאחר רסטוריזציה ורגרסיה NV34,47.

כדי לדמיין את כלי הדם ברשתית, העכברים החיים יכולים להיות חדורים עם דקסטרן עם תווית FITC או את תושבות שטוחות הרשתית ניתן מוכתם בצבע פלואורסצנטי שכותרתו Isolectin B4. צריך להבין את ההבדל בין צבעי הפלואורסצנט; הזיעה עם FITC-dextrans מתייגת רק את הלומן של כלי הדם, ואילו Isolectin B4 מכתים את פני השטח של תאי אנדותל. לכן, כלי דם פונקציונליים עם לומן מתאים יהיה רק לדמיין עם זלוף FITC-dextran, בעוד השטח הכולל של NV מופיע גדול יותר Isolectin B4 רשתית מוכתמת מאשר ב- FITC-dextran זלגו בעלי חיים, כי Isolectin B4 למעשה מרים אפילו תאים אנדותל אשר לא יצרו לומן פונקציונלי עדיין48. אפשרות עדכנית יותר לדמיין כדור רשתית / עין שלם בפורמט תלת-ממדי היא הדמיית רקמות עמוקות על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית דו פוטון(49).

מודל OIR מכרסמים, כמו גם מודלים בעלי חיים בכלל, רק חלקית מייצגים את המאפיינים של מחלות אנושיות. ההבדל העיקרי הקשור OIR הוא כי neovascularization הרשתית אינה קשורה פיברוזיס במכרסם OIR, ואילו neovascularization הרשתית מוביל בדרך כלל התפשטות פיברו וסקולרית במחלות רשתית ניאו-וסקולרית אנושית. יתר על כן, התנאים שגורמים OIR לעומת מחלה אנושית יכול להיות כמעט הפוך. preterm reonates עם ROP דורשים תוספת חמצן עם תמיכה נשימתית, ניסיון לעתים קרובות פרקים היפוקסמיים היפראוקסמיים הנגרמים על ידי דום נשימה חוזרים ונשנים, אבל הם לא נחשפים לרמות גבוהות של חמצן. כדי למזער את הנזק הקבוע, חלקים גבוהים של O2 השראה נמנעים. במובן זה, לא מודל העכבר עם חשיפה מתמדת 75% O2 במשך 5 ימים ולא מודל עכברוש 50/10 דומה פתוגנזה של ROP אנושי. יתר על כן, ישנם גם הבדלים בין החולדה לבין מודלים OIR העכבר. neovascularization נסוג במודל העכבר עם הקמה מחדש של כלי רגיל על ידי P24, ואילו המצב מחמיר במודל OIR החולדה (בדומה ROP האנושי). אמנם, מודל OIR החולדה מראה תכונות רלוונטיות קלינית של ROP כגון פיתוח כלי דם ברשתית מתעכב neovascularization פתולוגית הבאים, השימוש בו מוגבל על ידי היעדר כמעט מוחלט של זנים חולדה מהונדסים, עלויות תחזוקה גבוהות יותר פחות NV מאשר במודל OIR העכבר.

יחד, למרות ההבדלים בין רטינופתיות התפשטות איסכמי אנושי מודלים OIR מכרסמים, הקלות שבה NV יכול להיות המושרה, יחד עם הדמיה קלה וכימות של הרשתית, להפוך את מודלים OIR פופולרי ללמוד את המנגנונים המולקולריים וטיפולים פוטנציאליים עבור רטינופתיות התפשטות איסכמית. מעניין, החשיפה hyperoxia במודל OIR העכבר גם גורם דיספלסיה bronchopulmonary, מחלה נוספת הנגרמת על ידי טיפול בחמצן משלימה בפגים אנושיים, מראה כי מודל OIR יכול לשמש כדי לחקור מטרות הרומן עבור אדונופולמונארי דיספלזיה בו זמנית50.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מריה Vähätupa, PhD, ניינה Jääskeläinen, מארק סראדה-Gimenez, PhD, ורובינה Thapa הם עובדים של ניסויים בע"מ.

המחבר Giedrius Kalesnykas, PhD, הוא עובד (נשיא ומנכ"ל) ובעל מניות של Experimentica בע"מ המציעה שירותי מחקר חוזה העסקת מודלים OIR פרה-קליני בשימוש במאמר זה.

Tero Järvinen, MD, PhD, ו Hannele Uusitalo-Järvinen, MD, PhD, אין מה לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים למריאן קרלסברג, אן מארי הפנימי, פיבי פרטנן ואן קנקונן על תמיכה טכנית מצוינת. עבודה זו מומנה על ידי האקדמיה של פינלנד, Päivikki ו Sakari סולברג קרן, טמפרה שחפת קרן, קרן רפואית פינית, קרן המחקר המחוזית בית החולים Pirkanmaa וקרן המחקר של בית החולים אוניברסיטת טמפרה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
33 gauge, Small Hub RN Needle Hamilton Company 7803-05, 10mm, 25°, PS4 For intravitreal injection
Adobe Photoshop Adobe Inc. For image analysis
Air pump air100 Eheim GmbH & Co. KG. 143207 For inhalation anaesthesia
Anaesthesia unit 410 AP Univentor Ltd. 2360309 For inhalation anaesthesia
AnalaR NORMAPUR Soda lime VWR International Ltd 22666.362 For CO2 control during model induction
Attane Vet 1000 mg/g VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY vnr 17 05 79 For inhalation anaesthesia
Brush For preparation of flat mounts
Carbon dioxide gas For sacrifice
Celeris D430 ERG system Diagnosys LLC 121 For in vivo ERG
Cell culture dishes Greiner Bio-One International GmbH 664 160 For preparation of flat mounts
Cepetor Vet 1 mg/mL VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY vnr 08 78 96 For anaesthesia
Cover slips Thermo Fisher Scientific 15165452 For preparation of flat mounts
O2 Controlled InVivo Cabinet, Aninal Filtrarion System and Dehumidifier Coy Laboratory Products Closed system for disease model induction, optional for semi-closed system
E702 O2 sensor BioSphenix, Ltd. E207, 1801901 For oxygen level measurement
Envisu R2200 Spectral Domain Optical Coherence Tomograph (SD-OCT) Bioptigen, Inc. BPN000668 For in vivo imaging
Eye spears Beaver-Visitec International, Inc. 0008685 For intravitreal injection and in vivo imaging
Flexilux 600LL Cold light source Mikron 11140 For intravitreal injection or tissue collection
Fluorescein sodium salt Merck KGaA F6377-100G For in vivo imaging
Gas Exhaust unit (+Double 3-way valve, mouse and rat face masks, UNOsorb filter) UNO Roestvaststaal BV GEX 17015249 For inhalation anaesthesia
Glass syringe, Model 65 RN Hamilton Company 7633-01 For intravitreal injection
HRA2 Retina angiograph (FA) Heidelberg Engineering GmbH Spec-KT-05488 For in vivo imaging
Isolectin GS-IB4, Alexa Fluor 488 Conjugate Thermo Fisher Scientific I21411 For labeling retinal vasculature on flat mounts
Ketaminol Vet 50 mg/mL Intervet International B.V. vnr 51 14 85 For anaesthesia
Medicinal Oxygen gas For disease model induction
Mice C57BL/6JRj Janvier Labs Also other strains possible
Microscope slides Thermo Fisher Scientific J1800AMNZ For preparation of flat mounts
Minims Povidone Iodine 5% (unit) Bausch & Lomb U.K Limited vnr 24 11 304 For intravitreal injection
Nitrogen gas For disease model induction (rat)
Oftan Chlora 10 mg/g Santen Pharmaceutical Co., Ltd. vnr 55 01 11 For intravitreal injection
Oftan Metaoksedrin 100 mg/ml Santen Pharmaceutical Co., Ltd. vnr 55 03 43 For in vivo ERG
Oftan Obucain 4 mg/ml Santen Pharmaceutical Co., Ltd. vnr 55 03 50 For intravitreal injection
Oftan Tropicamid 5 mg/ml Santen Pharmaceutical Co., Ltd. vnr 04 12 36 For in vivo imaging
ProOx Model 110 O2 controller and animal chamber BioSphenix, Ltd. 803 For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system
ProOx Model P360 O2 controller and animal chamber BioSphenix, Ltd. 538 For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system
Rats CD(SD) Charles River Laboratories Also other strains possible
Revertor 5 mg/mL VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY vnr 13 04 97 For anaesthesia reversal
Silica gel For humidity control during model induction
Systane Ultra 10ml Alcon Tamro 2050250 For hydration of the eye
Systane Ultra unit 0.7ml Alcon Tamro 2064871 For hydration of the eye
Transfer pipette Thermo Fisher Scientific 1343-9108 For preparation of flat mounts
VENTI-Line VL 180 PRIME Drying oven VWR VL180S 170301 For drying silica gel
VisiScope SZT350 Stereomicroscope VWR 481067 For intravitreal injection or tissue collection

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chase, J. The evolution of retinal vascularization in mammals. A comparison of vascular and avascular retinae. Ophthalmology. 89 (12), 1518-1525 (1982).
  2. Sun, Y., Smith, L. E. H. Retinal vasculature in development and diseases. Annual Review of Vision Science. 4, 101-122 (2018).
  3. Vähätupa, M., Järvinen, T. A. H., Uusitalo-Järvinen, H. Exploration of oxygen-induced retinopathy model to discover new therapeutic drug targets in retinopathies. Frontiers in Pharmacology. 11, 873 (2020).
  4. Stahl, A., et al. The mouse retina as an angiogenesis model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (6), 2813-2826 (2010).
  5. Benjamin, L. E., Hemo, I., Keshet, E. A plasticity window for blood vessel remodelling is defined by pericyte coverage of the preformed endothelial network and is regulated by PDGF-B and VEGF. Development. 125 (9), 1591-1598 (1998).
  6. Bashinsky, A. L. Retinopathy of prematurity. North Carolina Medical Journal. 78 (2), 124-128 (2017).
  7. Ludwig, C. A., Chen, T. A., Hernandez-Boussard, T., Moshfeghi, A. A., Moshfeghi, D. M. The epidemiology of retinopathy of prematurity in the united states. Ophthalmic Surgery, Lasers and Imaging Retina. 48 (7), 553-562 (2017).
  8. Hartnett, M. E. Pathophysiology and mechanisms of severe retinopathy of prematurity. Ophthalmology. 122 (1), 200-210 (2015).
  9. Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. Animal models of ocular angiogenesis: From development to pathologies. FASEB Journal. 31 (11), 4665-4681 (2017).
  10. Szewczyk, T. S. Retrolental fibroplasia; etiology and prophylaxis. American Journal of Ophthalmology. 35 (3), 301-311 (1952).
  11. Szewczyk, T. S. Retrolental fibroplasia and related ocular diseases; classification, etiology, and prophylaxis. American Journal of Ophthalmology. 36 (10), 1336-1361 (1953).
  12. Gerschman, R., Nadig, P. W., Snell, A. C. Jr, Nye, S. W. Effect of high oxygen concentrations on eyes of newborn mice. American Journal of Physiology. 179 (1), 115-118 (1954).
  13. Gyllnesten, L. J., Hellström, B. E. Experimental approach to the pathogenesis of retrolental fibroplasia. III. changes in the eye induced by exposure of newborn mice to general hypoxia. British Journal of Ophthalmology. 39 (7), 409-415 (1955).
  14. Curley, F. J., Habegger, H., Ingalls, T. H., Philbrook, F. R. Retinopathy of immaturity in the newborn mouse after exposure to oxygen imbalances. American Journal of Ophthalmology. 42 (3), 377-392 (1956).
  15. Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).
  16. Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: A model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4 (11), 1565-1573 (2009).
  17. Penn, J. S., Tolman, B. L., Lowery, L. A. Variable oxygen exposure causes preretinal neovascularization in the newborn rat. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 34 (3), 576-585 (1993).
  18. Penn, J. S., Henry, M. M., Tolman, B. L. Exposure to alternating hypoxia and hyperoxia causes severe proliferative retinopathy in the newborn rat. Pediatric Research. 36 (6), 724-731 (1994).
  19. Ritter, M. R., et al. Three-dimensional in vivo imaging of the mouse intraocular vasculature during development and disease. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (9), 3021-3026 (2005).
  20. Xiao, S., et al. Fully automated, deep learning segmentation of oxygen-induced retinopathy images. Journal of Clinical Investigation Insight. 2 (24), 97585 (2017).
  21. Mazzaferri, J., Larrivee, B., Cakir, B., Sapieha, P., Costantino, S. A machine learning approach for automated assessment of retinal vasculature in the oxygen induced retinopathy model. Scientific Reports. 8 (1), 22251-22257 (2018).
  22. Kim, C. B., D'Amore, P. A., Connor, K. M. Revisiting the mouse model of oxygen-induced retinopathy. Eye and Brain. 8, 67-79 (2016).
  23. Barnett, J. M., Yanni, S. E., Penn, J. S. The development of the rat model of retinopathy of prematurity. Documenta Ophthalmologica. 120 (1), 3-12 (2010).
  24. Ritter, M. R., et al. Myeloid progenitors differentiate into microglia and promote vascular repair in a model of ischemic retinopathy. Journal of Clinical Investigation. 116 (12), 3266-3276 (2006).
  25. Floyd, B. N., et al. Differences between rat strains in models of retinopathy of prematurity. Molecular Vision. 11, 524-530 (2005).
  26. Scott, A., Powner, M. B., Fruttiger, M. Quantification of vascular tortuosity as an early outcome measure in oxygen induced retinopathy (OIR). Experimental Eye Research. 120, 55-60 (2014).
  27. Walsh, N., Bravo-Nuevo, A., Geller, S., Stone, J. Resistance of photoreceptors in the C57BL/6-c2J, C57BL/6J, and BALB/cJ mouse strains to oxygen stress: Evidence of an oxygen phenotype. Current Eye Research. 29 (6), 441-447 (2004).
  28. Chan, C. K., et al. Differential expression of pro- and antiangiogenic factors in mouse strain-dependent hypoxia-induced retinal neovascularization. Laboratory Investigation. 85 (6), 721-733 (2005).
  29. Stahl, A., et al. Postnatal weight gain modifies severity and functional outcome of oxygen-induced proliferative retinopathy. American Journal of Pathology. 177 (6), 2715-2723 (2010).
  30. Liegl, R., Priglinger, C., Ohlmann, A. Induction and readout of oxygen-induced retinopathy. Methods in Molecular Biology. 1834, 179-191 (2019).
  31. Holmes, J. M., Duffner, L. A. The effect of postnatal growth retardation on abnormal neovascularization in the oxygen exposed neonatal rat. Current Eye Research. 15 (4), 403-409 (1996).
  32. Holmes, J. M., Zhang, S., Leske, D. A., Lanier, W. L. The effect of carbon dioxide on oxygen-induced retinopathy in the neonatal rat. Current Eye Research. 16 (7), 725-732 (1997).
  33. Heiduschka, P., Plagemann, T., Li, L., Alex, A. F., Eter, N. Different effects of various anti-angiogenic treatments in an experimental mouse model of retinopathy of prematurity. Journal of Clinical and Experimental Ophthalmology. 47 (1), 79-87 (2019).
  34. Tokunaga, C. C., et al. Effects of anti-VEGF treatment on the recovery of the developing retina following oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (3), 1884-1892 (2014).
  35. Tokunaga, C. C., Chen, Y. H., Dailey, W., Cheng, M., Drenser, K. A. Retinal vascular rescue of oxygen-induced retinopathy in mice by norrin. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (1), 222-229 (2013).
  36. Vähätupa, M., Uusitalo-Järvinen, H., Järvinen, T. A. H., Uusitalo, H., Kalesnykas, G. Intravitreal injection of PBS reduces retinal neovascularization in the mouse oxygen-induced retinopathy model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. Abstract Issue. 57 (12), 3649 (2016).
  37. Penn, J. S., et al. Angiostatic effect of penetrating ocular injury: Role of pigment epithelium-derived factor. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (1), 405-414 (2006).
  38. Becker, S., Wang, H., Stoddard, G. J., Hartnett, M. E. Effect of subretinal injection on retinal structure and function in a rat oxygen-induced retinopathy model. Molecular Vision. 23, 832-843 (2017).
  39. Sophie, R., et al. Aflibercept: A potent vascular endothelial growth factor antagonist for neovascular age-related macular degeneration and other retinal vascular diseases. Biological Therapy. 2, (2012).
  40. Mezu-Ndubuisi, O. J. In vivo angiography quantifies oxygen-induced retinopathy vascular recovery. Optometry and Vision Science. 93 (10), 1268-1279 (2016).
  41. Mezu-Ndubuisi, O. J., et al. In vivo retinal vascular oxygen tension imaging and fluorescein angiography in the mouse model of oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (10), 6968-6972 (2013).
  42. Dailey, W. A., et al. Ocular coherence tomography image data of the retinal laminar structure in a mouse model of oxygen-induced retinopathy. Data in Brief. 15, 491-495 (2017).
  43. Mezu-Ndubuisi, O. J., Taylor, L. K., Schoephoerster, J. A. Simultaneous fluorescein angiography and spectral domain optical coherence tomography correlate retinal thickness changes to vascular abnormalities in an in vivo mouse model of retinopathy of prematurity. Journal of Ophthalmology. 2017, 9620876 (2017).
  44. Pinto, L. H., Invergo, B., Shimomura, K., Takahashi, J. S., Troy, J. B. Interpretation of the mouse electroretinogram. Documenta Ophthalmologica. 115 (3), 127-136 (2007).
  45. Nakamura, S., et al. Morphological and functional changes in the retina after chronic oxygen-induced retinopathy. PLoS One. 7 (2), 32167 (2012).
  46. Dorfman, A. L., Polosa, A., Joly, S., Chemtob, S., Lachapelle, P. Functional and structural changes resulting from strain differences in the rat model of oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (5), 2436-2450 (2009).
  47. Vähätupa, M., et al. SWATH-MS proteomic analysis of oxygen-induced retinopathy reveals novel potential therapeutic targets. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (8), 3294-3306 (2018).
  48. Campos, M., Amaral, J., Becerra, S. P., Fariss, R. N. A novel imaging technique for experimental choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (12), 5163-5170 (2006).
  49. Yanez, C. O., et al. Deep Vascular Imaging in Wounds by Two-Photon Fluorescence Microscopy. PLos One. 8 (7), 67559 (2013).
  50. Wickramasinghe, L. C., et al. Lung and eye disease develop concurrently in supplemental oxygen-exposed neonatal mice. American Journal of Pathology. , 30287 (2020).

Tags

רפואה גיליון 163 אנגיוגנזה ניאו-סקולריזציה רטינופתיה הנגרמת על ידי חמצן OIR היפוקסיה רטינופתיה של פגות ROP רטינופתיה סוכרתית הזרקה תוך-ויטריאלית ניתוח תמונה בינה מלאכותית בינה מלאכותית
מודל רטינופתיה הנגרמת על ידי חמצן למחלות רשתית איסכמיות במכרסמים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vähätupa, M.,… More

Vähätupa, M., Jääskeläinen, N., Cerrada-Gimenez, M., Thapa, R., Järvinen, T., Kalesnykas, G., Uusitalo-Järvinen, H. Oxygen-Induced Retinopathy Model for Ischemic Retinal Diseases in Rodents. J. Vis. Exp. (163), e61482, doi:10.3791/61482 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter