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Medicine

Modelo de Retinopatia Induzida por Oxigênio para Doenças Isquêmicas da Retina em Roedores

Published: September 16, 2020 doi: 10.3791/61482
Automatic Translation
1,2, 2, 2, 2, 1, 2, 1,3
1Faculty of Medicine and Health Technology, Tampere University & Tampere University Hospital, 2Experimentica Ltd, 3Eye Centre, Tampere University Hospital

Summary

A retinopatia induzida pelo oxigênio (OIR) pode ser usada para modelar doenças isquêmicas da retina, como a retinopatia da prematuridade e a retinopatia diabética proliferativa e servir de modelo para estudos de prova de conceito na avaliação de drogas antiangiogênicas para doenças neovasculares. O OIR induz a neovascularização robusta e reprodutível na retina que pode ser quantificada.

Abstract

Um dos modelos comumente usados para retinopatias isquêmicas é o modelo de retinopatia induzida pelo oxigênio (OIR). Aqui descrevemos protocolos detalhados para a indução do modelo OIR e suas leituras em camundongos e ratos. A neovascularização da retina é induzida em OIR expondo filhotes de roedores à hiperoxia (camundongos) ou a níveis alternados de hiperoxia e hipóxia (ratos). As leituras primárias desses modelos são do tamanho das áreas neovasculares (NV) e avasculares (AVA) na retina. Este modelo in vivo pré-clínico pode ser usado para avaliar a eficácia de potenciais drogas anti-angiogênicas ou para abordar o papel de genes específicos na angiogênese da retina usando animais geneticamente manipulados. O modelo tem alguma variação específica de tensão e fornecedor na indução OIR que deve ser levada em consideração ao projetar os experimentos.

Introduction

Modelos experimentais confiáveis e reprodutíveis são necessários para estudar a patologia por trás de doenças oculares angiogênicas e desenvolver novas terapêuticas para essas doenças devastadoras. A angiogênese patológica é a marca registrada para a degeneração macular relacionada à idade úmida (DM) e para muitas doenças isquêmicas da retina entre elas a retinopatia da prematuridade (ROP), a retinopatia diabética proliferativa (PDR) e a oclusão da veia retinária (RVO)1,2,3,4. As retinas humanas e roedores seguem um padrão de desenvolvimento semelhante, já que tanto a retina humana quanto a roedora estão entre os últimos tecidos vascularizados. Antes que a vasculatura da retina se desenvolva completamente, a retina recebe seu suprimento de nutrientes a partir da vasculatura hialoide, que, por sua vez, regrede quando a vasculatura da retina começa a se desenvolver1,2. No desenvolvimento vascular humano, a retina é concluída antes do nascimento, enquanto nos roedores o crescimento da vasculatura da retina ocorre após o nascimento. Uma vez que o desenvolvimento vascular da retina ocorre postnatalmente em roedores, fornece um sistema modelo ideal para estudar a angiogênese2,3. Os roedores recém-nascidos têm uma retina avascular que se desenvolve gradualmente até que o desenvolvimento completo da retina vascular seja alcançado até o final da terceira semana pós-natal4. Os vasos sanguíneos em crescimento do camundongo neonatal são plásticos, e sofrem regressão durante o estímulo da hiperoxia5.

O ROP é a principal causa de cegueira infantil nos países ocidentais, pois afeta quase 70% dos bebês prematuros com peso ao nascer abaixo de 1.250 g6,7. O ROP ocorre em bebês prematuros que nascem antes que os vasos da retina completem seu crescimento normal. O ROP progride em duas fases: na Fase I, o nascimento prematuro atrasa o crescimento vascular da retina onde, após a fase II, a vascularização inacabada da retina em desenvolvimento causa hipóxia, o que induz a expressão de fatores de crescimento angiogênico que estimulam o crescimento de novos e anormais vasos sanguíneos8. O modelo OIR tem sido um modelo amplamente utilizado para estudar a fisiopatologia do ROP e outras retinopatias isquêmicas, bem como para testar novos candidatos a drogas2,3,9. É amplamente considerado como um modelo reprodutível para a realização de estudos de prova de conceito para potenciais drogas antiangiogênicas para doenças oculares e não oculares. Os dois modelos de roedores, ou seja, o OIR de rato e rato diferem em seu modelo de indução e fenótipo da doença. O modelo de rato imita o fenótipo ROP com mais precisão, mas o modelo do mouse fornece um modelo mais robusto, rápido e reprodutível para neovascularização da retina (NV). No modelo do mouse, a NV se desenvolve para a retina central. Essa leitura patológica é importante em estudos de eficácia farmacológica para muitas retinopatias isquêmicas, como PDR, RV e DM exudativa, bem como para doenças angiogênicas não oculares, como o câncer. Além disso, a disponibilidade de camundongos geneticamente manipulados (transgênicos e nocautes) torna o modelo OIR do mouse uma opção mais popular. No entanto, nem o modelo de OIR de rato nem rato cria fibrose retinenta, que é típica em doenças humanas.

O entendimento de que altos níveis de oxigênio contribuem para o desenvolvimento da ROP na década de 195010,11 levou ao desenvolvimento de modelos animais. Os primeiros estudos sobre o efeito do oxigênio na vasculatura da retina foram feitos em 195012,13,14 e até a década de 1990 houve muitos refinamentos para o modelo OIR. A pesquisa de Smith et al. em 1994 estabeleceu um padrão para o modelo OIR do rato atual que separa a hialoidopatia da retinopatia15. Uma ampla adoção do método para quantificar a vaso-obliteração e o NV patológico por Connor et al. (2009) aumentou ainda mais sua popularidade16. Neste modelo, os camundongos são colocados a 75% de oxigênio (O2) por 5 dias em P7, seguidos por 5 dias em condições normóxidas. A hiperoxia de P7 a P12 faz com que a vasculatura da retina regreda na retina central. Ao retornar às condições normóxicas, a retina avascular torna-se hipóxica (Figura 1A). Devido aos estímulos hipóxicos da retina central avascular, alguns dos vasos sanguíneos da retina brotam em direção ao vítreo, formando nv pré-retinal, chamado tufos pré-semanais2,3. Estes tufos são imaturos e hiperpermeáveis. A quantidade de NV atinge picos em P17, após o qual ele regrede. A retina é totalmente revascularizada e a NV é totalmente regredida por P23 - P25 (Figura 2A)2,3.

O modelo OIR de rato (utilizando níveis variados de O2) foi descrito pela primeira vez na década de 1990 mostrando que níveis variados de O2 a 80% e 40% causam mais NV pronunciado do que abaixo de 80% O2 exposição constante17. Mais tarde, descobriu-se que o modelo de hipóxia intermitente, onde O2 é ciclou da hiperoxia (50%) à hipóxia (10-12%), causa ainda mais NV do que o modelo 80/40% O2 18. No modelo 50/10%, os filhotes de rato são expostos a 50% durante 24 horas, seguidos por 24 horas em 10% O2. Esses ciclos são continuados até P14, quando os filhotes de rato são devolvidos às condições normóxicas(Figura 1B). Assim como em pacientes humanos de ROP, no modelo de ratos as áreas avasculares desenvolvem-se para a periferia da retina por causa do plexo vascular imaturo da retina(Figura 3).

Em ambos os modelos, os principais parâmetros que geralmente são quantificados são o tamanho de AVA e NV. Esses parâmetros são tipicamente analisados a partir de montagens planas de retina onde as células endoteliais são rotuladas4,16. Anteriormente, a quantidade de NV pré-retinal foi avaliada a partir de seções transversais da retina, contando vasos sanguíneos ou núcleos de células vasculares que se estendem até vítreos acima da membrana limitante interna. A maior limitação dessa abordagem é que não é possível quantificar os AVAs.

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Protocol

O protocolo aqui descrito foi aprovado pelo Comitê Nacional de Ética Animal da Finlândia (número de protocolo ESAVI/9520/2020 e ESAVI/6421/04.10.07/2017).

1. Indução experimental de animais e modelo OIR do rato

NOTA: Use animais com acasalamento de tempo, por exemplo, camundongos C57BL/6J comumente usados, para fazer filhotes nascerem no mesmo dia. Utilize barragens de fomento, por exemplo, 129 cepas (129S1/SvImJ ou 129S3/SvIM) para amamentar os filhotes durante e após a indução da hiperoxia. Alternativamente, certifique-se de que há barragens de lactação extras disponíveis no caso de as barragens de enfermagem precisarem ser substituídas devido à exaustão. Restringir o tamanho do lixo a 6-7 filhotes para cada barragem ao usar ratos/barragens C57BL/6J (se as ninhadas forem maiores do que as que os filhotes tendem a ter ganho de peso restrito)16.

  1. Regissuir o peso dos animais antes e depois da indução da hiperoxia, e no momento do sacrifício.
  2. Certifique-se de que há comida suficiente no fundo da gaiola, para que as barragens tenham um fácil acesso aos alimentos.
  3. Adicione refrigerante com indicador de cor na parte inferior da câmara para absorver o excesso de CO2 quando um sistema de filtragem não for usado.
  4. Monitore a umidade e a temperatura dentro da câmara e mantenha a umidade entre 40 e 65%. Aumente a umidade da câmara, se necessário, colocando pratos com água no fundo da câmara (por exemplo, pratos de Petri).
  5. Calibrar o sensor O2 com 100% O2 e ar normal da sala.
  6. Coloque os ratos P7 em uma câmara e configure o nível O2 para 75%. Mantenha os ratos na câmara por 5 dias, até P12. Evite abrir a câmara durante a indução da hiperoxia. Verifique a pressão do gás do cilindro O2 e substitua o cilindro quando necessário. Monitore os animais durante a indução.
  7. Tire as gaiolas do rato da câmara e pese todos os filhotes. Agrupar os filhotes com base no peso para que cada grupo experimental tenha distribuição de peso semelhante em filhotes.

2. Indução experimental de animais e modelo OIR de rato (utilizando sistema semi-fechado)

NOTA: Use animais com acasalamento de tempo para que os filhotes nasçam no mesmo dia. Para o OIR de rato, use o aumento do tamanho do lixo, aproximadamente 18 filhotes/barragem, para obter indução suficiente de NV no modelo de rato. Filhotes de piscina de várias ninhadas para obter filhotes suficientes para cada ninhada.

  1. Registo o peso dos animais antes e depois da indução, e no momento do sacrifício.
  2. Certifique-se de que há comida suficiente no fundo da gaiola, para que as barragens tenham um fácil acesso aos alimentos.
  3. Adicione refrigerante com indicador de cor na parte inferior da câmara para absorver o excesso de CO2 quando o sistema de filtragem não for utilizado.
  4. Monitore a umidade e a temperatura dentro da câmara. Absorva umidade extra (gerada a partir de vários números de ratos) adicionando gel de sílica no fundo da câmara.
  5. Calibrar o sensor O2 com 100% N2 e ar normal da sala.
  6. Coloque os ratos na câmara em P0 (poucas horas após o nascimento). Defina o nível O2 para 50% e conecte O2 cilindros à câmara por 24 h. Depois disso, mude as configurações para 10% O2 e conecte o cilindro de nitrogênio (N2) à câmara por 24 h. Continue o ciclismo de 24h entre 50% e 10% níveis de O2 durante 14 dias.
  7. Monitore o consumo de gás e o bem-estar dos animais durante o estudo. Abra a câmara durante a troca entre 50/10% O2 e adicione mais comida e água, se necessário. Troque as gaiolas dos animais para limpar as durante a indução.
  8. Tire as gaiolas de ratos da câmara e pese todos os filhotes. Agrupar os filhotes com base no peso para que cada grupo experimental tenha distribuição de peso semelhante nos filhotes.

3. Administração de medicamentos (opcional)

NOTA: A rota de administração de medicamentos comumente usada em OIR é por tratamento intravitreal (ivt), em P12-P14 para camundongos e em P14 para ratos. Determine o dia do tratamento com base na configuração experimental. Quando várias ninhadas de filhotes são usadas em experimentos, divida os grupos de tratamento para ter animais de todas as ninhadas. De preferência, injete a droga em apenas um olho, e mantenha o olho contralateral como controle.

  1. Pesar os animais e fazer marcas de identificação na cauda e/ou orelha.
  2. Anestesiar o animal com anestesia injetável (por exemplo, mistura de cetamina e medetomidina, 30 mg/kg e 0,4 mg/kg para camundongos) ou com anestesia inalação (isoflurano a 2-3,5% de isoflurano e 200-350 mL/min de fluxo de ar). Verifique a profundidade da anestesia beliscando os dedos dos dedos. Mantenha o animal em uma almofada de aquecimento durante o tratamento.
  3. Para anestesia local, aplique uma gota de analgésico na pálpebra. Abra a pálpebra cuidadosamente com fórceps antes de realizar o ivt, enquanto ratos e ratos abrem os olhos em torno de P14. Aplique uma gota de analgésico (por exemplo, cloridrato de oxibuprocaina) na córnea.
  4. Aplique uma gota de iodo antes de conduzir a injeção de ivt.
  5. Para a injeção de ivt use uma seringa de vidro com uma agulha de 33-34 G presa. Pressione as pálpebras para baixo e aperte o globo ocular com fórceps. Faça a injeção posterior ao limbus, aproximadamente em agulha de ângulo de 45° apontando para o nervo óptico.
  6. Evite injetar mais de 1,0 μL no espaço intravitreal. Mantenha a agulha no lugar por 30 s depois de injetar a droga para evitar o refluxo da solução injetada.
  7. Examine o olho (por exemplo, com um oftalmofóscópio) para quaisquer complicações, como hemorragias ou danos na retina, após a remoção da agulha. Aplique pomada antibiótica em cima da córnea após a injeção.
    NOTA: O volume de injeção de ivt para camundongos deve ser de 0,5 – 1,0 μL.
  8. Inverta a anestesia (por exemplo, com um antagonista α2 para medetomidina (2,5 mg/kg) e devolva o filhote para a gaiola. Abrigar a ninhada normalmente até o final do estudo.

4. Imagem in vivo e eletroretinografia (opcional)

  1. Se desejar, realize imagens in vivo em animais vivos durante o período de seguimento para registrar alterações que se desenvolvem na retina durante as respostas angiogênicas. Por exemplo, realize a angiografia fluoresceína (FA) ou a microscopia confocrática a laser19 para visualizar a vasculatura(Figura 4). Use a tomografia de coerência óptica de domínio espectral (SD-OCT) para visualizar camadas de retina in vivo(Figura 4).
  2. Se desejar, investigue alterações funcionais em diferentes populações de células da retina após a indução de OIR por meio da eletroretina (ERG) (Figura 5).

5. Coleta de tecidos e preparação de montagens planas de retina

NOTA: Recolher os tecidos de acordo com a hipótese desejada da pesquisa. Para camundongos, colete as amostras, por exemplo, em P12 (para estudar vaso-obliteração após a fase hiperóxica) ou no período hipóxico (P13-P17). Colete as amostras de OIR do mouse em P17, que é o ponto de tempo mais comum para amostragem, para detectar o pico na quantidade de NV. Em OIR de rato, recolham as amostras em P18-P21 para observar a maior quantidade de NV(Figura 3).

  1. Pesar os animais antes da amostragem.
  2. Para rotular a vasculatura da retina, animais profundamente anestesiados podem ser transcardiais perfumados com FITC-dextran. (Alternativamente, colori a retina plana montada com Isolectina posteriormente).
  3. Sacrifique os animais usando overdose de drogas de anestesia (por exemplo, mistura de cetamina e medetomidina, 300 mg/kg e 4 mg/kg para camundongos) ou inalação de CO2.
  4. Colete os olhos dos animais agarrando atrás do globo ocular com fórceps curvas, corte o tecido ao redor dos olhos e levante o olho para fora da órbita.
  5. Incubar os globos oculares em recém-fabricados, filtrados 4% de paraformaldeído (em salina tamponada com fosfato, PBS) por 1-4 h. Retire o fixador e lave os globos oculares 3 x 10 min com PBS. Disseca as retinas imediatamente ou armazene-as em PBS a +4 °C.
    ATENÇÃO: O paraformaldeído é tóxico por inalação, em contato com a pele e se engolido. Leia a ficha técnica de segurança antes de trabalhar com ela.
    NOTA: Não aplique pressão no globo ocular durante a amostragem ou qualquer fase do processamento do tecido, a fim de evitar o descolamento da retina, se forem feitas seções transversais de globos oculares inteiros.
  6. Prepare montagens planas de retina para quantificar a quantidade de NV e o tamanho de AVAs. Alternativamente, processe os globos oculares/retinas para histologia, ou RNA ou análise de proteínas. Dissecar a retina sob um microscópio estéreo usando micro tesouras e fórceps.
    1. Coloque o globo ocular na PBS para mantê-lo úmido e perfurar o globo ocular no limbus com uma agulha (23G) e corte em torno de limbus com micro tesoura curva para remover íris e córnea.
    2. Coloque cuidadosamente a ponta da tesoura entre esclera e retina e corte esclera em direção ao nervo óptico. Faça o mesmo com o outro lado do globo ocular, e corte cuidadosamente/rasgue a esclera até que o copo de retina seja exposto. Retire a lente do copo de retina e adicione PBS ao copo.
    3. Remova todos os vasos hialoides, vítreos e detritos sem danificar a retina. Lave a retina adicionando PBS ao copo de retina. Realize quatro incisões (às 12, 3, 6 e 9 horas) na retina com micro tesoura reta para fazer uma estrutura semelhante a uma flor. Opcionalmente, faça os cortes com lâmina cirúrgica antes de montar as amostras. Levante a retina usando um pincel macio em uma placa de bem para coloração.
  7. Rotule a vasculatura da retina usando Isolectina B4 que mancha a superfície das células endoteliais (se os animais não foram perfundidos com FITC-dextran). Incubar as retinas no tampão de bloqueio (10% NGS + 0,5% Triton em TBS) por 1h e lavar com 1% de NGS + 0,1% Triton na TBS por 10 min. Incubar as retinas com corante fluorescente conjugado Isolectina B4 (5-10μg/ml) em 1% NGS + 0,1% Triton em TBS durante a noite a +4 °C enquanto protegido da luz.
    NOTA: Se desejar, rotule outras células, como células inflamatórias e pericílitos usando anticorpos específicos.
  8. Lave as retinas 3x por 10 min com 1% de NGS + 0,1% Triton em TBS e levante retinas em um slide microscópico, retina interna voltada para cima. Espalhe cuidadosamente a retina usando pincel macio e remova quaisquer vasos ou detritos hialoides restantes. Adicione o meio de montagem a um deslizamento de cobertura e coloque-o em cima da retina. Armazene retinas a +4 °C e proteja contra a luz.

6. Análise das montagens planas

  1. Faça imagens das montagens planas da retina usando um microscópio de fluorescência com objetivo de 10x. Foco no plexo vascular superficial e na neovascularização pré-retinal. Faça uma imagem de varredura de ladrilhos para capturar toda a retina e mesclar as varreduras de ladrilhos
  2. Quantifique as imagens medindo os AVAs, área de NV e área total da retina utilizando um programa de processamento de imagens (ver Tabela de Materiais).
    1. Desenhe os AVAs e a área total da retina usando uma ferramenta de desenho manual livre e selecione as áreas neovasculares usando uma ferramenta de seleção. O software mede as regiões de interesse em pixels, e as áreas de AVA e NV (expressas em pixels) podem ser usadas para calcular sua porcentagem em relação à área total da retina. Além disso, algumas ferramentas de software estão disponíveis para quantificar NV.
      NOTA: Recentemente, foram introduzidos programas de código aberto e totalmente automatizados para a quantificação dos principais valores das imagens OIR usando redes neurais de aprendizagem profunda e fornecem uma ferramenta confiável para quantificação reprodutível de AVA e NV reacionárias (por exemplo, https://github.com/uw-biomedical-ml/oir/tree/bf75f9346064f1425b8b9408ab792b1531a86c64)20,21.
  3. Se usar anticorpos para detecção imunohistoquímica de populações celulares individuais, quantifique o número de células manchadas (como microglia, Figura 2B) a partir dos suportes planos da retina à mão ou por sistemas automatizados de análise de imagem, se desejar.

7. Estatísticas

  1. Analise dados normalmente distribuídos pelo teste t do Student ou ANOVA one-Way seguido pelo teste de comparações múltiplas de Dunnett ou Tukey, conforme apropriado. Use testes não paramétricos como teste Mann-Whitney U ou teste kruskal Wallis para dados não normalmente distribuídos. Considere diferenças estatisticamente significativas no nível P < 0,05.

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Representative Results

O principal desfecho do modelo é o fenótipo vascular: o tamanho das AVAs e a quantidade de NV. No modelo OIR do camundongo, a vaso-obliteração ocorre na retina central (Figura 2A), enquanto no modelo de rato ele se desenvolve na periferia, ou seja, semelhante ao ROP22 humano (Figura 3A). Isso porque o plexo vascular superficial já se desenvolveu quando os camundongos são expostos à hiperoxia, enquanto no modelo de rato a retina é avascular no momento da indução de OIR (P0). A neovascularização pré-retinal desenvolve-se perto das áreas avasculares, ou seja, retina central em camundongos e periferia em ratos(Figura 2A e Figura 3A).

A análise histológica utilizando seções transversais ou montagens planas pode ser feita para avaliar alterações morfológicas nas retinas OIR ou a presença de tipos de interesse celular, por exemplo, células inflamatórias(Figura 2B). Além da retina, amostras oculares inteiras ou vítreas podem ser coletadas para novas análises de expressão genética e proteica em diferentes pontos de tempo durante o modelo OIR. Os níveis de expressão genética ou proteica podem ser analisados com métodos padrão, como RT-qPCR ou mancha ocidental.

Opcionalmente, imagens in vivo não invasivas podem ser realizadas durante o período de seguimento do OIR. A vasculatura retinana e hialoide pode ser visualizada com FA (Figura 4A). O SD-OCT pode ser usado para avaliar alterações estruturais na retina (Figura 4B). Alterações funcionais na retina podem ser medidas por ERG (Figura 5).

Os inibidores do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) são comumente utilizados no tratamento de doenças oculares angiogênicas humanas. Assim, o anti-VEGF é frequentemente usado como um composto de referência em OIR. O aflibercept, que funciona como uma armadilha VEGF solúvel, inibe tanto a NV quanto a revascularização fisiológica em OIR em doses altas e baixas (injetadas em P14). Os olhos OIR injetados em P14 com alta dose de aflibercepto tinham AVAs de retina ainda maiores do que os olhos não tratados(Figura 6). Isso sugere que os blocos de aflibercept também fisiológicos revascularização da retina impulsionada pela hipóxia. Ambos os modelos de camundongos e ratos podem ser usados para avaliar o efeito de diferentes agentes anti-angiogênicos na RETINA NV e revascularização fisiológica da retina (Figura 3B e Figura 6).

Figure 1
Figura 1: Visão geral gráfica de um projeto de estudo OIR padrão para ratos e ratos. (A) O modelo Mouse OIR foi induzido por expor os ratos a 75% O2 de P7 a P12 e retornou ao ar normal da sala. O pico de NV pré-retinal foi visto em P17, que geralmente é o ponto de amostragem para o experimento. (B) O modelo Dedoro foi induzido por expor os ratos a níveis alternados de O2 (50/10 % O2) de P0 a P14 e retornou às condições normóxicas. Ratos são geralmente sacrificados em P20, quando a quantidade de NV atingiu o pico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Fenótipo vascular no modelo OIR do mouse. Mouse OIR modelo foi gerado como descrito na Figura 1. (A) O plexo vascular superficial desenvolveu-se em camundongos normais, enquanto os camundongos OIR foram expostos a 75% O2 de P7 a P12. Durante esse período, a obliteração vascular desenvolveu-se na retina central (marcada em azul em P12 e P17 nas imagens quantificadas). Os camundongos foram devolvidos ao ar normal da sala, e a retina avascular tornou-se hipóxica, levando ao recrescimento funcional do vaso na retina e no NV patológico (marcado em vermelho em P17 no painel inferior). Tufos neovasculares pré-retais desenvolvidos entre as áreas vascular e avascular na retina central. A quantidade de NV atingiu o pico em P17 e regrediu depois. A retina foi totalmente revascularizada e o NV regrediu em torno de P24-P25. (B) Um exemplo de coloração imunohistoquímica do suporte plano da retina mostrando microglia manchada de retina Iba-1 (verde) e vasos sanguíneos manchados GS-IB4 (vermelho) em P12 e P17. (C) Seção transversal de um olho OIR do rato em P17, onde tufos pré-semanais (flechas) estavam brotando em direção ao vítreo. Além disso, foi visto o afinamento da camada nuclear interna (INL) e da camada plexiforme externa (OPL). As barras de escala são 1 mm em A, 50 μm em B e 100 μm em C. ILM = membrana limitante interna, GCL = camada celular gânglio, IPL = camada plexiforme interna, INL = camada nuclear interna, OPL = camada plexiforme externa, ONL = camada nuclear externa, RPE = epitélio pigmento de retina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Fenótipo vascular e seu desenvolvimento no modelo OIR de rato. (A) Áreas avasculares (marcadas em azul) e NV (marcadas em vermelho) desenvolvidas na periferia da retina, semelhantes ao ROP humano. (B) AvAs foram vistos em retinas OIR, mas não em controles normóxicos. (C) A quantificação da área de NV mostrou tendência para um pico na quantidade de VV em P20, mas a diferença não foi estatisticamente significante em relação ao P18 e P21 em OIR. (O teste t do aluno, entre o tempo correspondia às retinas normoxic e OIR, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001, ambos os olhos dos animais traçados no gráfico). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Imagem in vivo usando angiografia fluoresceína (FA) e tomografia de coerência óptica de domínio espectral (SD-OCT) no modelo OIR de rato. (A) A tortuosidade vascular (pontas de flecha) foi vista nas imagens tiradas da retina central (linha superior) em P18 e P20 em ratos OIR em comparação com ratos P19 normóxicos. NV (setas) e AVAs (asterisco) desenvolveram-se para a periferia da retina (linha média) como visto nas retinas P18 e P20 OIR. Vasos hialoides regredindo (linha inferior) foram capturados por FA. (B) O crescimento dos vasos sanguíneos em direção ao vítreo foi observado como um espessamento na camada de fibra nervosa (NFL) e camada de célula de glion (GCL) nas retinas OIR (seta). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: A funcionalidade dos neurônios da retina pode ser medida usando eletroretinação flash (fERG). (A) as ondas a foram derivadas do cone de retina e fotorreceptores de haste e suas amplitudes foram significativamente diminuídas no modelo OIR de rato. O efeito aumentou com uma maior intensidade de luz, sugerindo que os defeitos estavam afetando as funções do fotorreceptor do cone principalmente. (B) As amplitudes de ondas B dos animais OIR foram diminuídas em comparação com os controles normóxicos. As ondas B foram derivadas de células ON-bipolares e células Müller. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: PbS injetado intravitrealmente reduz NV e AVAs no modelo OIR do mouse. (A) Imagens representativas de montagens planas de retina não tratadas, e tratadas com aflibercept (20 μg em P14) e PBS injetadas olhos OIR em P17. A alta dose de aflibercept (20 μg) aumentou o tamanho dos AVAs em 47% (delineado em branco) e inibiu a NV em 98% (setas) em comparação com controles não tratados. A injeção de PBS diminuiu os AVAs em 31% e o NV em 42% em comparação com os controles não tratados. Além disso, a punção da esclera semelhante ao ivt produziu efeitos semelhantes à injeção de ivt de PBS, mas as diferenças não foram estatisticamente significativas. Ponta de flecha aponta para vasos hialoides que não foram removidos durante a dissecção. (One-Way ANOVA, * p ≤ 0,05; ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001, **** p ≤ 0,0001). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

A gravidade do fenótipo da doença depende tanto da cepa quanto mesmo do fornecedor nos modelos OIR de camundongos e ratos23. Isso sugere que há uma ampla variabilidade genotipa no desenvolvimento da patologia. Em geral, roedores pigmentados desenvolvem fenótipo mais severo do que os albinos. Por exemplo, a vasculatura de retina do albino BALB/c revasculariza-se rapidamente após a hiperoxia e não desenvolve NV em todos os24. Da mesma forma, em ratos, ratos da Noruega Marrom pigmentados apresentam patologia mais grave do que os ratos albinos Sprague Dawley (SD)25. Ratos SD são comumente usados, e diferenças relacionadas ao fornecedor no fenótipo OIR foram relatadas dentro da cepa. Por exemplo, ratos SD de Charles River produzem significativamente mais NV do que ratos de Harlan ou Zivic-Miller23. Os camundongos C3H/HeJ, por sua vez, que têm uma mutação no gene de degeneração da retina 1(Rd1),têm retinas finas e não desenvolvem NV26. Devido a essas razões e à disponibilidade de linhas de camundongos transgênicos, o C57BL/6J de raça é a cepa de camundongos mais utilizada para estudos OIR. No entanto, há uma mortalidade bastante alta entre as barragens C57BL/6J devido à exposição hiperóxica, por isso o bem-estar dos camundongos precisa ser considerado ao projetar o estudo e monitorado durante os experimentos. Além disso, o aumento do dano do fotorreceptor é visto em camundongos C57BL/6 em comparação com os ratos BALB/c27.

Para garantir o bem-estar dos camundongos e a sobrevivência das barragens e filhotes, o tamanho da ninhada deve ser mantido pequeno (6-7 filhotes/barragem). Isso é especialmente importante quando se usa camundongos C57BL/6, mais suscetíveis ao estresse hiperóxico27,28. Além disso, alimentos de suporte de fácil acesso (colocados na parte inferior da gaiola) devem ser fornecidos aos ratos. Alguns pesquisadores usam barragens substitutas para substituir as barragens na câmara por as saudáveis após a indução de oxigênio. No entanto, a maioria dos pesquisadores usa substitutos apenas se a barragem estiver esgotada22,29. As barragens substitutas são recomendadas para serem usadas se forem utilizadas grandes tamanhos de lixo. Foi publicado que os camundongos 129S3/SvIM produzem mais NV do que C57BL/6 e sustentam melhor as alterações causadas pelosdiferentes níveisde oxigênio 28 . Deve-se notar que as barragens utilizadas no OIR não são desfertiladas após a indução de OIR e não devem ser utilizadas para fins de reprodução posteriores22. O ganho de peso pós-natal dos filhotes afeta a gravidade da patologia OIR. Filhotes com baixo ganho de peso pós-natal (<5 g em P17) apresentam expressão retardada do VEGF e, portanto, fase prolongada de retinopatia quando comparados a filhotes com normal (5 - 7,5 g em P17) ou ganho de peso extenso (>7,5 g em P17)29. Além disso, os filhotes de camundongos que pesam mais de 5 g em P7 não apresentam áreas desniliteadas vaso após a indução de OIR30. Assim, é importante pesar os filhotes durante o experimento. O olho não tratado contralateral pode ser usado como um controle interno para garantir que o estado nutricional dos camundongos não afete os resultados. A situação é semelhante em ratos; quanto menores forem os filhotes, mais severos fenótipos OIR desenvolvem31. Assim, recomenda-se que o tamanho do lixo grande (aproximadamente 18 filhotes) seja usado para o modelo OIR de rato.

A indução do modelo OIR pode ser feita usando um sistema totalmente fechado, onde há um circuito de laço fechado com uma bomba que circula o ar através de um sistema de filtro (soda cal e carbono ativado) de volta para a câmara. Outra opção é um sistema semi-fechado, onde a ventilação garante que o excesso de metabólitos seja removido da câmara. Para garantir que o excesso de CO2 seja removido, o limão refrigerante (mistura de hidróxido de cálcio com hidróxido de sódio ou hidróxido de potássio) pode ser colocado no fundo da câmara. A remoção do CO2 é obrigatória, pois os altosníveis de CO 2 pioram o fenótipo da doença em ratos32. Deve-se lembrar também de recalibrar o sensor de oxigênio da câmara regularmente, pois eles tendem a deriva ao longo do tempo e podem fornecer concentração de oxigênio errada do pretendido.

Foi relatado que a injeção de veículo (PBS) sozinha ou mesmo apenas a punção ao espaço intravireal tem um efeito para a taxa de revascularização e a quantidade de NV (Figura 6)33,34,35,36. Especula-se se o efeito visto com a injeção de PBS/veículo pode ser devido a alterações na pressão intraocular durante a injeção, ou devido a lesões em estruturas oculares que aumentam os níveis de fatores de crescimento angiogênico entre eles o fator de crescimento derivado do epitélio34,37. Além disso, apenas uma injeção subretinal piloto (punção ao espaço subretinal) tem mostrado ter efeitos sobre o fenótipo vascular e funcional em OIR quando comparado com os ratos não tratados38. Esses resultados destacam a importância de controles negativos adequados nos estudos OIR ou mesmo na administração sistêmica de compostos testados, bem como números n suficientes em cada grupo de estudo. O fato de a injeção veicular realmente aumentar a taxa de revascularização na retina é um fator limitante importante, pois a taxa de revascularização e a formação de tufos pré-retais patológicos estão inter-relacionados no modelo OIR: se a taxa de revascularização for acelerada, leva à queda compensatória dos tufos neovasculares e vice-versa. Assim, ambas as medidas de desfecho primário do modelo OIR são afetadas pela injeção do veículo.

Os inibidores vegf revolucionaram o tratamento que o modelo AMD e DR. OIR foi usado para demonstrar sua eficácia preclinicamente. Em relação aos inibidores do VEGF na OIR, um estudo comparando diferentes anti-VEGFs e anti-PlGFs (fator de crescimento placentário) (injetado em P12) mostrou que apenas o anti-VEGF levou a pequenas áreas avasculares, enquanto os olhos tratados anti-PIGF tinham áreas avasculares maiores33. A Aflibercept teve os maiores AVAs quando comparado com outros tratamentos medicamentosos33. O Aflibercept é conhecido por ligar vegf e PlGF39, pode ser que inibir PlGF em OIR leva ao bloqueio da angiogênese fisiológica.

A imagem in vivo não invasiva fornece uma ferramenta para monitorar vasculatura de retina40 e camadas de retina e estrutura durante o período de seguimento. Utilizando FA, parâmetros como densidade vascular e tortuosidade arterial e dilatação venosa (chamada mais doença, Figura 4A) podem ser medidos40,41. O SD-OCT pode ser usado para avaliar alterações estruturais e medir a espessura da retina durante o período de seguimento do OIR42,43. O ERG é usado para medir as alterações funcionais na retina. Diferentes tipos de células produzem potenciais elétricos após estímulos leves, e esses sinais ou "ondas" podem ser medidos com ERG. Fotorreceptores estão produzindo a onda A negativa, e as células bipolares ON e Müller são as principais responsáveis pela onda B44. A perda da função da retina é típica em camundongos OIR e ratos45,46 ( Figura5). Alterações duradouras persistem na retina e tanto alterações funcionais quanto alterações no nível da proteína têm sido relatadas nas retinas OIR mesmo após a revascularização e a regressão de NV34,47.

Para visualizar a vasculatura da retina, os ratos vivos podem ser perfumados com dextran com etiqueta FITC ou os suportes planos de retina podem ser manchados com corante fluorescente rotulado Isolectina B4. É preciso entender a diferença entre os corantes fluorescentes; a perfusão com fitc-dextrans rotula apenas o lúmen dos vasos, enquanto isolectina B4 mancha a superfície das células endoteliais. Assim, os vasos sanguíneos funcionais com lúmen adequado só serão visualizados com perfusão FITC-dextran, enquanto a área total de NV aparece maior em retinas manchadas de Isolectina B4 do que em animais perfusados FITC-dextran, pois isolectina B4 essencialmente capta até mesmo células endoteliais que ainda não formaram lumens funcionais ainda48. Uma opção mais recente para visualizar toda a retina/globo ocular em formato 3D é a imagem de tecido profundo por microscopia de fluorescência de dois fótons(49).

O modelo de OIR de roedores, bem como os modelos animais em geral, representam apenas parcialmente as características das doenças humanas. A principal diferença relacionada ao OIR é que a neovascularização da retina não está associada à fibrose no OIR roedor, enquanto a neovascularização da retina leva comumente à proliferação fibrovascular em doenças neovasculares humanas. Além disso, as condições que causam OIR vs. doença humana podem ser quase opostas. Os recém-nascidos prematuros com ROP requerem oxigênio suplementar com suporte respiratório, experimentam episódios hipoxêmicos e hiperoxêmicos frequentemente intermitentes causados por apneia recorrente, mas não são expostos a altos níveis de oxigênio. Para minimizar os danos permanentes, altas frações de O2 inspirado são evitadas. A esse respeito, nem o modelo de mouse com exposição constante a 75% O2 por 5 dias nem o modelo de rato 50/10 se assemelham à patogênese do ROP humano. Além disso, também há diferenças entre os modelos OIR do rato e do mouse. A neovascularização regrede no modelo de mouse com o resta establishment de vasos normais por P24, enquanto a condição piora no modelo OIR de rato (semelhante ao ROP humano). Embora, o modelo de OIR de rato mostre características clinicamente relevantes do ROP, como o desenvolvimento vascular da retina retardada e a subsequente neovascularização patológica, seu uso é limitado pela ausência quase completa de cepas de ratos transgênicos, custos de manutenção mais elevados e menos NV do que no modelo OIR do mouse.

Juntos, apesar das diferenças entre retinopatias isquêmicas humanas e modelos de OIR roedores, a facilidade pela qual o NV pode ser induzido, juntamente com fácil visualização e quantificação da retina, tornam os modelos OIR populares para estudar os mecanismos moleculares e potenciais terapêuticos para retinopatias proliferativas isquêmicas. Curiosamente, a exposição à hiperoxia no modelo OIR do camundongo também induz displasia broncopulmonar, outra doença causada pela oxigenoterapia suplementar em bebês prematuros humanos, mostrando que o modelo OIR poderia ser usado para explorar novos alvos tanto para a displasia ROP e broncopulmonar simultaneamente50.

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Disclosures

Os autores Maria Vähätupa, PhD, Niina Jääskeläinen, Marc Cerrada-Gimenez, PhD e Rubina Thapa são funcionários da Experimentica Ltd.

O autor Giedrius Kalesnykas, PhD, é um funcionário (Presidente e Diretor Executivo) e acionista da Experimentica Ltd. que oferece serviços de pesquisa de contratos empregando modelos OIR pré-clínicos usados neste artigo.

Tero Järvinen, M.D., PhD, e Hannele Uusitalo-Järvinen, M.D., PhD, não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Agradecemos a Marianne Karlsberg, Anne Mari Haapaniemi, Päivi Partanen e Anne Kankkunen pelo excelente apoio técnico. Este trabalho foi financiado pela Academia da Finlândia, Päivikki e Fundação Sakari Sohlberg, Fundação Tampere Tuberculosis, Fundação Médica Finlandesa, Fundação de Pesquisa do Distrito Hospitalar de Pirkanmaa e o Tampere University Hospital Research Fund.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
33 gauge, Small Hub RN Needle Hamilton Company 7803-05, 10mm, 25°, PS4 For intravitreal injection
Adobe Photoshop Adobe Inc. For image analysis
Air pump air100 Eheim GmbH & Co. KG. 143207 For inhalation anaesthesia
Anaesthesia unit 410 AP Univentor Ltd. 2360309 For inhalation anaesthesia
AnalaR NORMAPUR Soda lime VWR International Ltd 22666.362 For CO2 control during model induction
Attane Vet 1000 mg/g VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY vnr 17 05 79 For inhalation anaesthesia
Brush For preparation of flat mounts
Carbon dioxide gas For sacrifice
Celeris D430 ERG system Diagnosys LLC 121 For in vivo ERG
Cell culture dishes Greiner Bio-One International GmbH 664 160 For preparation of flat mounts
Cepetor Vet 1 mg/mL VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY vnr 08 78 96 For anaesthesia
Cover slips Thermo Fisher Scientific 15165452 For preparation of flat mounts
O2 Controlled InVivo Cabinet, Aninal Filtrarion System and Dehumidifier Coy Laboratory Products Closed system for disease model induction, optional for semi-closed system
E702 O2 sensor BioSphenix, Ltd. E207, 1801901 For oxygen level measurement
Envisu R2200 Spectral Domain Optical Coherence Tomograph (SD-OCT) Bioptigen, Inc. BPN000668 For in vivo imaging
Eye spears Beaver-Visitec International, Inc. 0008685 For intravitreal injection and in vivo imaging
Flexilux 600LL Cold light source Mikron 11140 For intravitreal injection or tissue collection
Fluorescein sodium salt Merck KGaA F6377-100G For in vivo imaging
Gas Exhaust unit (+Double 3-way valve, mouse and rat face masks, UNOsorb filter) UNO Roestvaststaal BV GEX 17015249 For inhalation anaesthesia
Glass syringe, Model 65 RN Hamilton Company 7633-01 For intravitreal injection
HRA2 Retina angiograph (FA) Heidelberg Engineering GmbH Spec-KT-05488 For in vivo imaging
Isolectin GS-IB4, Alexa Fluor 488 Conjugate Thermo Fisher Scientific I21411 For labeling retinal vasculature on flat mounts
Ketaminol Vet 50 mg/mL Intervet International B.V. vnr 51 14 85 For anaesthesia
Medicinal Oxygen gas For disease model induction
Mice C57BL/6JRj Janvier Labs Also other strains possible
Microscope slides Thermo Fisher Scientific J1800AMNZ For preparation of flat mounts
Minims Povidone Iodine 5% (unit) Bausch & Lomb U.K Limited vnr 24 11 304 For intravitreal injection
Nitrogen gas For disease model induction (rat)
Oftan Chlora 10 mg/g Santen Pharmaceutical Co., Ltd. vnr 55 01 11 For intravitreal injection
Oftan Metaoksedrin 100 mg/ml Santen Pharmaceutical Co., Ltd. vnr 55 03 43 For in vivo ERG
Oftan Obucain 4 mg/ml Santen Pharmaceutical Co., Ltd. vnr 55 03 50 For intravitreal injection
Oftan Tropicamid 5 mg/ml Santen Pharmaceutical Co., Ltd. vnr 04 12 36 For in vivo imaging
ProOx Model 110 O2 controller and animal chamber BioSphenix, Ltd. 803 For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system
ProOx Model P360 O2 controller and animal chamber BioSphenix, Ltd. 538 For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system
Rats CD(SD) Charles River Laboratories Also other strains possible
Revertor 5 mg/mL VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY vnr 13 04 97 For anaesthesia reversal
Silica gel For humidity control during model induction
Systane Ultra 10ml Alcon Tamro 2050250 For hydration of the eye
Systane Ultra unit 0.7ml Alcon Tamro 2064871 For hydration of the eye
Transfer pipette Thermo Fisher Scientific 1343-9108 For preparation of flat mounts
VENTI-Line VL 180 PRIME Drying oven VWR VL180S 170301 For drying silica gel
VisiScope SZT350 Stereomicroscope VWR 481067 For intravitreal injection or tissue collection

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