Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Kemirgenlerde İskemik Retina Hastalıkları için Oksijen Kaynaklı Retinopati Modeli

Published: September 16, 2020 doi: 10.3791/61482
Automatic Translation
1,2, 2, 2, 2, 1, 2, 1,3
1Faculty of Medicine and Health Technology, Tampere University & Tampere University Hospital, 2Experimentica Ltd, 3Eye Centre, Tampere University Hospital

Summary

Oksijen kaynaklı retinopati (OIR), prematürite retinopatisi ve proliferatif diyabetik retinopati gibi iskemik retina hastalıklarını modellemek ve neovasküler hastalıklar için antianjiyojenik ilaçların değerlendirilmesinde kavram kanıtı çalışmaları için bir model görevi görmek için kullanılabilir. OIR, retinada ölçülebilen sağlam ve tekrarlanabilir neovaskülarizasyona neden olur.

Abstract

İskemik retinopatiler için yaygın olarak kullanılan modellerden biri oksijen kaynaklı retinopati (OIR) modelidir. Burada OIR modeli indüksiyonu için ayrıntılı protokolleri ve hem farelerde hem de sıçanlarda okumalarını açıklıyoruz. Retinal neovaskülarizasyon OIR'de kemirgen yavrularını hiperoksi (fareler) veya alternatif hiperoksi ve hipoksi (sıçanlar) seviyelerine maruz kalarak indüklenmiştir. Bu modellerin birincil okumaları retinadaki neovasküler (NV) ve avasküler (AVA) alanların büyüklüğüdür. Bu preklinik in vivo model, potansiyel anti-anjiyojenik ilaçların etkinliğini değerlendirmek veya genetik olarak manipüle edilmiş hayvanlar kullanarak retina anjiogenezinde belirli genlerin rolünü ele almak için kullanılabilir. Model, deneyleri tasarlarken dikkate alınması gereken OIR indüksiyonunda bazı gerilme ve satıcıya özgü varyasyonlara sahiptir.

Introduction

Anjiyojenik göz hastalıklarının arkasındaki patolojiyi incelemek ve bu yıkıcı hastalıklara yeni terapötikler geliştirmek için güvenilir ve tekrarlanabilir deneysel modellere ihtiyaç vardır. Patolojik anjiogenez, ıslak yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) ve bunların arasında prematürite retinopatisi (ROP), proliferatif diyabetik retinopati (PDR) ve retinal ven tıkanıklığı (RVO)1, 2,3,4gibi birçok iskemik retina hastalığı için ayırt edicidir. İnsan ve kemirgen retinaları benzer bir gelişim modelini izler, çünkü hem insan hem de kemirgen retinası damarlı son dokular arasındadır. Retina vaskülat tamamen gelişmeden önce, retina besin kaynağını hyaloid vaskülürden alır, bu da retinal vaskülat gelişmeye başladığında geriler1,2. İnsanda, retinal vasküler gelişim doğumdan önce tamamlanır, kemirgenlerde ise doğumdan sonra retinal vaskülat büyümesi meydana gelir. Retinal vasküler gelişim kemirgenlerde postnatal olarak gerçekleştiğinden, anjiogenez2,3. Yenidoğan kemirgenler, üçüncü doğum sonrası haftanın sonuna kadar tam vasküler retina gelişimi elde edilene kadar yavaş yavaş gelişen bir avasküler retinaya sahiptir4. Yenidoğan faresinin büyüyen kan damarları plastiktir ve hiperoksi uyaranı sırasında gerileme geçirirler5.

ROP, Doğum ağırlığı 1.250 g6,7'nin altında olan prematüre bebeklerin neredeyse% 70'ini etkilediği için Batı ülkelerinde çocukluk körlüğünün önde gelen nedenidir. ROP, retina damarları normal büyümesini tamamlamadan doğan prematüre bebeklerde görülür. ROP iki aşamada ilerler: Faz I'de, preterm doğum retina vasküler büyümeyi geciktirir, faz II'den sonra, gelişmekte olan retinanın bitmemiş vaskülerleşmesi hipoksiye neden olur, bu da yeni ve anormal kan damar büyümesini uyaran anjiyojenik büyüme faktörlerinin ifade edilmesine neden olur8. OIR modeli, ROP ve diğer iskemik retinopatilerin patofizyolojisini incelemek ve yeni ilaç adaylarını test etmek için yaygın olarak kullanılan bir model olmuştur2,3,9. Oküler ve oküler olmayan hastalıklar için potansiyel antianjiyojenik ilaçlar için kavram kanıtı çalışmaları yapmak için tekrarlanabilir bir model olarak kabul edilir. İki kemirgen modeli, yani fare ve sıçan OIR, model indüksiyonu ve hastalık fenotipinde farklılık gösterir. Sıçan modeli ROP fenotipini daha doğru bir şekilde taklit eder, ancak fare modeli retina neovaskülarizasyonu (NV) için daha sağlam, hızlı ve tekrarlanabilir bir model sağlar. Fare modelinde, NV merkezi retinaya gelişir. Bu patolojik okuma, PDR, RV ve eksüdatif AMD gibi birçok iskemik retinopatinin yanı sıra kanser gibi oküler olmayan, anjiyojenik hastalıklar için farmakolojik etkinlik çalışmalarında önemlidir. Ayrıca, genetik olarak manipüle edilmiş (transgenik ve nakavt) farelerin mevcudiyeti, fare OIR modelini daha popüler bir seçenek haline getirir. Bununla birlikte, ne fare ne de sıçan OIR modeli, insan hastalıklarında tipik olan retina fibrozisi oluşturur.

Yüksek oksijen seviyelerinin 1950'lerde ROP gelişimine katkıda bulunduğunun anlaşılması10,11 hayvan modellerinin gelişmesine yol açmıştır. Oksijenin retinal vaskülür üzerindeki etkisi ile ilgili ilk çalışmalar 195012 , 13,14'te yapılmış ve 1990'lara kadar OIR modelinde birçok iyileştirme yapılmıştır. Smith ve arkadaşları tarafından 1994 yılında yapılan araştırma, hyaloidopatiyi retinopati15'tenayıran mevcut fare OIR modeli için bir standart belirledi. Connor ve ark. (2009) tarafından vazo-yok etme ve patolojik NV'yi ölçme yönteminin geniş bir şekilde benimsenmesi popülaritesini daha da artırdı16. Bu modelde, fareler P7'de 5 gün boyunca% 75 oksijene (O2)yerleştirilir, ardından normoksik koşullarda 5 gün. P7'den P12'ye hiperoksi, retina vaskülatlarının merkezi retinada gerilemesine neden olur. Normoksik durumlara geri döndüğünde, avasküler retina hipoksik hale gelir (Şekil 1A). Avasküler merkezi retinanın hipoksik uyaranları nedeniyle, retina kan damarlarının bir kısmı vitreusa doğru filizlenir ve preretinal tufts2,3olarak adlandırılan preretinal NV oluşturur. Bu tutamlar olgunlaşmamış ve hiperpermezik. NV miktarı P17'de zirveler, daha sonra geriler. Retina tamamen revaskülarizedir ve NV P23 - P25 (Şekil 2A)2,3tarafından tamamen geriletilir.

Sıçan OIR modeli (farklı O2seviyeleri kullanılarak) ilk olarak 1990'larda, değişen O2 seviyelerinin% 80 ve% 40'ta% 80'in altında daha belirgin NV'ye neden olduğunu gösteren açıklanmıştır O2 sürekli maruz kalma17. Daha sonra, O2'nin hiperoksiden (%50) geçtiği aralıklı hipoksi modelinin hipoksiye (%10-12), %80/40 O2 model18'dendaha fazla NV'ye neden olur. % 50/10 modelinde, sıçan yavruları 24 saat boyunca% 50'ye maruz kalır, ardından% 10 O2'de 24saat . Bu döngüler, sıçan yavrularının normoksik koşullara geri döndüğü P14'e kadar devam eder (Şekil 1B). İnsan ROP hastalarında olduğu gibi, sıçan modelinde de avasküler alanlar olgunlaşmamış retinal vasküler pleksus nedeniyle retinanın çevresine gelişir (Şekil 3).

Her iki modelde de, genellikle ölçülen ana parametreler AVA ve NV'nin boyutudur. Bu parametreler tipik olarak endotel hücrelerinin4,16olarak etiketlendiği retina düz montajlarından analiz edilir. Daha önce preretinal NV miktarı, iç sınırlayıcı zarın üzerinde vitreusa kadar uzanan kan damarı veya vasküler hücre çekirdekleri sayılarak retina kesitlerinden değerlendirildi. Bu yaklaşımın en büyük sınırlaması, AVA'ları ölçmenin mümkün olmamasıdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Burada açıklanan protokol Finlandiya Ulusal Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır (protokol numarası ESAVI/9520/2020 ve ESAVI/6421/04.10.07/2017).

1. Deneysel hayvanlar ve fare OIR modeli indüksiyonu

NOT: Yavruların aynı gün doğması için zaman çiftleşmesine neden olan hayvanları, örneğin yaygın olarak kullanılan C57BL/6J fareleri kullanın. Hiperoksinin indüksiyonu sırasında ve sonrasında yavruları emzirmek için 129 suş (129S1/SvImJ veya 129S3/SvIM) emziren barajlar kullanın. Alternatif olarak, bakım barajlarının tükenme nedeniyle değiştirilmesi gerektiğinde ekstra emziren barajlar olduğundan emin olun. C57BL/ 6J fareler / barajlar kullanırken her baraj için çöp boyutunu 6-7 yavru ile kısıtlayın (yavrular, yavruların sınırlı kilo alımına sahip olma eğiliminde olduğundan daha büyükse)16.

  1. Hiperoksi indüksiyondan önce ve sonra ve kurban anında hayvanların ağırlığını kaydedin.
  2. Kafesin dibinde yeterli yiyecek olduğundan emin olun, böylece barajlar yiyeceğe kolay erişime sahiptir.
  3. Filtrasyon sistemi kullanılmadığında fazla CO2'yi emmek için odanın altına renk göstergesine sahip soda kireç ekleyin.
  4. Odanın içindeki nemi ve sıcaklığı izleyin ve nemi% 40 ila 65 arasında tutun. Gerekirse, odanın dibine su ile bulaşıklar yerleştirerek odanın nemini artırın (örneğin, Petri yemekleri).
  5. O2 sensörini %100 O2 ve normal oda havasıyla kalibre edin.
  6. P7 farelerini bir odaya yerleştirin ve O2 seviyesini% 75'e ayarlayın. Fareleri P12'ye kadar 5 gün boyunca odada tutun. Hiperoksi indüksiyonu sırasında hazneyi açmaktan kaçının. O2 silindirinin gaz basıncını kontrol edin ve gerektiğinde silindiri değiştirin. İndüksiyon sırasında hayvanları izleyin.
  7. Fare kafeslerini odadan çıkar ve tüm yavruları tart. Yavruları ağırlığa göre grupla, böylece her deney grubu yavrularda benzer ağırlık dağılımına sahiptir.

2. Deney hayvanları ve sıçan OIR modeli indüksiyonu (yarı kapalı sistem kullanılarak)

NOT: Yavruların aynı gün doğmasını sağlamak için zamanla çiftleşen hayvanları kullanın. Sıçan OIR için, sıçan modelinde yeterli NV indüksiyonu elde etmek için yaklaşık 18 yavru / baraj olmak üzere artan çöp boyutu kullanın. Her çöpe yeterli yavru elde etmek için birkaç çöpten havuz yavruları.

  1. Hayvanların ağırlığını indüksiyondan önce ve sonra ve kurban anında kaydedin.
  2. Kafesin dibinde yeterli yiyecek olduğundan emin olun, böylece barajlar yiyeceğe kolay erişime sahiptir.
  3. Filtrasyon sistemi kullanılmadığında fazla CO2'yi emmek için odanın altına renk göstergesine sahip soda kireç ekleyin.
  4. Odanın içindeki nemi ve sıcaklığı izleyin. Odanın altına silika jel ekleyerek ekstra nemi (birden fazla sayıda sıçandan üretilen) emer.
  5. O2 sensörini %100 N2 ve normal oda havasıyla kalibre edin.
  6. Sıçanları P0'daki odaya yerleştirin (doğumdan birkaç saat sonra). O2 seviyesini % 50'ye ayarlayın ve O2 silindirini 24 saat boyunca hazneye bağlayın. Bundan sonra, ayarları% 10 O2'ye geçirin ve azot (N2)silindirini 24 saat boyunca odaya bağlayın. 14 gün boyunca % 50 ila% 10 O 2 seviyeleri arasında24 saat bisiklet sürmeye devam edin.
  7. Çalışma sırasında gaz tüketimini ve hayvanların refahını izleyin. %50/10 O2 arasındaki değişim sırasında hazneyi açın ve gerekirse daha fazla yiyecek ve su ekleyin. İndüksiyon sırasında hayvanların kafeslerini temiz olacak şekilde değiştirin.
  8. Fare kafeslerini odadan çıkar ve tüm yavruları tart. Yavruları ağırlığa göre gruplaştır, böylece her deney grubu yavrularda benzer ağırlık dağılımına sahiptir.

3. İlaç kullanımı (isteğe bağlı)

NOT: OIR'de yaygın olarak kullanılan ilaç uygulama yolu intravitreal tedavi (ivt), fareler için P12-P14 ve sıçanlar için P14'tedir. Deneysel kuruluma göre tedavi gününü belirleyin. Deneylerde birden fazla yavru kullanıldığında, tüm yavrulardan hayvan olması için tedavi gruplarını bölün. Tercihen, ilacı sadece bir göze enjekte edin ve karşıt gözü kontrol olarak tutun.

  1. Hayvanları tartın ve kuyruğa ve/veya kulağa kimlik işaretleri yapın.
  2. Hayvanı enjekte edilebilir anestezi (örneğin ketamin ve medetomidin karışımı, fareler için 30 mg/kg ve 0,4 mg/kg) veya inhalasyon anestezisi (% 2-3,5 izofluran ve 200-350 mL/ dk hava akışında izofluran) ile uyuşturun. Parmak uçlarını kıstırarak anestezinin derinliğini kontrol edin. Tedavi sırasında hayvanı bir ısıtma yastığında tutun.
  3. Lokal anestezi için göz kapağına bir damla analjezik uygulayın. Fareler ve sıçanlar P14 etrafında gözlerini açtığından, ivt'yi gerçekleştirmeden önce göz kapağınıps ile dikkatlice açın. Korneaya bir damla analjezik (örneğin oksibuprokain hidroklorür) uygulayın.
  4. Ivt enjeksiyonu yapmadan önce bir damla iyot uygulayın.
  5. Ivt enjeksiyonu için 33-34 G iğnesi takılı bir cam şırınga kullanın. Göz kapaklarını aşağı bastırın ve göz küresini asalarla kavrayın. Enjeksiyon arkasını limbusun içine, yaklaşık olarak optik sinire doğru işaret eden 45° açılı iğne yapın.
  6. İntravitreal alana 1,0 μL'den fazla enjekte etmekten kaçının. Enjekte edilen çözeltinin reflüden kaçınmak için ilacı enjekte ettikten sonra iğneyi 30 s yerinde tutun.
  7. İğneyi çıkardıktan sonra kanamalar veya retina hasarı gibi komplikasyonlar için gözü (örneğin oftalmoskopla) inceleyin. Enjeksiyondan sonra korneanın üzerine antibiyotik merhem uygulayın.
    NOT: Fareler için ivt enjeksiyon hacmi 0,5 – 1,0 μL olmalıdır.
  8. Anesteziyi tersine çevirin (örneğin medetomidin için bir α2-antagonist ile (2,5 mg / kg) ve yavruyu kafese geri koyun. Çöpü çalışmanın sonuna kadar normal şekilde barındırın.

4. In vivo görüntüleme ve elektroretinografi (isteğe bağlı)

  1. İstenirse, anjiyojenik yanıtlar sırasında retinada gelişen değişiklikleri kaydetmek için takip süresi boyunca canlı hayvanlar üzerinde in vivo görüntüleme gerçekleştirin. Örneğin, vaskülatı görselleştirmek için floresan anjiyografi (FA) veya tarama lazer konfokal mikroskopi19 gerçekleştirin (Şekil 4). Retina katmanlarını in vivo olarak görselleştirmek için spektral etki alanı optik tutarlılık tomografisini (SD-OCT) kullanın (Şekil 4).
  2. İstenirse, elektroretinografi (ERG) kullanarak OIR indüksiyonu sonrası farklı retina hücre popülasyonlarındaki fonksiyonel değişiklikleri araştırın (Şekil 5).

5. Doku toplama ve retina düz montajların hazırlanması

NOT: Dokuları istenen araştırma hipotezine göre toplayın. Fareler için, örnekleri örneğin P12'de (hiperoksik fazdan sonra vazo-obliterasyonu incelemek için) veya hipoksik dönemde (P13-P17) toplayın. NV miktarındaki tepe noktasını tespit etmek için örnekleme için en yaygın zaman noktası olan P17'de fare OIR örneklerini toplayın. Sıçan OIR'de, en yüksek NV miktarını gözlemlemek için örnekleri P18-P21'de toplayın (Şekil 3).

  1. Örneklemeden önce hayvanları tartın.
  2. Retinal vaskülatürü etiketlemek için, derin anesteziye maruz hayvanlar FITC-dekstran ile transkardiyel olarak perfüzyon yapılabilir. (Alternatif olarak, retina düz montajlarını daha sonra Isolectin ile lekelenin).
  3. Aşırı dozda anestezi ilaçları (örneğin ketamin ve medetomidin karışımı, fareler için 300 mg / kg ve 4 mg / kg) veya CO2 inhalasyonu kullanarak hayvanları kurban edin.
  4. Kavisli tokalarla göz küresinin arkasına tutunarak hayvanların gözlerini toplayın, gözlerin etrafındaki dokuyu kesin ve gözü yörüngeden kaldırın.
  5. Gözbebeklerini taze yapılmış, filtrelenmiş% 4 paraformaldehitte (fosfat tamponlu salin, PBS'de) 1-4 saat kuluçkaya yatırın. Fiksatifi çıkarın ve gözbebeklerini PBS ile 3 x 10 dk yıkayın. Retinaları hemen parçalara alın veya PBS'de +4 °C'de saklayın.
    DİkKAT: Paraformaldehit solunması, ciltle temas halinde ve yutulması durumunda toksiktir. Lütfen çalışmadan önce güvenlik veri sayfasını okuyun.
    NOT: Tüm göz kürelerinden kesitler yapılırsa, retina dekolmanını önlemek için örnekleme sırasında veya doku işleminin herhangi bir aşamasında göz küresine basınç uygulamayın.
  6. NV miktarını ve AVA'ların boyutunu ölçmek için retina düz montajları hazırlayın. Alternatif olarak, histoloji veya RNA veya protein analizi için göz kürelerini / retinaları işleyin. Retinayı stereo mikroskop altında mikro makas ve etops kullanarak parçalara ayrıştırın.
    1. Göz küresini nemli tutmak için PBS'ye yerleştirin ve göz küresini bir iğneyle (23G) limbusta delin ve iris ve korneayı çıkarmak için kavisli mikro makasla limbus etrafında kesin.
    2. Makasın ucunu sklera ve retina arasına dikkatlice yerleştirin ve sklerayı optik sinire doğru kesin. Aynı şeyi göz küresinin diğer tarafına da yapın ve retina kabı açığa çıkana kadar sklerayı dikkatlice kesin / yırtın. Lensi retina kabından çıkarın ve fincana PBS ekleyin.
    3. Retinaya zarar vermeden tüm hyaloid damarları, vitreus ve döküntüleri çıkarın. Retina kabına PBS ekleyerek retinayı yıkayın. Çiçek benzeri bir yapı yapmak için retinaya düz mikro makasla dört kesi (saat 12, 3, 6 ve 9'da) yapın. İsteğe bağlı olarak, numuneleri monte etmeden önce cerrahi bıçakla kesimleri yapın. Yumuşak bir boya fırçası kullanarak retinayı boyama için iyi bir tabağa kaldırın.
  7. Endotel hücrelerinin yüzeyini lekeleyen Isolectin B4 kullanarak retinal vaskülatürü etiketleyin (hayvanlar FITC-dekstran ile perfüzyona maruz kalmadıysa). Retinaları bloke tamponunda (%10 NGS + TBS'de %0,5 Triton) 1 saat kuluçkaya yatırın ve 10 dakika boyunca TBS'de %1 NGS + %0,1 Triton ile yıkayın. Işıktan korunurken bir gecede TBS'de%1 NGS + %0,1 Triton'da floresan boya konjuge Isolectin B 4 (5-10μg/ml) ile retinaları kuluçkaya yatırın.
    NOT: İsterseniz, belirli antikorları kullanarak enflamatuar hücreler ve perisitler gibi diğer hücreleri etiketleyin.
  8. Tbs'de %1 NGS + %0,1 Triton ile retinaları 10 dakika boyunca 3x yıkayın ve retinaları mikroskobik bir slaytta, iç retina yukarı bakacak şekilde kaldırın. Retinayı yumuşak boya fırçası kullanarak dikkatlice yayın ve kalan hyaloid kaplarını veya kalıntılarını çıkarın. Kapak kaymasına montaj ortamı ekleyin ve retinanın üzerine yerleştirin. Retinaları +4 °C'de saklayın ve ışıktan koruyun.

6. Düz montajların analizi

  1. 10x hedefe sahip bir floresan mikroskobu kullanarak retina düz montajlarının görüntülerini alın. Yüzeysel vasküler pleksusa ve preretinal neovaskülarizasyona odaklanın. Tüm retinayı yakalamak ve karo taramalarını birleştirmek için bir karo tarama görüntüsü yapın
  2. Bir görüntü işleme programı kullanarak AVA'ları, NV alanını ve toplam retina alanını ölçerek görüntüleri ölçün (bkz. Malzeme Tablosu).
    1. Ücretsiz bir el çizim aracı kullanarak AVA'ları ve toplam retina alanını çizin ve bir seçim aracı kullanarak neovasküler alanları seçin. Yazılım, ilgi alanlarını piksel cinsinden ölçür ve AVA ve NV alanları (piksellerle ifade edilir) toplam retina alanına göre yüzdelerini hesaplamak için kullanılabilir. Ayrıca, NV'yi ölçmek için bazı yazılım araçları mevcuttur.
      NOT: Son zamanlarda, derin öğrenme sinir ağları kullanarak OIR görüntülerinin temel değerlerinin ölçülmesi için açık kaynaklı, tam otomatik programlar tanıtıldı ve retina AVA ve NV'nin (örneğin, https://github.com/uw-biomedical-ml/oir/tree/bf75f9346064f1425b8b9408ab792b1531a86c64) tekrarlanabilir nicelemesi için güvenilir bir araç sağladı20,21.
  3. Bireysel hücre popülasyonlarının immünohistokimyasal tespiti için antikor kullanıyorsanız, retina düz montajlarından elde veya istenirse otomatik görüntü analiz sistemleriyle lekeli hücrelerin (mikroglia, Şekil 2Bgibi) sayısını ölçün.

7. İstatistikler

  1. Normalde dağıtılan verileri Student's t testine veya One-Way ANOVA'ya ve ardından Dunnett'in veya Tukey'in çoklu karşılaştırma testine göre analiz edin. Normalde dağıtılmayan veriler için Mann-Whitney U testi veya Kruskal Wallis testi gibi nonparametrik testler kullanın. P < 0.05 düzeyinde istatistiksel olarak anlamlı farklılıkları göz önünde bulundurun.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Modelin ana sonucu vasküler fenotiptir: AVA'ların büyüklüğü ve NV miktarı. Fare OIR modelinde, vazo-obliterasyon merkezi retinada meydana gelir (Şekil 2A), sıçan modelinde ise periferde, yani insan ROP22'ye benzer şekilde gelişir (Şekil 3A). Bunun nedeni, fareler hiperoksiye maruz kaldığında yüzeyel vasküler pleksus zaten gelişmiştir, sıçan modelinde retina OIR indüksiyonu sırasında avaskülerdir (P0). Preretinal neovaskülarizasyon, farede merkezi retina ve sıçanlarda çevre gibi avasküler bölgelerin yakınında gelişir (Şekil 2A ve Şekil 3A).

OIR retinalardaki morfolojik değişiklikleri veya örneğin enflamatuar hücreler gibi hücre türlerinin varlığını değerlendirmek için kesitler veya düz montajlar kullanılarak histolojik analiz yapılabilir (Şekil 2B). Retinaya ek olarak, OIR modeli sırasında farklı zaman noktalarında daha fazla gen ve protein ekspresyon analizi için tüm göz veya vitreus örnekleri toplanabilir. Gen veya protein ekspresyon düzeyleri RT-qPCR veya batı şişkinliği gibi standart yöntemlerle analiz edilebilir.

İsteğe bağlı olarak, OIR takip döneminde non-invaziv in vivo görüntüleme yapılabilir. Retinal ve hyaloid vaskülat FA ile görselleştirilebilir (Şekil 4A). Retinadaki yapısal değişiklikleri değerlendirmek için SD-OCT kullanılabilir (Şekil 4B). Retinadaki fonksiyonel değişiklikler ERG ile ölçülebilir (Şekil 5).

Vasküler endotel büyüme faktörü (VEGF) inhibitörleri insan anjiyojenik göz hastalıklarının tedavisinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu nedenle, anti-VEGF genellikle OIR'de referans bileşik olarak kullanılır. Çözünür bir VEGF tuzağı olarak çalışan aflibercept, OIR'de hem yüksek hem de düşük dozlarda (P14'te enjekte edilen) hem NV hem de fizyolojik revaskülarizasyonu inhibe eder. P14'te yüksek doz aflibercept ile enjekte edilen OIR gözleri, tedavi edilmeyen gözlerden daha büyük retina AVA'larına sahipti(Şekil 6). Bu, aflibercept bloklarının da hipoksi tarafından yönlendirilen fizyolojik retinal revaskülarizasyon olduğunu göstermektedir. Farklı anti-anjiyojenik ajanların retina NV ve retinanın fizyolojik revaskülarizasyonu üzerindeki etkisini değerlendirmek için hem fare hem de sıçan modelleri kullanılabilir (Şekil 3B ve Şekil 6).

Figure 1
Şekil 1: Fareler ve sıçanlar için standart bir OIR çalışma tasarımına grafiksel genel bakış. (A) Fare OIR modeli, farelerin P7'den P12'ye% 75 O2'ye maruz kalmasıyla indüklendi ve normal oda havasına geri döndü. Preretinal NV'nin zirvesi, genellikle deney için örnekleme noktası olan P17'de görüldü. (B) Sıçan OIR modeli, sıçanların P0'dan P14'e kadar değişen O2 seviyelerine (% 50/10 O2)maruz kalarak indüklendi ve normoksik koşullara geri döndü. Sıçanlar genellikle NV miktarının zirve yaptığı P20'de kurban edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Fare OIR modelinde vasküler fenotip. Fare OIR modeli Şekil 1'de açıklandığı gibi oluşturulmuştır. (A) Yüzeysel vasküler pleksus normal farelerde gelişirken, OIR fareleri P7'den P12'ye% 75 O2'ye maruz kaldı. Bu süre zarfında, merkezi retinada vasküler obliterasyon gelişti (nicel görüntülerde P12 ve P17'de mavi ile işaretlenmiş). Fareler normal oda havasına geri döndü ve avasküler retina hipoksik hale geldi ve retina ve patolojik NV'de fonksiyonel damar büyümesine yol açtı (alt panelde P17'de kırmızı ile işaretlendi). Merkezi retinadaki vasküler ve avasküler alanlar arasında preretinal neovasküler tutamlar gelişmiştir. NV miktarı P17'de zirve yaptı ve daha sonra geriledi. Retina tamamen revaskülarize edildi ve NV P24-P25 etrafında geriledi. (B) P12 ve P17'de retina Iba-1 lekeli mikroglia (yeşil) ve GS-IB4 lekeli kan damarlarını (kırmızı) gösteren retina düz montajının immünohistokimyasal lekelenme örneği. (C) P17'de bir fare OIR gözünün kesiti, burada preretinal tutamlar (oklar) vitreusa doğru filizlenirdi. Ayrıca iç nükleer tabaka (INL) ve dış pleksiform tabakanın (OPL) inceltmeleri görülmüştür. Ölçek çubukları A'da 1 mm, B'de 50 μm ve C. ILM'de 100 μm'dir = iç sınırlayıcı membran, GCL = ganglion hücre tabakası, IPL = iç pleksiform tabaka, INL = iç nükleer tabaka, OPL = dış pleksiform tabaka, ONL = dış nükleer tabaka, RPE = retina pigment epitel. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Vasküler fenotip ve sıçan OIR modelinde gelişimi. (A) Retinanın çevresinde insan ROP'una benzer şekilde geliştirilen avasküler alanlar (mavi ile işaretlenmiş) ve NV (kırmızı ile işaretlenmiştir). (B) OIR retinalarda AVA'lar görüldü, ancak normoksik kontrollerde görülmedi. (C) NV alanının nicelleştirilmesi, P20'de NV miktarında bir zirveye doğru bir eğilim gösterdi, ancak fark OIR'deki P18 ve P21 ile karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlı değildi. (Öğrencinin t testi, zamanla eşleşen normoksik ve OIR retinalar arasında, ** p ≤ 0.01, *** p ≤ 0.001, her iki gözü de grafikte çizilmiş hayvanların). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Sıçan OIR modelinde floresan anjiyografi (FA) ve spektral etki alanı optik koherens tomografisi (SD-OCT) kullanılarak in vivo görüntüleme. (A) OIR sıçanlarında P18 ve P20'de merkezi retinadan (üst sıra) çekilen görüntülerde normoksik P19 sıçanlarına göre damar işkencesi (ok uçları) görüldü. NV (oklar) ve AVA'lar (yıldız işareti), P18 ve P20 OIR retinalarında görüldüğü gibi retinanın çevresine (orta sıra) gelişmiştir. Gerileyen hyaloid damarları (alt sıra) FA. (B) Vitreusa doğru kan damarı büyümesi, OIR retinalarında (ok) sinir lifi tabakası (NFL) ve ganglion hücre tabakasında (GCL) kalınlaşma olarak gözlendi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Retina nöronlarının işlevselliği flaş elektroretinografi (fERG) kullanılarak ölçülebilir. (A) a-dalgaları retina konisi ve çubuk fotoreceptörlerinden elde edildi ve sıçan OIR modelinde genlikleri önemli ölçüde azaldı. Etki daha yüksek bir ışık yoğunluğu ile arttı, bu da kusurların öncelikle koni fotoreceptör işlevlerini etkilediğini düşündürmektedir. (B) OIR hayvanlarından elde edilen B-dalga genlikleri normoksik kontrollere göre azaldı. B-dalgaları ON-bipolar hücrelerden ve Müller hücrelerden türetilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: Intravitreally enjekte PBS, fare OIR modelinde NV ve AVA'ları azaltır. (A) Retina düz montajların tedavi edilmemiş ve aflibercept işlem görmüş (P14'te 20 μg) ve PBS enjekte edilen OIR gözlerinin temsili görüntüleri P17'de. Yüksek doz aflibercept (20 μg) AVAs boyutunu% 47 artırdı (beyaz ile özetlenmiştir) ve NV'yi tedavi edilmemiş kontrollere kıyasla% 98 (oklar) inhibe etti. PBS enjeksiyonu, tedavi edilmeyen kontrollere kıyasla AVA'ları %31 ve NV'yi %42 azalttı. Ayrıca, ivt'ye benzeyen skleranın delinmesi, PBS'nin ivt enjeksiyonu ile benzer etkiler yarattı, ancak farklılıklar istatistiksel olarak anlamlı değildi. Ok ucu, diseksiyon sırasında çıkarılmayan hyalüoid damarlarda noktalar. (Tek Yönlü ANOVA, * s ≤ 0.05; ** p ≤ 0.01, *** p ≤ 0.001, **** p ≤ 0.0001). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hastalık fenotipinin şiddeti hem fare hem de sıçan OIR modellerinde hem zorlanmaya hem de satıcıyabağlıdır 23. Bu, patoloji gelişiminde geniş bir genotipik değişkenlik olduğunu göstermektedir. Genel olarak, pigmentli kemirgenler albino olanlardan daha şiddetli fenotip geliştirir. Örneğin, albino BALB /c'nin retinal vaskülatürü hiperoksiden sonra hızla revaskülarize olur ve24'teNV gelişmez. Benzer şekilde, sıçanlarda, pigmentli Kahverengi Norveç sıçanları albino Sprague Dawley (SD) sıçanlarından daha şiddetli patoloji gösterir25. SD sıçanlar yaygın olarak suş kullanılır ve OIR fenotipinde satıcıya bağlı farklılıklar suş içinde bildirilmiştir. Örneğin, Charles Nehri'nden gelen SD sıçanları Harlan veya Zivic-Miller23'tensıçanlardan önemli ölçüde daha fazla NV üretir. C3H / HeJ fareleri, sırayla, retina dejenerasyonu 1 (Rd1) geninde mutasyona sahip, ince retinalara sahip ve NV26geliştirmez. Bu nedenlerden ve transgenik fare hatlarının mevcudiyeti nedeniyle, inbred C57BL/6J, OIR çalışmaları için en sık kullanılan fare zorlanmasıdır. Bununla birlikte, hiperoksik maruziyet nedeniyle C57BL / 6J barajları arasında oldukça yüksek bir mortalite vardır, bu nedenle çalışmayı tasarlarken farelerin refahının göz önünde bulundurulması ve deneyler sırasında izlenmesi gerekir. Ayrıca, BALB / c farelerine kıyasla C57BL / 6 farelerde artan fotoreceptör hasarı görülür27.

Farelerin refahını ve barajların ve yavruların hayatta kalmasını sağlamak için, çöp boyutu küçük tutulmalıdır (6-7 yavru / baraj). Bu özellikle hiperoksik strese daha duyarlı olan C57BL / 6 fareleri kullanırken önemlidir27,28. Ek olarak, farelere kolayca erişilebilen destek yiyecekleri (kafesin dibine yerleştirilir) sağlanmalıdır. Bazı araştırmacılar, oksijen indüksiyonundan sonra odadaki barajları sağlıklı barajlarla değiştirmek için taşıyıcı barajlar kullanırlar. Bununla birlikte, çoğu araştırmacı sadece baraj tükenmişse suretleri kullanır22,29. Daha büyük çöp boyutları kullanılıyorsa taşıyıcı barajların kullanılması önerilir. 129S3 / SvIM farelerinin C57BL / 6'dan daha fazla NV ürettiği ve değişen oksijen seviyelerinin neden olduğu değişiklikleri daha iyi sürdürdüğü yayınlanmıştır28. OIR'de kullanılan barajların OIR indüksiyonu sonrası infertil olmadığı ve daha fazla ıslah amacıyla kullanılmaması gerektiği unutulmamalıdır22. Yavruların doğum sonrası kilo alımı OIR patolojisinin şiddetini etkiler. Doğum sonrası kilo alımı zayıf olan yavrular (P17'de<5 g), normal (P17'de 5 - 7,5 g) veya geniş kilo alımı (P17'de 7,5 g)29ile karşılaştırıldığında VEGF'nin gecikmiş ifadesini ve dolayısıyla uzun süreli retinopati evresini gösterir. Ayrıca, P7'de 5 g'ın üzerinde olan fare yavruları, OIR indüksiyonu30'dansonra vazo-yok edilmiş alanlar göstermez. Bu nedenle, deney sırasında yavruları tartmak önemlidir. Kontrasepteral tedavi edilmemiş göz, farelerin beslenme durumunun sonuçları etkilememesini sağlamak için dahili bir kontrol olarak kullanılabilir. Durum sıçanlarda benzerdir; yavrular ne kadar küçükse, OIR fenotipi o kadar şiddetli gelişir31. Bu nedenle, sıçan OIR modeli için büyük çöp boyutunun (yaklaşık 18 yavru) kullanılması önerilir.

OIR modeli indüksiyonu, havayı bir filtre sistemi (soda kireç ve aktif karbon) aracılığıyla odaya geri dolayan bir pompa ile kapalı bir devrenin bulunduğu tamamen kapalı bir sistem kullanılarak yapılabilir. Başka bir seçenek, havalandırmanın fazla metabolitlerin odadan çıkarılmasını sağladığı yarı kapalı bir sistemdir. Fazla CO2'nin çıkarılmasını sağlamak için, odanın dibine soda kireç (sodyum hidroksit veya potasyum hidroksit ile kalsiyum hidroksit karışımı) yerlenebilir. Yüksek CO2 seviyeleri sıçanlarda hastalık fenotipini kötüleştirdikçe CO2'nin çıkarılması zorunludur32. Ayrıca, odanın oksijen sensörlerini düzenli olarak yeniden ayarlamayı unutmamak gerekir, çünkü zamanla sürüklenme eğilimindedirler ve amaçlanandan yanlış oksijen konsantrasyonu sağlayabilirler.

Araç enjeksiyonunun (PBS) tek başına hatta sadece intravitreal alana delinmenin revaskülarizasyon oranı ve NV miktarı (Şekil 6) 33 ,34,35,36için bir etkisi olduğu bildirilmiştir. PBS/ araç enjeksiyonu ile görülen etkinin enjeksiyon sırasında göz içi basıncındaki değişikliklerden mi yoksa aralarındaki anjiyojenik büyüme faktörlerinin seviyelerini artıran oküler yapılardaki yaralanmadan mı kaynaklanabileceği tahmin edilmiştir pigment epitel türevi büyüme faktörü34,37. Ayrıca, sadece bir pilot subretinal enjeksiyonun (subretinal boşluğa delinme) tedavi edilmemiş sıçanlara kıyasla OIR'deki vasküler ve fonksiyonel fenotip üzerinde etkileri olduğu gösterilmiştir38. Bu sonuçlar, OIR çalışmalarında uygun negatif kontrollerin ve hatta test edilen bileşiklerin sistemik yönetiminin yanı sıra her çalışma grubunda yeterince büyük n sayısının önemini vurgulamaktadır. Araç enjeksiyonunun retinada revaskülarizasyon oranını gerçekten artırması, OIR modelinde revaskülarizasyon oranı ve patolojik preretinal tutamların oluşumu birbiriyle ilişkili olduğu için önemli bir sınırlayıcı faktördür: eğer revaskülarizasyon oranı hızlanırsa, neovasküler tutamların telafi edici şekilde aşağı doğrulmasına yol açar ve bunun tersi de önemlidir. Böylece, OIR modelinin her iki birincil sonuç önlemi de araç enjeksiyonundan etkilenir.

VEGF inhibitörleri tedavide devrim yaratmadı AMD ve DR. OIR modeli etkinliklerini preklinik olarak göstermek için kullanıldı. OIR'deki VEGF inhibitörleri ile ilgili olarak, farklı anti-VEGF'leri ve anti-SKO'ları (plasental büyüme faktörü) (P12'de enjekte edilen) karşılaştıran bir çalışma, anti-VEGF'nin tek başına küçük avasküler alanlara yol açtığını, oysa anti-PIGF tedavi edilen gözlerin daha büyük avasküler alanlara sahip olduğunu göstermiştir33. Aflibercept, diğer ilaç tedavilerine kıyasla en büyük AVA'lara sahipti33. Aflibercept'in hem VEGF hem de PlGF39'ubağladığı bilinmektedir, OIR'de PlGF'yi inhibe etmek fizyolojik anjiogenezin bloke edilmesine yol açabilir.

Noninvaziv in vivo görüntüleme, takip süresi boyunca retinal vaskülat40 ve retina katmanlarını ve yapısını izlemek için bir araç sağlar. FA kullanılarak, damar yoğunluğu ve arteriyel tortuozite ve venöz genişleme (artı hastalık olarak adlandırılır, Şekil 4A)gibi parametreler40,41ölçülebilir. SD-OCT, OIR takip süresi42 , 43sırasında yapısal değişikliklerin değerlendirilmesi ve retina kalınlığının ölçülmesi için kullanılabilir. ERG retinadaki fonksiyonel değişiklikleri ölçmek için kullanılır. Farklı hücre tipleri ışık uyaranlarından sonra elektrik potansiyeli üretir ve bu sinyaller veya "dalgalar" ERG ile ölçülebilir. Fotoreceptörler negatif a-dalgayı üretiyor ve ON bipolar hücreler ve Müller hücreleri esas olarak b-dalga44'densorumludur. Retina fonksiyonu kaybı OIR farelerde ve sıçanlarda tipiktir45,46 ( Şekil5). Retinada uzun süreli değişiklikler devam eder ve revaskülarizasyon ve NV regresyon34,47'densonra bile OIR retinalarında hem fonksiyonel değişiklikler hem de protein seviyesinde değişiklikler bildirilmiştir.

Retinal vaskülatörü görselleştirmek için, canlı fareler FITC etiketli dektran ile perfüzyona maruz olabilir veya retina düz montajları Isolectin B4etiketli floresan boya ile boyanabilir. Floresan boyalar arasındaki farkı anlamak gerekir; FITC-dekstrans ile perfüzyon sadece damarların lümenini etiketlerken, Isolectin B4 endotel hücrelerinin yüzeyini lekeler. Bu nedenle, uygun lümenli fonksiyonel kan damarları sadece FITC-dektran perfüzyonu ile görselleştirilirken, NV'nin toplam alanı Isolectin B4 lekeli retinalarda FITC-dextran perfüzyonlu hayvanlardan daha büyük görünür, çünkü Isolectin B4 esasen henüz fonksiyonel lümen oluşturmamış endotel hücrelerini bilealır. Tüm retina / göz toplarını 3-B formatında görselleştirmek için daha yeni bir seçenek, iki foton floresan mikroskopisi(49)ile derin doku görüntülemedir.

Kemirgen OIR modeli ve genel olarak hayvan modelleri, insan hastalıklarının özelliklerini sadece kısmen temsil eder. OIR ile ilgili en büyük fark, retina neovaskülarizasyonunun kemirgen OIR'deki fibrozis ile ilişkili olmamasıdır, retinal neovaskülarizasyon ise insan neovasküler retina hastalıklarında fibrovasküler çoğalmaya yol açar. Ayrıca, OIR ve insan hastalığına neden olan durumlar neredeyse zıt olabilir. ROP'li preterm yenidoğanlar solunum desteği ile ek oksijen gerektirir, tekrarlayan apnenin neden olduğu sık aralıklı hipoksemik ve hiperoksimik ataklar yaşarlar, ancak yüksek oksijen seviyelerine maruz kalmazlar. Kalıcı hasarı en aza indirmek için, ilham alan O2'nin yüksek fraksiyonlarından kaçınılır. Bu bakımdan, ne 5 gün boyunca% 75 O2'ye sürekli maruz olan fare modeli ne de 50/10 sıçan modeli insan ROP patogenezine benzemez. Ayrıca, sıçan ve fare OIR modelleri arasında da farklılıklar vardır. Neovaskülarizasyon, normal damarların P24 tarafından yeniden kurulmasıyla fare modelinde gerilerken, sıçan OIR modelinde (insan ROP'a benzer) durum daha da kötüleşir. Sıçan OIR modeli, gecikmiş retinal vasküler gelişim ve sonraki patolojik neovaskülarizasyon gibi ROP'un klinik olarak ilgili özelliklerini gösterse de, kullanımı transgenik sıçan suşlarının neredeyse tamamen yokluğu, daha yüksek bakım maliyetleri ve fare OIR modeline göre daha az NV ile sınırlıdır.

Birlikte ele alındığında, insan iskemik proliferatif retinopatiler ve kemirgen OIR modelleri arasındaki farklılıklara rağmen, NV'nin indüklenebilme kolaylığı, retinanın kolay görselleştirilmesi ve nicelleştirilmesi ile birleştiğinde, OIR modellerini iskemik proliferatif retinopatiler için moleküler mekanizmaları ve potansiyel terapötikleri incelemek için popüler hale getirir. İlginçtir ki, fare OIR modelinde hiperoksi maruziyeti, insan prematüre bebeklerinde ek oksijen tedavisinin neden olduğu başka bir hastalık olan bronkopulmoner displaziye de neden olur ve OIR modelinin hem ROP hem de bronkopulmoner displazi için yeni hedefleri aynı anda keşfetmek için kullanılabileceğini gösterir50.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar Maria Vähätupa, PhD, Niina Jääskeläinen, Marc Cerrada-Gimenez, PhD ve Rubina Thapa Experimentica Ltd.'nin çalışanlarıdır.

Yazar Giedrius Kalesnykas, PhD, bu Makalede kullanılan preklinik OIR modellerini kullanan sözleşme araştırma hizmetleri sunan Experimentica Ltd.'nin bir çalışanı (Başkan ve İcra Kurulu Başkanı) ve hissedarıdır.

Tero Järvinen, M.D., PhD ve Hannele Uusitalo-Järvinen, M.D., PhD, açıklayacak hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Marianne Karlsberg, Anne Mari Haapaniemi, Päivi Partanen ve Anne Kankkunen'e mükemmel teknik destek için teşekkür ederiz. Bu çalışma Finlandiya Akademisi, Päivikki ve Sakari Sohlberg Vakfı, Tampere Tüberküloz Vakfı, Finlandiya Tıp Vakfı, Pirkanmaa Hastanesi Bölge Araştırma Vakfı ve Tampere Üniversite Hastanesi Araştırma Fonu tarafından finanse edildi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
33 gauge, Small Hub RN Needle Hamilton Company 7803-05, 10mm, 25°, PS4 For intravitreal injection
Adobe Photoshop Adobe Inc. For image analysis
Air pump air100 Eheim GmbH & Co. KG. 143207 For inhalation anaesthesia
Anaesthesia unit 410 AP Univentor Ltd. 2360309 For inhalation anaesthesia
AnalaR NORMAPUR Soda lime VWR International Ltd 22666.362 For CO2 control during model induction
Attane Vet 1000 mg/g VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY vnr 17 05 79 For inhalation anaesthesia
Brush For preparation of flat mounts
Carbon dioxide gas For sacrifice
Celeris D430 ERG system Diagnosys LLC 121 For in vivo ERG
Cell culture dishes Greiner Bio-One International GmbH 664 160 For preparation of flat mounts
Cepetor Vet 1 mg/mL VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY vnr 08 78 96 For anaesthesia
Cover slips Thermo Fisher Scientific 15165452 For preparation of flat mounts
O2 Controlled InVivo Cabinet, Aninal Filtrarion System and Dehumidifier Coy Laboratory Products Closed system for disease model induction, optional for semi-closed system
E702 O2 sensor BioSphenix, Ltd. E207, 1801901 For oxygen level measurement
Envisu R2200 Spectral Domain Optical Coherence Tomograph (SD-OCT) Bioptigen, Inc. BPN000668 For in vivo imaging
Eye spears Beaver-Visitec International, Inc. 0008685 For intravitreal injection and in vivo imaging
Flexilux 600LL Cold light source Mikron 11140 For intravitreal injection or tissue collection
Fluorescein sodium salt Merck KGaA F6377-100G For in vivo imaging
Gas Exhaust unit (+Double 3-way valve, mouse and rat face masks, UNOsorb filter) UNO Roestvaststaal BV GEX 17015249 For inhalation anaesthesia
Glass syringe, Model 65 RN Hamilton Company 7633-01 For intravitreal injection
HRA2 Retina angiograph (FA) Heidelberg Engineering GmbH Spec-KT-05488 For in vivo imaging
Isolectin GS-IB4, Alexa Fluor 488 Conjugate Thermo Fisher Scientific I21411 For labeling retinal vasculature on flat mounts
Ketaminol Vet 50 mg/mL Intervet International B.V. vnr 51 14 85 For anaesthesia
Medicinal Oxygen gas For disease model induction
Mice C57BL/6JRj Janvier Labs Also other strains possible
Microscope slides Thermo Fisher Scientific J1800AMNZ For preparation of flat mounts
Minims Povidone Iodine 5% (unit) Bausch & Lomb U.K Limited vnr 24 11 304 For intravitreal injection
Nitrogen gas For disease model induction (rat)
Oftan Chlora 10 mg/g Santen Pharmaceutical Co., Ltd. vnr 55 01 11 For intravitreal injection
Oftan Metaoksedrin 100 mg/ml Santen Pharmaceutical Co., Ltd. vnr 55 03 43 For in vivo ERG
Oftan Obucain 4 mg/ml Santen Pharmaceutical Co., Ltd. vnr 55 03 50 For intravitreal injection
Oftan Tropicamid 5 mg/ml Santen Pharmaceutical Co., Ltd. vnr 04 12 36 For in vivo imaging
ProOx Model 110 O2 controller and animal chamber BioSphenix, Ltd. 803 For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system
ProOx Model P360 O2 controller and animal chamber BioSphenix, Ltd. 538 For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system
Rats CD(SD) Charles River Laboratories Also other strains possible
Revertor 5 mg/mL VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY vnr 13 04 97 For anaesthesia reversal
Silica gel For humidity control during model induction
Systane Ultra 10ml Alcon Tamro 2050250 For hydration of the eye
Systane Ultra unit 0.7ml Alcon Tamro 2064871 For hydration of the eye
Transfer pipette Thermo Fisher Scientific 1343-9108 For preparation of flat mounts
VENTI-Line VL 180 PRIME Drying oven VWR VL180S 170301 For drying silica gel
VisiScope SZT350 Stereomicroscope VWR 481067 For intravitreal injection or tissue collection

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chase, J. The evolution of retinal vascularization in mammals. A comparison of vascular and avascular retinae. Ophthalmology. 89 (12), 1518-1525 (1982).
  2. Sun, Y., Smith, L. E. H. Retinal vasculature in development and diseases. Annual Review of Vision Science. 4, 101-122 (2018).
  3. Vähätupa, M., Järvinen, T. A. H., Uusitalo-Järvinen, H. Exploration of oxygen-induced retinopathy model to discover new therapeutic drug targets in retinopathies. Frontiers in Pharmacology. 11, 873 (2020).
  4. Stahl, A., et al. The mouse retina as an angiogenesis model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (6), 2813-2826 (2010).
  5. Benjamin, L. E., Hemo, I., Keshet, E. A plasticity window for blood vessel remodelling is defined by pericyte coverage of the preformed endothelial network and is regulated by PDGF-B and VEGF. Development. 125 (9), 1591-1598 (1998).
  6. Bashinsky, A. L. Retinopathy of prematurity. North Carolina Medical Journal. 78 (2), 124-128 (2017).
  7. Ludwig, C. A., Chen, T. A., Hernandez-Boussard, T., Moshfeghi, A. A., Moshfeghi, D. M. The epidemiology of retinopathy of prematurity in the united states. Ophthalmic Surgery, Lasers and Imaging Retina. 48 (7), 553-562 (2017).
  8. Hartnett, M. E. Pathophysiology and mechanisms of severe retinopathy of prematurity. Ophthalmology. 122 (1), 200-210 (2015).
  9. Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. Animal models of ocular angiogenesis: From development to pathologies. FASEB Journal. 31 (11), 4665-4681 (2017).
  10. Szewczyk, T. S. Retrolental fibroplasia; etiology and prophylaxis. American Journal of Ophthalmology. 35 (3), 301-311 (1952).
  11. Szewczyk, T. S. Retrolental fibroplasia and related ocular diseases; classification, etiology, and prophylaxis. American Journal of Ophthalmology. 36 (10), 1336-1361 (1953).
  12. Gerschman, R., Nadig, P. W., Snell, A. C. Jr, Nye, S. W. Effect of high oxygen concentrations on eyes of newborn mice. American Journal of Physiology. 179 (1), 115-118 (1954).
  13. Gyllnesten, L. J., Hellström, B. E. Experimental approach to the pathogenesis of retrolental fibroplasia. III. changes in the eye induced by exposure of newborn mice to general hypoxia. British Journal of Ophthalmology. 39 (7), 409-415 (1955).
  14. Curley, F. J., Habegger, H., Ingalls, T. H., Philbrook, F. R. Retinopathy of immaturity in the newborn mouse after exposure to oxygen imbalances. American Journal of Ophthalmology. 42 (3), 377-392 (1956).
  15. Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).
  16. Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: A model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4 (11), 1565-1573 (2009).
  17. Penn, J. S., Tolman, B. L., Lowery, L. A. Variable oxygen exposure causes preretinal neovascularization in the newborn rat. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 34 (3), 576-585 (1993).
  18. Penn, J. S., Henry, M. M., Tolman, B. L. Exposure to alternating hypoxia and hyperoxia causes severe proliferative retinopathy in the newborn rat. Pediatric Research. 36 (6), 724-731 (1994).
  19. Ritter, M. R., et al. Three-dimensional in vivo imaging of the mouse intraocular vasculature during development and disease. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (9), 3021-3026 (2005).
  20. Xiao, S., et al. Fully automated, deep learning segmentation of oxygen-induced retinopathy images. Journal of Clinical Investigation Insight. 2 (24), 97585 (2017).
  21. Mazzaferri, J., Larrivee, B., Cakir, B., Sapieha, P., Costantino, S. A machine learning approach for automated assessment of retinal vasculature in the oxygen induced retinopathy model. Scientific Reports. 8 (1), 22251-22257 (2018).
  22. Kim, C. B., D'Amore, P. A., Connor, K. M. Revisiting the mouse model of oxygen-induced retinopathy. Eye and Brain. 8, 67-79 (2016).
  23. Barnett, J. M., Yanni, S. E., Penn, J. S. The development of the rat model of retinopathy of prematurity. Documenta Ophthalmologica. 120 (1), 3-12 (2010).
  24. Ritter, M. R., et al. Myeloid progenitors differentiate into microglia and promote vascular repair in a model of ischemic retinopathy. Journal of Clinical Investigation. 116 (12), 3266-3276 (2006).
  25. Floyd, B. N., et al. Differences between rat strains in models of retinopathy of prematurity. Molecular Vision. 11, 524-530 (2005).
  26. Scott, A., Powner, M. B., Fruttiger, M. Quantification of vascular tortuosity as an early outcome measure in oxygen induced retinopathy (OIR). Experimental Eye Research. 120, 55-60 (2014).
  27. Walsh, N., Bravo-Nuevo, A., Geller, S., Stone, J. Resistance of photoreceptors in the C57BL/6-c2J, C57BL/6J, and BALB/cJ mouse strains to oxygen stress: Evidence of an oxygen phenotype. Current Eye Research. 29 (6), 441-447 (2004).
  28. Chan, C. K., et al. Differential expression of pro- and antiangiogenic factors in mouse strain-dependent hypoxia-induced retinal neovascularization. Laboratory Investigation. 85 (6), 721-733 (2005).
  29. Stahl, A., et al. Postnatal weight gain modifies severity and functional outcome of oxygen-induced proliferative retinopathy. American Journal of Pathology. 177 (6), 2715-2723 (2010).
  30. Liegl, R., Priglinger, C., Ohlmann, A. Induction and readout of oxygen-induced retinopathy. Methods in Molecular Biology. 1834, 179-191 (2019).
  31. Holmes, J. M., Duffner, L. A. The effect of postnatal growth retardation on abnormal neovascularization in the oxygen exposed neonatal rat. Current Eye Research. 15 (4), 403-409 (1996).
  32. Holmes, J. M., Zhang, S., Leske, D. A., Lanier, W. L. The effect of carbon dioxide on oxygen-induced retinopathy in the neonatal rat. Current Eye Research. 16 (7), 725-732 (1997).
  33. Heiduschka, P., Plagemann, T., Li, L., Alex, A. F., Eter, N. Different effects of various anti-angiogenic treatments in an experimental mouse model of retinopathy of prematurity. Journal of Clinical and Experimental Ophthalmology. 47 (1), 79-87 (2019).
  34. Tokunaga, C. C., et al. Effects of anti-VEGF treatment on the recovery of the developing retina following oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (3), 1884-1892 (2014).
  35. Tokunaga, C. C., Chen, Y. H., Dailey, W., Cheng, M., Drenser, K. A. Retinal vascular rescue of oxygen-induced retinopathy in mice by norrin. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (1), 222-229 (2013).
  36. Vähätupa, M., Uusitalo-Järvinen, H., Järvinen, T. A. H., Uusitalo, H., Kalesnykas, G. Intravitreal injection of PBS reduces retinal neovascularization in the mouse oxygen-induced retinopathy model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. Abstract Issue. 57 (12), 3649 (2016).
  37. Penn, J. S., et al. Angiostatic effect of penetrating ocular injury: Role of pigment epithelium-derived factor. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (1), 405-414 (2006).
  38. Becker, S., Wang, H., Stoddard, G. J., Hartnett, M. E. Effect of subretinal injection on retinal structure and function in a rat oxygen-induced retinopathy model. Molecular Vision. 23, 832-843 (2017).
  39. Sophie, R., et al. Aflibercept: A potent vascular endothelial growth factor antagonist for neovascular age-related macular degeneration and other retinal vascular diseases. Biological Therapy. 2, (2012).
  40. Mezu-Ndubuisi, O. J. In vivo angiography quantifies oxygen-induced retinopathy vascular recovery. Optometry and Vision Science. 93 (10), 1268-1279 (2016).
  41. Mezu-Ndubuisi, O. J., et al. In vivo retinal vascular oxygen tension imaging and fluorescein angiography in the mouse model of oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (10), 6968-6972 (2013).
  42. Dailey, W. A., et al. Ocular coherence tomography image data of the retinal laminar structure in a mouse model of oxygen-induced retinopathy. Data in Brief. 15, 491-495 (2017).
  43. Mezu-Ndubuisi, O. J., Taylor, L. K., Schoephoerster, J. A. Simultaneous fluorescein angiography and spectral domain optical coherence tomography correlate retinal thickness changes to vascular abnormalities in an in vivo mouse model of retinopathy of prematurity. Journal of Ophthalmology. 2017, 9620876 (2017).
  44. Pinto, L. H., Invergo, B., Shimomura, K., Takahashi, J. S., Troy, J. B. Interpretation of the mouse electroretinogram. Documenta Ophthalmologica. 115 (3), 127-136 (2007).
  45. Nakamura, S., et al. Morphological and functional changes in the retina after chronic oxygen-induced retinopathy. PLoS One. 7 (2), 32167 (2012).
  46. Dorfman, A. L., Polosa, A., Joly, S., Chemtob, S., Lachapelle, P. Functional and structural changes resulting from strain differences in the rat model of oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (5), 2436-2450 (2009).
  47. Vähätupa, M., et al. SWATH-MS proteomic analysis of oxygen-induced retinopathy reveals novel potential therapeutic targets. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (8), 3294-3306 (2018).
  48. Campos, M., Amaral, J., Becerra, S. P., Fariss, R. N. A novel imaging technique for experimental choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (12), 5163-5170 (2006).
  49. Yanez, C. O., et al. Deep Vascular Imaging in Wounds by Two-Photon Fluorescence Microscopy. PLos One. 8 (7), 67559 (2013).
  50. Wickramasinghe, L. C., et al. Lung and eye disease develop concurrently in supplemental oxygen-exposed neonatal mice. American Journal of Pathology. , 30287 (2020).

Tags

Tıp Sayı 163 anjiogenez neovaskülarizasyon oksijen kaynaklı retinopati OIR hipoksi prematürite retinopatisi ROP diyabetik retinopati intravitreal enjeksiyon görüntü analizi yapay zeka yapay zeka
Kemirgenlerde İskemik Retina Hastalıkları için Oksijen Kaynaklı Retinopati Modeli
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vähätupa, M.,… More

Vähätupa, M., Jääskeläinen, N., Cerrada-Gimenez, M., Thapa, R., Järvinen, T., Kalesnykas, G., Uusitalo-Järvinen, H. Oxygen-Induced Retinopathy Model for Ischemic Retinal Diseases in Rodents. J. Vis. Exp. (163), e61482, doi:10.3791/61482 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter