Summary
Her præsenterer vi en metode til registrering af lys-fremkaldte elektriske reaktioner af retinale pigment epitel (RPE) i mus ved hjælp af en teknik kendt som DC-ERGs første beskrevet af Marmorstein, Peachey, og kolleger i begyndelsen af 2000'erne.
Abstract
Den retinale pigment epitel (RPE) er en specialiseret monolag af celler strategisk placeret mellem nethinden og choriocapillaris at opretholde den generelle sundhed og strukturelle integritet fotoreceptorer. RPE er polariseret, udviser apisk og basalt placeret receptorer eller kanaler, og udfører vektoral transport af vand, ioner, metabolitter, og udskiller flere cytokiner.
In vivo noninvasive målinger af RPE-funktion kan foretages ved hjælp af direkte koblede ERGs (DC-ERGs). Metoden bag DC-ERG blev udviklet af Marmorstein, Peachey, og kolleger ved hjælp af et specialbygget stimuleringsoptagelsessystem og demonstrerede senere ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt system. DC-ERG-teknikken bruger glaskapillærer fyldt med Hanks buffersaltopløsning (HBSS) til at måle RPE's langsommere elektriske reaktioner fremkaldt af lysbetalte koncentrationsændringer i subretinale rum på grund af fotoreceptoraktivitet. Dc-ERG-optagelsens langvarige lysmulmulans og længde gør den sårbar over for drift og støj, hvilket resulterer i et lavt udbytte af brugbare optagelser. Her præsenterer vi en hurtig, pålidelig metode til at forbedre stabiliteten af optagelserne og samtidig reducere støj ved hjælp af vakuumtryk for at reducere / eliminere bobler, der skyldes udgasning af HBSS og elektrodeholderen. Derudover er strømledningsartefakter svækket ved hjælp af en spændingsregulator/strømbalator. Vi inkluderer de nødvendige lysstimuleringsprotokoller til et kommercielt tilgængeligt ERG-system samt scripts til analyse af DC-ERG-komponenterne: c-wave, hurtig svingning, let top og off response. På grund af den forbedrede lethed af optagelser og hurtig analyse workflow, denne forenklede protokol er særlig nyttig til måling af aldersrelaterede ændringer i RPE funktion, sygdomsprogression, og i vurderingen af farmakologisk intervention.
Introduction
Den retinale pigment epitel (RPE) er en monolayer af specialiserede celler, linje den bageste segment af øjet og udøve kritiske funktioner til at opretholde retinale homøostase1. RPE understøtter fotoreceptorer ved at regenerere deres foton-fanger visuelle pigment i en proces kaldet denvisuelle cyklus 2, ved at deltage i den døgnfarlige fagocytose af kaste ydre segment tips3, og i transport af næringsstoffer og metaboliske produkter mellem fotoreceptorer og choriocapillaris4,5. Abnormiteter i RPE funktion ligger til grund for mange menneskelige retinale sygdomme, såsom aldersrelaterede makuladegeneration6, Leber's medfødte amaurosis7,8 ogBedste vitelliform makulad dystrofi9. Da donorøjevæv ofte er vanskelige at opnå udelukkende til forskningsformål, kan dyremodeller med genetiske modifikationer være en alternativ måde at undersøge udviklingen af retinalesygdomme 10,11. Derudover, fremkomsten og anvendelsen af CRISPR cas9 teknologi tillader nu genomiske introduktioner (knock-in) eller sletninger (knock-out) i en enkel, et-trins proces overgår begrænsninger af tidligere gen målretning teknologier12. Boomet i tilgængeligheden af nye musemodeller13 kræver en mere effektiv optagelsesprotokol til ikke-invasivt evaluere RPE-funktion.
Måling af RPE's lysbetalte elektriske reaktioner kan opnås ved hjælp af en direkte koblet elektroretinogram (DC-ERG) teknik. Når dc-ERG anvendes i kombination med konventionelle ERG-optagelser, der måler fotoreceptoren (a-wave) og bipolære (b-wave)celleresponser 14, kan den definere, hvordan responsegenskaberne for RPE ændrer sig med retinal degeneration15,16,17 ellerom RPE-dysfunktion går forud for fotoreceptortab. Denne protokol beskriver en metode tilpasset fra arbejdet i Marmorstein, Peachey, og kolleger, der først udviklede DC-ERG teknik16,18,19,20 og forbedrer reproducerbarhed og brugervenlighed.
DC-ERG-optagelsen er vanskelig at udføre på grund af den lange anskaffelsestid (9 min.), hvor enhver afbrydelse eller indførelse af støj kan komplicere fortolkningen af dataene. Fordelen ved denne nye metode er, at baselines nå stabil tilstand inden for en kortere tid at reducere sandsynligheden for, at dyret vil vække for tidligt fra anæstesi og er mindre tilbøjelige til boble dannelse i kapillær elektroder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol følger de retningslinjer for dyrepleje, der er skitseret i dyreforsøgsprotokollen, der er godkendt af Animal Care and Use Committee of the National Eye Institute.
1. Import af lysstimuleringsprotokoller til DC-ERG
BEMÆRK: Følg nedenstående anvisninger for at importere lysstimuleringsprotokollerne for DC-ERG til ERG-systemsoftwaren (Materialetabel). Protokollen består af en 0,5 min pre-stimulus interval, efterfulgt af et trin af lys (10 cd/m2)i 7 min, og slutter med en 1,5 min post-stimulus interval. Lysintensiteten på 10 cd/m2 (1 log10 cd/m2) blev valgt, da den fremkalder ca. halvdelen af den maksimale respons for alle komponenterne i DC-ERG i WT mus18,21. C-bølge og hurtige svingninger er af særlig interesse, da oprindelsen af disse elektriske reaktioner er godt karakteriseret og kan isoleres og studeres yderligere in vitro RPE modeller (f.eks iPSC-RPE). Anvendelsen af andre lysintensiteter kan udtrække yderligere oplysninger, for eksempel, off respons gennemgår en vending af polaritet på lysere lys stimuli og kan vise forskelle ved den intensitet, hvormed denne vending finder sted. Brugeren kan frit ændre lysintensitetsindstillingerne efter eget skøn.
- Åbn ERG-systemsoftwaren.
- Klik på Database Center.
- Klik på Ny (angiv et nyt databasefilnavn). Klik på Gem. Pop op-boksen vises: "Database oprettet, vil du oprette forbindelse til den nye databasefil." Klik på Ja. Det aktuelle databasenavn skulle nu afspejle det nye filnavn.
- Klik på Overfør ind i vinduet Databasekontrolcenter.
- Vælg Supplerende fil 1: LightProtocols - TRANSFER. EXP. Klik på Åbn.
- Klik på Luk (DatabaseKontrolcenter) efter afslutningen af statuslinjen.
- Klik på den grønne startknap.
- Klik på Nyt i vinduet Vælg patient. Opret et nyt patientfamilienavn, der beskriver musemodellen, angiv fødselsdatoen (DOB, mm/dd/yyyy), skifte køn knappen (M / F) knappen til den relevante beskrivelse. Klik på Luk for at gemme de eksperimentelle detaljer.
- Klik på Protokoller. De mørktilpassede ERG- og DC-ERG-protokoller bør nu være synlige.
- Endelig skal du placere Long Flash.col-filen i følgende mappe C:\ERG-brugerfiler\Long Flash.col.
2. Kapillær elektrode forberedelse
- Skær de 1,5 mm glas kapillærer i halve ved hjælp af en keramisk flise ( Tabel afMaterialer) for at score glasset og bryde dem rent ved hjælp af et bord til at give fysisk modkraft og til at stabilisere glasset.
BEMÆRK: Sløv snitterne efter behov. - Ved hjælp af en Bunsen brænder (Tabel af Materialer) tillader varmen at gøre en lille bøjning i kapillær, mens du holder den over flammen med snævler.
3. Fyldning kapillær elektroder
- Forbind vakuumudsiccatoren til laboratoriets vakuumlinje gennem et in-line filter (Materialetabel).
- Hæld 30 ml hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (Materialetabel) i et åbent 50 ml konisk rør, og den (med hætten fjernet) anbringes i vakuumkammeret.
- Tænd for vakuum og afgas HBSS, mens du tænder for computeren og kontrolapparatet.
- Efter 5\u201210 min slukke for vakuum og bruge afgasset HBSS til at fylde en 12 ml sprøjte gennem en vedhæftet 25 G nål. Brug den til at fylde elektrodeholdernes baser og tage ekstra forsigtighed for ikke at indføre bobler.
- For at gøre dette skal du fjerne gevindskruehætten og forsigtigt skubbe sprøjtenålen gennem silikonegummipakningen for at nå holderens bagvæg (sølv/sølvchloridpeller).
BEMÆRK: Sølv-/sølvchloridpillerne er fordelagtige i forhold til holdere, der bruger sølvtråd, da de giver mere overfladeareal, hvilket resulterer i en stabil støjsnåe. Sølv-/sølvchloridpiller kræver dog en væskegrænseflade, der er fri for luftbobler for at opnå en god forbindelse. Vær derfor meget forsigtig med ikke at indføre luftbobler under denne proces. - Injicer gradvist HBSS for at fylde hele mikroelektroden, mens sprøjtens nål langsomt trækkes tilbage. Sæt gevindhætten på igen, men stram ikke. Sæt sprøjtenylen i igen for at fylde det tomme rum i hætten med HBSS. Fyld derefter glaskapillæren, mens du holder den vandret for at forhindre opløsningen i at slippe ud af den anden ende.
- Hold glaskapillæren fra den bøjede ende, og indsæt langsomt den modsatte ende gennem den løsnede hætte, og stram derefter skruehætten på plads.
BEMÆRK: Glaselektroder fyldt med HBSS opretholder smøring af musens øje og forhindrer hornhindedehydrering, der ville opstå ved brug af standard guldløkkeelektroder.
- For at gøre dette skal du fjerne gevindskruehætten og forsigtigt skubbe sprøjtenålen gennem silikonegummipakningen for at nå holderens bagvæg (sølv/sølvchloridpeller).
- Placer elektrodeholderne med kapillærelektroderne vippet opad, så boblerne kan strømme ud. Kør vakuum i 5\u201210 min til degas. Gas, der slipper ud fra glas- og plastoverfladerne, skubber HBSS ud af elektrodeholderne.
- Stop og slip derefter langsomt tomrummet. Genopfyld elektrodeholderne og glaskapillærerne som beskrevet tidligere.
BEMÆRK: Bobler har tendens til at samle på eller i nærheden af silikone gummipakning og kan også gemme sig i rillerne på gevindhætten, derfor skal der lægges særlig vægt på at holde disse områder boblefri. - Installer og fastgør mikroelektrodeholderen i den specialfremstillede T-clip/Magnetic ball joint stand(Figur 1A,indsat). For at gøre den brugerdefinerede stå for mikroelektrode indehaveren, ændre en T-klip (5/16"-11/32" OD Tubing) #8 (Tabel af Materialer) ved at fjerne den sorte polyacetal klip på den ene side. Få cylinderbunden af de magnetiske kuglesamlinger bearbejdet i halve for at justere højden (Materialetabel). Fastgør de modificerede T-clips til de magnetiske kuglemonteringsskruer med M3-nødder.
- Anvend mikroelektrodeholderen i den modificerede T-clips, og hold den tæt på plads ved at glide i ca. et 1"-tilspidset træhåndtag, der er fremstillet af at bryde en bomuldsspidsrensepind (Materialetabel) i en vinkel. Brug den sjældne jordmagnet cylinderbase til sikker placering af den tilpassede elektrodeholder på metalpladen på scenen, der muliggør 360° rotation på en 180° akse.
4. Testelektroder
- Hbss hældes i en lille beholder (f.eks. hætten på det koniske 50 ml rør).
- Sænk forsigtigt de fuldt samlede, HBSS-fyldte kapillærmimielektroder ind i hætten indeholdende HBSS for at præekvilibre elektroderne og placere nåleklodselektroden (hale/bagben) og Ag/AgCl sintret pelletreferenceelektrode (mund) i samme HBSS for at fuldende kredsløbet (Figur 1A).
BEMÆRK: Udfør alle efterfølgende trin under svagt rødt lys. Brug en rød-lys lommelygte til at placere musen og kapillær elektroder. Husk helt at slukke for alle lyskilder, før optagelsen påbegyndes. - Vælg eller opret et passende id (efternavn) for at beskrive den mus, der skal testes, og vælg den DC-ERG-protokol, der skal udføres, ved at fuldføre registreringen i henhold til følgende rækkefølge.
- Klik på Protokoller. Vælg DC-ERG. Klik på Kør. En dialogboks vil poppe op: "Nuværende patient er XXX [DOB: XX/XX/XX) Er dette korrekt for den test, der udføres?" Klik på Ja. Fortsæt derefter til "Trin 1/6".
- Luk dørene til faraday buret.
- Vis impedanstilstand ved at klikke på Impedance, og kontroller, at værdierne for mundreference, halejord og optagelseselektroder er acceptable (se figur 1B).
- Test baseline stabilitet (støj og drift) ved at klikke på Trin (fremad pil) for at vælge Trin 4 / 6 "Long Flash No Light."
BEMÆRK: Den mængde afdrift, der observeres, når elektroderne anbringes i HBSS-badet, er generelt mindre end 500 μV pr. 80 s, når de har stabiliseret sig, og svarer til den fordrift, der observeres, når elektroderne er forbundet med musen. Således er den elektriske udlæsning af elektroderne i HBSS-badet en vigtig indikator for elektrodernes status. Støjen, målt som top-til-top, er generelt ~ 10\u201215% større i musen end i HBSS bad. Dette skyldes sandsynligvis tilføjelsen af bevægelse artefakter fra vejrtrækning. - Begynd at få vist sporingerne ved at klikke på Eksempel. Sporene skal være lav støj med en top-til-top amplitude <200 μV. En let afdrift (<500 μV/80 s), der gradvist svinder til baseline, er acceptabel (Figur 1C).
5. Positionering af mus og elektrode
- Hold musene natten over i en godt ventileret lystæt kasse til mørk tilpasning.
- Bedøve dyrene ved intraperitonal injektion af ketamin (80 mg/kg) og xylazin (8 mg/kg).
- Påfør et fald på 0,5% proparacain HCl topisk at bedøve hornhinden samt et fald på 2,5% phenylephrin HCl og 0,5% tropicamide at spile eleverne.
- Trim musen whiskers med en saks for at forhindre utilsigtet trækninger fra forstyrre glas kapillær elektroder under optagelsen.
BEMÆRK: DC-ERG stimulus-protokollen i ERG-systemet har flere indbyggede stimulus rutiner, der kan vælges ved at klikke på Step (fremad pil) eller Step (baglæns pil). Kun trin 1, 4 og 5 i softwaren er nødvendige for at forberede og udføre DC-ERG-optagelsen. - I ERG-systemsoftwaren skal du kontrollere, at den korrekte patient er valgt. Klik på den grønne protokolknap. Vælg DC-ERG under Protokolbeskrivelse. Klik derefter på Kør. Kontroller, at dette er den korrekte test, der udføres ved at klikke på Ja.
- Brug trin 1/6 udpegede Red Light stimulus til at tænde det røde lys inde i kuplen for at hjælpe med at placere musen og elektroderne, mens du observerer ændringerne i impedans.
- Placer musen på et opvarmet optagelsesbord og forsigtigt telt huden af det bageste ben ved hjælp af spån. Hold nåleelektroden fast i den ene hånd og sæt den subkutende ind i bagbenet for at fastgøre den på plads.
- Anbring referencen Ag/AgCl elektrode (Materialetabel) inde i munden, så den sintret pellet hviler langs bag kinden og holdes på plads bag tænderne.
BEMÆRK: Guldtrådselektroder bør ikke anvendes som mundreferenceelektroden, da de har forskellige impedansegenskaber og øger top-til-top-støjen. - Før kapillærelektroderne anbringes i musens øje, skal elektrodeholderen holdes lodret med glaskapillærerne lodret, svirp elektrodeholderen med pegefingeren for at fjerne eventuelle bobler, der måtte være blevet indført. Fyld spidsen med HBSS med en 25 G nål fastgjort til en sprøjte og undersøg for at sikre, at der ikke er nogen luftboble fanget på spidsen. Placer elektrodeholderholderen, så den åbne spids af de HBSS-fyldte kapillærer er i let kontakt med hornhinden.
- Brug særlige forholdsregler for at undgå at indføre luftbobler ved at holde smøremidlet øje gel dispenser omvendt og kassér de første dråber. Anlæg en dråbe smøremiddeløjegel på hvert øje for at opretholde ledningsevne og undgå udledning under optagelsen.
6. DC-ERG-optagelse
- Klik på Trin (pil fremad) for at vælge Trin 4/6 "Long Flash No Li".
- Klik på Impedance. Brug skærmen Impedance Checking til at undersøge modstanden i venstre og højre øjne. Impedansværdierne for optagelseselektroderne på hvert øje forventes at være ens (~39 kΩ). Impedansværdierne for både jord- og referenceelektroder forventes at være mindre end 10 kΩ).
- Klik på Eksempel for at se sporene for venstre og højre øje. Vent på, at der opnås en stabil basislinje (<10 min). Klik på Stop for at afslutte sporingseksemplet.
BEMÆRK: Pludselige ændringer i drift retning eller afvigende støj i optagelsen vil ikke forbedres med tiden og vil kræve at identificere kapillær elektrode, der kræver opmærksomhed. Den mest sandsynlige årsag er en boble introduceret til spidsen af elektroden. Genopfyld spidsen med HBSS. Klik på Eksempel igen for at kontrollere den oprindelige plan. - Klik på Trin (frem pil) for at vælge Trin 5 / 6 "Long Flash 10 cd 7 min."
- Klik på Kør for at starte optagelsen ( Figur1D).
7. Dataeksport
- Vælg den "Patient" (Familienavn), der beskriver den museregistrering, der skal eksporteres.
- Klik på Gamle Tests.
- Vælg DC-ERG under Protokolbeskrivelse. Klik på den grønne belastningsknap for at indlæse de tidligere erhvervede data.
- Klik på Step (frem pil) for at gå videre til trin 5 / 6 "Long Flash 10 cd 7 min."
- Klik på Eksportér.
- Angiv filnavnet (f.eks. filnavn.csv). Et gyldigt filnavn skal begynde med et bogstav efterfulgt af bogstaver, tal eller understregninger. Brug ikke specialtegn eller bindestreger. Dataanalyseprogrammet (DCERG_Analysis.exe) kræver, at tabelposter opfylder kravene til variabelnavne.
- Markere datatabellen ud for Datatabel. Vælg Tabulator ud for separator. Placer markeringer ud for Indstillinger (Titler, Lodret), Medtag alle (trin, Chans, Resultater), Datakolonner (Indhold, Resultater, Sweeps) og Format (Fil).
- Klik derefter på Eksport (Figur 1E). Der vises *.csv i mappen C:\Multifokal.
8. Dataanalyse
- Hent og installer det relevante installationsprogram (Materialetabel)
- Hent og installer DCERG_Analysis.exe installationsprogrammet.
BEMÆRK: Dette installerer det script, der skal udføre analysen af DC-ERG-komponenterne, og opretter en genvej til at køre programmet i mappen Startmenu. - Klik på den genvej, der er oprettet i mappen Start > Programmer.
- Vælg den eller de eksporterede datafil (*.csv) til analyse. Brug Ctrl + venstre klik på musen for at vælge mere end én fil.
BEMÆRK: Den eksekverbare fil genererer to typer af observationsområder: 1) de rådata er afbildet med en bedst egnet linje, der angiver den målte drift; 2) den drift korrigeret svar er plottet efter at være blevet glattet med et glidende gennemsnit (med en spændvidde på ~ 5 s). Fra dette plot amplituder og time-to-peak af DC-ERG komponenter er identificeret: c-bølge, hurtig svingning, lys top, og off respons. Dataene eksporteres derefter i tabelformat for at udmærke sig, hvor hvert ark svarer til en anden museoptagelse. Disse ark efterfølges af to sammenfattende ark: i) kompilerede DC-ERG-amplituder (mV); ii) kompileret DC-ERG time-to-peaks (let debut, t = 0 min).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 er et prøvedatasæt fra mus af miR-204 ko/ko cre/+ (betinget KO) og vilde typer (WT). MiR-204 ko/ko cre/+ er mus med en betinget knockout af microRNA 204 i retinal pigment epitel. Disse mus genereres ved at krydse floxed miR-204 mus (produceret af NEIGEF)22 med VMD2-CRE mus23. MiR-204 er meget udtrykt i RPE, hvor det regulerer ekspressionen af proteiner afgørende for epitelfunktion, der opretholder stramme samling integritet (f.eks claudins), vedligeholdelse af kalium homøostase gennem udtrykket kir 7,1 kalium kanaler, og udtryk for flere visuelle cyklus gener (f.eks LRAT, RPE65)24.
Da unormal RPE morfologi blev rapporteret i flere RPE-specifikke Cre udtrykke muselinjer25, vi overvåges for normal RPE morfologi i Cre udtrykke mus med WT fænotype. De strukturelle og funktionelle abnormiteter af miR-204 ko/ko cre + (betinget KO) musenængelig ligner de funktioner, der findes i miR-204 null mus15 karakteriseret ved hyper autofluorescens (lipofuscin-lignende indskud) og øget microglia lokaliseret til RPE apical overflade. I null mus disse ændringer blev ledsaget med nedsat lys-fremkaldte elektriske reaktioner af RPE, med minimal ændring af fotoreceptor reaktioner (vurderet af retinale ERG). Således, hastighed af miR-204 udtryk i miR-204 ko /ko cre /+ mus forventes også at ændre den elektriske respons af RPE.
I eksemplet placeres en mus på den opvarmede platform, og elektroderne placeres korrekt, før kuplen sænkes. Impedans og drift kontrolleres som tidligere beskrevet ved hjælp af badopløsningen. Repræsentative "negative" resultater er vist i figur 2A. I figur 2A (øverste panel) lider sporingen af små bobler i elektroden, der øger top-til-top støj i sporet (skygget med blåt). I et andet eksempel(Figur 2A, nederste panel), når bobler løsne sig fra overfladen af glasset og bevæge sig langs længden af elektroden dette forårsager pludselige ændringer i retning af baseline drift, der ikke kan kompenseres ved drift subtraktion. Figur 2B viser repræsentative "positive" optagelser af WT og miR-204 ko/ko cre/+ mus, hvor boblerne er blevet elimineret ved hjælp af vakuumkammeret, før mikroelektroderne samles i elektrodeholderens stande.
Den bedst egnede linje til de oprindelige 25 s (grøn) beregnes og vises med blåt (Figur 2B). De drift korrigerede svar er replotted i figur 2C sammen med identifikation af amplituder af DC-ERG komponenter. Ved hjælp af DC-ERG teknik, der er beskrevet i denne protokol dyr fra både WT og miR-204 ko/ ko cre / + stammer kan hurtigt registreres og analyseres.
C-bølgen består af to komponenter: en hyperpolarisering af RPE-membranen på grund af øget kaliumledningsevne som reaktion på et fald i kalium i det subretinale rum på grund af fotoreceptoraktivitet og et separat bidrag fra indre retinale celler (langsom P3-komponent – hvilket afspejler aktiviteten af Müller-celler). Den hurtige svingning giver oplysninger om hyperpolarisering af RPE basolateralmembran 26, primært på grund af ændringer i ledningsevne af en Cl transporter kaldet cystisk fibrose transmembrane ledningsans regulator (CFTR)27. Lyset peak menes at stamme fra en ændring i koncentrationen af en fotoreceptor drevet stof28, der gennem en anden messenger system depolarizes RPE's basolaterale membran ved at modulere aktiviteten af Ca2 + afhængige Cl kanaler21. Endelig er off-response et komplekst samspil mellem reaktioner, der varierer i polaritet og varierer med lysintensitet18.
Som forventet dæmper reduceret ekspression af Kir 7,1 K+ kanaler i høj grad c-bølge29 og hurtige svingninger som vist i de gennemsnitlige svar i figur 2D, hvilket indikerer en betydelig forringelse af RPE'ens elektriske egenskaber. Et resumé af ændringerne i komponenterne i DC-ERG findes i figur 2E. Dc-ERG-komponenternes relative amplituder (normaliseret til WT) afbildes mod de relativt to største lysformlidede a-bølge-amplituder (1 cd·s/m2; 10 cd·s/m2) (normaliseret til WT) og vist i figur 2F\u2012H. Reduktionen i a-bølgeresponsen til den klareste lysintensitet (10cd·s/m2) (Figur 2F\u2012H, supplerende figur S1A,B) tyder på en forsinkelse i genoprettelsen af følsomheden på grund af synscyklussvækkelse(f.eks.som følge af reduceret LRAT- eller RPE65-udtryk som følge af genomisk knockout på miR-20424,30).
Figur 1: Diagrammet fremhæver de vigtigste trin i DC-ERG-protokollen. (A) Billede af det færdige kredsløb, der opnås ved at sænke optagelsen (glaskapillære mikroelektroder), reference og jordelektroder i samme badeopløsning. Denne konfiguration gør det muligt at køre indledende test (før musen bedøves) for at vurdere den karakteristiske impedans, støj og drift. Indsat (øverst til venstre), der viser et sidesyn skematisk af den brugerdefinerede mikroelektrode holder stå. b) Repræsentativt billede af impedancekontroltilstanden, der viser de relevante værdier for elektrode impedanser. Impedansen i venstre og højre øjenelektroder skal være sammenlignelig inden for 5 KΩ af hinanden (f.eks. venstre øje: 38,7 KΩ vs Højre øje: 40,36 KΩ). Mundreferenceelektrodens impedans skal være mindre end 1 KΩ, mens haleelektroden skal være omkring 2,5 KΩ. (C) Der vises et repræsentativt billede af eksempelsporingen (trin 4/6). Trin 4 (Long Flash No Light) er valgt, da der ikke leveres lys under eksemplet på dette trin. Sporene skal være lav støj og kan have en lille afdrift, der gradvist svinder med tiden til baseline. Når sporene har opnået en konstant afdrift i begge kanaler og bliver relativt flad, kan den faktiske optagelse begynde. (D) Ved hjælp af trin 5/6 (Long Flash 10 cd 7 min) efter 0,5 min mørke, et let trin på 10 cd/m2 leveres til musen i 7 min efterfulgt af en tilbagevenden til mørke i 1,5 min. (E) Billede af de eksportparametre, der anvendes til at konvertere data til en * .csv fil. Dette præcise format er nødvendigt for at køre DC-ERG analysesoftware. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Repræsentative spor og arbejdsgang for DC-ERG-analyse. Billede af et negativt DC-ERG-resultat, der viser overdreven (A, toppanel)top-til-top støj og (A, bundpanel)drift. (B) Billeder af positive DC-ERG optagelse resultater fra en WT og miR-204 ko / ko cre / + mus. Genererede parceller af de rå spor, der viser de bedst egnede linjer (blå) til de første 25 s (grønne) før lys debut. (C) Parceller af drift korrigeret DC-ERG svar for WT og miR-204 ko / ko cre / + mus vist i B. Amplituderne af komponenterne i DC-ERG er angivet i forklaringen. d) Gennemsnitlige DC-ERG-responser på 3-8 måneder gamle WT (n = 6) og miR-204 ko/ko cre/+ (n = 6) mus. DC-ERG-komponenterne er mærket på WT-sporingen, og lysstimuleringsparametrene er defineret nedenfor. (E) Resumé af DC-ERG komponenter taget fra optagelser af WT og miR-204 ko/ko cre/+ mus. Søjleplots repræsenterer middelværdi, fejllinjer angiver standardfejl. De relative amplituder af(F)c-bølge, (G) hurtige svingninger, og (H) off respons afbildes mod de relativt to største lys-fremkaldte a-bølge amplituder (1 cd·s/m2; 10 cd·s/m2) (normaliseret til WT). Betydning er angivet med stjerner: (Studerendes t-test; * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001). Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 1: ERG-respons fra WT og miR-204 ko/ko cre/+ mus. (A) Svar fra WT (sort) og miR-204 ko/ko cre/+ mus (magenta) til 4 ms glimt af lys med stigende intensitet: 0,0001 cd·s/m2 (n = 5), 0,001 cd·s/m2 (n = 5), 0,01 cd·s/m2 (n = 3), 0,1 cd·s/m2 (n = 3), 1 cd·s/m2 (n = 3), 10 cd·s/m2 (n = 2). (B) Gennemsnit a-bølge amplitude plottet mod flash intensitet. (C) Gennemsnitlig b-bølge amplitude plottet mod flash intensitet. d) Gennemsnitlig time-to-peak af a-bølge reaktioner plottet mod flash intensitet. (E) Gennemsnitlig time-to-peak af b-bølge reaktioner afbildet mod flash intensitet. For alle parceller, der vises fejllinjer angiver SEM. Betydning er angivet med stjerner: (Student's t-test; * = p < 0,05). Klik her for at downloade dette tal.
Supplerende figur 2: Eksempel på en DC-forskydning i strømledningen, som kan afbødes ved brug af en spændingsregulator/effektbalsam. (A)I mangel af spænding regulering spænding pigge (forårsaget af brug af udstyr i et tilstødende rum f.eks OCT) generere en DC-offset, der kan forstyrre målingen af DC-ERG komponenter, især lyset peak. Den forstyrrende forskydning forstørres til højre. (B) Med spænding regulator / power conditioner aktiveret den oprindelige spike er stadig mærkbar, men den skadelige DC-offset er fjernet. Effekten af spændingsregulatoren/effektbalatoren forstørres og vises til højre. Klik her for at downloade dette tal.
supplerende filer. Klik her for at downloade disse filer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiske trin
En god DC-ERG optagelse kræver stabile elektroder, der er fri for bobler, der skaber artefakter og uønsket drift, da de er ekstremt følsomme over for udgasning og temperaturændringer. Det er vigtigt, at der opnås en stabil basislinje, når elektroderne placeres i HBSS-badopløsningen, før du går videre med museregistreringen. Små bobler har tendens til at samle sig i bunden af kapillær elektroden eller omkring silikonepakningen og er svære at se, når elektrodeholderen er helt samlet. Når der kun er få bobler til stede, vil let svirpende indehaveren frigøre dem til fjernelse. Hvis der er for mange bobler, eller hvis afdrift eller støj ikke kan fjernes, er det ofte bedre at skille elektroden ad og starte forfra, mens du omhyggeligt inspicerer for bobler på hvert trin i processen.
Ændringer og fejlfinding
Følgende tilpasninger kan foretages til opsætningen (Tabel over materialer) for at forbedre kvaliteten af DC-ERG-optagelserne. Støjsvekabler til mikroelektrodeholdere kan bruges til at udvide de eksisterende kabler fra 32-bit forstærkeren til optagebordet. Den ekstra længde muliggør omhyggelig placering og justering af elektrodeholderen uden at forstyrre deres position, når Ganzfeld kuplen er lukket. En spænding regulator / power conditioner kan bruges til at fjerne i linje støj og strømstød genereret fra lys eller udstyr i tilstødende rum bliver tændt og slukket(Figur S2). Derudover kan bordpladen Ganzfeld dome stimulator og 32-bit forstærker placeres inde i en Faraday bur jordet til bygningen jorden bar til at beskytte mod eventuelle yderligere elektrisk støj.
Begrænsninger af metoden
DC-ERG kan kun registreres trofast på mørke tilpassede dyr, hvilket betyder, at når lysmult stimulus er tændt er der lidt, der kan gøres for at fjerne uønskede potentialer eller drift. En anden begrænsning er, at polariteten af nogle af komponenterne i DC-ERG (light-peak, off-response) er underlagt den anvendtelysintensitet 16. Det betyder, at de største afvigelser fra WT kan forekomme ved intensiteter, der ikke i sig selv er til stede ved den lysintensitet, som denne protokol anvender (10 cd/m2). Til dette punkt, dc-ERG analyse software blev designet under forudsætning af en negativ off respons (et svar minimum). Lysere lysintensiteter, der resulterer i tilbageførsel af polaritet af off respons vil kræve behovet for at ændre den medfølgende analyse script fil.
Betydning
RPE er involveret i den homøostatiske vedligeholdelse af retinale miljø og spiller en afgørende rolle i patologi af flere retinale sygdomme. Denne metode forklarer i detaljer, hvordan du konfigurerer et DC-ERG-system til registrering af RPE-elektrisk respons, som når det udføres sammen med konventionelle ERG-optagelser, giver et objektivt mål for den ydre retinale og RPE-funktion. Disse mål for RPE-funktionalitet kan bruges til at evaluere transgene muselinjer, der viser degenerative fænotyper, eller til at teste for lægemiddel-effekt eller lægemiddelinduceret cytotoksicitet for RPE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NEI-midler inden for intramural. Forfatterne oprigtigt anerkende Dr. Sheldon Miller for hans videnskabelige vejledning, teknisk rådgivning, og ekspertise i RPE fysiologi og sygdom. Forfatterne takker Megan Kopera og dyrepleje personale til styring af musen kolonier, og Dr. Tarun Bansal, Raymond Zhou, og Yuan Wang for teknisk support.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ag/AgCl (mouth) Electrode | WPI Inc | EP1 | Mouth reference electrode for mouse |
| Ceramic Tile | Sutter Instrument | CTS | Used to cut the glass capillary tube to an appropriate size |
| Cotton Tipped Cleaning Stick | Puritan Medical Products | 867-WC No Glue | To be used as a spacer to improve the fit of the electrode holder assembly |
| Electroretinogram (ERG) System | Diagnosys LLC | E3 System | Visual electrophysiology system to diagnose ophthalmic conditions in vision research and drug trials |
| Bunsen Burner | Argos Technologies | BW20002460 | Or equivlaent to shape glass under flame |
| Glass Capillary Tube (1.5 mm) | Sutter Instruments | BF150-75 | For filling with HBSS and making contact to the cornea |
| Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific Inc | 14175-095 | Commercially available. Maintain at RT |
| In-Line Filter | Whatman | 6722-5001 | To protect vacuum pump from aerosols |
| Low Noise Cable for Microelectrode Holders | WPI Inc | 5372 | Suggested for improving the length and placement of the cables and electrode holder assemblies |
| Magnetic Ball Joint | WPI Inc | 500871 | For magnetically positioning the electrode holder assembly on the stage |
| MatLab | Mathworks | MatLab: For editing the analysis software | |
| MatLab Curvefit Toolbox | Mathworks | Toolbox for MatLab (only required for editing the analysis software) | |
| MatLab Compiler | Mathworks | Toolbox for MatLab (only required for editing and re-releasing the analysis software) | |
| MatLab Runtime version 9.5 | Mathworks | R2018b (9.5) | Required to run the analysis software: https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html |
| Microelectrode Holders (45 degrees) | WPI Inc | MEH345-15 | For holding the capillaries |
| Needle (25 ga) | Covidien | 8881250313 | For filling the capillary tubes with HBSS |
| Needle (ground) Electrode | Rhythmlink | 13mm - one elctrode | Subdermal needle electrode (ground) for mouse (13mm long, 0.4mm diameter needle, 1.5m leadwire) |
| Regulator/Power Conditioner | Furman | P-1800 | Or equivalent to remove DC-offset from noise introduced through power line |
| Syringe (12 mL) | Monoject | 1181200777 | For filling the capillary tubes with HBSS |
| T-clip | Cole-Parmer | 06852-20 | For electrode holder assembly |
| Vacuum Desiccator | Bel-Art | 420120000 | Clear polycarbonate bottom & cover |
| Pharmacological treatment | |||
| Lubricant eye gel | Alcon | 0078-0429-47 | Helps lubricate corneal surface and maintain electrical contact with capillary electrodes |
| Phenylephrine Hydrochloride 2.5% | Akorn | 17478-201-15 | Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation) |
| Proparacaine Hydrochloride 0.5% | Akorn | 17478-263-12 | Local anesthetic for ophthalmic instillation |
| Tropicamide 0.5% | Akorn | 17478-101-12 | Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation) |
| Xylazine | AnaSed | sc-362949Rx | Analgesic and muscle relaxant |
| Zetamine (Ketamine HCl) | VetOne | 501072 | Anesthetic for intramuscular injections |
References
- Steinberg, R. H. Interactions between the retinal pigment epithelium and the neural retina. Documenta Ophthalmologica. 60 (4), 327-346 (1985).
- Sahu, B., Maeda, A. RPE Visual Cycle and Biochemical Phenotypes of Mutant Mouse Models. Methods in Molecular Biology. 1753, 89-102 (2018).
- Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture. Experimental Eye Resarch. 126, 51-60 (2014).
- Wimmers, S., Karl, M. O., Strauss, O. Ion channels in the RPE. Progress in Retinal Eye Research. 26 (3), 263-301 (2007).
- Gundersen, D., Orlowski, J., Rodriguez-Boulan, E. Apical polarity of Na,K-ATPase in retinal pigment epithelium is linked to a reversal of the ankyrin-fodrin submembrane cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 112 (5), 863-872 (1991).
- Fletcher, E. L., et al. Studying age-related macular degeneration using animal models. Optometry and Vision Science. 91 (8), 878-886 (2014).
- Gu, S. M., et al. Mutations in RPE65 cause autosomal recessive childhood-onset severe retinal dystrophy. Nature Genetics. 17 (2), 194-197 (1997).
- Marlhens, F., et al. Mutations in RPE65 cause Leber's congenital amaurosis. Nature Genetics. 17 (2), 139-141 (1997).
- Marmorstein, A. D., et al. the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (23), 12758-12763 (2000).
- Chang, B. Mouse models for studies of retinal degeneration and diseases. Methods in Molecular Biology. 935, 27-39 (2013).
- Collin, G. B., et al. Mouse Models of Inherited Retinal Degeneration with Photoreceptor Cell Loss. Cells. 9 (4), (2020).
- Shrock, E., Güell, M. CRISPR in Animals and Animal Models. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 152, 95-114 (2017).
- Smalley, E. CRISPR mouse model boom, rat model renaissance. Nature Biotechnology. 34 (9), 893-894 (2016).
- Benchorin, G., Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Vollrath, D. Assessment of Murine Retinal Function by Electroretinography. Bio Protocol. 7 (7), (2017).
- Zhang, C., et al. Regulation of phagolysosomal activity by miR-204 critically influences structure and function of retinal pigment epithelium/retina. Human Molecular Genetics. 28 (20), 3355-3368 (2019).
- Samuels, I. S., et al. Light-evoked responses of the retinal pigment epithelium: changes accompanying photoreceptor loss in the mouse. Journal of Neurophysiology. 104 (1), 391-402 (2010).
- Wu, J., Marmorstein, A. D., Peachey, N. S. Functional abnormalities in the retinal pigment epithelium of CFTR mutant mice. Experimental Eye Research. 83 (2), 424-428 (2006).
- Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Neurophysiology. 91 (3), 1134-1142 (2004).
- Peachey, N. S., Stanton, J. B., Marmorstein, A. D. Noninvasive recording and response characteristics of the rat dc-electroretinogram. Visual Neuroscience. 19 (6), 693-701 (2002).
- Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).
- Marmorstein, L. Y., et al. The light peak of the electroretinogram is dependent on voltage-gated calcium channels and antagonized by bestrophin (best-1). Journal of General Physiology. 127 (5), 577-589 (2006).
- Zhang, C., et al. Invest. Ophtalmol. Vis. Sci. Annual Meeting for the Association for Research in Vision and Ophthalmology. , 3568 (2017).
- Iacovelli, J., et al. Generation of Cre transgenic mice with postnatal RPE-specific ocular expression. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (3), 1378-1383 (2011).
- Wang, F. E., et al. MicroRNA-204/211 alters epithelial physiology. FASEB Journal. 24 (5), 1552-1571 (2010).
- He, L., Marioutina, M., Dunaief, J. L., Marneros, A. G. Age- and gene-dosage-dependent cre-induced abnormalities in the retinal pigment epithelium. American Journal of Pathology. 184 (6), 1660-1667 (2014).
- Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. Light-evoked modulation of basolateral membrane Cl- conductance in chick retinal pigment epithelium: the light peak and fast oscillation. Journal of Neurophysiology. 70 (4), 1669-1680 (1993).
- Blaug, S., Quinn, R., Quong, J., Jalickee, S., Miller, S. S. Retinal pigment epithelial function: a role for CFTR. Documenta Ophthalmologica. 106 (1), 43-50 (2003).
- Gallemore, R. P., Griff, E. R., Steinberg, R. H. Evidence in support of a photoreceptoral origin for the "light-peak substance". Investigative Ophthalmology and Visual Science. 29 (4), 566-571 (1988).
- Shahi, P. K., et al. Abnormal Electroretinogram after Kir7.1 Channel Suppression Suggests Role in Retinal Electrophysiology. Science Reports. 7 (1), 10651 (2017).
- Li, Y., et al. Mouse model of human RPE65 P25L hypomorph resembles wild type under normal light rearing but is fully resistant to acute light damage. Human Molecular Genetics. 24 (15), 4417-4428 (2015).
