Direkte koblet elektroretinogram (DC-ERG) til registrering af lys-fremkaldte elektriske svar af musen retinal pigment epitel
Summary
Her præsenterer vi en metode til registrering af lys-fremkaldte elektriske reaktioner af retinale pigment epitel (RPE) i mus ved hjælp af en teknik kendt som DC-ERGs første beskrevet af Marmorstein, Peachey, og kolleger i begyndelsen af 2000’erne.
Abstract
Den retinale pigment epitel (RPE) er en specialiseret monolag af celler strategisk placeret mellem nethinden og choriocapillaris at opretholde den generelle sundhed og strukturelle integritet fotoreceptorer. RPE er polariseret, udviser apisk og basalt placeret receptorer eller kanaler, og udfører vektoral transport af vand, ioner, metabolitter, og udskiller flere cytokiner.
In vivo noninvasive målinger af RPE-funktion kan foretages ved hjælp af direkte koblede ERGs (DC-ERGs). Metoden bag DC-ERG blev udviklet af Marmorstein, Peachey, og kolleger ved hjælp af et specialbygget stimuleringsoptagelsessystem og demonstrerede senere ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt system. DC-ERG-teknikken bruger glaskapillærer fyldt med Hanks buffersaltopløsning (HBSS) til at måle RPE’s langsommere elektriske reaktioner fremkaldt af lysbetalte koncentrationsændringer i subretinale rum på grund af fotoreceptoraktivitet. Dc-ERG-optagelsens langvarige lysmulmulans og længde gør den sårbar over for drift og støj, hvilket resulterer i et lavt udbytte af brugbare optagelser. Her præsenterer vi en hurtig, pålidelig metode til at forbedre stabiliteten af optagelserne og samtidig reducere støj ved hjælp af vakuumtryk for at reducere / eliminere bobler, der skyldes udgasning af HBSS og elektrodeholderen. Derudover er strømledningsartefakter svækket ved hjælp af en spændingsregulator/strømbalator. Vi inkluderer de nødvendige lysstimuleringsprotokoller til et kommercielt tilgængeligt ERG-system samt scripts til analyse af DC-ERG-komponenterne: c-wave, hurtig svingning, let top og off response. På grund af den forbedrede lethed af optagelser og hurtig analyse workflow, denne forenklede protokol er særlig nyttig til måling af aldersrelaterede ændringer i RPE funktion, sygdomsprogression, og i vurderingen af farmakologisk intervention.
Introduction
Den retinale pigment epitel (RPE) er en monolayer af specialiserede celler, linje den bageste segment af øjet og udøve kritiske funktioner til at opretholde retinale homøostase1. RPE understøtter fotoreceptorer ved at regenerere deres foton-fanger visuelle pigment i en proces kaldet denvisuelle cyklus 2, ved at deltage i den døgnfarlige fagocytose af kaste ydre segment tips3, og i transport af næringsstoffer og metaboliske produkter mellem fotoreceptorer og choriocapillaris4,5. Abnormiteter i RPE funktion ligger til grund for mange menneskelige retinale sygdomme, såsom aldersrelaterede makuladegeneration6, Leber’s medfødte amaurosis7,8 ogBedste vitelliform makulad dystrofi9. Da donorøjevæv ofte er vanskelige at opnå udelukkende til forskningsformål, kan dyremodeller med genetiske modifikationer være en alternativ måde at undersøge udviklingen af retinalesygdomme 10,11. Derudover, fremkomsten og anvendelsen af CRISPR cas9 teknologi tillader nu genomiske introduktioner (knock-in) eller sletninger (knock-out) i en enkel, et-trins proces overgår begrænsninger af tidligere gen målretning teknologier12. Boomet i tilgængeligheden af nye musemodeller13 kræver en mere effektiv optagelsesprotokol til ikke-invasivt evaluere RPE-funktion.
Måling af RPE’s lysbetalte elektriske reaktioner kan opnås ved hjælp af en direkte koblet elektroretinogram (DC-ERG) teknik. Når dc-ERG anvendes i kombination med konventionelle ERG-optagelser, der måler fotoreceptoren (a-wave) og bipolære (b-wave)celleresponser 14, kan den definere, hvordan responsegenskaberne for RPE ændrer sig med retinal degeneration15,16,17 ellerom RPE-dysfunktion går forud for fotoreceptortab. Denne protokol beskriver en metode tilpasset fra arbejdet i Marmorstein, Peachey, og kolleger, der først udviklede DC-ERG teknik16,18,19,20 og forbedrer reproducerbarhed og brugervenlighed.
DC-ERG-optagelsen er vanskelig at udføre på grund af den lange anskaffelsestid (9 min.), hvor enhver afbrydelse eller indførelse af støj kan komplicere fortolkningen af dataene. Fordelen ved denne nye metode er, at baselines nå stabil tilstand inden for en kortere tid at reducere sandsynligheden for, at dyret vil vække for tidligt fra anæstesi og er mindre tilbøjelige til boble dannelse i kapillær elektroder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritiske trin
En god DC-ERG optagelse kræver stabile elektroder, der er fri for bobler, der skaber artefakter og uønsket drift, da de er ekstremt følsomme over for udgasning og temperaturændringer. Det er vigtigt, at der opnås en stabil basislinje, når elektroderne placeres i HBSS-badopløsningen, før du går videre med museregistreringen. Små bobler har tendens til at samle sig i bunden af kapillær elektroden eller omkring silikonepakningen og er svære at se, når e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af NEI-midler inden for intramural. Forfatterne oprigtigt anerkende Dr. Sheldon Miller for hans videnskabelige vejledning, teknisk rådgivning, og ekspertise i RPE fysiologi og sygdom. Forfatterne takker Megan Kopera og dyrepleje personale til styring af musen kolonier, og Dr. Tarun Bansal, Raymond Zhou, og Yuan Wang for teknisk support.
Materials
| Ag/AgCl (mouth) Electrode | WPI Inc | EP1 | Mouth reference electrode for mouse |
| Ceramic Tile | Sutter Instrument | CTS | Used to cut the glass capillary tube to an appropriate size |
| Cotton Tipped Cleaning Stick | Puritan Medical Products | 867-WC No Glue | To be used as a spacer to improve the fit of the electrode holder assembly |
| Electroretinogram (ERG) System | Diagnosys LLC | E3 System | Visual electrophysiology system to diagnose ophthalmic conditions in vision research and drug trials |
| Bunsen Burner | Argos Technologies | BW20002460 | Or equivlaent to shape glass under flame |
| Glass Capillary Tube (1.5 mm) | Sutter Instruments | BF150-75 | For filling with HBSS and making contact to the cornea |
| Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific Inc | 14175-095 | Commercially available. Maintain at RT |
| In-Line Filter | Whatman | 6722-5001 | To protect vacuum pump from aerosols |
| Low Noise Cable for Microelectrode Holders | WPI Inc | 5372 | Suggested for improving the length and placement of the cables and electrode holder assemblies |
| Magnetic Ball Joint | WPI Inc | 500871 | For magnetically positioning the electrode holder assembly on the stage |
| MatLab | Mathworks | MatLab: For editing the analysis software | |
| Matlab Curvefit Toolbox | Mathworks | Toolbox for MatLab (only required for editing the analysis software) | |
| MatLab Compiler | Mathworks | Toolbox for MatLab (only required for editing and re-releasing the analysis software) | |
| MatLab Runtime version 9.5 | Mathworks | R2018b (9.5) | Required to run the analysis software: https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html |
| Microelectrode Holders (45 degrees) | WPI Inc | MEH345-15 | For holding the capillaries |
| Needle (25 ga) | Covidien | 8881250313 | For filling the capillary tubes with HBSS |
| needle (ground) electrode | Rhythmlink | 13mm – one elctrode | Subdermal needle electrode (ground) for mouse (13mm long, 0.4mm diameter needle, 1.5m leadwire) |
| Regulator/Power Conditioner | Furman | P-1800 | Or equivalent to remove DC-offset from noise introduced through power line |
| Syringe (12 mL) | Monoject | 1181200777 | For filling the capillary tubes with HBSS |
| T-clip | Cole-Parmer | 06852-20 | For electrode holder assembly |
| Vacuum Desiccator | Bel-Art | 420120000 | Clear polycarbonate bottom & cover |
| Pharmacological treatment | |||
| Lubricant eye gel | Alcon | 0078-0429-47 | Helps lubricates corneal surface and maintain electrical contact with capillary electrodes |
| Phenylephrine Hydrochloride 2.5% | Akorn | 17478-201-15 | Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation) |
| Proparacaine Hydrochloride 0.5% | Akorn | 17478-263-12 | Local anesthetic for ophthalmic instillation |
| Tropicamide 0.5% | Akorn | 17478-101-12 | Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation) |
| Xylazine | AnaSed | sc-362949Rx | Analgesic and muscle relaxant |
| Zetamine (Ketamine HCl) | VetOne | 501072 | Anesthetic for intramuscular injections |
References
- Steinberg, R. H. Interactions between the retinal pigment epithelium and the neural retina. Documenta Ophthalmologica. 60 (4), 327-346 (1985).
- Sahu, B., Maeda, A. RPE Visual Cycle and Biochemical Phenotypes of Mutant Mouse Models. Methods in Molecular Biology. 1753, 89-102 (2018).
- Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture. Experimental Eye Resarch. 126, 51-60 (2014).
- Wimmers, S., Karl, M. O., Strauss, O. Ion channels in the RPE. Progress in Retinal Eye Research. 26 (3), 263-301 (2007).
- Gundersen, D., Orlowski, J., Rodriguez-Boulan, E. Apical polarity of Na,K-ATPase in retinal pigment epithelium is linked to a reversal of the ankyrin-fodrin submembrane cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 112 (5), 863-872 (1991).
- Fletcher, E. L., et al. Studying age-related macular degeneration using animal models. Optometry and Vision Science. 91 (8), 878-886 (2014).
- Gu, S. M., et al. Mutations in RPE65 cause autosomal recessive childhood-onset severe retinal dystrophy. Nature Genetics. 17 (2), 194-197 (1997).
- Marlhens, F., et al. Mutations in RPE65 cause Leber’s congenital amaurosis. Nature Genetics. 17 (2), 139-141 (1997).
- Marmorstein, A. D., et al. the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (23), 12758-12763 (2000).
- Chang, B. Mouse models for studies of retinal degeneration and diseases. Methods in Molecular Biology. 935, 27-39 (2013).
- Collin, G. B., et al. Mouse Models of Inherited Retinal Degeneration with Photoreceptor Cell Loss. Cells. 9 (4), (2020).
- Shrock, E., Güell, M. CRISPR in Animals and Animal Models. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 152, 95-114 (2017).
- Smalley, E. CRISPR mouse model boom, rat model renaissance. Nature Biotechnology. 34 (9), 893-894 (2016).
- Benchorin, G., Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Vollrath, D. Assessment of Murine Retinal Function by Electroretinography. Bio Protocol. 7 (7), (2017).
- Zhang, C., et al. Regulation of phagolysosomal activity by miR-204 critically influences structure and function of retinal pigment epithelium/retina. Human Molecular Genetics. 28 (20), 3355-3368 (2019).
- Samuels, I. S., et al. Light-evoked responses of the retinal pigment epithelium: changes accompanying photoreceptor loss in the mouse. Journal of Neurophysiology. 104 (1), 391-402 (2010).
- Wu, J., Marmorstein, A. D., Peachey, N. S. Functional abnormalities in the retinal pigment epithelium of CFTR mutant mice. Experimental Eye Research. 83 (2), 424-428 (2006).
- Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Neurophysiology. 91 (3), 1134-1142 (2004).
- Peachey, N. S., Stanton, J. B., Marmorstein, A. D. Noninvasive recording and response characteristics of the rat dc-electroretinogram. Visual Neuroscience. 19 (6), 693-701 (2002).
- Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).
- Marmorstein, L. Y., et al. The light peak of the electroretinogram is dependent on voltage-gated calcium channels and antagonized by bestrophin (best-1). Journal of General Physiology. 127 (5), 577-589 (2006).
- Zhang, C., et al. Invest. Ophtalmol. Vis. Sci. Annual Meeting for the Association for Research in Vision and Ophthalmology. , 3568 (2017).
- Iacovelli, J., et al. Generation of Cre transgenic mice with postnatal RPE-specific ocular expression. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (3), 1378-1383 (2011).
- Wang, F. E., et al. MicroRNA-204/211 alters epithelial physiology. FASEB Journal. 24 (5), 1552-1571 (2010).
- He, L., Marioutina, M., Dunaief, J. L., Marneros, A. G. Age- and gene-dosage-dependent cre-induced abnormalities in the retinal pigment epithelium. American Journal of Pathology. 184 (6), 1660-1667 (2014).
- Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. Light-evoked modulation of basolateral membrane Cl- conductance in chick retinal pigment epithelium: the light peak and fast oscillation. Journal of Neurophysiology. 70 (4), 1669-1680 (1993).
- Blaug, S., Quinn, R., Quong, J., Jalickee, S., Miller, S. S. Retinal pigment epithelial function: a role for CFTR. Documenta Ophthalmologica. 106 (1), 43-50 (2003).
- Gallemore, R. P., Griff, E. R., Steinberg, R. H. Evidence in support of a photoreceptoral origin for the “light-peak substance”. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 29 (4), 566-571 (1988).
- Shahi, P. K., et al. Abnormal Electroretinogram after Kir7.1 Channel Suppression Suggests Role in Retinal Electrophysiology. Science Reports. 7 (1), 10651 (2017).
- Li, Y., et al. Mouse model of human RPE65 P25L hypomorph resembles wild type under normal light rearing but is fully resistant to acute light damage. Human Molecular Genetics. 24 (15), 4417-4428 (2015).
