Direct-Coupled Electroretinogram (DC-ERG) voor het opnemen van de licht-opgeroepen elektrische reacties van de Muis Retinal Pigment Epithelium
Summary
Hier presenteren we een methode voor het opnemen van licht-opgeroepen elektrische reacties van het retinale pigment epitheel (RPE) in muizen met behulp van een techniek bekend als DC-ERGs voor het eerst beschreven door Marmorstein, Peachey, en collega’s in de vroege jaren 2000.
Abstract
Het retinale pigment epitheel (RPE) is een gespecialiseerde monolaag van cellen strategisch gelegen tussen het netvlies en de choriocapillaris die de algehele gezondheid en structurele integriteit van de fotoreceptoren te behouden. De RPE is gepolariseerd, vertoont apically en basaal gelegen receptoren of kanalen, en voert vectoraal transport van water, ionen, metabolieten, en scheidt verschillende cytokinen.
In vivo kunnen niet-invasieve metingen van de RPE-functie worden uitgevoerd met behulp van direct-coupled ERG’s (DC-ERG’s). De methodologie achter de DC-ERG werd gepionierd door Marmorstein, Peachey, en collega’s met behulp van een op maat gebouwd stimulatie opnamesysteem en later aangetoond met behulp van een commercieel beschikbaar systeem. De DC-ERG techniek maakt gebruik van glazen haarvaten gevuld met Hank’s gebufferde zoutoplossing (HBSS) om de tragere elektrische reacties van de RPE te meten die ontlokt worden van lichtopgevraagde concentratieveranderingen in de subretinale ruimte als gevolg van fotoreceptoractiviteit. De langdurige lichte stimulus en lengte van de DC-ERG opname maken het kwetsbaar voor drift en ruis wat resulteert in een lage opbrengst van bruikbare opnames. Hier presenteren we een snelle, betrouwbare methode voor het verbeteren van de stabiliteit van de opnames, terwijl het verminderen van ruis met behulp van vacuümdruk te verminderen / te elimineren bellen die voortvloeien uit outgassing van de HBSS en elektrode houder. Bovendien, power line artefacten worden verzwakt met behulp van een spanningsregelaar / power conditioner. We bevatten de nodige lichtstimulatieprotocollen voor een commercieel beschikbaar ERG-systeem en scripts voor analyse van de DC-ERG-componenten: c-wave, snelle oscillatie, lichtpiek en off response. Vanwege het verbeterde gemak van opnames en snelle analyse workflow, dit vereenvoudigde protocol is vooral nuttig bij het meten van leeftijdsgebonden veranderingen in RPE functie, ziekte progressie, en bij de beoordeling van farmacologische interventie.
Introduction
Het retinale pigment epitheel (RPE) is een monolaag van gespecialiseerde cellen die het achterste segment van het oog lijn en kritische functies uit te oefenen om retinale homeostase1te behouden. De RPE ondersteunt fotoreceptoren door hun foton-vastleggen visuele pigment in een proces genaamd de visuele cyclus2, door deel te nemen aan de dagelfcytose van schuur buitenste segment tips3, en in het vervoer van voedingsstoffen en metabole producten tussen fotoreceptoren en de chocaprioillaris4,5. Afwijkingen in RPE functie liggen ten grondslag aan tal van menselijke retinale ziekten, zoals leeftijdsgebonden macula degeneratie6, Leber’s aangeboren amaurosis7,8 en Beste vitelliform macula dystrofie9. Aangezien donoroogweefsels vaak moeilijk te verkrijgen zijn uitsluitend voor onderzoeksdoeleinden, kunnen diermodellen met genetische modificaties een alternatieve manier bieden om de ontwikkeling van netvliesziekten te bestuderen10,11. Bovendien, de opkomst en toepassing van CRISPR cas9-technologie maakt nu genomische introducties (knock-in) of schrappingen (knock-out) mogelijk in een eenvoudig proces in één stap dat de beperkingen van eerdere gentargetingtechnologieën overtreft12. De hausse in de beschikbaarheid van nieuwe muismodellen13 vereist een efficiënter opnameprotocol om de RPE-functie niet-invasief te evalueren.
Meting van de licht-opgeroepen elektrische reacties van de RPE kan worden bereikt met behulp van een direct-gekoppelde elektroretinogram (DC-ERG) techniek. Bij gebruik in combinatie met conventionele ERG-opnames die de fotoreceptor (a-wave) en bipolaire (b-wave) celreacties14meten, kan de DC-ERG definiëren hoe de responseigenschappen van de RPE veranderen met retinale degeneratie15,16,17 of dat RPE-disfunctie voorafgaat aan fotoreceptorverlies. Dit protocol beschrijft een methode aangepast aan het werk van Marmorstein, Peachey, en collega’s die voor het eerst ontwikkelde de DC-ERG techniek16,18,19,20 en verbetert de reproduceerbaarheid en het gebruiksgemak.
De DC-ERG opname is moeilijk uit te voeren vanwege de lange aanschaftijd (9 min) waarin elke onderbreking of introductie van ruis de interpretatie van de gegevens kan bemoeilijken. Het voordeel van deze nieuwe methode is dat de basislijnen binnen een kortere tijd stabiel bereik bereiken, waardoor de kans dat het dier voortijdig ontwaakt uit anesthesie vermindert en minder gevoelig is voor bellenvorming in de capillaire elektroden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritieke stappen
Een goede DC-ERG opname vereist stabiele elektroden die vrij zijn van bellen die artefacten en ongewenste drift te creëren als ze zijn zeer gevoelig voor outgassing en temperatuurveranderingen. Het is essentieel dat een stabiele basislijn wordt bereikt wanneer de elektroden in de HBSS-badoplossing worden geplaatst voordat u verder gaat met de muisopname. Kleine belletjes hebben de neiging om te verzamelen aan de basis van de capillaire elektrode of rond de si…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door nei intramurale fondsen. De auteurs erkennen oprecht Dr. Sheldon Miller voor zijn wetenschappelijke begeleiding, technisch advies, en deskundigheid in fysiologie RPE en ziekte. De auteurs bedanken Megan Kopera en de dierenverzorging personeel voor het beheer van de muis kolonies, en Dr Tarun Bansal, Raymond Zhou, en Yuan Wang voor technische ondersteuning.
Materials
| Ag/AgCl (mouth) Electrode | WPI Inc | EP1 | Mouth reference electrode for mouse |
| Ceramic Tile | Sutter Instrument | CTS | Used to cut the glass capillary tube to an appropriate size |
| Cotton Tipped Cleaning Stick | Puritan Medical Products | 867-WC No Glue | To be used as a spacer to improve the fit of the electrode holder assembly |
| Electroretinogram (ERG) System | Diagnosys LLC | E3 System | Visual electrophysiology system to diagnose ophthalmic conditions in vision research and drug trials |
| Bunsen Burner | Argos Technologies | BW20002460 | Or equivlaent to shape glass under flame |
| Glass Capillary Tube (1.5 mm) | Sutter Instruments | BF150-75 | For filling with HBSS and making contact to the cornea |
| Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific Inc | 14175-095 | Commercially available. Maintain at RT |
| In-Line Filter | Whatman | 6722-5001 | To protect vacuum pump from aerosols |
| Low Noise Cable for Microelectrode Holders | WPI Inc | 5372 | Suggested for improving the length and placement of the cables and electrode holder assemblies |
| Magnetic Ball Joint | WPI Inc | 500871 | For magnetically positioning the electrode holder assembly on the stage |
| MatLab | Mathworks | MatLab: For editing the analysis software | |
| Matlab Curvefit Toolbox | Mathworks | Toolbox for MatLab (only required for editing the analysis software) | |
| MatLab Compiler | Mathworks | Toolbox for MatLab (only required for editing and re-releasing the analysis software) | |
| MatLab Runtime version 9.5 | Mathworks | R2018b (9.5) | Required to run the analysis software: https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html |
| Microelectrode Holders (45 degrees) | WPI Inc | MEH345-15 | For holding the capillaries |
| Needle (25 ga) | Covidien | 8881250313 | For filling the capillary tubes with HBSS |
| needle (ground) electrode | Rhythmlink | 13mm – one elctrode | Subdermal needle electrode (ground) for mouse (13mm long, 0.4mm diameter needle, 1.5m leadwire) |
| Regulator/Power Conditioner | Furman | P-1800 | Or equivalent to remove DC-offset from noise introduced through power line |
| Syringe (12 mL) | Monoject | 1181200777 | For filling the capillary tubes with HBSS |
| T-clip | Cole-Parmer | 06852-20 | For electrode holder assembly |
| Vacuum Desiccator | Bel-Art | 420120000 | Clear polycarbonate bottom & cover |
| Pharmacological treatment | |||
| Lubricant eye gel | Alcon | 0078-0429-47 | Helps lubricates corneal surface and maintain electrical contact with capillary electrodes |
| Phenylephrine Hydrochloride 2.5% | Akorn | 17478-201-15 | Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation) |
| Proparacaine Hydrochloride 0.5% | Akorn | 17478-263-12 | Local anesthetic for ophthalmic instillation |
| Tropicamide 0.5% | Akorn | 17478-101-12 | Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation) |
| Xylazine | AnaSed | sc-362949Rx | Analgesic and muscle relaxant |
| Zetamine (Ketamine HCl) | VetOne | 501072 | Anesthetic for intramuscular injections |
References
- Steinberg, R. H. Interactions between the retinal pigment epithelium and the neural retina. Documenta Ophthalmologica. 60 (4), 327-346 (1985).
- Sahu, B., Maeda, A. RPE Visual Cycle and Biochemical Phenotypes of Mutant Mouse Models. Methods in Molecular Biology. 1753, 89-102 (2018).
- Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture. Experimental Eye Resarch. 126, 51-60 (2014).
- Wimmers, S., Karl, M. O., Strauss, O. Ion channels in the RPE. Progress in Retinal Eye Research. 26 (3), 263-301 (2007).
- Gundersen, D., Orlowski, J., Rodriguez-Boulan, E. Apical polarity of Na,K-ATPase in retinal pigment epithelium is linked to a reversal of the ankyrin-fodrin submembrane cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 112 (5), 863-872 (1991).
- Fletcher, E. L., et al. Studying age-related macular degeneration using animal models. Optometry and Vision Science. 91 (8), 878-886 (2014).
- Gu, S. M., et al. Mutations in RPE65 cause autosomal recessive childhood-onset severe retinal dystrophy. Nature Genetics. 17 (2), 194-197 (1997).
- Marlhens, F., et al. Mutations in RPE65 cause Leber’s congenital amaurosis. Nature Genetics. 17 (2), 139-141 (1997).
- Marmorstein, A. D., et al. the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (23), 12758-12763 (2000).
- Chang, B. Mouse models for studies of retinal degeneration and diseases. Methods in Molecular Biology. 935, 27-39 (2013).
- Collin, G. B., et al. Mouse Models of Inherited Retinal Degeneration with Photoreceptor Cell Loss. Cells. 9 (4), (2020).
- Shrock, E., Güell, M. CRISPR in Animals and Animal Models. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 152, 95-114 (2017).
- Smalley, E. CRISPR mouse model boom, rat model renaissance. Nature Biotechnology. 34 (9), 893-894 (2016).
- Benchorin, G., Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Vollrath, D. Assessment of Murine Retinal Function by Electroretinography. Bio Protocol. 7 (7), (2017).
- Zhang, C., et al. Regulation of phagolysosomal activity by miR-204 critically influences structure and function of retinal pigment epithelium/retina. Human Molecular Genetics. 28 (20), 3355-3368 (2019).
- Samuels, I. S., et al. Light-evoked responses of the retinal pigment epithelium: changes accompanying photoreceptor loss in the mouse. Journal of Neurophysiology. 104 (1), 391-402 (2010).
- Wu, J., Marmorstein, A. D., Peachey, N. S. Functional abnormalities in the retinal pigment epithelium of CFTR mutant mice. Experimental Eye Research. 83 (2), 424-428 (2006).
- Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Neurophysiology. 91 (3), 1134-1142 (2004).
- Peachey, N. S., Stanton, J. B., Marmorstein, A. D. Noninvasive recording and response characteristics of the rat dc-electroretinogram. Visual Neuroscience. 19 (6), 693-701 (2002).
- Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).
- Marmorstein, L. Y., et al. The light peak of the electroretinogram is dependent on voltage-gated calcium channels and antagonized by bestrophin (best-1). Journal of General Physiology. 127 (5), 577-589 (2006).
- Zhang, C., et al. Invest. Ophtalmol. Vis. Sci. Annual Meeting for the Association for Research in Vision and Ophthalmology. , 3568 (2017).
- Iacovelli, J., et al. Generation of Cre transgenic mice with postnatal RPE-specific ocular expression. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (3), 1378-1383 (2011).
- Wang, F. E., et al. MicroRNA-204/211 alters epithelial physiology. FASEB Journal. 24 (5), 1552-1571 (2010).
- He, L., Marioutina, M., Dunaief, J. L., Marneros, A. G. Age- and gene-dosage-dependent cre-induced abnormalities in the retinal pigment epithelium. American Journal of Pathology. 184 (6), 1660-1667 (2014).
- Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. Light-evoked modulation of basolateral membrane Cl- conductance in chick retinal pigment epithelium: the light peak and fast oscillation. Journal of Neurophysiology. 70 (4), 1669-1680 (1993).
- Blaug, S., Quinn, R., Quong, J., Jalickee, S., Miller, S. S. Retinal pigment epithelial function: a role for CFTR. Documenta Ophthalmologica. 106 (1), 43-50 (2003).
- Gallemore, R. P., Griff, E. R., Steinberg, R. H. Evidence in support of a photoreceptoral origin for the “light-peak substance”. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 29 (4), 566-571 (1988).
- Shahi, P. K., et al. Abnormal Electroretinogram after Kir7.1 Channel Suppression Suggests Role in Retinal Electrophysiology. Science Reports. 7 (1), 10651 (2017).
- Li, Y., et al. Mouse model of human RPE65 P25L hypomorph resembles wild type under normal light rearing but is fully resistant to acute light damage. Human Molecular Genetics. 24 (15), 4417-4428 (2015).
