Summary

Direktgekoppeltes Elektroretinogramm (DC-ERG) zur Aufzeichnung der lichtbeschworenen elektrischen Reaktionen des retinalen Pigmentepithels der Maus

Published: July 14, 2020
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Summary

Hier stellen wir eine Methode zur Aufzeichnung lichtevokierter elektrischer Reaktionen des retinalen Pigmentepithels (RPE) bei Mäusen vor, die eine Technik verwendet, die als DC-ERGs bekannt ist und von Marmorstein, Peachey und Kollegen in den frühen 2000er Jahren beschrieben wurde.

Abstract

Das retinale Pigmentepithel (RPE) ist eine spezialisierte Monoschicht von Zellen, die strategisch zwischen der Netzhaut und der Choriokapillare liegen und die allgemeine Gesundheit und strukturelle Integrität der Photorezeptoren erhalten. Das RPE ist polarisiert, zeigt apisch und basal lokalisierte Rezeptoren oder Kanäle, und führt vektoriell Transport von Wasser, Ionen, Metaboliten, und sezernieren mehrere Zytokine.

In vivo nichtinvasive Messungen der RPE-Funktion können mit direkt gekoppelten ERGs (DC-ERGs) durchgeführt werden. Die Methodik hinter dem DC-ERG wurde von Marmorstein, Peachey und Kollegen mit einem kundenspezifischen Stimulationsaufzeichnungssystem entwickelt und später mit einem kommerziell erhältlichen System demonstriert. Die DC-ERG-Technik verwendet Glaskapillaren, die mit Hanks gepufferter Salzlösung (HBSS) gefüllt sind, um die langsameren elektrischen Reaktionen des RPE zu messen, die durch lichtevokte Konzentrationsänderungen im subretinalen Raum aufgrund der Photorezeptoraktivität ausgelöst werden. Der verlängerte Lichtreiz und die Länge der DC-ERG-Aufnahme machen sie anfällig für Drift und Rauschen, was zu einer geringen Ausbeute an verwendbaren Aufnahmen führt. Hier präsentieren wir eine schnelle, zuverlässige Methode zur Verbesserung der Stabilität der Aufnahmen bei gleichzeitiger Reduzierung von Geräuschen durch Verwendung von Vakuumdruck zur Reduzierung/Beseitigung von Blasen, die sich aus der Ausgasung des HBSS- und Elektrodenhalters ergeben. Darüber hinaus werden Stromleitungsartefakte mit einem Spannungsregler/Leistungsaufbereiter abgeschwächt. Wir beinhalten die notwendigen Lichtstimulationsprotokolle für ein handelsübliches ERG-System sowie Skripte zur Analyse der DC-ERG-Komponenten: c-Wave, schnelle Schwingung, Lichtspitzen- und Off-Response. Aufgrund der verbesserten Leichtigkeit der Aufzeichnungen und des schnellen Analyse-Workflows ist dieses vereinfachte Protokoll besonders nützlich bei der Messung altersbedingter Veränderungen der RPE-Funktion, des Krankheitsverlaufs und bei der Bewertung pharmakologischer Interventionen.

Introduction

Das retinale Pigmentepithel (RPE) ist eine Monoschicht spezialisierter Zellen, die das hintere Segment des Auges ausbilden und kritische Funktionen ausüben, um die netzhautige Homöostase1aufrechtzuerhalten. Das RPE unterstützt Photorezeptoren durch Regenerierung ihres photonenerfassenden visuellen Pigments in einem Prozess, der als visueller Zyklus2bezeichnet wird, durch Die Teilnahme an der tagesphagozytose der äußeren Segmentspitzen3, und beim Transport von Nährstoffen und Stoffwechselprodukten zwischen Photorezeptoren und der Choriokapillare4,5. Anomalien in der RPE-Funktion unterlegen zahlreiche menschliche Netzhauterkrankungen, wie altersbedingte Makuladegeneration6, Lebers angeborene Amaurose7,8 und Best vitelliform Makuladystrophie9. Da Spenderaugengewebe oft nur für Forschungszwecke schwer zu erhalten sind, können Tiermodelle mit genetischen Veränderungen eine alternative Möglichkeit bieten, die Entwicklung von Netzhauterkrankungen zu untersuchen10,11. Darüber hinaus ermöglicht die Entstehung und Anwendung der CRISPR cas9-Technologie nun genomische Einschleppungen (Knock-in) oder Deletionen (Knock-out) in einem einfachen, einstufigen Prozess, der die Grenzen früherer Gen-Targeting-Technologien überschreitet12. Der Boom der Verfügbarkeit neuer Mausmodelle13 erfordert ein effizienteres Aufzeichnungsprotokoll, um die RPE-Funktion nicht-invasiv auszuwerten.

Die Messung der lichtevozierten elektrischen Ansprechungen des RPE kann mit einer direkt gekoppelten Elektroretinogramm-Technik (DC-ERG) erreicht werden. In Kombination mit herkömmlichen ERG-Aufnahmen, die die Photorezeptor- (a-Welle) und bipolaren (b-Wellen) Zellreaktionen14messen, kann das DC-ERG definieren, wie sich die Ansprecheigenschaften des RPE mit Netzhautdegeneration15,16,17 ändern oder ob die RPE-Dysfunktion dem Verlust des Photorezeptors vorausgeht. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, die an die Arbeit von Marmorstein, Peachey und Kollegen angepasst wurde, die zuerst die DC-ERG-Technik16,18,19,20 entwickelt haben und die Reproduzierbarkeit und Benutzerfreundlichkeit verbessern.

Die DC-ERG-Aufnahme ist aufgrund der langen Erfassungszeit (9 min), in der eine Unterbrechung oder Einschleppung von Rauschen die Interpretation der Daten erschweren kann, schwierig durchzuführen. Der Vorteil dieser neuen Methode ist, dass die Basislinien innerhalb einer kürzeren Zeitzeit einen stabilen Zustand erreichen und die Wahrscheinlichkeit verringern, dass das Tier vorzeitig aus der Anästhesie erwacht und weniger anfällig für Blasenbildung in den Kapillarelektroden ist.

Protocol

Dieses Protokoll folgt den Leitlinien für die Tierpflege, die in dem vom Tierpflege- und Verwendungsausschuss des National Eye Institute genehmigten Tierstudienprotokoll summiert sind. 1. Importieren von Lichtstimulationsprotokollen für DC-ERG HINWEIS: Folgen Sie den anweisungen unten, um die Lichtstimulationsprotokolle für das DC-ERG in die ERG-Systemsoftware (Tabelle der Materialien )zu importieren. Das Protokoll besteht aus einem 0,5 min Pre-Sti…

Representative Results

Abbildung 2 ist ein Beispiel-Dataset von miR-204 ko/ko cre/+ (bedingte KO) und Wildtyp (WT) Mäuse. MiR-204 ko/ko cre/+ sind Mäuse mit einem bedingten Knockout von microRNA 204 im retinalen Pigmentepithel. Diese Mäuse werden durch Kreuzung von floxed miR-204 Mäusen (produziert von NEIGEF)22 mit VMD2-CRE Mäusen23erzeugt. MiR-204 wird stark in der RPE exprimiert, wo es die Expression von Proteinen reguliert, die für die Epithelfunktion kriti…

Discussion

Kritische Schritte

Eine gute DC-ERG-Aufnahme erfordert stabile Elektroden, die frei von Blasen sind, die Artefakte und unerwünschte Drift erzeugen, da sie extrem empfindlich auf Ausgasung und Temperaturänderungen reagieren. Es ist wichtig, dass eine stabile Ausgangsbasis erreicht wird, wenn die Elektroden in der HBSS-Badelösung platziert werden, bevor sie mit der Mausaufzeichnung fortfahren. Kleine Blasen neigen dazu, sich an der Basis der Kapillarelektrode oder um die Sili…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von nei-Intramural-Fonds unterstützt. Die Autoren würdigen Dr. Sheldon Miller aufrichtig für seine wissenschaftliche Beratung, technische Beratung und Expertise in RPE-Physiologie und Krankheit. Die Autoren danken Megan Kopera und dem Tierpfleger für die Verwaltung der Mauskolonien und Dr. Tarun Bansal, Raymond Zhou und Yuan Wang für die technische Unterstützung.

Materials

Ag/AgCl (mouth) Electrode WPI Inc EP1 Mouth reference electrode for mouse
Ceramic Tile Sutter Instrument CTS Used to cut the glass capillary tube to an appropriate size
Cotton Tipped Cleaning Stick Puritan Medical Products 867-WC No Glue To be used as a spacer to improve the fit of the electrode holder assembly
Electroretinogram (ERG) System Diagnosys LLC E3 System Visual electrophysiology system to diagnose ophthalmic conditions in vision research and drug trials
Bunsen Burner Argos Technologies BW20002460 Or equivlaent to shape glass under flame
Glass Capillary Tube (1.5 mm) Sutter Instruments BF150-75 For filling with HBSS and making contact to the cornea
Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) Thermo Fisher Scientific Inc 14175-095 Commercially available. Maintain at RT
In-Line Filter Whatman 6722-5001 To protect vacuum pump from aerosols
Low Noise Cable for Microelectrode Holders WPI Inc 5372 Suggested for improving the length and placement of the cables and electrode holder assemblies
Magnetic Ball Joint WPI Inc 500871 For magnetically positioning the electrode holder assembly on the stage
MatLab Mathworks MatLab: For editing the analysis software
Matlab Curvefit Toolbox Mathworks Toolbox for MatLab (only required for editing the analysis software)
MatLab Compiler Mathworks Toolbox for MatLab (only required for editing and re-releasing the analysis software)
MatLab Runtime version 9.5 Mathworks R2018b (9.5) Required to run the analysis software: https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html
Microelectrode Holders (45 degrees) WPI Inc MEH345-15 For holding the capillaries
Needle (25 ga) Covidien 8881250313 For filling the capillary tubes with HBSS
needle (ground) electrode Rhythmlink 13mm – one elctrode Subdermal needle electrode (ground) for mouse (13mm long, 0.4mm diameter needle, 1.5m leadwire)
Regulator/Power Conditioner Furman P-1800 Or equivalent to remove DC-offset from noise introduced through power line
Syringe (12 mL) Monoject 1181200777 For filling the capillary tubes with HBSS
T-clip Cole-Parmer 06852-20 For electrode holder assembly
Vacuum Desiccator Bel-Art 420120000 Clear polycarbonate bottom & cover
Pharmacological treatment
Lubricant eye gel Alcon 0078-0429-47 Helps lubricates corneal surface and maintain electrical contact with capillary electrodes
Phenylephrine Hydrochloride 2.5% Akorn 17478-201-15 Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation)
Proparacaine Hydrochloride 0.5% Akorn 17478-263-12 Local anesthetic for ophthalmic instillation
Tropicamide 0.5% Akorn 17478-101-12 Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation)
Xylazine AnaSed sc-362949Rx Analgesic and muscle relaxant
Zetamine (Ketamine HCl) VetOne 501072 Anesthetic for intramuscular injections

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Miyagishima, K. J., Zhang, C., Malechka, V. V., Bharti, K., Li, W. Direct-Coupled Electroretinogram (DC-ERG) for Recording the Light-Evoked Electrical Responses of the Mouse Retinal Pigment Epithelium. J. Vis. Exp. (161), e61491, doi:10.3791/61491 (2020).

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