אלקטרורטינוגרמה ישירה (DC-ERG) להקלטת התגובות החשמליות המעוררות אור של אפיתל פיגמנט רשתית העכבר
Summary
כאן, אנו מציגים שיטה להקלטת תגובות חשמליות אור-עורר של אפיתל פיגמנט רשתית (RPE) בעכברים באמצעות טכניקה המכונה DC-ERGs שתואר לראשונה על ידי מרמורשטיין, Peachey, ועמיתים בתחילת שנות ה-2000.
Abstract
אפיתל פיגמנט רשתית (RPE) הוא מונו-שכבתית מיוחדת של תאים הממוקמים אסטרטגית בין הרשתית לבין choriocapillaris לשמור על הבריאות הכוללת ושלמות מבנית של photoreceptors. RPE הוא מקוטב, מציג קולטנים או ערוצים הממוקמים באופן אפי ובסיסי, ומבצע הובלה וקטורית של מים, יונים, מטבוליטים, ומפריס מספר ציטוקנים.
במדידות vivo לא פולשניות של פונקציית RPE ניתן לבצע באמצעות ERGs זהביים (DC-ERGs). המתודולוגיה שמאחורי DC-ERG הייתה חלוצה של מרמורשטיין, פיצ’י ועמיתיו באמצעות מערכת הקלטת גירויים מותאמת אישית, ומאוחר יותר הדגימה באמצעות מערכת מסחרית זמינה. טכניקת DC-ERG משתמשת נימים זכוכית מלא תמיסת מלח חוצץ של האנק (HBSS) כדי למדוד את התגובות החשמליות האיטיות יותר של RPE נבע משינויי ריכוז אור-עורר בחלל subretinal עקב פעילות פוטורסקטור. הגירוי האור הממושך והאורך של הקלטת DC-ERG הופכים אותו לפגיע להיסחף ורעש וכתוצאה מכך לתפוקה נמוכה של הקלטות שותנות. כאן, אנו מציגים שיטה מהירה ואמינה לשיפור היציבות של ההקלטות תוך הפחתת רעש באמצעות לחץ ואקום כדי להפחית / לחסל בועות הנובעות outgassing של HBSS ומחזיק אלקטרודה. בנוסף, חפצים של קו מתח מושטחים באמצעות מותם מתח/מרכך מתח. אנו כוללים את פרוטוקולי גירוי האור הדרושים עבור מערכת ERG זמינה מסחרית, כמו גם סקריפטים לניתוח רכיבי DC-ERG: c-wave, תנודות מהירות, שיא אור ותגובה כבויה. בשל הקלות המשופרת של הקלטות וזרימת עבודה של ניתוח מהיר, פרוטוקול פשוט זה שימושי במיוחד במדידת שינויים הקשורים לגיל בתפקוד RPE, התקדמות המחלה, ובהערכה של התערבות תרופתית.
Introduction
אפיתל פיגמנט רשתית (RPE) הוא שכבת מונו-שכבתית של תאים מיוחדים הקו החלק האחורי של העין ולהפעיל פונקציות קריטיות כדי לשמור על ההונואוסטזיסרשתית 1. RPE תומך פוטורצטופטורים על ידי התחדשות פיגמנט חזותי לכידת הפוטון שלהם בתהליך שנקרא מחזורחזותי 2, על ידי השתתפות phagocytosis מיורנלה שלסככה קצוות קטע חוץ 3, ובהובלה של חומרים מזינים ומוצרי חילוף חומרים בין photoreceptors choriocapillaris4,5. חריגות בתפקוד RPE בבסיס מחלות רשתית אנושיות רבות, כגון ניוון מקולריהקשור לגיל 6, amaurosis מולד של לבר7,8 ו ניוון מקולרי vitelliform הטוב ביותר9. כמו רקמות עיניים תורם לעתים קרובות קשה להשיג אך ורק למטרות מחקר, מודלים בעלי חיים עם שינויים גנטיים יכולים לספק דרך חלופית ללמוד את הפיתוח של מחלותרשתית 10,11. בנוסף, הופעתה ויישום הטכנולוגיה CRISPR cas9 מאפשרת כעת היכרות גנומית (נוק-אין) או מחיקות (נוק-אאוט) בתהליך פשוט, צעד אחד העולה על מגבלות של טכנולוגיות פילוחגנים קודמות 12. הפריחה בזמינות של דגמי עכברחדשים 13 מחייבת פרוטוקול הקלטה יעיל יותר כדי להעריך באופן לא פולשני את פונקציית RPE.
מדידה של התגובות החשמליות מעוררות האור של RPE ניתן להשיג באמצעות אלקטרורטינוגרמה ישירה (DC-ERG) טכניקה. כאשר נעשה שימוש בשילוב עם הקלטות ERG קונבנציונליות המודדות את הפוטורה-ceptor (גל) ותגובות תא דו קוטבי (b-wave)14, DC-ERG יכול להגדיר כיצד מאפייני התגובה של RPE לשנות עם ניווןרשתית 15,16,17 אואם תפקוד RPE מקדים אובדן photoreceptor. פרוטוקול זה מתאר שיטה המותאמת מעבודתו של מרמורשטיין, פיצ’י ועמיתיו שפיתחו לראשונה את טכניקת DC-ERG16,18,19,20 ומשפרת את הרבייה וקלות השימוש.
קשה לבצע את הקלטת DC-ERG בשל זמן הרכישה הארוך (9 דקות) שבמהלכו כל הפרעה או הקדמה של רעש יכולים לסבך את הפרשנות של הנתונים. היתרון של שיטה חדשה זו הוא שהתוכנית הבסיסית מגיעה למצב יציב בתוך פרק זמן קצר יותר ומפחיתה את הסבירות שהחיה תתעורר בטרם עת מהרדמה ונוטה פחות להיווצרות בועות באלקטרודות של נימה.
Protocol
Representative Results
Discussion
שלבים קריטיים
הקלטה טובה של DC-ERG דורשת אלקטרודות יציבות ללא בועות שיוצרות חפצים והסחף לא רצוי מכיוון שהן רגישות מאוד לשינויי חוץ וטמפרטורה. חיוני שערך בסיסי יציב יושג כאשר האלקטרודות ממוקמות בתמיסת האמבטיה של HBSS לפני שימשיך קדימה עם הקלטת העכבר. בועות קטנות נוטות ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי קרנות תוך-ממורל של NEI. המחברים מכירים בכנות את ד”ר שלדון מילר על ההדרכה המדעית שלו, ייעוץ טכני, ומומחיות בפיזיולוגיה ומחלות RPE. המחברים מודים למייגן Kopera וצוות טיפול בבעלי חיים לניהול מושבות העכבר, וד”ר Tarun בנסל, ריימונד ז’או, ויואן וואנג לתמיכה טכנית.
Materials
| Ag/AgCl (mouth) Electrode | WPI Inc | EP1 | Mouth reference electrode for mouse |
| Ceramic Tile | Sutter Instrument | CTS | Used to cut the glass capillary tube to an appropriate size |
| Cotton Tipped Cleaning Stick | Puritan Medical Products | 867-WC No Glue | To be used as a spacer to improve the fit of the electrode holder assembly |
| Electroretinogram (ERG) System | Diagnosys LLC | E3 System | Visual electrophysiology system to diagnose ophthalmic conditions in vision research and drug trials |
| Bunsen Burner | Argos Technologies | BW20002460 | Or equivlaent to shape glass under flame |
| Glass Capillary Tube (1.5 mm) | Sutter Instruments | BF150-75 | For filling with HBSS and making contact to the cornea |
| Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific Inc | 14175-095 | Commercially available. Maintain at RT |
| In-Line Filter | Whatman | 6722-5001 | To protect vacuum pump from aerosols |
| Low Noise Cable for Microelectrode Holders | WPI Inc | 5372 | Suggested for improving the length and placement of the cables and electrode holder assemblies |
| Magnetic Ball Joint | WPI Inc | 500871 | For magnetically positioning the electrode holder assembly on the stage |
| MatLab | Mathworks | MatLab: For editing the analysis software | |
| Matlab Curvefit Toolbox | Mathworks | Toolbox for MatLab (only required for editing the analysis software) | |
| MatLab Compiler | Mathworks | Toolbox for MatLab (only required for editing and re-releasing the analysis software) | |
| MatLab Runtime version 9.5 | Mathworks | R2018b (9.5) | Required to run the analysis software: https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html |
| Microelectrode Holders (45 degrees) | WPI Inc | MEH345-15 | For holding the capillaries |
| Needle (25 ga) | Covidien | 8881250313 | For filling the capillary tubes with HBSS |
| needle (ground) electrode | Rhythmlink | 13mm – one elctrode | Subdermal needle electrode (ground) for mouse (13mm long, 0.4mm diameter needle, 1.5m leadwire) |
| Regulator/Power Conditioner | Furman | P-1800 | Or equivalent to remove DC-offset from noise introduced through power line |
| Syringe (12 mL) | Monoject | 1181200777 | For filling the capillary tubes with HBSS |
| T-clip | Cole-Parmer | 06852-20 | For electrode holder assembly |
| Vacuum Desiccator | Bel-Art | 420120000 | Clear polycarbonate bottom & cover |
| Pharmacological treatment | |||
| Lubricant eye gel | Alcon | 0078-0429-47 | Helps lubricates corneal surface and maintain electrical contact with capillary electrodes |
| Phenylephrine Hydrochloride 2.5% | Akorn | 17478-201-15 | Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation) |
| Proparacaine Hydrochloride 0.5% | Akorn | 17478-263-12 | Local anesthetic for ophthalmic instillation |
| Tropicamide 0.5% | Akorn | 17478-101-12 | Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation) |
| Xylazine | AnaSed | sc-362949Rx | Analgesic and muscle relaxant |
| Zetamine (Ketamine HCl) | VetOne | 501072 | Anesthetic for intramuscular injections |
References
- Steinberg, R. H. Interactions between the retinal pigment epithelium and the neural retina. Documenta Ophthalmologica. 60 (4), 327-346 (1985).
- Sahu, B., Maeda, A. RPE Visual Cycle and Biochemical Phenotypes of Mutant Mouse Models. Methods in Molecular Biology. 1753, 89-102 (2018).
- Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture. Experimental Eye Resarch. 126, 51-60 (2014).
- Wimmers, S., Karl, M. O., Strauss, O. Ion channels in the RPE. Progress in Retinal Eye Research. 26 (3), 263-301 (2007).
- Gundersen, D., Orlowski, J., Rodriguez-Boulan, E. Apical polarity of Na,K-ATPase in retinal pigment epithelium is linked to a reversal of the ankyrin-fodrin submembrane cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 112 (5), 863-872 (1991).
- Fletcher, E. L., et al. Studying age-related macular degeneration using animal models. Optometry and Vision Science. 91 (8), 878-886 (2014).
- Gu, S. M., et al. Mutations in RPE65 cause autosomal recessive childhood-onset severe retinal dystrophy. Nature Genetics. 17 (2), 194-197 (1997).
- Marlhens, F., et al. Mutations in RPE65 cause Leber’s congenital amaurosis. Nature Genetics. 17 (2), 139-141 (1997).
- Marmorstein, A. D., et al. the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (23), 12758-12763 (2000).
- Chang, B. Mouse models for studies of retinal degeneration and diseases. Methods in Molecular Biology. 935, 27-39 (2013).
- Collin, G. B., et al. Mouse Models of Inherited Retinal Degeneration with Photoreceptor Cell Loss. Cells. 9 (4), (2020).
- Shrock, E., Güell, M. CRISPR in Animals and Animal Models. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 152, 95-114 (2017).
- Smalley, E. CRISPR mouse model boom, rat model renaissance. Nature Biotechnology. 34 (9), 893-894 (2016).
- Benchorin, G., Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Vollrath, D. Assessment of Murine Retinal Function by Electroretinography. Bio Protocol. 7 (7), (2017).
- Zhang, C., et al. Regulation of phagolysosomal activity by miR-204 critically influences structure and function of retinal pigment epithelium/retina. Human Molecular Genetics. 28 (20), 3355-3368 (2019).
- Samuels, I. S., et al. Light-evoked responses of the retinal pigment epithelium: changes accompanying photoreceptor loss in the mouse. Journal of Neurophysiology. 104 (1), 391-402 (2010).
- Wu, J., Marmorstein, A. D., Peachey, N. S. Functional abnormalities in the retinal pigment epithelium of CFTR mutant mice. Experimental Eye Research. 83 (2), 424-428 (2006).
- Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Neurophysiology. 91 (3), 1134-1142 (2004).
- Peachey, N. S., Stanton, J. B., Marmorstein, A. D. Noninvasive recording and response characteristics of the rat dc-electroretinogram. Visual Neuroscience. 19 (6), 693-701 (2002).
- Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).
- Marmorstein, L. Y., et al. The light peak of the electroretinogram is dependent on voltage-gated calcium channels and antagonized by bestrophin (best-1). Journal of General Physiology. 127 (5), 577-589 (2006).
- Zhang, C., et al. Invest. Ophtalmol. Vis. Sci. Annual Meeting for the Association for Research in Vision and Ophthalmology. , 3568 (2017).
- Iacovelli, J., et al. Generation of Cre transgenic mice with postnatal RPE-specific ocular expression. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (3), 1378-1383 (2011).
- Wang, F. E., et al. MicroRNA-204/211 alters epithelial physiology. FASEB Journal. 24 (5), 1552-1571 (2010).
- He, L., Marioutina, M., Dunaief, J. L., Marneros, A. G. Age- and gene-dosage-dependent cre-induced abnormalities in the retinal pigment epithelium. American Journal of Pathology. 184 (6), 1660-1667 (2014).
- Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. Light-evoked modulation of basolateral membrane Cl- conductance in chick retinal pigment epithelium: the light peak and fast oscillation. Journal of Neurophysiology. 70 (4), 1669-1680 (1993).
- Blaug, S., Quinn, R., Quong, J., Jalickee, S., Miller, S. S. Retinal pigment epithelial function: a role for CFTR. Documenta Ophthalmologica. 106 (1), 43-50 (2003).
- Gallemore, R. P., Griff, E. R., Steinberg, R. H. Evidence in support of a photoreceptoral origin for the “light-peak substance”. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 29 (4), 566-571 (1988).
- Shahi, P. K., et al. Abnormal Electroretinogram after Kir7.1 Channel Suppression Suggests Role in Retinal Electrophysiology. Science Reports. 7 (1), 10651 (2017).
- Li, Y., et al. Mouse model of human RPE65 P25L hypomorph resembles wild type under normal light rearing but is fully resistant to acute light damage. Human Molecular Genetics. 24 (15), 4417-4428 (2015).
