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Chemistry

Elettroretinogramma ad accoppiamento diretto (DC-ERG) per la registrazione delle risposte elettriche evocate dalla luce dell'epitelio pigmentato retinico del mouse

doi: 10.3791/61491 Published: July 14, 2020
* These authors contributed equally

Summary

Qui, presentiamo un metodo per registrare le risposte elettriche evocate dalla luce dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) nei topi usando una tecnica nota come DC-ENG descritta per la prima volta da Marmorstein, Peachey e colleghi nei primi anni 2000.

Abstract

L'epitelio pigmentato retinico (RPE) è un monostrato specializzato di cellule strategicamente situate tra la retina e il coriocapillaris che mantengono la salute generale e l'integrità strutturale dei fotorecettori. L'RPE è polarizzato, esibendo recettori o canali localizzati in modo apico e basale, ed esegue il trasporto vettoriale di acqua, ioni, metaboliti e secenere diverse citochine.

Le misurazioni nonive in vivo della funzione RPE possono essere effettuate utilizzando ENG ad accoppiamento diretto (DC-ENG). La metodologia alla base del DC-ERG è stata introdotta da Marmorstein, Peachey e colleghi che utilizzano un sistema di registrazione della stimolazione personalizzato e in seguito ha dimostrato di utilizzare un sistema disponibile in commercio. La tecnica DC-ERG utilizza capillari di vetro riempiti con la soluzione di sale tamponato (HBSS) di Hank per misurare le risposte elettriche più lente dell'RPE suscitate dai cambiamenti di concentrazione evocati dalla luce nello spazio subretinale a causa dell'attività del fotorecettore. Lo stimolo luminoso prolungato e la lunghezza della registrazione DC-ERG lo rendono vulnerabile alla deriva e al rumore con conseguente bassa resa di registrazioni utilizzabili. Qui presentiamo un metodo rapido e affidabile per migliorare la stabilità delle registrazioni riducendo al contempo il rumore utilizzando la pressione del vuoto per ridurre / eliminare le bolle derivanti dal degassamento dell'HBSS e del supporto per elettrodi. Inoltre, gli artefatti della linea elettrica vengono attenuati utilizzando un regolatore di tensione / condizionatore di potenza. Includiamo i protocolli di stimolazione della luce necessari per un sistema ERG disponibile in commercio e script per l'analisi dei componenti DC-ERG: onda c, oscillazione rapida, picco di luce e risposta off. Grazie alla migliore facilità di registrazione e al flusso di lavoro di analisi rapida, questo protocollo semplificato è particolarmente utile per misurare i cambiamenti legati all'età nella funzione RPE, nella progressione della malattia e nella valutazione dell'intervento farmacologico.

Introduction

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L'epitelio pigmentato retinico (RPE) è un monostrato di cellule specializzate che allineano il segmento posteriore dell'occhio ed esercitano funzioni critiche per mantenere l'omeostasi retinica1. L'RPE supporta i fotorecettori rigenerando il loro pigmento visivo che cattura fotoni in un processo chiamato ciclovisivo 2,partecipando alla fagocitosi diurna delle punte del segmentoesterno capannone 3,e nel trasporto di nutrienti e prodotti metabolici tra fotorecettori e coriocapillaris4,5. Le anomalie nella funzione RPE sono alla base di numerose malattie della retina umana, come la degenerazione maculare legata all'età6,l'amaurosi congenita di Leber7,8 e la migliore distrofia maculare vitelliforme9. Poiché i tessuti oculari del donatore sono spesso difficili da ottenere esclusivamente a scopo di ricerca, i modelli animali con modifiche genetiche possono fornire un modo alternativo per studiare lo sviluppo di malattie retiniche10,11. Inoltre, l'emergere e l'applicazione della tecnologia CRISPR cas9 consente ora l'introduzione genomica (knock-in) o le eliminazioni (knock-out) in un processo semplice in una sola fase che supera i limiti delle precedenti tecnologie di targeting genico12. Il boom nella disponibilità di nuovi modelli di mouse13 richiede un protocollo di registrazione più efficiente per valutare in modo non invasivo la funzione RPE.

La misurazione delle risposte elettriche evocate dalla luce dell'RPE può essere ottenuta utilizzando una tecnica di elettroretinogramma ad accoppiamento diretto (DC-ERG). Se utilizzato in combinazione con registrazioni ERG convenzionali che misurano le risposte cellulari fotorecettore (a-onda) e bipolare (onda b)14, il DC-ERG può definire come cambiano le proprietà di risposta dell'RPE con la degenerazione retinica15,16,17 o se la disfunzione RPE precede la perdita del fotorecettore. Questo protocollo descrive un metodo adattato dal lavoro di Marmorstein, Peachey e colleghi che per primi hanno sviluppato la tecnica DC-ERG16,18,19,20 e migliora la riproducibilità e la facilità d'uso.

La registrazione DC-ERG è difficile da eseguire a causa del lungo tempo di acquisizione (9 min) durante il quale qualsiasi interruzione o introduzione del rumore può complicare l'interpretazione dei dati. Il vantaggio di questo nuovo metodo è che le linee di base raggiungono lo stato stazionario in un lasso di tempo più breve riducendo la probabilità che l'animale si svegli prematuramente dall'anestesia ed è meno incline alla formazione di bolle negli elettrodi capillari.

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Protocol

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Questo protocollo segue le linee guida per la cura degli animali delineate nel protocollo di studio sugli animali approvato dal Comitato per la cura e l'uso degli animali del National Eye Institute.

1. Importazione di protocolli di stimolazione della luce per DC-ERG

NOTA: Seguire le istruzioni riportate di seguito per importare i protocolli di stimolazione della luce per il DC-ERG nel software del sistema ERG(Table of Materials). Il protocollo consiste in un intervallo di pre-stimolo di 0,5 minuti, seguito da un passo di luce (10 cd/m2) per 7 minuti, e termina con un intervallo post-stimolo di 1,5 minuti. L'intensità luminosa di 10 cd/m2 (1 log10 cd/m2) è stata selezionata poiché evoca circa la metà della risposta massima per tutti i componenti del DC-ERG nei mouse WT18,21. L'onda c e l'oscillazione rapida sono di particolare interesse in quanto le origini di queste risposte elettriche sono ben caratterizzate e possono essere isolate e studiate ulteriormente modelli RPE in vitro (ad esempio, iPSC-RPE). L'applicazione di altre intensità luminose può estrarre informazioni aggiuntive, ad esempio, la risposta off subisce un'inversione di polarità a stimoli di luce più luminosi e può mostrare differenze all'intensità con cui avviene questa inversione. L'utente è libero di modificare le impostazioni di intensità della luce a propria discrezione.

  1. Aprire il software di sistema ERG.
  2. Fare clic su Centro database.
  3. Fare clic su Nuovo (fornire un nuovo nome di file di database). Fare clic su Salva. Verrà visualizzata la casella popup: "Database creato, si desidera connettersi al nuovo file di database". Fare clic su . Il nome del database corrente dovrebbe ora riflettere il nuovo nome file.
  4. Fare clic su Trasferisci nella finestra Centro controllo database.
  5. Selezionare File supplementare 1: LightProtocols - TRANSFER. Exp. Clicca su Apri.
  6. Fare clic su Chiudi (Centro controllo database) al completamento dell'barra di stato.
  7. Clicca sul pulsante Start verde.
  8. Fare clic su Nuovo nella finestra Seleziona paziente. Creare un nuovo nome di famiglia di pazienti che descriva il modello del mouse, immettere la data di nascita (DOB, mm/gg/a), attivare o disattivare il pulsante di genere (M/F) sulla descrizione appropriata. Clicca su Chiudi per salvare i dettagli sperimentali.
  9. Clicca su Protocolli. I protocolli ERG e DC-ERG adattati al buio dovrebbero ora essere visibili.
  10. Infine, inserire il file Long Flash.col nella seguente cartella C:\ERG User Files\Long Flash.col.

2. Preparazione degli elettrodi capillari

  1. Tagliare i capillari di vetro da 1,5 mm a metà utilizzando una piastrella di ceramica(Tavolo dei Materiali)per segnare il vetro e romperli in modo pulito utilizzando un tavolo per fornire controforza fisica e stabilizzare il vetro.
    NOTA: Smussare le estremità del taglio se necessario.
  2. L'uso di un bruciatore Bunsen(Table of Materials)consente al calore di fare una piccola piega nel capillare tenendolo sopra la fiamma con le forcep.

3. Riempimento di elettrodi capillari

  1. Collegare l'essiccatore a vuoto alla linea del vuoto del laboratorio attraverso un filtro in linea(Table of Materials).
  2. Versare 30 ml di soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS) (Tavolo dei materiali) in un tubo conico aperto da 50 ml e posizionarlo (con il cappuccio rimosso) nella camera a vuoto.
  3. Accendere il vuoto e degasa l'HBSS mentre si accende il computer e l'apparecchiatura di registrazione.
  4. Dopo 5\u201210 min spegnere il vuoto e utilizzare l'HBSS degassato per riempire una siringa da 12 ml attraverso un ago da 25 G collegato. Usalo per riempire le basi dei supporti degli elettrodi prendendo ulteriori precauzioni per non introdurre bolle.
    1. Per fare ciò, rimuovere il tappo a vite filettato e far scorrere con cura l'ago della siringa attraverso la guarnizione in gomma siliconica per raggiungere la parete posteriore (pellet di cloruro argento / argento) del supporto.
      NOTA: I pellet di cloruro argento/argento sono vantaggiosi rispetto ai supporti che utilizzano filo d'argento in quanto forniscono più superficie con conseguente linea di base stabile a basso rumore. Tuttavia, i pellet di cloruro d'argento/argento richiedono un'interfaccia liquida priva di bolle d'aria per ottenere una buona connessione. Pertanto, fai molta attenzione a non introdurre bolle d'aria durante questo processo.
    2. Iniettare gradualmente HBSS per riempire l'intero microelettrodo mentre si ritrae lentamente l'ago della siringa. Ricollegare il cappuccio filettato ma non stringere. Reinserire l'ago della siringa per riempire lo spazio vuoto all'interno del cappuccio con HBSS. Quindi riempire il capillare di vetro tenendolo orizzontale per evitare che la soluzione fuorievi dall'altra estremità.
    3. Tenere il capillare di vetro dall'estremità piegata e inserire lentamente l'estremità opposta attraverso il cappuccio allentato e quindi stringere il tappo della vite in posizione.
      NOTA: Gli elettrodi di vetro riempiti con HBSS mantengono la lubrificazione dell'occhio del topo e prevengono la disidratazione corneale che si verificherebbe con l'uso di elettrodi standard ad anello d'oro.
  5. Posizionare i supporti degli elettrodi con gli elettrodi capillari inclinati verso l'alto per consentire il flusso delle bolle. Eseguire il vuoto per 5\u201210 min per degas. La fuoriuscita di gas dalle superfici in vetro e plastica spingerà l'HBSS fuori dai supporti degli elettrodi.
  6. Fermarsi e quindi rilasciare lentamente il vuoto. Riempire i supporti degli elettrodi e i capillari di vetro come descritto in precedenza.
    NOTA: Le bolle tendono a raccogliere sulla guarnizione in gomma siliconica o vicino a loro e possono anche nascondersi nelle scanalature del cappuccio filettato, quindi è necessario prestare particolare attenzione per mantenere queste aree senza bolle.
  7. Installare e fissare il supporto per microelettrodi nel supporto per giunti a T/Sfera magnetica su misura (Figura 1A, inserto). Per creare il supporto personalizzato per il supporto in microelettrodi, modificare una clip A (tubo OD da 5/16"-11/32") #8(Tavolo dei materiali)rimuovendo le clip poliacetali nere su un lato. Far lavorare a metà la base del cilindro dei giunti a sfera magnetica per regolare l'altezza(Tabella dei materiali). Fissare le clip a T modificate alle viti di montaggio a sfera magnetica con dadi di dimensioni M3.
  8. Posizionare il supporto del microelettrodo nella clip a T modificata e tenerlo saldamente in posizione scivolando in una maniglia di legno affusolata da circa 1 pollice realizzata rompendo un bastoncino di pulizia con punta dicotone (Table of Materials)ad angolo. Utilizzare la base del cilindro del magnete a terre rare per posizionare in modo sicuro il supporto dell'elettrodo personalizzato sulla piastra metallica dello stadio consentendo una rotazione di 360 ° su un asse di 180 °.

4. Elettrodi di prova

  1. Versare HBSS in un piccolo contenitore (ad esempio, il tappo del tubo conico da 50 ml).
  2. Abbassare delicatamente i microelettrodi capillari riempiti di HBSS completamente assemblati nel cappuccio contenente HBSS per pre-equilibrare gli elettrodi e posizionare l'elettrodo di terra dell'ago (coda/gamba posteriore) e l'elettrodo di riferimento a pellet sinterizzazione Ag/AgCl (bocca) nello stesso HBSS per completare il circuito(Figura 1A).
    NOTA: Eseguire tutti i passaggi successivi sotto la luce rossa fioca. Utilizzare una torcia a luce rossa per posizionare il mouse e gli elettrodi capillari. Ricordarsi di spegnere completamente tutte le sorgenti luminose prima di iniziare la registrazione.
  3. Selezionare o creare un identificatore appropriato (cognome) per descrivere il mouse da testare e selezionare il protocollo DC-ERG da eseguire completando la registrazione in base al seguente ordine.
    1. Clicca su Protocolli. Selezionare DC-ERG. Fare clic su Esegui. Verrà visualizzata una finestra di dialogo: "Il paziente attuale è XXX [DOB: XX/XX/XX) È corretto per il test in corso?" Fare clic su . Quindi procedere al passaggio 1/6.
  4. Chiudi le porte della gabbia di Faraday.
  5. Visualizzare la modalità di impedenza facendo clic su Impedenza e verificare che i valori per il riferimento alla bocca, il terreno di coda e gli elettrodi di registrazione siano accettabili (vedere figura 1B).
  6. Testare la stabilità della linea di base (rumore e deriva) facendo clic su Passo (freccia in avanti) per selezionare il passaggio 4/6 "Lampo lungo senza luce".
    NOTA: La quantità di deriva osservata quando gli elettrodi sono posizionati nel bagno HBSS è generalmente inferiore a 500 μV per 80 s una volta stabilizzati ed è equivalente alla deriva osservata quando gli elettrodi sono collegati al mouse. Pertanto, la lettura elettrica degli elettrodi nel bagno HBSS è un indicatore importante dello stato degli elettrodi. Il rumore, misurato come picco-picco, è generalmente ~ 10 \ u201215% maggiore nel mouse rispetto al bagno HBSS. Ciò è probabilmente dovuto all'aggiunta di artefatti di movimento dalla respirazione.
  7. Iniziare a visualizzare le tracce facendo clic su Anteprima. Le tracce devono essere a basso rumore con un'ampiezza da picco a picco <200 μV. È accettabile una leggera deriva (<500 μV/80 s) che gradualmente svanisce verso la linea di base (Figura 1C).

5. Posizionamento di mouse ed elettrodi

  1. Tenere i topi durante la notte in una scatola a tenuta di luce ben ventilata per un adattamento scuro.
  2. Anestetizzare gli animali mediante iniezione intraperitoneale di chetamina (80 mg/kg) e xiazina (8 mg/kg).
  3. Applicare un calo dello 0,5% di proparacaina HCl topicamente per anestetizzare la cornea, nonché un calo del 2,5% di fenilefrina HCl e dello 0,5% di tropicamide per dilatare le pupille.
  4. Tagliare i baffi del mouse con le forbici per evitare che contrazioni involontarie disturbino gli elettrodi capillari in vetro durante la registrazione.
    NOTA: Il protocollo di stimolo DC-ERG all'interno del sistema ERG ha diverse routine di stimolo integrate che possono essere selezionate facendo clic sul passo (freccia avanti) o sul passo (freccia all'indietro). Per preparare ed eseguire la registrazione DC-ERG sono necessari solo i passaggi 1, 4 e 5 del software.
  5. Nel software di sistema ERG verificare che sia selezionato il paziente corretto. Clicca sul pulsante verde Protocolli. In Descrizione protocollo selezionare DC-ERG. Quindi fare clic su Esegui. Verificare che questo sia il test corretto eseguito facendo clic su .
  6. Utilizzare lo stimolo a luce rossa designato Passo 1/6 per accendere la luce rossa all'interno della cupola per aiutare a posizionare il mouse e gli elettrodi osservando i cambiamenti di impedenza.
  7. Posizionare il mouse su un tavolo di registrazione riscaldato e tendere con cura la pelle della gamba posteriore utilizzando le forcette. Tenere l'elettrodo dell'ago saldamente in una mano e inserirlo per via sottocutanea nella gamba posteriore per fissarlo in posizione.
  8. Posizionare l'elettrodo Ag/AgCl di riferimento (Table of Materials) all'interno della bocca in modo che il pellet sinterato poggia lungo la guancia posteriore e sia tenuto in posizione dietro i denti.
    NOTA: Gli elettrodi a filo d'oro non devono essere utilizzati come elettrodo di riferimento della bocca in quanto hanno caratteristiche di impedenza diverse e aumentano il rumore dal picco al picco.
  9. Prima di posizionare gli elettrodi capillari nell'occhio del mouse, tenere il supporto dell'elettrodo con i capillari di vetro verticali, far scorrere il supporto dell'elettrodo con il dito indice per rimuovere eventuali bolle che potrebbero essere state introdotte. Riempire la punta con HBSS utilizzando un ago da 25 G attaccato a una siringa e ispezionare per assicurarsi che non vi sia alcuna bolla d'aria intrappolata sulla punta. Posizionare il supporto dell'elettrodo in modo che la punta aperta dei capillari riempiti con HBSS sia a contatto delicato con la cornea.
  10. Utilizzare precauzioni speciali per evitare di introdurre bolle d'aria tenendo invertito il distributore di gel per gli occhi lubrificante e scartare le gocce iniziali. Posizionare una goccia di gel per gli occhi lubrificante su ogni occhio per mantenere la conducibilità e prevenire l'essiccazione durante la registrazione.

6. Registrazione DC-ERG

  1. Fare clic su Passo (freccia in avanti) per selezionare il passaggio 4/6 "Flash lungo senza li".
  2. Fare clic su Impedenza. Utilizzate la schermata Controllo impedenza (Impedance Checking) per esaminare le resistenze degli occhi sinistro e destro. I valori di impedenza per gli elettrodi di registrazione ad ogni occhio dovrebbero essere simili (~39 kΩ). I valori di impedenza sia per gli elettrodi di terra che per quelli di riferimento dovrebbero essere inferiori a 10 kΩ).
  3. Clicca su Anteprima per visualizzare le tracce per l'occhio sinistro e destro. Attendere il conseciare una linea di base stabile (<10 min). Fare clic su Interrompi per uscire dall'anteprima di traccia.
    NOTA: Bruschi cambiamenti nella direzione di deriva o rumore aberrante nella registrazione non miglioreranno con il tempo e richiederanno l'identificazione dell'elettrodo capillare che richiede attenzione. La causa più probabile è una bolla introdotta sulla punta dell'elettrodo. Riempire la punta con HBSS. Fare di nuovo clic su Anteprima per controllare la linea di base.
  4. Fare clic su Passo (freccia avanti) per selezionare Il passaggio 5/6 "Flash lungo 10 cd 7 min".
  5. Fare clic su Esegui per avviare la registrazione ( Figura1D).

7. Esportazione dei dati

  1. Selezionare il "Paziente" (Cognome) che descrive la registrazione del mouse da esportare.
  2. Clicca su Vecchi test.
  3. In Descrizione protocollo selezionare DC-ERG. Clicca sul pulsante di caricamento verde per caricare i dati acquisiti in precedenza.
  4. Fare clic su Passo (freccia avanti) per passare al passaggio 5/6 "Long Flash 10 cd 7 min".
  5. Fare clic su Esporta.
  6. Fornire il nome del file (ad esempio, nomefile.csv). Un nome di file valido deve iniziare con una lettera, seguita da lettere, numeri o caratteri di sottolineatura. Non usare caratteri speciali o trattini. Il programma di analisi dei dati (DCERG_Analysis.exe) richiede che le voci di tabella soddisfino i requisiti per i nomi delle variabili.
  7. Posizionare un segno di spunta accanto a Tabella dati. Accanto a separatore selezionare Tab. Posizionare i segni di spunta accanto a Opzioni (Titoli, Verticale), Includi tutti (Passaggi, Chans, Risultati), Colonne didati( Contenuto , Risultati, Sweep) e Formato (File).
  8. Quindi fare clic su Esporta (Figura 1E). In questo modo il file *.csv nella cartella C:\Multifocal.

8. Analisi dei dati

  1. Scaricare e installare il programma di installazione di runtime appropriato (Table of Materials)
  2. Scaricare e installare il programma di DCERG_Analysis.exe installazione.
    NOTA: questo installa lo script che eseguirà l'analisi dei componenti DC-ERG e crea un collegamento per eseguire il programma nella cartella Menu Start.
  3. Fare clic sul collegamento creato nella cartella Menu Start > Programmi.
  4. Selezionare il file o i file di dati esportati (*.csv) per l'analisi. Usare CTRL+ clic con il pulsante sinistro del mouse per selezionare più file.
    NOTA: Il file eseguibile genera due tipi di grafici: 1) i dati grezzi vengono tracciati con una linea di adattamento migliore che indica la deriva misurata; 2) la risposta corretta alla deriva viene tracciata dopo essere stata levigata con una media mobile (con un intervallo di ~ 5 s). Da questo grafico vengono identificate le ampiezze e il time-to-peak dei componenti DC-ERG: onda c, oscillazione rapida, picco di luce e risposta off. I dati vengono quindi esportati in formato tabella in Excel, dove ogni foglio corrisponde a una registrazione del mouse diversa. Questi fogli sono seguiti da due fogli di riepilogo: (i) ampiezze DC-ERG compilate (mV); (ii) compilato DC-ERG time-to-peaks (light onset, t = 0 min).

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Representative Results

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La figura 2 è un set di dati di esempio di mouse miR-204 ko/ko cre/+ (KO condizionale) e di tipo selvaggio (WT). MiR-204 ko/ko cre/+ sono topi con un knockout condizionale di microRNA 204 nell'epitelio pigmentato retinico. Questi topi sono generati incrociando topi miR-204 floxed (prodotti da NEIGEF)22 con topi VMD2-CRE23. MiR-204 è altamente espresso nell'RPE dove regola l'espressione di proteine critiche per la funzione epiteliale che mantengono una stretta integrità della giunzione (ad esempio claudine), il mantenimento dell'omeostasi del potassio attraverso l'espressione dei canali del potassio Kir 7.1 e l'espressione di diversi geni del ciclo visivo (ad esempio, LRAT, RPE65)24.

Poiché la morfologia anomala dell'RPE è stata segnalata in diversi Cre specifici dell'RPE che esprimono le linee del mouse25, abbiamo monitorato la normale morfologia RPE in Cre esprimendo topi con fenotipo WT. Le anomalie strutturali e funzionali della retina del topo miR-204 ko/ko cre+ (KO condizionale) assomigliano alle caratteristiche riscontrate nei topi nulli miR-20415 caratterizzati da iper autofluorescenza (depositi lipofuscina) e aumento delle microglia localizzate sulla superficie apicica RPE. Nei topi nulli questi cambiamenti sono stati accompagnati da una diminuzione delle risposte elettriche evocate dalla luce dell'RPE, con una minima alterazione delle risposte del fotorecettore (valutata dall'ERG retinica). Pertanto, la perturbazione dell'espressione miR-204 nei topi miR-204 ko/ko cre/+ dovrebbe anche alterare la risposta elettrica dell'RPE.

Nell'esempio presentato, un mouse viene posizionato sulla piattaforma riscaldata e gli elettrodi vengono posizionati in modo appropriato prima di abbassare la cupola. L'impedenza e la deriva vengono controllate come descritto in precedenza utilizzando la soluzione da bagno. I risultati rappresentativi "negativi" sono riportati nella figura 2A. Nella figura 2A (pannello superiore), la traccia soffre di bolle minute nell'elettrodo che aumentano il rumore da picco a picco nella traccia (ombreggiato in blu). In un altro esempio (Figura 2A, pannello inferiore), quando le bolle si staccano dalla superficie del vetro e si muovono lungo la lunghezza dell'elettrodo, ciò causa bruschi cambiamenti nella direzione della deriva di base che non possono essere compensati dalla sottrazione di deriva. La figura 2B mostra registrazioni rappresentative "positive" di topi WT e miR-204 ko/ko cre/+ in cui le bolle sono state eliminate utilizzando la camera a vuoto prima di assemblare i microelettrodi nelle supporti del supporto dell'elettrodo.

La linea di adattamento migliore ai 25 s iniziali (verde) è calcolata e mostrata in blu (Figura 2B). Le risposte corrette per la deriva sono ripossetta nella figura 2C insieme all'identificazione delle ampiezze dei componenti DC-ERG. Utilizzando la tecnica DC-ERG descritta in questo protocollo gli animali provenienti da ceppi WT e miR-204 ko/ko cre/+ possono essere rapidamente registrati e analizzati.

L'onda c è composta da due componenti: un'iperpolarizzazione della membrana apicale RPE a causa dell'aumento della condutto di potassio in risposta a una diminuzione del potassio nello spazio subretinico dovuta all'attività del fotorecettore e un contributo separato originato dalle cellule retiniche interne (componente P3 lenta – che riflette l'attività delle cellule di Müller). L'oscillazione rapida fornisce informazioni riguardanti l'iperpolarizzazione della membrana basolaterale RPE26, principalmente a causa di cambiamenti nella condutto di un trasportatore Cl chiamato regolatore di conduzione transmembrana della fibrosi cistica (CFTR)27. Si pensa che il picco di luce derivi da un cambiamento nella concentrazione di una sostanza guidata dal fotorecettore28 che attraverso un secondo sistema messaggero depolarizza la membrana basolaterale dell'RPE modulando l'attività dei canali Cl dipendenti da Ca2+ 21. Infine, la off-response è una complessa interazione di risposte che differiscono in polarità e variano con l'intensità della luce18.

Come previsto, l'espressione ridotta dei canali Kir 7.1 K+ attenua notevolmente l'onda c29 e l'oscillazione rapida come mostrato nelle risposte medie nella figura 2D,indicando una significativa compromissione delle proprietà elettriche dell'RPE. Un riepilogo delle modifiche apportate ai componenti del DC-ERG è fornito nella figura 2E. Le ampiezze relative dei componenti DC-ERG (normalizzate a WT) sono tracciate rispetto alle due più grandi ampiezze a onde evocate dalla luce (1 cd·s/m2; 10 cd·s/m2) (normalizzate a WT) e mostrate nella figura 2F\u2012H. La riduzione della risposta a-onda all'intensità luminosa più luminosa (10cd·s/m2) (Figura 2F\u2012H, Figura supplementare S1A,B) suggerisce un ritardo nel recupero della sensibilità dovuto alla compromissione del ciclo visivo (ad esempio, derivante dalla ridotta espressione di LRAT o RPE65 a causa del knockout genomico di miR-20424,30).

Figure 1
Figura 1: Il diagramma evidenzia i passaggi chiave del protocollo DC-ERG. (A) Immagine del circuito completato effettuata abbassando la registrazione (microelettrodi capillari di vetro), il riferimento e gli elettrodi di terra nella stessa soluzione del bagno. Questa configurazione consente di eseguire test preliminari (prima di anestetizzare il mouse) per valutare l'impedenza, il rumore e la deriva caratteristici. Inserto (in alto a sinistra) che mostra uno schema a vista laterale del supporto personalizzato per microelettrodi. (B) Immagine rappresentativa della modalità di controllo dell'impedenza che mostra i valori appropriati per le impedenze degli elettrodi. L'impedenza negli elettrodi oculari sinistro e destro dovrebbe essere paragonabile, entro 5 KΩ l'uno dall'altro (ad esempio, occhio sinistro: 38,7 KΩ contro occhio destro: 40,36 KΩ). L'impedenza dell'elettrodo di riferimento della bocca dovrebbe essere inferiore a 1 KΩ, mentre l'elettrodo di coda dovrebbe essere di circa 2,5 KΩ. (C) Viene visualizzata l'immagine rappresentativa della traccia di anteprima (passaggio 4/6). Il passaggio 4 (Long Flash No Light) viene selezionato in quanto nessuna luce viene consegnata durante l'anteprima di questo passaggio. Le tracce dovrebbero essere a basso rumore e possono avere una leggera deriva che gradualmente svanisce con il tempo alla linea di base. Una volta che le tracce hanno raggiunto una deriva costante in entrambi i canali e sono diventate relativamente piatte, la registrazione effettiva può iniziare. (D) Utilizzando il passaggio 5/6 (Long Flash 10 cd 7 min) dopo 0,5 minuti di oscurità, un passo luminoso di 10 cd/m2 viene consegnato al mouse per 7 minuti seguito da un ritorno all'oscurità per 1,5 minuti ( E )Immaginedei parametri di esportazione utilizzati per convertire i dati in un file *.csv. Questo formato preciso è necessario per eseguire il software di analisi DC-ERG. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Tracce rappresentative e flusso di lavoro dell'analisi DC-ERG. Immagine di un risultato DC-ERG negativo che mostra un rumore eccessivo (A, pannello superiore) dal picco al picco e (A, pannello inferiore) alla deriva. (B) Immagini di registrazione DC-ERG positiva risultati da un mouse WT e miR-204 ko/ko cre/+. Grafici generati delle tracce grezze che mostrano le migliori linee di adattamento (blu) ai 25 s iniziali (verde) prima dell'inizio della luce. (C) Grafici delle risposte DC-ERG corrette alla deriva per i topi WT e miR-204 ko/ko cre/+ mostrati in B. Le ampiezze dei componenti del DC-ERG sono indicate nella legenda. (D) Risposte medie DC-ERG di 3-8 mesi WT (n = 6) e miR-204 ko/ko cre/+ (n = 6) topi. I componenti DC-ERG sono etichettati sulla traccia WT e i parametri di stimolazione della luce sono definiti di seguito. (E) Riepilogo dei componenti DC-ERG prelevati dalle registrazioni di topi WT e miR-204 ko/ko cre/+. I grafici a barre rappresentano la media, le barre di errore indicano un errore standard. Le ampiezze relative dell'onda c (F), (G) oscillazione rapida, e (H) off response sono tracciate contro le due più grandi ampiezze di onde a evocate dalla luce (1 cd·s/m2; 10 cd·s/m2) (normalizzate a WT). Il significato è indicato dagli asterischi: (test t dello studente; * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura complementare 1: Risposte ERG dei topi WT e miR-204 ko/ko cre/+. (A) Risposte dei topi WT (nero) e miR-204 ko/ko cre/+ (magenta) a 4 ms lampi di luce di intensità crescente: 0,0001 cd·s/m2 (n = 5), 0,001 cd·s/m22 (n = 5), 0,01 cd·s/m2 (n = 3), 0,1 cd·s/m2 (n = 3), 1 cd·s/m2 (n = 3), 10 cd·s/m2 (n = 2). (B) Ampiezza media dell'onda a tracciata rispetto all'intensità del flash. (C) Ampiezza media dell'onda B tracciata rispetto all'intensità del flash. (D) Tempo medio di picco delle risposte ad onda a tracciate rispetto all'intensità del flash. (E) Tempo medio di picco delle risposte delle onde B tracciate rispetto all'intensità del flash. Per tutti i grafici mostrati le barre di errore indicano SEM. Il significato è indicato dagli asterischi: (test t dello studente; * = p < 0,05). Clicca qui per scaricare questa cifra.

Figura supplementare 2: Esempio di offset CC nella linea elettrica che può essere mitigato con l'uso di un regolatore di tensione / condizionatore di potenza. (A) In assenza di picchi di tensione di regolazione della tensione (causati dall'uso di apparecchiature in una stanza adiacente, ad esempio OCT) generare un offset CC che può interferire con la misurazione dei componenti DC-ERG, in particolare il picco di luce. L'offset dirompente viene ingrandito a destra. (B) Con il regolatore di tensione/condizionatore di potenza abilitato il picco iniziale è ancora evidente ma il dannoso offset CC viene rimosso. L'effetto del regolatore di tensione/condizionatore di potenza viene ingrandito e mostrato a destra. Clicca qui per scaricare questa cifra.

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Discussion

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Passaggi critici

Una buona registrazione DC-ERG richiede elettrodi stabili che sono liberi da bolle che creano artefatti e deriva indesiderata in quanto sono estremamente sensibili al degassamento e alle variazioni di temperatura. È essenziale che si ottiene una linea di base stabile quando gli elettrodi vengono posizionati nella soluzione da bagno HBSS prima di procedere con la registrazione del mouse. Piccole bolle tendono a raccogliere alla base dell'elettrodo capillare o intorno alla guarnizione in silicone e sono difficili da vedere una volta che il supporto dell'elettrodo è completamente assemblato. Quando sono presenti poche bolle, sfogliare leggermente il supporto li libererà per la rimozione. Se ci sono troppe bolle o la deriva o il rumore non possono essere rimossi, spesso è meglio smontare l'elettrodo e ricominciare mentre si ispezionano attentamente le bolle in ogni fase del processo.

Modifiche e risoluzione dei problemi

Le seguenti personalizzazioni possono essere effettuate all'impostazione (Table of Materials) al fine di migliorare la fedeltà delle registrazioni DC-ERG. I cavi a basso rumore per i supporti in microelettrodi possono essere utilizzati per estendere i cavi esistenti dall'amplificatore a 32 bit alla tabella di registrazione. La lunghezza aggiuntiva consente l'attento posizionamento e regolazione del supporto dell'elettrodo senza disturbare la loro posizione una volta chiusa la cupola di Ganzfeld. Un regolatore di tensione/condizionatore di potenza può essere utilizzato per eliminare il rumore di linea e le sovratensioni di potenza generate da luci o apparecchiature in ambienti adiacenti accesi e spenti (Figura S2). Inoltre, lo stimolatore a cupola Ganzfeld da tavolo e l'amplificatore a 32 bit possono essere posizionati all'interno di una gabbia Faraday messa a terra sulla barra di terra dell'edificio per proteggersi da qualsiasi rumore elettrico aggiuntivo.

Limitazioni del metodo

Il DC-ERG può essere registrato fedelmente solo su animali adattati al buio, il che significa che una volta acceso lo stimolo leggero c'è poco che si può fare per eliminare potenziali indesiderati o deriva. Un'altra limitazione è che la polarità di alcuni dei componenti del DC-ERG (picco di luce, off-response) è soggetta all'intensità luminosautilizzata 16. Ciò significa che le maggiori deviazioni da WT possono verificarsi ad intensità non intrinsecamente presenti all'intensità luminosa utilizzata da questo protocollo (10 cd/m2). A questo punto, il software di analisi DC-ERG è stato progettato assumendo una risposta negativa (un minimo di risposta). Intensità di luce più luminose che si traducono nell'inversione della polarità della risposta off richiederanno la necessità di modificare il file di script di analisi incluso.

Significato

L'RPE è coinvolto nel mantenimento omeostatico dell'ambiente retinale e svolge un ruolo fondamentale nella patologia di diverse malattie retiniche. Questo metodo spiega in dettaglio come impostare un sistema DC-ERG per registrare la risposta elettrica RPE che, se eseguita in combinazione con le registrazioni ERG convenzionali, fornisce una misura oggettiva della funzione retinica esterna e RPE. Queste misure della funzionalità RPE possono essere utilizzate per valutare le linee transgeniche del mouse che mostrano fenotipi degenerativi o per testare l'efficacia del farmaco o la citotossicità indotta da farmaci per l'RPE.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto da fondi intramurali NEI. Gli autori riconoscono sinceramente il Dr. Sheldon Miller per la sua guida scientifica, consulenza tecnica e competenza nella fisiologia e nelle malattie RPE. Gli autori ringraziano Megan Kopera e lo staff di cura degli animali per la gestione delle colonie di topi, e il Dr. Tarun Bansal, Raymond Zhou e Yuan Wang per il supporto tecnico.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ag/AgCl (mouth) Electrode WPI Inc EP1 Mouth reference electrode for mouse
Ceramic Tile Sutter Instrument CTS Used to cut the glass capillary tube to an appropriate size
Cotton Tipped Cleaning Stick Puritan Medical Products 867-WC No Glue To be used as a spacer to improve the fit of the electrode holder assembly
Electroretinogram (ERG) System Diagnosys LLC E3 System Visual electrophysiology system to diagnose ophthalmic conditions in vision research and drug trials
Bunsen Burner Argos Technologies BW20002460 Or equivlaent to shape glass under flame
Glass Capillary Tube (1.5 mm) Sutter Instruments BF150-75 For filling with HBSS and making contact to the cornea
Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) Thermo Fisher Scientific Inc 14175-095 Commercially available. Maintain at RT
In-Line Filter Whatman 6722-5001 To protect vacuum pump from aerosols
Low Noise Cable for Microelectrode Holders WPI Inc 5372 Suggested for improving the length and placement of the cables and electrode holder assemblies
Magnetic Ball Joint WPI Inc 500871 For magnetically positioning the electrode holder assembly on the stage
MatLab Mathworks MatLab: For editing the analysis software
MatLab Curvefit Toolbox Mathworks Toolbox for MatLab (only required for editing the analysis software)
MatLab Compiler Mathworks Toolbox for MatLab (only required for editing and re-releasing the analysis software)
MatLab Runtime version 9.5 Mathworks R2018b (9.5) Required to run the analysis software: https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html
Microelectrode Holders (45 degrees) WPI Inc MEH345-15 For holding the capillaries
Needle (25 ga) Covidien 8881250313 For filling the capillary tubes with HBSS
Needle (ground) Electrode Rhythmlink 13mm - one elctrode Subdermal needle electrode (ground) for mouse (13mm long, 0.4mm diameter needle, 1.5m leadwire)
Regulator/Power Conditioner Furman P-1800 Or equivalent to remove DC-offset from noise introduced through power line
Syringe (12 mL) Monoject 1181200777 For filling the capillary tubes with HBSS
T-clip Cole-Parmer 06852-20 For electrode holder assembly
Vacuum Desiccator Bel-Art 420120000 Clear polycarbonate bottom & cover
Pharmacological treatment
Lubricant eye gel Alcon 0078-0429-47 Helps lubricate corneal surface and maintain electrical contact with capillary electrodes
Phenylephrine Hydrochloride 2.5% Akorn 17478-201-15 Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation)
Proparacaine Hydrochloride 0.5% Akorn 17478-263-12 Local anesthetic for ophthalmic instillation
Tropicamide 0.5% Akorn 17478-101-12 Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation)
Xylazine AnaSed sc-362949Rx Analgesic and muscle relaxant
Zetamine (Ketamine HCl) VetOne 501072 Anesthetic for intramuscular injections

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References

  1. Steinberg, R. H. Interactions between the retinal pigment epithelium and the neural retina. Documenta Ophthalmologica. 60, (4), 327-346 (1985).
  2. Sahu, B., Maeda, A. RPE Visual Cycle and Biochemical Phenotypes of Mutant Mouse Models. Methods in Molecular Biology. 1753, 89-102 (2018).
  3. Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture. Experimental Eye Resarch. 126, 51-60 (2014).
  4. Wimmers, S., Karl, M. O., Strauss, O. Ion channels in the RPE. Progress in Retinal Eye Research. 26, (3), 263-301 (2007).
  5. Gundersen, D., Orlowski, J., Rodriguez-Boulan, E. Apical polarity of Na,K-ATPase in retinal pigment epithelium is linked to a reversal of the ankyrin-fodrin submembrane cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 112, (5), 863-872 (1991).
  6. Fletcher, E. L., et al. Studying age-related macular degeneration using animal models. Optometry and Vision Science. 91, (8), 878-886 (2014).
  7. Gu, S. M., et al. Mutations in RPE65 cause autosomal recessive childhood-onset severe retinal dystrophy. Nature Genetics. 17, (2), 194-197 (1997).
  8. Marlhens, F., et al. Mutations in RPE65 cause Leber's congenital amaurosis. Nature Genetics. 17, (2), 139-141 (1997).
  9. Marmorstein, A. D., et al. the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97, (23), 12758-12763 (2000).
  10. Chang, B. Mouse models for studies of retinal degeneration and diseases. Methods in Molecular Biology. 935, 27-39 (2013).
  11. Collin, G. B., et al. Mouse Models of Inherited Retinal Degeneration with Photoreceptor Cell Loss. Cells. 9, (4), (2020).
  12. Shrock, E., Güell, M. CRISPR in Animals and Animal Models. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 152, 95-114 (2017).
  13. Smalley, E. CRISPR mouse model boom, rat model renaissance. Nature Biotechnology. 34, (9), 893-894 (2016).
  14. Benchorin, G., Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Vollrath, D. Assessment of Murine Retinal Function by Electroretinography. Bio Protocol. 7, (7), (2017).
  15. Zhang, C., et al. Regulation of phagolysosomal activity by miR-204 critically influences structure and function of retinal pigment epithelium/retina. Human Molecular Genetics. 28, (20), 3355-3368 (2019).
  16. Samuels, I. S., et al. Light-evoked responses of the retinal pigment epithelium: changes accompanying photoreceptor loss in the mouse. Journal of Neurophysiology. 104, (1), 391-402 (2010).
  17. Wu, J., Marmorstein, A. D., Peachey, N. S. Functional abnormalities in the retinal pigment epithelium of CFTR mutant mice. Experimental Eye Research. 83, (2), 424-428 (2006).
  18. Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Neurophysiology. 91, (3), 1134-1142 (2004).
  19. Peachey, N. S., Stanton, J. B., Marmorstein, A. D. Noninvasive recording and response characteristics of the rat dc-electroretinogram. Visual Neuroscience. 19, (6), 693-701 (2002).
  20. Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes. Journal of Neurophysiology. 113, (4), 1085-1099 (2015).
  21. Marmorstein, L. Y., et al. The light peak of the electroretinogram is dependent on voltage-gated calcium channels and antagonized by bestrophin (best-1). Journal of General Physiology. 127, (5), 577-589 (2006).
  22. Zhang, C., et al. Invest. Ophtalmol. Vis. Sci. Annual Meeting for the Association for Research in Vision and Ophthalmology. 3568 (2017).
  23. Iacovelli, J., et al. Generation of Cre transgenic mice with postnatal RPE-specific ocular expression. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52, (3), 1378-1383 (2011).
  24. Wang, F. E., et al. MicroRNA-204/211 alters epithelial physiology. FASEB Journal. 24, (5), 1552-1571 (2010).
  25. He, L., Marioutina, M., Dunaief, J. L., Marneros, A. G. Age- and gene-dosage-dependent cre-induced abnormalities in the retinal pigment epithelium. American Journal of Pathology. 184, (6), 1660-1667 (2014).
  26. Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. Light-evoked modulation of basolateral membrane Cl- conductance in chick retinal pigment epithelium: the light peak and fast oscillation. Journal of Neurophysiology. 70, (4), 1669-1680 (1993).
  27. Blaug, S., Quinn, R., Quong, J., Jalickee, S., Miller, S. S. Retinal pigment epithelial function: a role for CFTR. Documenta Ophthalmologica. 106, (1), 43-50 (2003).
  28. Gallemore, R. P., Griff, E. R., Steinberg, R. H. Evidence in support of a photoreceptoral origin for the "light-peak substance". Investigative Ophthalmology and Visual Science. 29, (4), 566-571 (1988).
  29. Shahi, P. K., et al. Abnormal Electroretinogram after Kir7.1 Channel Suppression Suggests Role in Retinal Electrophysiology. Science Reports. 7, (1), 10651 (2017).
  30. Li, Y., et al. Mouse model of human RPE65 P25L hypomorph resembles wild type under normal light rearing but is fully resistant to acute light damage. Human Molecular Genetics. 24, (15), 4417-4428 (2015).
Elettroretinogramma ad accoppiamento diretto (DC-ERG) per la registrazione delle risposte elettriche evocate dalla luce dell'epitelio pigmentato retinico del mouse
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Miyagishima, K. J., Zhang, C., Malechka, V. V., Bharti, K., Li, W. Direct-Coupled Electroretinogram (DC-ERG) for Recording the Light-Evoked Electrical Responses of the Mouse Retinal Pigment Epithelium. J. Vis. Exp. (161), e61491, doi:10.3791/61491 (2020).More

Miyagishima, K. J., Zhang, C., Malechka, V. V., Bharti, K., Li, W. Direct-Coupled Electroretinogram (DC-ERG) for Recording the Light-Evoked Electrical Responses of the Mouse Retinal Pigment Epithelium. J. Vis. Exp. (161), e61491, doi:10.3791/61491 (2020).

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