Här presenterar vi en metod för att registrera ljus-evoked elektriska svar av retinal pigment epitel (RPE) i möss med hjälp av en teknik som kallas DC-ERGs först beskrivs av Marmorstein, Peachey, och kollegor i början av 2000-talet.
Näthinnans pigmentepitelet (RPE) är en specialiserad monolayer av celler som är strategiskt placerade mellan näthinnan och choriocapillaris som upprätthåller fotoreceptorernas allmänna hälsa och strukturella integritet. Den RPE är polariserad, uppvisar apiskt och basalt belägna receptorer eller kanaler, och utför vektorala transporter av vatten, joner, metaboliter, och utsöndrar flera cytokiner.
In vivo noninvasive mätningar av RPE-funktionen kan göras med hjälp av direkt-kopplade ERGs (DC-ERGs). Metoden bakom DC-ERG var pionjärer marmorstein, Peachey, och kollegor med hjälp av en specialbyggd stimulering inspelningssystem och senare visat med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt system. DC-ERG-tekniken använder glaskapillärer fyllda med Hanks buffrade saltlösning (HBSS) för att mäta de långsammare elektriska svaren från RPE som framkallas från ljusuppmanade koncentrationsförändringar i det subretinala utrymmet på grund av fotoreceptoraktivitet. Den långvariga ljusstimulansen och längden på DC-ERG-inspelningen gör den sårbar för drift och buller vilket resulterar i en låg avkastning på användbara inspelningar. Här presenterar vi en snabb, tillförlitlig metod för att förbättra stabiliteten i inspelningarna samtidigt som du minskar bullret genom att använda vakuumtryck för att minska/eliminera bubblor som resulterar från utgasning av HBSS och elektrodhållaren. Dessutom är kraftledningsartefakter försvagade med hjälp av en spänningsregulator / power-balsam. Vi inkluderar nödvändiga protokoll för ljusstimulering för ett kommersiellt tillgängligt ERG-system samt skript för analys av DC-ERG-komponenterna: c-wave, snabb svängning, ljustopp och off-respons. På grund av den förbättrade lätt för inspelningar och snabb analys arbetsflöde, detta förenklade protokollet är särskilt användbart för att mäta åldersrelaterade förändringar i RPE funktion, sjukdomsprogression, och i bedömningen av farmakologiska intervention.
Den näthinnans pigment epitel (RPE) är en monolayer av specialiserade celler som linje den bakre delen av ögat och utöva kritiska funktioner för att upprätthålla näthinnans homeostas1. Den RPE stöder fotoreceptorer genom att regenerera deras foton-fånga visuella pigment i en process som kallas den visuellacykeln 2, genom att delta i dagaktiva fagocytos av skjul yttre segment tips3, och i transporten av näringsämnen och metaboliska produkter mellan fotoreceptorer och choriocapillaris4,5. Avvikelser i RPE funktion ligger bakom ett flertal mänskliga näthinnesjukdomar, såsom åldersrelaterad makuladegeneration6, Lebers medfödda amaurosis7,8 och Bästa vitelliform makuladystrofi9. Eftersom donatorögonvävnader ofta är svåra att få enbart för forskningsändamål kan djurmodeller med genetiska modifieringar ge ett alternativt sätt att studera utvecklingen av näthinnesjukdomar10,11. Dessutom tillåter framväxten och tillämpningen av CRISPR cas9-tekniken nu genomiska introduktioner (knock-in) eller strykningar (knock-out) i en enkel enstegsprocess som överträffar begränsningarna av tidigare geninriktningsteknik12. Bommen i tillgången på nya musmodeller13 nödvändiggör ett effektivare inspelningsprotokoll för att icke-invasivt utvärdera RPE-funktionen.
Mätning av de ljusuppmanade elektriska svaren från RPE kan uppnås med hjälp av en direktkoppling elektroretinogram (DC-ERG) teknik. När de används i kombination med konventionella ERG-inspelningar som mäter fotoreceptorn (a-wave) och bipolär (b-wave) cellsvar14, kan DC-ERG definiera hur RPE-nas responsegenskaper förändras med retinal degeneration15,16,17 eller om RPE-dysfunktion föregår fotoreceptorförlust. Detta protokoll beskriver en metod som anpassas från arbetet av Marmorstein, Peachey, och kollegor som först framkallade DC-ERG-tekniken16,18,19,20 och förbättrar på reproducerbarheten och lindrar av bruk.
DC-ERG-inspelningen är svår att utföra på grund av den långa förvärvstiden (9 min) under vilken eventuella avbrott eller införande av buller kan försvåra tolkningen av uppgifterna. Fördelen med denna nya metod är att baslinjerna når steady state inom en kortare tid som minskar sannolikheten för att djuret kommer att vakna i förtid från anestesi och är mindre benägna att bubbla bildas i kapillärelektroderna.
Kritiska steg
En bra DC-ERG-inspelning kräver stabila elektroder som är fria från bubblor som skapar artefakter och oönskad drift då de är extremt känsliga för utgasning och temperaturförändringar. Det är väsentligt att en stabil baslinje uppnås när elektroderna placeras i HBSS-badlösningen innan man går vidare med musinspelningen. Små bubblor tenderar att samla vid basen av kapillärelektroden eller runt silikonpackningen och är svåra att se när elektrodh?…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av NEI intramural fonder. Författarna erkänner uppriktigt Dr Sheldon Miller för hans vetenskapliga vägledning, teknisk rådgivning och expertis inom RPE fysiologi och sjukdom. Författarna tackar Megan Kopera och djurvårdspersonal för att hantera musen kolonier, och Dr Tarun Bansal, Raymond Zhou, och Yuan Wang för tekniskt stöd.
Ag/AgCl (mouth) Electrode | WPI Inc | EP1 | Mouth reference electrode for mouse |
Ceramic Tile | Sutter Instrument | CTS | Used to cut the glass capillary tube to an appropriate size |
Cotton Tipped Cleaning Stick | Puritan Medical Products | 867-WC No Glue | To be used as a spacer to improve the fit of the electrode holder assembly |
Electroretinogram (ERG) System | Diagnosys LLC | E3 System | Visual electrophysiology system to diagnose ophthalmic conditions in vision research and drug trials |
Bunsen Burner | Argos Technologies | BW20002460 | Or equivlaent to shape glass under flame |
Glass Capillary Tube (1.5 mm) | Sutter Instruments | BF150-75 | For filling with HBSS and making contact to the cornea |
Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific Inc | 14175-095 | Commercially available. Maintain at RT |
In-Line Filter | Whatman | 6722-5001 | To protect vacuum pump from aerosols |
Low Noise Cable for Microelectrode Holders | WPI Inc | 5372 | Suggested for improving the length and placement of the cables and electrode holder assemblies |
Magnetic Ball Joint | WPI Inc | 500871 | For magnetically positioning the electrode holder assembly on the stage |
MatLab | Mathworks | MatLab: For editing the analysis software | |
Matlab Curvefit Toolbox | Mathworks | Toolbox for MatLab (only required for editing the analysis software) | |
MatLab Compiler | Mathworks | Toolbox for MatLab (only required for editing and re-releasing the analysis software) | |
MatLab Runtime version 9.5 | Mathworks | R2018b (9.5) | Required to run the analysis software: https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html |
Microelectrode Holders (45 degrees) | WPI Inc | MEH345-15 | For holding the capillaries |
Needle (25 ga) | Covidien | 8881250313 | For filling the capillary tubes with HBSS |
needle (ground) electrode | Rhythmlink | 13mm – one elctrode | Subdermal needle electrode (ground) for mouse (13mm long, 0.4mm diameter needle, 1.5m leadwire) |
Regulator/Power Conditioner | Furman | P-1800 | Or equivalent to remove DC-offset from noise introduced through power line |
Syringe (12 mL) | Monoject | 1181200777 | For filling the capillary tubes with HBSS |
T-clip | Cole-Parmer | 06852-20 | For electrode holder assembly |
Vacuum Desiccator | Bel-Art | 420120000 | Clear polycarbonate bottom & cover |
Pharmacological treatment | |||
Lubricant eye gel | Alcon | 0078-0429-47 | Helps lubricates corneal surface and maintain electrical contact with capillary electrodes |
Phenylephrine Hydrochloride 2.5% | Akorn | 17478-201-15 | Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation) |
Proparacaine Hydrochloride 0.5% | Akorn | 17478-263-12 | Local anesthetic for ophthalmic instillation |
Tropicamide 0.5% | Akorn | 17478-101-12 | Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation) |
Xylazine | AnaSed | sc-362949Rx | Analgesic and muscle relaxant |
Zetamine (Ketamine HCl) | VetOne | 501072 | Anesthetic for intramuscular injections |