Эта методология призвана проиллюстрировать механизмы, с помощью которых внеклеточные матричные сигналы, такие как жесткость субстрата, состав белка и морфология клеток регулируют фенотип клеток Шванн (SC).
Травматические травмы периферической нервной системы (PNS) в настоящее время не имеют подходящего лечения, чтобы восстановить полное функциональное восстановление. Клетки Шванн (SCs), как основные глиальные клетки PNS, играют жизненно важную роль в содействии регенерации PNS путем dedifferentiating в регенеративного фенотипа клеток после травмы. Однако, dedifferentiated состояние SCs является сложной задачей для поддержания в течение периода времени, необходимого для регенерации и влияет на изменения в окружающих внеклеточной матрицы (ECM). Поэтому необходимо определить сложное взаимодействие между ОК и различными ECM для обеспечения сигналов регенеративного потенциала УК. Для решения этой проблемы была разработана стратегия, в рамках которой различные белки ECM были адсоргированны на тунецовый полидиметилсилоксан (PDMS), который обеспечивал платформу, на которой можно модулировать жесткость и состав белка. СК были посеяны на тунецовые субстраты и критические клеточные функции, представляющие динамику фенотипа SC были измерены. Чтобы проиллюстрировать взаимодействие между экспрессией белка SC и клеточной морфологией, различные плотности посева СК в дополнение к отдельным микроконтакт печатных клеточных моделей были использованы и характеризуется иммунофлуоресценции окрашивания и западной пятно. Результаты показали, что клетки с меньшей площадью распространения и более высокой степенью клеточного удлинения способствовали более высоким уровням регенеративных фенотипических маркеров SC. Эта методология не только начинает разгадывать значительную связь между ЭКМ и клеточной функцией ОК, но и содержит руководящие принципы для будущей оптимизации биоматериалов в периферическом ремонте нервов.
Травмы периферической нервной системы (PNS) остаются серьезной клинической проблемой в здравоохранении, ставя под угрозу качество жизни пациентов и создавая значительное влияние через множество социально-экономическихфакторов 1,2. Клетки Шванн (SC), как основные глиальные клетки в PNS, обеспечивают необходимые молекулярные и физические сигналы, чтобы вызвать регенерацию PNS и помощь в функциональном восстановлении в коротких травм разрыва. Это связано с замечательной способностью SCs dedifferentiate в “ремонт” фенотип клеток из миелиниации или Фенотип Remak3. Ремонт SC является отличительным фенотипом клеток несколькими способами. После травмы, SCs увеличить их скорость распространения путем повторного ввода клеточного цикла и начать выражение нескольких транскрипционых факторов для облегчения reinnervation. Эти факторы, такие как c-Jun и p75 NTR, регулируются в то время как миелинирующие маркеры SC, такие как миелин основной белок (MBP), являются вниз регулируется4,5. Кроме того, УК изменить морфологию, чтобы стать удлиненными и выровнены друг с другом, чтобы сформировать Бюнгнер полосы по всей травмы сайта6. Это обеспечивает физический механизм наведения для аксонов, чтобы распространиться на правильную дистальную цель7. Однако, несмотря на способность, которой обладают РК, содействовать регенерации нервов при коротких травмах, результат функционального восстановления остается плохим при тяжелых травмах. Отчасти это связано с потерей внеклеточной матрицы (ECM) наведения сигналов, а также неспособностью ОК поддерживать регенеративный фенотип в течение длительных периодоввремени 8.
Процесс регенерации нерва и восстановления тесно связаны с состоянием базальной ламины после травмы. Базальная ламина представляет собой слой ECM вокруг нерва, который облегчает руководство и обеспечивает ECM-связанные сигналы для аксонов и ОК в тех случаях, когда он остается нетронутым после травмы9. Состояние ECM и его способность доставить матрицы связаны сигналы к клеткам является жизненно важным и ранее были изучены в различных контекстах10,11,12,13,14. Например, было показано, что жесткость ECM может направлять функции клеток, такие как пролиферация и дифференциация11,,15,,16. Состав ECM может также привести к четкой клеточной реакции и регулировать поведение клеток, таких как миграция и дифференциация через внутриклеточные сигнальные пути17,,18. Кроме того, морфология клеток, включая область распространения и клеточное удлинение, играет важную роль в регулировании функции и может регулироваться ECM-связанными сигналами19,,20. Многие предыдущие исследования были сосредоточены на стволовых клеток дифференциации в определенных линий, но РК обладают аналогичной способностью изменять фенотип из гомеостатических, взрослых SC в здоровом нерве, чтобы ремонт SC способны выделять белки и факторы роста при реконструкции ECM после травмы нерва5,21. Поэтому особенно важно определить механизмы, лежащие в основе взаимосвязи между врожденной регенеративной способностью SC и связанными ЭКМ сигналами для понимания, чтобы в конечном итоге использовать эту способность для регенерации нервов.
Для решения этой проблемы мы разработали подробную методологию для создания субстрата клеточной культуры, где механическая жесткость и тип лиганда могут быть легко настроены в физиологически соответствующих диапазонах. Polydimethyl siloxane (PDMS) был выбран в качестве субстрата из-за его высокой тунецовой механики по сравнению с полиакриламидным гелем, где максимальный модуль Янг составляет около 12 кПа контрастирует с PDMS около 1000 kPa22,23,24. Это полезно для работы под рукой, так как недавние исследования показали, что модули Янга седалищного нерва может превышать 50 кПа во время разработки, тем самым предполагая, что диапазон жесткости нервов в PNS шире, чем ранее изучены. Различные белки способны адсорбции на субстраты PDMS для анализа комбинаторной регуляции механики и лигандов на поведение SC. Это позволяет исследовать несколько микроокрументальных сигналов, присутствующих в процессе регенерации PNS, и сравнить высокую степень настраиваемости с работой, фокусясь исключительно на жесткости субстрата25. Кроме того, эти инженерии субстратов клеточной культуры совместимы с множеством методов количественного анализа, таких как иммуногистохимия, западная помарка, и количественная полимеразная цепная реакция (q-PCR).
Эта разработанная платформа клеточной культуры очень подходит для анализа механистических путей из-за высокого уровня индивидуальной настройки каждого сигнала, связанного с ECM. Кроме того, популярные методы микропаттернирования клеток, в том числе микроконтактная печать, могут быть достигнуты на субстратах, чтобы позволить для контролируемой клеточной адгезии для анализа формы клеток по отношению к другим ECM связанных сигналов24. Это имеет решающее значение, поскольку линейные узорчатые субстраты, которые способствуют удлинению популяций клеток, служат инструментом для имитации и изучения удлиненной и регенеративной ОБЛАСТИ в диапазонах Бюнгнера во время регенерации нервов. Кроме того, клеточная морфология является мощным регулятором нескольких функций клеток и потенциально может ввести смешанные экспериментальныерезультаты,если не контролируется26,27. Значительное внимание в настоящее время уделяется механизмам, регулирующим SC регенеративного фенотипа, регулируемых ECM сигналы28,29,30. Это необходимо для того, чтобы дать представление о дизайне биоматериалов, которые могут быть применены в качестве нервных каналов для помощи в регенерации нервов PNS. Эти подробные протоколы в конечном счете могут быть применены в качестве потенциального инструмента для расшифровки механизмов SC и других функций типа клеток, регулируемых ECM связаны сигналы.
SCs может способствовать регенерации нерва из-за их фенотипической трансформации и регенеративного потенциала после повреждения нерва. Однако, как ECM сигналы регулируют этот регенеративный потенциал остается в основном неясным, потенциально препятствуя не только развитие биоматериал…
The authors have nothing to disclose.
Авторы с благодарностью признают финансовую поддержку со стороны Университета Цинциннати. Авторы также поблагодарить Рона Фленникена из Университета Цинциннати Расширенный Характеристика материалы лаборатории для поддержки.
Albumin from Bovine Serum (BSA), Texas Red conjugate | Thermo Fisher Scientific | A23017 | BSA staining to show micropatterns |
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7076S | Antibody used for western blot analysis |
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074S | Antibody used for western blot analysis |
BrdU | Thermo Fisher Scientific | B23151 | Reagent used to measure cell proliferation |
BrdU primary antibody conjugated with Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | B35130 | Used to visualize BrdU in cell proliferation assays |
Collagen I | Thermo Fisher Scientific | A10483-01 | Protein used to coat coverslips |
Compression force test machine | TestResources | Instrument to quantify mechanical properties of polymers | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | Cell culture medium |
Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | Cell culture medium supplemental |
Fibronectin | Thermo Fisher Scientific | 33010-018 | Protein used to coat coverslips |
Fluorescence microscope | Nikon | Eclipse Ti2 | Fluorescence microscope |
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Fisher Scientific | 78440 | Protease and Phosphatase Inhibitor |
Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017015 | Protein used to coat coverslips |
Mounting medium with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36971 | Coverslip mountant and nuclei staining |
Mouse c-Jun primary antibody | Thermo Fisher Scientific | 711202 | Primary antibody to visualize c-Jun protein |
Mouse β-Actin primary antibody | Cell Signaling Technology | 3700S | Loading control for western blot experiments |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Cell culture medium supplemental |
Photoresist SU 2010 | KAYAKU | SU8-2010 | Photoresist |
Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | P-2443 | Block non-specific protein binding |
Rabbit c-Jun primary antibody | Cell Signaling Technology | 9165S | Primary antibody for visualization of c-Jun protein |
Rabbit myelin basic protein primary antibody | Abcam | ab40390 | Primary antibody for visualization of MBP |
Rabbit p75NTR primary antibody | Cell Signaling Technology | 8238S | Primary antibody for visualization of p75NTR |
Rhodamine phalloidin | Thermo Fisher Scientific | R415 | Visualization of cell cytoskeleton |
RIPA buffer | Abcam | ab156034 | Cell lysis buffer |
RT4-D6P2T Schwann cell line | ATCC | CRL-2768 | Cell line used in experiments |
SYLGARD 184 PDMS base and curing agent | Sigma Aldrich | 761036 | Tunable polymer used to coat coverslips |
Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 15090-046 | Cell dissociation reagent |
UV-Ozone cleaner | Novascan | Increase hydrophicility of PDMS | |
Versene (1x) | Thermo Fisher Scientific | 15040066 | Cell dissociation reagent |