מתודולוגיה זו שואפת להמחיש את המנגנונים שבהם מדובר ברמזים של מטריקס כגון קשיות המצע, הרכב החלבון ומורפולוגיה התא ויסות התא Schwann (SC) פנוטיפים.
מערכת העצבים ההיקפית טראומטית (היקפית) פציעות כרגע חסר טיפולים מתאימים כדי להחזיר התאוששות תפקודית מלאה. תאים schwann (ה scs), כמו התאים העיקריים גליה של היקפית, לשחק תפקיד חיוני בקידום התחדשות היקפית על ידי הבחנה לתוך תא התחדשות פניטיפ לאחר הפציעה. עם זאת, המצב הה scs של המדינה מאתגרת לשמור דרך תקופת הזמן הדרושה להתחדשות והיא מושפע משינויים במטריצה שמסביב (ECM). לכן, קביעת הגומלין המורכבים בין ה scs לבין ECM שונות כדי לספק רמזים של פוטנציאל משובי של ה scs הוא חיוני. כדי להתייחס לכך, אסטרטגיה נוצרה כאשר חלבונים ecm שונים היו נספחת על המצע polydiמתיל siloxane (pdms) אשר סיפק פלטפורמה שבה נוקשות והרכב חלבון יכול להיות מאופנן. ה scs היו הנזרע על מצעים התאים הקריטיים פונקציות הסלולר המייצגים את הדינמיקה של SC פנוטיפים נמדדו. כדי להמחיש את הגומלין בין ביטוי חלבון SC לבין מורפולוגיה הסלולר, שונים צפיפות הזריעה של ה scs בנוסף מיקרומגע בודדים מודפס דפוסים סלולריים היו מנוצלים ומאופיין על ידי immunofluorescence כתמי והאבן המערבית אבן. תוצאות הראו כי תאים עם שטח התפשטות קטן יותר ובהיקף גבוה יותר של התארכות הסלולר לקדם רמות גבוהות יותר של סמנים משובי התחדשות של SC. מתודולוגיה זו לא רק מתחילה לפענח את הקשר המשמעותי בין הפונקציה ECM והסלולר של ה scs, אבל גם מספק הנחיות לאופטימיזציה עתידית של ביואטילים בתיקון עצבי היקפי.
מערכת העצבים ההיקפית (היקפית) פציעות להישאר אתגר קליני גדול בטיפול רפואי על ידי התפשרות על איכות החיים עבור חולים ויצירת השפעה משמעותית באמצעות המון גורמים סוציואקונומיים1,2. התאים schwann (SC), כמו תאים גליה העיקריים ב היקפית, לספק רמזים מולקולריים הדרושים כדי לגרום התחדשות היקפית וסיוע שחזורים תפקודית בפציעות פער קצר. זה בגלל היכולת המדהימה של ה scs להפריד לתוך “תיקון” תא מושגים מתוך מיאלואידית או מיפוי פניטיפ3. התיקון SC הוא התאים הייחודיים הפנוטיפ במספר דרכים. לאחר הפציעה, ה scs להגדיל את שיעור ההתפשטות שלהם על ידי הזנה מחדש של מחזור התא ולהתחיל ביטוי של מספר גורמים משתנים כדי להקל על שימור. גורמים אלה, כגון c-Jun ו p75 ntr, הם upregulated בעוד סמנים מיאלווניים, כמו חלבון מיאלין בסיסי (mbp), הם מוסדרות4,5. בנוסף, ה scs שינוי מורפולוגיה להיות מוארך ומיושר אחד עם השני כדי ליצור להקות Büngner על פני הפגיעה באתר6. הדבר מספק מנגנון הנחיה פיזי עבור האקסונים כדי להאריך את המטרה הנכונה7. עם זאת, למרות היכולת כי ה scs יש לקדם התחדשות העצב בפציעות פער קצר, התוצאה של התאוששות תפקודית נשאר עני בפציעות חמורות. זה נובע בחלקו לאובדן של מטריקס מטריצה (ECM) רמזים הדרכה, כמו גם את חוסר היכולת של ה scs לשמור על פניטיפים משובי על פרקי זמן ארוכים של זמן8.
התחדשות העצב ותהליך ההחלמה קשורים באופן אינטימי למצב של לינה הבסיס לאחר הפציעה. טרף הבסיס היא שכבה של ecm סביב העצב המקל הדרכה ומספק הרמזים ecm מאוגד עבור אקסונים ו ה scs במקרים שבהם הוא נשאר שלם לאחר הפציעה9. מצב ה-ecm והיכולת שלה לספק רמזים מאוגדים במטריקס לתאים הוא חיוני ובעבר בחנו במגוון הקשרים שונים10,11,12,13,14. לדוגמה, זה הוכח כי הנוקשות של ecm יכול להנחות פונקציות תא כגון התפשטות ובידול11,15,16. הרכב של ecm יכול גם להוביל לתגובה סלולרית ברורה לווסת התנהגויות תא כגון הגירה בידול באמצעות מסלולים מאותת תאיים17,18. יתר על כן, מורפולוגיה התא, כולל שטח התפשטות והתארכות הסלולר, לשחק תפקיד מרכזי בוויסות הפונקציה והוא יכול להיות נשלט על ידי הרמזים ecm19מאוגד 19,20. מחקרים קודמים רבים התמקדו בתאי גזע המבדילים לתוך ליננים מוגדרים, עדיין ה scs בעלי יכולת דומה לשנות פנוטיפ מן הומסטטי, מבוגר SC בתוך עצב בריא, כדי תיקון SC מסוגל הפרשה חלבונים וגורמי גדילה תוך שיפוץ של ecm פציעה העצבים הבאה5,21. לכן, זה חיוני במיוחד כדי לזהות מנגנונים הנמצאים בבסיס היחסים בין הקיבולת הטבועה של משובי SC ו ECM מאוגד רמזים עבור התובנה בסופו של דבר לרתום את היכולת הזו להתחדשות העצב.
כדי לענות על כך, פיתחנו מתודולוגיה מפורטת כדי לייצר מצע של תרבות התא שבו נוקשות מכנית, ליגנד סוג ניתן לכוונן בקלות בטווחים הרלוונטיים פיזיולוגית. Polydimethyl תיל siloxane (pdms) נבחרה כמצע בשל המכניקה שלה מאוד מאוד מאוד משלה לעומת polyאקרילאמיד ג’ל, שם מודולוס הצעיר המרבי הוא סביב 12 kpa בניגוד pdms בסביבות 1000 kpa22,23,24. זה מועיל לעבודה בהישג יד, כפי שמחקרים שנעשו לאחרונה הראו את מודולוס של הצעיר של עצב הארנב יכול לעלות על 50 kPa במהלך הפיתוח, ובכך מציע כי טווח הנוקשות של העצבים בתוך היקפית הוא רחב יותר מאשר נבדק בעבר. חלבונים שונים מסוגלים ספיחה על מצעים pdms לנתח את הרגולציה קומבינטורית של מכניקה וליגטים על התנהגות SC. זה מאפשר את החקירה של מספר רמזים מיקרו סביבתיים בתהליך התחדשות היקפית והשוואה של רמה גבוהה של היכולת לעבוד התמקדות אך ורק על נוקשות של מצע25. יתר על כן, אלה מהונדסים התרבות תאים מצעים תואמים עם ריבוי של שיטות ניתוח כמותי כגון אימונוהיסטוכימיה, כתם מערבי, ואת תגובת שרשרת פולימראז כמותי (q-PCR).
פלטפורמה זו של תרבות התא מהונדסים מתאים מאוד לניתוח מסלולים מכניסטיים עקב רמה גבוהה של מנהרה בודדים של כל אות ECM מאוגד. בנוסף לכך, ניתן להשיג שיטות נפוצות למיקרו-תאים, כולל הדפסת מיקרו-מגעים, על מנת לאפשר הדבקה תאית מבוקרת כדי לנתח את צורת התא ביחס לרמזים אחרים המאוגדים ב-ECM24. זה קריטי כי קו מצעים השורה, אשר לקדם התארכות באוכלוסיות תאים, לספק כלי לחקות וללמוד מוארך ומשובי ה scs בתוך להקות Büngner במהלך התחדשות העצב. יתרה מזאת, מורפולוגיה סלולרית היא מווסת חזק של פונקציות תא מרובות והוא עלול להחדיר תוצאות נסיוניות אם לא נשלט26,27. תשומת לב משמעותית מסופק כעת למנגנון המסדירים את משובי SC פנוטיפ מוסדר על ידי המקלות ecm28,29,30. זה חיוני כדי לספק תובנה לתוך העיצוב של ביואטילים כי ניתן להחיל כתעלות הדרכה עצבים לסיוע התחדשות העצב היקפית. אלה פרוטוקולים מפורטים יכול בסופו של דבר להיות מיושם ככלי פוטנציאלי כדי לפענח את המנגנונים של SC ותפקוד סוג תא אחר כפי מוסדר על ידי רמזים מאוגדים ECM.
ה scs יכול לקדם התחדשות העצב בשל הטרנספורמציה פנוטימית שלהם פוטנציאל התחדשות לאחר פגיעה בעצב. עם זאת, איך הרמזים ECM לווסת את יכולת ההתחדשות הזו נותרת בלתי ברורה ברובו, באופן פוטנציאלי לא רק את ההתפתחות של ביואטילים כי המטרה לקדם התחדשות עצבים, אלא גם את ההבנה של המנגנונים המעורבים התחדשות הע…
The authors have nothing to disclose.
המחברים מודים בהכרת התמיכה מאוניברסיטת סינסינטי. המחברים גם מודים לרון פלמוזיקן מתוך המעבדה לאפיון חומרים מתקדמים של אוניברסיטת סינסינטי לצורך תמיכה.
Albumin from Bovine Serum (BSA), Texas Red conjugate | Thermo Fisher Scientific | A23017 | BSA staining to show micropatterns |
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7076S | Antibody used for western blot analysis |
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074S | Antibody used for western blot analysis |
BrdU | Thermo Fisher Scientific | B23151 | Reagent used to measure cell proliferation |
BrdU primary antibody conjugated with Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | B35130 | Used to visualize BrdU in cell proliferation assays |
Collagen I | Thermo Fisher Scientific | A10483-01 | Protein used to coat coverslips |
Compression force test machine | TestResources | Instrument to quantify mechanical properties of polymers | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | Cell culture medium |
Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | Cell culture medium supplemental |
Fibronectin | Thermo Fisher Scientific | 33010-018 | Protein used to coat coverslips |
Fluorescence microscope | Nikon | Eclipse Ti2 | Fluorescence microscope |
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Fisher Scientific | 78440 | Protease and Phosphatase Inhibitor |
Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017015 | Protein used to coat coverslips |
Mounting medium with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36971 | Coverslip mountant and nuclei staining |
Mouse c-Jun primary antibody | Thermo Fisher Scientific | 711202 | Primary antibody to visualize c-Jun protein |
Mouse β-Actin primary antibody | Cell Signaling Technology | 3700S | Loading control for western blot experiments |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Cell culture medium supplemental |
Photoresist SU 2010 | KAYAKU | SU8-2010 | Photoresist |
Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | P-2443 | Block non-specific protein binding |
Rabbit c-Jun primary antibody | Cell Signaling Technology | 9165S | Primary antibody for visualization of c-Jun protein |
Rabbit myelin basic protein primary antibody | Abcam | ab40390 | Primary antibody for visualization of MBP |
Rabbit p75NTR primary antibody | Cell Signaling Technology | 8238S | Primary antibody for visualization of p75NTR |
Rhodamine phalloidin | Thermo Fisher Scientific | R415 | Visualization of cell cytoskeleton |
RIPA buffer | Abcam | ab156034 | Cell lysis buffer |
RT4-D6P2T Schwann cell line | ATCC | CRL-2768 | Cell line used in experiments |
SYLGARD 184 PDMS base and curing agent | Sigma Aldrich | 761036 | Tunable polymer used to coat coverslips |
Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 15090-046 | Cell dissociation reagent |
UV-Ozone cleaner | Novascan | Increase hydrophicility of PDMS | |
Versene (1x) | Thermo Fisher Scientific | 15040066 | Cell dissociation reagent |