Summary

Utarbeidelse av justerbare ekstracellulære matrisemikromiljøer for å evaluere Schwann Cell Phenotype Specification

Published: June 02, 2020
doi:

Summary

Denne metodikken tar sikte på å illustrere mekanismene som ekstracellulære matrisesignaler som substratstivhet, proteinsammensetning og cellemorfologi regulerer Schwann celle (SC) fenotype.

Abstract

Traumatiske perifere nervesystemet (PNS) skader mangler for tiden egnede behandlinger for å gjenvinne full funksjonell gjenoppretting. Schwann celler (SCs), som de viktigste glial cellene i PNS, spiller en viktig rolle i å fremme PNS regenerering ved å dedifferentiating inn i en regenerativ celle fenotype etter skade. Den avdifferentiated tilstanden til SCer er imidlertid utfordrende å opprettholde gjennom tidsperioden som trengs for regenerering og påvirkes av endringer i den omkringliggende ekstracellulære matrisen (ECM). Derfor er det viktig å bestemme det komplekse samspillet mellom SCer og ulike ECM for å gi signaler om regenerativt potensial for SCer. For å løse dette ble det opprettet en strategi der forskjellige ECM-proteiner ble adsorbert på et tunable polydimethylsiloxane (PDMS) substrat som ga en plattform der stivhet og proteinsammensetning kan moduleres. SCer ble seedet på de justerbare substratene og kritiske cellulære funksjoner som representerer dynamikken i SC-fenotype ble målt. For å illustrere samspillet mellom SC protein uttrykk og cellulær morfologi, ulike seeding tettheter av SCs i tillegg til individuelle mikrokontakt trykte cellulære mønstre ble benyttet og preget av immunofluorescens farging og vestlige blot. Resultatene viste at celler med et mindre spredningsområde og høyere grad av cellulær forlengelse fremmet høyere nivåer av SC regenerative fenotypiske markører. Denne metodikken begynner ikke bare å løse det betydelige forholdet mellom ECM og cellulær funksjon av SCer, men gir også retningslinjer for fremtidig optimalisering av biomaterialer i perifer nervereparasjon.

Introduction

Perifere nervesystemet (PNS) skader forblir en stor klinisk utfordring i helsevesenet ved å kompromittere livskvaliteten for pasienter og skape en betydelig innvirkning gjennom en rekke sosioøkonomiske faktorer1,,2. Schwann celler (SC), som de viktigste glial cellene i PNS, gir nødvendige molekylære og fysiske signaler for å indusere PNS regenerering og hjelp til funksjonelle gjenopprettinger i korte gap skader. Dette skyldes den bemerkelsesverdige evnen til SCs å avdifferentiate i en “reparasjon” celle fenotype fra en myelinating eller Remak fenotype3. Reparasjons-SC er en særegen cellefenotype på flere måter. Etter skade øker SCer spredningsraten ved å gå inn i cellesyklusen igjen og begynne uttrykk for flere transkripsjonelle faktorer for å lette gjeninnjevning. Disse faktorene, for eksempel c-Jun og p75 NTR, er upregulert mens myelinating SC markører, for eksempel myelin grunnleggende protein (MBP), er downregulert4,5. I tillegg endrer SCs morfologi til å bli langstrakt og på linje med hverandre for å danne Büngner-bånd over skadestedet6. Dette gir en fysisk veiledningsmekanisme for at aksonene skal utvides til riktig distal mål7. Men til tross for evnen som SCs har til å fremme nerveregenerering i korte gapskader, er utfallet av funksjonell gjenoppretting fortsatt dårlig i alvorlige skader. Dette skyldes delvis tap av ekstracellulære matrise (ECM) veiledningssignaler, samt manglende evne til SCer for å opprettholde den regenerative fenotypen over lange perioder8.

Nerveregenerering og gjenopprettingsprosessen er nært knyttet til tilstanden til basal lamina etter skade. Basal lamina er et lag av ECM rundt nerven som letter veiledning og gir ECM-bundne signaler for aksoner og SCer i tilfeller der det forblir intakt etter skade9. Tilstanden til ECM og dens evne til å levere matrisebundne signaler til celler er svært viktig og har tidligere blitt utforsket i en rekke forskjellige sammenhenger10,11,12,13,14. Det har for eksempel vist seg at stivheten i ECM kan veilede cellefunksjoner som spredning og differensiering11,,15,,16. Sammensetning av ECM kan også føre til en distinkt cellulær respons og regulere celleatferd som migrering og differensiering gjennom intracellulære signalveier17,18. Videre spiller cellemorfologi, inkludert spredningsområde og cellulær forlengelse, en viktig rolle i reguleringen av funksjonen og kan styres av ECM-bundne signaler19,20. Mange tidligere studier har fokusert på stamceller som differensierer til definerte linjer, men SCs har en lignende evne til å endre fenotype fra en homeostatisk, voksen SC i en sunn nerve, til en reparasjon SC i stand til å skille ut proteiner og vekstfaktorer mens remodeling ECM etter nerveskade5,21. Derfor er det spesielt viktig å identifisere mekanismer som ligger til grunn for forholdet mellom den medfødte SC regenerative kapasiteten og ECM-bundne signaler for innsikten til slutt å utnytte denne kapasiteten for nerveregenerering.

For å løse dette har vi utviklet en detaljert metodikk for å produsere et cellekultursubstrat der mekanisk stivhet og ligandtype lett kan justeres i fysiologisk relevante områder. Polydimetyl siloxane (PDMS) ble valgt som et substrat på grunn av sin svært tunable mekanikk sammenlignet med polyakrylamid gel, hvor den maksimale Youngs modulus er rundt 12 kPa i kontrast til PDMS på rundt 1000 kPa22,23,24. Dette er gunstig for det forestående arbeidet, da nyere studier har vist at Youngs modulus av en kanin isjiasnerve kan overstige 50 kPa under utvikling, og dermed tyder på at omfanget av stivhet av nerver i PNS er bredere enn tidligere undersøkt. Ulike proteiner er i stand til adsorpsjon på PDMS-underlag for å analysere kombinatorisk regulering av mekanikk og ligander på SC-atferd. Dette gjør det mulig for undersøkelse av flere mikromiljøsignaler som finnes i PNS regenereringsprosessen og sammenligning av en høy grad av tunability til arbeidet med å fokusere utelukkende på stivhet i substratet25. Videre er disse konstruerte cellekultursubstratene kompatible med en rekke kvantitative analysemetoder som immunohistochemistry, vestlig blot og kvantitativ polymerasekjedereaksjon (q-PCR).

Denne konstruerte cellekulturplattformen er svært egnet for å analysere mekanistiske veier på grunn av det høye nivået av individuell tunability av hvert ECM-bundet signal. I tillegg kan populære metoder for cellemikring, inkludert mikrokontaktutskrift, oppnås på substratene for å tillate kontrollert cellulær vedheft å analysere celleform i forhold til andre ECM-bundne signaler24. Dette er avgjørende fordi linjemønstrede substrater, som fremmer forlengelse i cellepopulasjoner, gir et verktøy for å etterligne og studere langstrakte og regenerative SCer i Büngner-bånd under nerveregenerering. Videre er cellulær morfologi en potent regulator av flere cellefunksjoner og kan potensielt introdusere forvirrende eksperimentelle resultater hvis ikke kontrollert26,27. Det gis nå betydelig oppmerksomhet til mekanismene som styrer SC regenerativ fenotype som regulert av ECM-signaler28,,29,,30. Dette er viktig for å gi innsikt i utformingen av biomaterialer som kan brukes som nerveveiledningskanaler for hjelp i PNS nerveregenerering. Disse detaljerte protokollene kan til slutt brukes som et potensielt verktøy for å dechiffrere mekanismene til SC og annen celletypefunksjon som regulert av ECM-bundne signaler.

Protocol

1. Tunable celle kultur substrat forberedelse og karakterisering Substrat forberedelse Bland PDMS base elastomer og herdingsmidler ved hjelp av en pipettespiss kraftig i forholdet mellom 10:1 og 60:1 til boblene er homogent dispergert i blandingen. Fjern bobler ved hjelp av vakuumtørke til bobler forsvinner.MERK: Under PDMS polymerisering, herding agent krysskoblinger med basen elastomer for å gi endelig polymer ønskede mekaniske egenskaper. Crosslink-forhold kan justeres for ?…

Representative Results

For å analysere og kvantifisere samspillet mellom substratstivhet og proteinsammensetning på SC-fenotype, ble det utviklet et tunable PDMS cellekultursubstrat (figur 1A). Kompresjonstesting av polymeren ved forskjellig base: herdingsmiddelforhold ble benyttet til å kvantifisere Youngs modulus (E) av substratet (Figur 1B). Det resulterende utvalget av modulære verdier representerer fysiologisk relevante substratforhold. Etter utarbeidelse av substrater ble SC…

Discussion

SCs kan fremme nerve regenerering på grunn av deres fenotypiske transformasjon og regenerative potensial etter nerveskade. Men hvordan ECM-signaler regulerer denne regenerative kapasiteten forblir for det meste uklar, noe som potensielt hindrer ikke bare utviklingen av biomaterialer som tar sikte på å fremme nerveregenerering, men også forståelsen av mekanismene som er involvert i nerveregenerering. For å begynne å undersøke dette samspillet, ble cellekultur substrater opprettet der ECM-signaler som stivhet, prot…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne anerkjenner takknemlig finansieringsstøtte fra University of Cincinnati. Forfatterne takker også Ron Flenniken fra University of Cincinnati Advanced Materials Characterization laboratory for støtte.

Materials

Albumin from Bovine Serum (BSA), Texas Red conjugate Thermo Fisher Scientific A23017 BSA staining to show micropatterns
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7076S Antibody used for western blot analysis
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7074S Antibody used for western blot analysis
BrdU Thermo Fisher Scientific B23151 Reagent used to measure cell proliferation
BrdU primary antibody conjugated with Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific B35130 Used to visualize BrdU in cell proliferation assays
Collagen I Thermo Fisher Scientific A10483-01 Protein used to coat coverslips
Compression force test machine TestResources Instrument to quantify mechanical properties of polymers
Dulbecco's Modified Eagle Medium Thermo Fisher Scientific 11965092 Cell culture medium
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 16000044 Cell culture medium supplemental
Fibronectin Thermo Fisher Scientific 33010-018 Protein used to coat coverslips
Fluorescence microscope Nikon Eclipse Ti2 Fluorescence microscope
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) Thermo Fisher Scientific 78440 Protease and Phosphatase Inhibitor
Laminin Thermo Fisher Scientific 23017015 Protein used to coat coverslips
Mounting medium with DAPI Thermo Fisher Scientific P36971 Coverslip mountant and nuclei staining
Mouse c-Jun primary antibody Thermo Fisher Scientific 711202 Primary antibody to visualize c-Jun protein
Mouse β-Actin primary antibody Cell Signaling Technology 3700S Loading control for western blot experiments
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 Cell culture medium supplemental
Photoresist SU 2010 KAYAKU SU8-2010 Photoresist
Pluronic F-127 Sigma Aldrich P-2443 Block non-specific protein binding
Rabbit c-Jun primary antibody Cell Signaling Technology 9165S Primary antibody for visualization of c-Jun protein
Rabbit myelin basic protein primary antibody Abcam ab40390 Primary antibody for visualization of MBP
Rabbit p75NTR primary antibody Cell Signaling Technology 8238S Primary antibody for visualization of p75NTR
Rhodamine phalloidin Thermo Fisher Scientific R415 Visualization of cell cytoskeleton
RIPA buffer Abcam ab156034 Cell lysis buffer
RT4-D6P2T Schwann cell line ATCC CRL-2768 Cell line used in experiments
SYLGARD 184 PDMS base and curing agent Sigma Aldrich 761036 Tunable polymer used to coat coverslips
Trypsin Thermo Fisher Scientific 15090-046 Cell dissociation reagent
UV-Ozone cleaner Novascan Increase hydrophicility of PDMS
Versene (1x) Thermo Fisher Scientific 15040066 Cell dissociation reagent

References

  1. Taylor, C. A., Braza, D., Rice, J. B., Dillingham, T. The Incidence of Peripheral Nerve Injury in Extremity Trauma. American Journal of Physical Medicine & Rehabilitation. 87, 381-385 (2008).
  2. Noble, J., Munro, C. A., Prasad, V. S. S. V., Midha, R. Analysis of Upper and Lower Extremity Peripheral Nerve Injuries in a Population of Patients with Multiple Injuries. Journal of Trauma and Acute Care Surgery. 45, 116-122 (1998).
  3. Jessen, K. R., Mirsky, R. The repair Schwann cell and its function in regenerating nerves. Journal of Physiology. 594, 3521-3531 (2016).
  4. Arthur-Farraj, P. J., et al. c-Jun Reprograms Schwann Cells of Injured Nerves to Generate a Repair Cell Essential for Regeneration. Neuron. 75, 633-647 (2012).
  5. Jessen, K. R., Mirsky, R. The Success and Failure of the Schwann Cell Response to Nerve Injury. Frontiers in Cell Neurosciences. 13, 33 (2019).
  6. Gomez-Sanchez, J. A., et al. After Nerve Injury, Lineage Tracing Shows That Myelin and Remak Schwann Cells Elongate Extensively and Branch to Form Repair Schwann Cells, Which Shorten Radically on Remyelination. Journal of Neuroscience. 37 (37), 9086-9099 (2017).
  7. Deumens, R., et al. Repairing injured peripheral nerves: Bridging the gap. Progress in Neurobiology. 92, 245-276 (2010).
  8. Höke, A., Gordon, T., Zochodne, D. W., Sulaiman, O. A. R. A decline in glial cell-line-derived neurotrophic factor expression is associated with impaired regeneration after long-term Schwann cell denervation. Experimental Neurology. 173, 77-85 (2002).
  9. Jones, S., Eisenberg, H. M., Jia, X. Advances and future applications of augmented peripheral nerve regeneration. International Journal of Molecular Sciences. 17, 1-17 (2016).
  10. Harris, G. M., et al. Nerve Guidance by a Decellularized Fibroblast Extracellular Matrix. Matrix Biology. 60-61, 176-189 (2017).
  11. Harris, G. M., Piroli, M. E., Jabbarzadeh, E. Deconstructing the Effects of Matrix Elasticity and Geometry in Mesenchymal Stem Cell Lineage Commitment. Advanced Function Mater. 24 (16), 2396-2403 (2014).
  12. Pryzhkova, M. V., Harris, G. M., Ma, S., Jabbarzadeh, E. Patterning pluripotent stem cells at a single cell level. Journal of Biomaterials and Tissue Engineering. 3 (4), 461-471 (2013).
  13. Engler, A. J., Sweeney, H. L., Discher, D. E., Schwarzbauer, J. E. Extracellular matrix elasticity directs stem cell differentiation. Journal of Musculoskeleton and Neuronal Interaction. 7 (4), 335 (2007).
  14. Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
  15. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
  16. Pickup, M. W., Mouw, J. K., Weaver, V. M. The extracellular matrix modulates the hallmarks of cancer. EMBO Reports. 15, 1243-1253 (2014).
  17. Chernousov, M. A., Carey, D. J. Schwann cell extracellular matrix molecules and their receptors. Histology and Histopathology. 15, 593-601 (2000).
  18. Shibata, S., et al. Selective Laminin-Directed Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Distinct Ocular Lineages. Cell Reports. 25 (6), 1668-1679 (2018).
  19. Mcbeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell Shape, Cytoskeletal tenstion and RhoA regulate stem cell lineage committment. Developmental Cell. 6, 483-495 (2004).
  20. Halder, G., Dupont, S., Piccolo, S. Transduction of mechanical and cytoskeletal cues by YAP and TAZ. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13, 591-600 (2012).
  21. Jessen, K. R., Mirsky, R. The repair Schwann cell and its function in regenerating nerves. Journal of Physiology. 594 (13), 3521-3531 (2016).
  22. Lopez-Fagundo, C., Bar-Kochba, E., Livi, L. L., Hoffman-Kim, D., Franck, C. Three-dimensional traction forces of Schwann cells on compliant substrates. Journal of The Royal Society Interface. 11, 20140247 (2014).
  23. Gu, Y., et al. The influence of substrate stiffness on the behavior and functions of Schwann cells in culture. Biomaterials. 33, 6672-6681 (2012).
  24. Xu, Z. Y., Orkwis, J. A., DeVine, B. M., Harris, G. M. Extracellular matrix cues modulate Schwann cell morphology, proliferation, and protein expression. Journal of Tissue Engineering and Regenerative. , (2019).
  25. Urbanski, M. M., et al. Myelinating glia differentiation is regulated by extracellular matrix elasticity. Scientific Reports. 6, 1-12 (2016).
  26. Sun, Y., et al. Tunable stiffness of graphene oxide/polyacrylamide composite scaffolds regulates cytoskeleton assembly. Chemical Sciences. 9 (31), 6516-6522 (2018).
  27. Hwang, J. H., et al. Extracellular matrix stiffness regulates osteogenic differentiation through MAPK activation. PLoS One. 10, 1-16 (2015).
  28. Ryan, A. J., et al. A Physicochemically Optimized and Neuroconductive Biphasic Nerve Guidance Conduit for Peripheral Nerve Repair. Advanced Healthcare Materials. 6, 1-13 (2017).
  29. Du, J., et al. Prompt peripheral nerve regeneration induced by a hierarchically aligned fibrin nanofiber hydrogel. Acta Biomaterialia. 55, 296-309 (2017).
  30. Huang, L., et al. A compound scaffold with uniform longitudinally oriented guidance cues and a porous sheath promotes peripheral nerve regeneration in vivo. Acta Biomaterialia. 68, 223-236 (2018).
  31. Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices. Jouranl of Visualized Experiments. (119), e55276 (2017).
  32. Gupta, R., et al. Shear stress alters the expression of myelin-associated glycoprotein (MAG) and myelin basic protein (MBP) in Schwann cells. Journal of Orthopaedic Research : Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 23, 1232-1239 (2005).
  33. Harris, G. M., Shazly, T., Jabbarzadeh, E. Deciphering the combinatorial roles of geometric, mechanical, and adhesion cues in regulation of cell spreading. PLoS One. 8 (11), (2013).
  34. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  35. Schreck, I., et al. C-Jun localizes to the nucleus independent of its phosphorylation by and interaction with JNK and vice versa promotes nuclear accumulation of JNK. Biochemical and Biophysical Research Communications. 407, 735-740 (2011).
  36. Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact printing of proteins for cell biology. Journal Visualized Experiments. (22), e1065 (2008).
  37. Treter, J., et al. Washing-resistant surfactant coated surface is able to inhibit pathogenic bacteria adhesion. Applied Surface Science. 303, 147-154 (2014).
  38. Lutz, J. F. Polymerization of oligo(ethylene glycol) (meth)acrylates: Toward new generations of smart biocompatible materials. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 46 (11), 3459-3470 (2008).
  39. Marcus, M., et al. Interactions of Neurons with Physical Environments. Advanced Healthcare Materials. 6, (2017).
  40. Pu, J. Golgi polarization in a strong electric field. Journal of Cell Science. 118, 1117-1128 (2005).
  41. Blaker, J. J., et al. Bioactive Silk-Based Nerve Guidance Conduits for Augmenting Peripheral Nerve Repair. Advanced Healthcare Materials. 7, 1800308 (2018).
  42. Daly, W., Yao, L., Zeugolis, D., Windebank, A., Pandit, A. A biomaterials approach to peripheral nerve regeneration : bridging the peripheral nerve gap and enhancing functional recovery. Journal of the Royal Society of Interface. 9 (67), 202-221 (2012).
  43. Xia, H., et al. Directed neurite growth of rat dorsal root ganglion neurons and increased colocalization with Schwann cells on aligned poly(methyl methacrylate) electrospun nanofibers. Brain Research. 1565, 18-27 (2014).
  44. Wang, H. B., Mullins, M. E., Cregg, J. M., McCarthy, C. W., Gilbert, R. J. Varying the diameter of aligned electrospun fibers alters neurite outgrowth and Schwann cell migration. Acta Biomaterialia. 6, 2970-2978 (2010).
  45. Carvalho, C. R., Oliveira, J. M., Reis, R. L. Modern Trends for Peripheral Nerve Repair and Regeneration: Beyond the Hollow Nerve Guidance Conduit. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 337 (2019).
  46. Yang, Y., Wang, K., Gu, X., Leong, K. W. Biophysical Regulation of Cell Behavior – Cross Talk between Substrate Stiffness and Nanotopography. Engineering. 3, 36-54 (2017).
  47. Tan, J. L., Liu, W., Nelson, C. M., Raghavan, S., Chen, C. S. Simple Approach to Micropattern Cells on Common Culture Substrates by Tuning Substrate Wettability. Tissue Engineering. 10, 865-872 (2004).
  48. Grove, M., et al. YAP/TAZ initiate and maintain schwann cell myelination. Elife. 6, 1-27 (2017).
  49. Poitelon, Y., et al. YAP and TAZ control peripheral myelination and the expression of laminin receptors in Schwann cells. Nature Neuroscience. 19, 879-887 (2016).

Play Video

Cite This Article
Xu, Z., Orkwis, J. A., Harris, G. M. Preparation of Tunable Extracellular Matrix Microenvironments to Evaluate Schwann Cell Phenotype Specification. J. Vis. Exp. (160), e61496, doi:10.3791/61496 (2020).

View Video