Denne metodikken tar sikte på å illustrere mekanismene som ekstracellulære matrisesignaler som substratstivhet, proteinsammensetning og cellemorfologi regulerer Schwann celle (SC) fenotype.
Traumatiske perifere nervesystemet (PNS) skader mangler for tiden egnede behandlinger for å gjenvinne full funksjonell gjenoppretting. Schwann celler (SCs), som de viktigste glial cellene i PNS, spiller en viktig rolle i å fremme PNS regenerering ved å dedifferentiating inn i en regenerativ celle fenotype etter skade. Den avdifferentiated tilstanden til SCer er imidlertid utfordrende å opprettholde gjennom tidsperioden som trengs for regenerering og påvirkes av endringer i den omkringliggende ekstracellulære matrisen (ECM). Derfor er det viktig å bestemme det komplekse samspillet mellom SCer og ulike ECM for å gi signaler om regenerativt potensial for SCer. For å løse dette ble det opprettet en strategi der forskjellige ECM-proteiner ble adsorbert på et tunable polydimethylsiloxane (PDMS) substrat som ga en plattform der stivhet og proteinsammensetning kan moduleres. SCer ble seedet på de justerbare substratene og kritiske cellulære funksjoner som representerer dynamikken i SC-fenotype ble målt. For å illustrere samspillet mellom SC protein uttrykk og cellulær morfologi, ulike seeding tettheter av SCs i tillegg til individuelle mikrokontakt trykte cellulære mønstre ble benyttet og preget av immunofluorescens farging og vestlige blot. Resultatene viste at celler med et mindre spredningsområde og høyere grad av cellulær forlengelse fremmet høyere nivåer av SC regenerative fenotypiske markører. Denne metodikken begynner ikke bare å løse det betydelige forholdet mellom ECM og cellulær funksjon av SCer, men gir også retningslinjer for fremtidig optimalisering av biomaterialer i perifer nervereparasjon.
Perifere nervesystemet (PNS) skader forblir en stor klinisk utfordring i helsevesenet ved å kompromittere livskvaliteten for pasienter og skape en betydelig innvirkning gjennom en rekke sosioøkonomiske faktorer1,,2. Schwann celler (SC), som de viktigste glial cellene i PNS, gir nødvendige molekylære og fysiske signaler for å indusere PNS regenerering og hjelp til funksjonelle gjenopprettinger i korte gap skader. Dette skyldes den bemerkelsesverdige evnen til SCs å avdifferentiate i en “reparasjon” celle fenotype fra en myelinating eller Remak fenotype3. Reparasjons-SC er en særegen cellefenotype på flere måter. Etter skade øker SCer spredningsraten ved å gå inn i cellesyklusen igjen og begynne uttrykk for flere transkripsjonelle faktorer for å lette gjeninnjevning. Disse faktorene, for eksempel c-Jun og p75 NTR, er upregulert mens myelinating SC markører, for eksempel myelin grunnleggende protein (MBP), er downregulert4,5. I tillegg endrer SCs morfologi til å bli langstrakt og på linje med hverandre for å danne Büngner-bånd over skadestedet6. Dette gir en fysisk veiledningsmekanisme for at aksonene skal utvides til riktig distal mål7. Men til tross for evnen som SCs har til å fremme nerveregenerering i korte gapskader, er utfallet av funksjonell gjenoppretting fortsatt dårlig i alvorlige skader. Dette skyldes delvis tap av ekstracellulære matrise (ECM) veiledningssignaler, samt manglende evne til SCer for å opprettholde den regenerative fenotypen over lange perioder8.
Nerveregenerering og gjenopprettingsprosessen er nært knyttet til tilstanden til basal lamina etter skade. Basal lamina er et lag av ECM rundt nerven som letter veiledning og gir ECM-bundne signaler for aksoner og SCer i tilfeller der det forblir intakt etter skade9. Tilstanden til ECM og dens evne til å levere matrisebundne signaler til celler er svært viktig og har tidligere blitt utforsket i en rekke forskjellige sammenhenger10,11,12,13,14. Det har for eksempel vist seg at stivheten i ECM kan veilede cellefunksjoner som spredning og differensiering11,,15,,16. Sammensetning av ECM kan også føre til en distinkt cellulær respons og regulere celleatferd som migrering og differensiering gjennom intracellulære signalveier17,18. Videre spiller cellemorfologi, inkludert spredningsområde og cellulær forlengelse, en viktig rolle i reguleringen av funksjonen og kan styres av ECM-bundne signaler19,20. Mange tidligere studier har fokusert på stamceller som differensierer til definerte linjer, men SCs har en lignende evne til å endre fenotype fra en homeostatisk, voksen SC i en sunn nerve, til en reparasjon SC i stand til å skille ut proteiner og vekstfaktorer mens remodeling ECM etter nerveskade5,21. Derfor er det spesielt viktig å identifisere mekanismer som ligger til grunn for forholdet mellom den medfødte SC regenerative kapasiteten og ECM-bundne signaler for innsikten til slutt å utnytte denne kapasiteten for nerveregenerering.
For å løse dette har vi utviklet en detaljert metodikk for å produsere et cellekultursubstrat der mekanisk stivhet og ligandtype lett kan justeres i fysiologisk relevante områder. Polydimetyl siloxane (PDMS) ble valgt som et substrat på grunn av sin svært tunable mekanikk sammenlignet med polyakrylamid gel, hvor den maksimale Youngs modulus er rundt 12 kPa i kontrast til PDMS på rundt 1000 kPa22,23,24. Dette er gunstig for det forestående arbeidet, da nyere studier har vist at Youngs modulus av en kanin isjiasnerve kan overstige 50 kPa under utvikling, og dermed tyder på at omfanget av stivhet av nerver i PNS er bredere enn tidligere undersøkt. Ulike proteiner er i stand til adsorpsjon på PDMS-underlag for å analysere kombinatorisk regulering av mekanikk og ligander på SC-atferd. Dette gjør det mulig for undersøkelse av flere mikromiljøsignaler som finnes i PNS regenereringsprosessen og sammenligning av en høy grad av tunability til arbeidet med å fokusere utelukkende på stivhet i substratet25. Videre er disse konstruerte cellekultursubstratene kompatible med en rekke kvantitative analysemetoder som immunohistochemistry, vestlig blot og kvantitativ polymerasekjedereaksjon (q-PCR).
Denne konstruerte cellekulturplattformen er svært egnet for å analysere mekanistiske veier på grunn av det høye nivået av individuell tunability av hvert ECM-bundet signal. I tillegg kan populære metoder for cellemikring, inkludert mikrokontaktutskrift, oppnås på substratene for å tillate kontrollert cellulær vedheft å analysere celleform i forhold til andre ECM-bundne signaler24. Dette er avgjørende fordi linjemønstrede substrater, som fremmer forlengelse i cellepopulasjoner, gir et verktøy for å etterligne og studere langstrakte og regenerative SCer i Büngner-bånd under nerveregenerering. Videre er cellulær morfologi en potent regulator av flere cellefunksjoner og kan potensielt introdusere forvirrende eksperimentelle resultater hvis ikke kontrollert26,27. Det gis nå betydelig oppmerksomhet til mekanismene som styrer SC regenerativ fenotype som regulert av ECM-signaler28,,29,,30. Dette er viktig for å gi innsikt i utformingen av biomaterialer som kan brukes som nerveveiledningskanaler for hjelp i PNS nerveregenerering. Disse detaljerte protokollene kan til slutt brukes som et potensielt verktøy for å dechiffrere mekanismene til SC og annen celletypefunksjon som regulert av ECM-bundne signaler.
SCs kan fremme nerve regenerering på grunn av deres fenotypiske transformasjon og regenerative potensial etter nerveskade. Men hvordan ECM-signaler regulerer denne regenerative kapasiteten forblir for det meste uklar, noe som potensielt hindrer ikke bare utviklingen av biomaterialer som tar sikte på å fremme nerveregenerering, men også forståelsen av mekanismene som er involvert i nerveregenerering. For å begynne å undersøke dette samspillet, ble cellekultur substrater opprettet der ECM-signaler som stivhet, prot…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne anerkjenner takknemlig finansieringsstøtte fra University of Cincinnati. Forfatterne takker også Ron Flenniken fra University of Cincinnati Advanced Materials Characterization laboratory for støtte.
Albumin from Bovine Serum (BSA), Texas Red conjugate | Thermo Fisher Scientific | A23017 | BSA staining to show micropatterns |
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7076S | Antibody used for western blot analysis |
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074S | Antibody used for western blot analysis |
BrdU | Thermo Fisher Scientific | B23151 | Reagent used to measure cell proliferation |
BrdU primary antibody conjugated with Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | B35130 | Used to visualize BrdU in cell proliferation assays |
Collagen I | Thermo Fisher Scientific | A10483-01 | Protein used to coat coverslips |
Compression force test machine | TestResources | Instrument to quantify mechanical properties of polymers | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | Cell culture medium |
Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | Cell culture medium supplemental |
Fibronectin | Thermo Fisher Scientific | 33010-018 | Protein used to coat coverslips |
Fluorescence microscope | Nikon | Eclipse Ti2 | Fluorescence microscope |
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Fisher Scientific | 78440 | Protease and Phosphatase Inhibitor |
Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017015 | Protein used to coat coverslips |
Mounting medium with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36971 | Coverslip mountant and nuclei staining |
Mouse c-Jun primary antibody | Thermo Fisher Scientific | 711202 | Primary antibody to visualize c-Jun protein |
Mouse β-Actin primary antibody | Cell Signaling Technology | 3700S | Loading control for western blot experiments |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Cell culture medium supplemental |
Photoresist SU 2010 | KAYAKU | SU8-2010 | Photoresist |
Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | P-2443 | Block non-specific protein binding |
Rabbit c-Jun primary antibody | Cell Signaling Technology | 9165S | Primary antibody for visualization of c-Jun protein |
Rabbit myelin basic protein primary antibody | Abcam | ab40390 | Primary antibody for visualization of MBP |
Rabbit p75NTR primary antibody | Cell Signaling Technology | 8238S | Primary antibody for visualization of p75NTR |
Rhodamine phalloidin | Thermo Fisher Scientific | R415 | Visualization of cell cytoskeleton |
RIPA buffer | Abcam | ab156034 | Cell lysis buffer |
RT4-D6P2T Schwann cell line | ATCC | CRL-2768 | Cell line used in experiments |
SYLGARD 184 PDMS base and curing agent | Sigma Aldrich | 761036 | Tunable polymer used to coat coverslips |
Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 15090-046 | Cell dissociation reagent |
UV-Ozone cleaner | Novascan | Increase hydrophicility of PDMS | |
Versene (1x) | Thermo Fisher Scientific | 15040066 | Cell dissociation reagent |