Summary

Beredning av Tunable Extracellular Matrix Microenvironments att utvärdera Schwann Cell Fenotyp Specifikation

Published: June 02, 2020
doi:

Summary

Denna metod syftar till att illustrera de mekanismer genom vilka extracellulära matris ledtrådar såsom substrat stelhet, protein sammansättning och cell morfologi reglera Schwann cell (SC) fenotyp.

Abstract

Traumatiska perifera nervsystemet (PNS) skador saknar för närvarande lämpliga behandlingar för att återfå full funktionell återhämtning. Schwann celler (SCs), som de viktigaste gliacellerna i PNS, spelar en viktig roll för att främja PNS förnyelse genom att dedifferentiating till en regenerativ cell fenotyp efter skada. Dedifferentierade tillståndet för betydande betydande betydande information är dock en utmaning att upprätthålla genom den tidsperiod som krävs för regenerering och påverkas av förändringar i den omgivande extracellulära matrisen (ECM). Därför är det viktigt att fastställa det komplexa samspelet mellan de rådgivande centralföretag och olika ECM för att tillhandahålla signaler om regenerativ potential hos de centralföretagare som är avgörande. För att ta itu med detta skapades en strategi där olika ECM-proteiner adsorbelades på ett avstämt polydimetylsiloxansubstrat (PDMS) som gav en plattform där styvhet och proteinsammansättning kan moduleras. SCs seeds på den oförstämda substrat och kritiska cellulära funktioner som representerar dynamiken i SC fenotyp mättes. För att illustrera samspelet mellan SC protein uttryck och cellulära morfologi, olika sådd tätheter av SCs utöver enskilda microcontact tryckta cellulära mönster utnyttjades och kännetecknas av immunofluorescens färgning och västra blot. Resultaten visade att celler med en mindre spridning område och högre utsträckning av cellulära töjning främjas högre nivåer av SC regenerativ fenotypiska markörer. Denna metod börjar inte bara att reda ut det betydande förhållandet mellan ECM och cellulära funktion avCS, men ger också riktlinjer för framtida optimering av biomaterial i perifera nerv reparation.

Introduction

Skador på perifera nervsystemet (PNS) är fortfarande en stor klinisk utmaning inom hälso- och sjukvården genom att äventyra livskvaliteten för patienterna och skapa en betydande inverkan genom en mängd socioekonomiska faktorer1,2. Schwann celler (SC), som de viktigaste gliaceller i PNS, ge nödvändiga molekylära och fysiska ledtrådar för att inducera PNS förnyelse och stöd i funktionella återvinningar i korta gap skador. Detta beror på den anmärkningsvärda förmågan hos SCs att dedifferentiera till en “reparation” cell fenotyp från en myelinating eller Remak fenotyp3. Reparationen SC är en distinkt cell fenotyp på flera sätt. Efter skada, SCs öka sin spridning genom att åter komma in i cellcykeln och börja uttryck för flera transkriptionella faktorer för att underlätta reinnervation. Dessa faktorer, såsom c-Jun och p75 NTR, är uppreglerade medan myelinating SC markörer, såsom myelin grundläggande protein (MBP), är downregulated4,5. Dessutom ändrar SCs morfologi för att bli långsträckt och i linje med varandra för att bilda Büngner band över skadeområdet6. Detta ger en fysisk vägledningsmekanism för axoner att utvidgas till rätt distala mål7. Men trots förmågan att SCs har att främja nerv regenerering i korta gap skador, resultatet av funktionell återhämtning är fortfarande dålig i svåra skador. Detta beror delvis på en förlust av extracellulär matris (ECM) vägledning ledtrådar, liksom oförmågacs att upprätthålla regenerativ fenotyp under långa tidsperioder8.

Nervregenerering och återhämtningsprocessen är intimt knutna till tillståndet i den basala lamina efter skada. Den basala lamina är ett lager av ECM runt nerven som underlättar vägledning och ger ECM-bundna ledtrådar för axoner och SCs i de fall där det förblir intakt efter skada9. Tillståndet för ECM och dess förmåga att leverera matris bundna ledtrådar till celler är mycket viktigt och har tidigare undersökts i en mängd olika sammanhang10,11,12,13,14. Det har till exempel visats att styvheten i ECM kan styra cellfunktioner som spridning och differentiering11,15,16. Sammansättningen av ECM kan också leda till ett distinkt cellulärt svar och reglera cellbeteenden som migration och differentiering genom intracellulära signalvägar17,18. Dessutom spelar cellmorfologi, inklusive spridningsområde och cellulär töjning, en viktig roll i regleringen av funktionen och kan styras av ECM-bundna signaler19,20. Många tidigare studier har fokuserat på stamceller som skiljer sig till definierade härstamningar, men SCs har en liknande förmåga att ändra fenotyp från en homeostatisk, vuxen SC inom en frisk nerv, till en reparation SC kan utsöndra proteiner och tillväxtfaktorer medan remodeling ECM efter nervskada5,21. Därför är det särskilt viktigt att identifiera mekanismer som ligger till grund för förhållandet mellan den medfödda SC regenerativ kapacitet och ECM bundna ledtrådar för insikten att i slutändan utnyttja denna kapacitet för nervregenerering.

För att åtgärda detta har vi utvecklat en detaljerad metod för att ta fram ett cellodlingssubstrat där mekanisk styvhet och ligandtyp enkelt kan justeras i fysiologiskt relevanta områden. Polydi metylsiloxan (PDMS) valdes som substrat på grund av dess mycket avstämbara mekanik jämfört med polyakrylamidgel, där den maximala Youngs modul är cirka 12 kPa kontrasterad till PDMS på omkring 1000 kPa22,23,24. Detta är fördelaktigt för det arbete som finns, eftersom nyligen genomförda studier har visat att Youngs modulus av en kanin ischiasnerven kan överstiga 50 kPa under utveckling, vilket tyder på att utbudet av stelhet av nerver inom PNS är bredare än tidigare undersökts. Olika proteiner kan adsorption på PDMS substrat för att analysera kombinatorisk reglering av mekanik och ligander på SC beteende. Detta gör det möjligt för undersökning av flera mikromiljö signaler som finns i PNS regenereringsprocessen och jämförelse av en hög grad av tunability till arbetet fokuserar enbart på styvhet av substratet25. Vidare är dessa konstruerade cellodlingssubstrat kompatibla med en mängd kvantitativa analysmetoder som immunohistokemi, västra blot och kvantitativ polymeraskedjereaktion (q-PCR).

Denna konstruerade cellodlingsplattform är mycket lämplig för att analysera mekanistiska vägar på grund av den höga individuella tunabilityen hos varje ECM-bunden signal. Dessutom kan populära metoder för cellmikromönster, inklusive mikrokontakter, uppnås på substraten för att möjliggöra kontrollerad cellvidhäftning för att analysera cellform i förhållande till andra ECM bundna signaler24. Detta är avgörande eftersom linjemönstrade substrat, som främjar töjning i cellpopulationer, ger ett verktyg för att efterlikna och studera långsträckta och regenerativa SCs inom Büngner band under nervregenerering. Vidare, cellulär morfologi är en potent regulator av flera cellfunktioner och kan potentiellt införa förvirrande experimentella resultat om inte kontrolleras26,27. Betydande uppmärksamhet ägnas nu åt de mekanismer som styr SC regenerativ fenotyp som regleras av ECM cues28,29,30. Detta är viktigt för att ge insikt i utformningen av biomaterial som kan tillämpas som nerv vägledning ledningar för stöd i PNS nerv regenerering. Dessa detaljerade protokoll kan i slutändan tillämpas som ett potentiellt verktyg för att dechiffrera mekanismerna för SC och andra celltyp funktion som regleras av ECM bundna ledtrådar.

Protocol

1. Sunable cellodling substrat förberedelse och karakterisering Substratberedning Blanda PDMS bas elastomer och härdningsmedel med hjälp av en pipett spets kraftigt i ett förhållande mellan 10:1 och 60:1 tills bubblor är homogent spridda i blandningen. Ta bort bubblor med vakuum uttorkning tills bubblor skingras.OBS: Under PDMS polymerisation, härdningsmedel tvärbindningar med basen elastomer för att ge slutliga polymer önskade mekaniska egenskaper. Tvärlänksförhålla…

Representative Results

För att analysera och kvantifiera samspelet mellan substratstyvhet och proteinsammansättning på SC-fenotyp utvecklades ett avstämt PDMS-cellodlingssubstrat (figur 1A). Kompressionstestning av polymeren vid olika bas: härdningsmedelsförhållanden användes för att kvantifiera Youngs modulus (E) av substratet (figur 1B). Det resulterande intervallet av modulvärden representerar fysiologiskt relevanta substratförhållanden. Efter beredning av substrat, var…

Discussion

SCs kan främja nerv regenerering på grund av deras fenotypiska omvandling och regenerativ potential efter nerv skada. Men hur ECM signaler reglerar denna regenerativa kapacitet är fortfarande mestadels oklart, potentiellt hindrar inte bara utvecklingen av biomaterial som syftar till att främja nervregenerering men också förståelsen av de mekanismer som är involverade i nervregenerering. För att börja undersöka detta samspel, cellkultur substrat skapades där ECM ledtrådar såsom styvhet, protein beläggning, …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Författarna erkänner tacksamt finansiering stöd från universitetet i Cincinnati. Författarna tackar också Ron Flenniken vid University of Cincinnati Advanced Materials Characterization laboratory för stöd.

Materials

Albumin from Bovine Serum (BSA), Texas Red conjugate Thermo Fisher Scientific A23017 BSA staining to show micropatterns
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7076S Antibody used for western blot analysis
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7074S Antibody used for western blot analysis
BrdU Thermo Fisher Scientific B23151 Reagent used to measure cell proliferation
BrdU primary antibody conjugated with Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific B35130 Used to visualize BrdU in cell proliferation assays
Collagen I Thermo Fisher Scientific A10483-01 Protein used to coat coverslips
Compression force test machine TestResources Instrument to quantify mechanical properties of polymers
Dulbecco's Modified Eagle Medium Thermo Fisher Scientific 11965092 Cell culture medium
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 16000044 Cell culture medium supplemental
Fibronectin Thermo Fisher Scientific 33010-018 Protein used to coat coverslips
Fluorescence microscope Nikon Eclipse Ti2 Fluorescence microscope
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) Thermo Fisher Scientific 78440 Protease and Phosphatase Inhibitor
Laminin Thermo Fisher Scientific 23017015 Protein used to coat coverslips
Mounting medium with DAPI Thermo Fisher Scientific P36971 Coverslip mountant and nuclei staining
Mouse c-Jun primary antibody Thermo Fisher Scientific 711202 Primary antibody to visualize c-Jun protein
Mouse β-Actin primary antibody Cell Signaling Technology 3700S Loading control for western blot experiments
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 Cell culture medium supplemental
Photoresist SU 2010 KAYAKU SU8-2010 Photoresist
Pluronic F-127 Sigma Aldrich P-2443 Block non-specific protein binding
Rabbit c-Jun primary antibody Cell Signaling Technology 9165S Primary antibody for visualization of c-Jun protein
Rabbit myelin basic protein primary antibody Abcam ab40390 Primary antibody for visualization of MBP
Rabbit p75NTR primary antibody Cell Signaling Technology 8238S Primary antibody for visualization of p75NTR
Rhodamine phalloidin Thermo Fisher Scientific R415 Visualization of cell cytoskeleton
RIPA buffer Abcam ab156034 Cell lysis buffer
RT4-D6P2T Schwann cell line ATCC CRL-2768 Cell line used in experiments
SYLGARD 184 PDMS base and curing agent Sigma Aldrich 761036 Tunable polymer used to coat coverslips
Trypsin Thermo Fisher Scientific 15090-046 Cell dissociation reagent
UV-Ozone cleaner Novascan Increase hydrophicility of PDMS
Versene (1x) Thermo Fisher Scientific 15040066 Cell dissociation reagent

References

  1. Taylor, C. A., Braza, D., Rice, J. B., Dillingham, T. The Incidence of Peripheral Nerve Injury in Extremity Trauma. American Journal of Physical Medicine & Rehabilitation. 87, 381-385 (2008).
  2. Noble, J., Munro, C. A., Prasad, V. S. S. V., Midha, R. Analysis of Upper and Lower Extremity Peripheral Nerve Injuries in a Population of Patients with Multiple Injuries. Journal of Trauma and Acute Care Surgery. 45, 116-122 (1998).
  3. Jessen, K. R., Mirsky, R. The repair Schwann cell and its function in regenerating nerves. Journal of Physiology. 594, 3521-3531 (2016).
  4. Arthur-Farraj, P. J., et al. c-Jun Reprograms Schwann Cells of Injured Nerves to Generate a Repair Cell Essential for Regeneration. Neuron. 75, 633-647 (2012).
  5. Jessen, K. R., Mirsky, R. The Success and Failure of the Schwann Cell Response to Nerve Injury. Frontiers in Cell Neurosciences. 13, 33 (2019).
  6. Gomez-Sanchez, J. A., et al. After Nerve Injury, Lineage Tracing Shows That Myelin and Remak Schwann Cells Elongate Extensively and Branch to Form Repair Schwann Cells, Which Shorten Radically on Remyelination. Journal of Neuroscience. 37 (37), 9086-9099 (2017).
  7. Deumens, R., et al. Repairing injured peripheral nerves: Bridging the gap. Progress in Neurobiology. 92, 245-276 (2010).
  8. Höke, A., Gordon, T., Zochodne, D. W., Sulaiman, O. A. R. A decline in glial cell-line-derived neurotrophic factor expression is associated with impaired regeneration after long-term Schwann cell denervation. Experimental Neurology. 173, 77-85 (2002).
  9. Jones, S., Eisenberg, H. M., Jia, X. Advances and future applications of augmented peripheral nerve regeneration. International Journal of Molecular Sciences. 17, 1-17 (2016).
  10. Harris, G. M., et al. Nerve Guidance by a Decellularized Fibroblast Extracellular Matrix. Matrix Biology. 60-61, 176-189 (2017).
  11. Harris, G. M., Piroli, M. E., Jabbarzadeh, E. Deconstructing the Effects of Matrix Elasticity and Geometry in Mesenchymal Stem Cell Lineage Commitment. Advanced Function Mater. 24 (16), 2396-2403 (2014).
  12. Pryzhkova, M. V., Harris, G. M., Ma, S., Jabbarzadeh, E. Patterning pluripotent stem cells at a single cell level. Journal of Biomaterials and Tissue Engineering. 3 (4), 461-471 (2013).
  13. Engler, A. J., Sweeney, H. L., Discher, D. E., Schwarzbauer, J. E. Extracellular matrix elasticity directs stem cell differentiation. Journal of Musculoskeleton and Neuronal Interaction. 7 (4), 335 (2007).
  14. Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
  15. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
  16. Pickup, M. W., Mouw, J. K., Weaver, V. M. The extracellular matrix modulates the hallmarks of cancer. EMBO Reports. 15, 1243-1253 (2014).
  17. Chernousov, M. A., Carey, D. J. Schwann cell extracellular matrix molecules and their receptors. Histology and Histopathology. 15, 593-601 (2000).
  18. Shibata, S., et al. Selective Laminin-Directed Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Distinct Ocular Lineages. Cell Reports. 25 (6), 1668-1679 (2018).
  19. Mcbeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell Shape, Cytoskeletal tenstion and RhoA regulate stem cell lineage committment. Developmental Cell. 6, 483-495 (2004).
  20. Halder, G., Dupont, S., Piccolo, S. Transduction of mechanical and cytoskeletal cues by YAP and TAZ. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13, 591-600 (2012).
  21. Jessen, K. R., Mirsky, R. The repair Schwann cell and its function in regenerating nerves. Journal of Physiology. 594 (13), 3521-3531 (2016).
  22. Lopez-Fagundo, C., Bar-Kochba, E., Livi, L. L., Hoffman-Kim, D., Franck, C. Three-dimensional traction forces of Schwann cells on compliant substrates. Journal of The Royal Society Interface. 11, 20140247 (2014).
  23. Gu, Y., et al. The influence of substrate stiffness on the behavior and functions of Schwann cells in culture. Biomaterials. 33, 6672-6681 (2012).
  24. Xu, Z. Y., Orkwis, J. A., DeVine, B. M., Harris, G. M. Extracellular matrix cues modulate Schwann cell morphology, proliferation, and protein expression. Journal of Tissue Engineering and Regenerative. , (2019).
  25. Urbanski, M. M., et al. Myelinating glia differentiation is regulated by extracellular matrix elasticity. Scientific Reports. 6, 1-12 (2016).
  26. Sun, Y., et al. Tunable stiffness of graphene oxide/polyacrylamide composite scaffolds regulates cytoskeleton assembly. Chemical Sciences. 9 (31), 6516-6522 (2018).
  27. Hwang, J. H., et al. Extracellular matrix stiffness regulates osteogenic differentiation through MAPK activation. PLoS One. 10, 1-16 (2015).
  28. Ryan, A. J., et al. A Physicochemically Optimized and Neuroconductive Biphasic Nerve Guidance Conduit for Peripheral Nerve Repair. Advanced Healthcare Materials. 6, 1-13 (2017).
  29. Du, J., et al. Prompt peripheral nerve regeneration induced by a hierarchically aligned fibrin nanofiber hydrogel. Acta Biomaterialia. 55, 296-309 (2017).
  30. Huang, L., et al. A compound scaffold with uniform longitudinally oriented guidance cues and a porous sheath promotes peripheral nerve regeneration in vivo. Acta Biomaterialia. 68, 223-236 (2018).
  31. Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices. Jouranl of Visualized Experiments. (119), e55276 (2017).
  32. Gupta, R., et al. Shear stress alters the expression of myelin-associated glycoprotein (MAG) and myelin basic protein (MBP) in Schwann cells. Journal of Orthopaedic Research : Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 23, 1232-1239 (2005).
  33. Harris, G. M., Shazly, T., Jabbarzadeh, E. Deciphering the combinatorial roles of geometric, mechanical, and adhesion cues in regulation of cell spreading. PLoS One. 8 (11), (2013).
  34. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  35. Schreck, I., et al. C-Jun localizes to the nucleus independent of its phosphorylation by and interaction with JNK and vice versa promotes nuclear accumulation of JNK. Biochemical and Biophysical Research Communications. 407, 735-740 (2011).
  36. Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact printing of proteins for cell biology. Journal Visualized Experiments. (22), e1065 (2008).
  37. Treter, J., et al. Washing-resistant surfactant coated surface is able to inhibit pathogenic bacteria adhesion. Applied Surface Science. 303, 147-154 (2014).
  38. Lutz, J. F. Polymerization of oligo(ethylene glycol) (meth)acrylates: Toward new generations of smart biocompatible materials. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 46 (11), 3459-3470 (2008).
  39. Marcus, M., et al. Interactions of Neurons with Physical Environments. Advanced Healthcare Materials. 6, (2017).
  40. Pu, J. Golgi polarization in a strong electric field. Journal of Cell Science. 118, 1117-1128 (2005).
  41. Blaker, J. J., et al. Bioactive Silk-Based Nerve Guidance Conduits for Augmenting Peripheral Nerve Repair. Advanced Healthcare Materials. 7, 1800308 (2018).
  42. Daly, W., Yao, L., Zeugolis, D., Windebank, A., Pandit, A. A biomaterials approach to peripheral nerve regeneration : bridging the peripheral nerve gap and enhancing functional recovery. Journal of the Royal Society of Interface. 9 (67), 202-221 (2012).
  43. Xia, H., et al. Directed neurite growth of rat dorsal root ganglion neurons and increased colocalization with Schwann cells on aligned poly(methyl methacrylate) electrospun nanofibers. Brain Research. 1565, 18-27 (2014).
  44. Wang, H. B., Mullins, M. E., Cregg, J. M., McCarthy, C. W., Gilbert, R. J. Varying the diameter of aligned electrospun fibers alters neurite outgrowth and Schwann cell migration. Acta Biomaterialia. 6, 2970-2978 (2010).
  45. Carvalho, C. R., Oliveira, J. M., Reis, R. L. Modern Trends for Peripheral Nerve Repair and Regeneration: Beyond the Hollow Nerve Guidance Conduit. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 337 (2019).
  46. Yang, Y., Wang, K., Gu, X., Leong, K. W. Biophysical Regulation of Cell Behavior – Cross Talk between Substrate Stiffness and Nanotopography. Engineering. 3, 36-54 (2017).
  47. Tan, J. L., Liu, W., Nelson, C. M., Raghavan, S., Chen, C. S. Simple Approach to Micropattern Cells on Common Culture Substrates by Tuning Substrate Wettability. Tissue Engineering. 10, 865-872 (2004).
  48. Grove, M., et al. YAP/TAZ initiate and maintain schwann cell myelination. Elife. 6, 1-27 (2017).
  49. Poitelon, Y., et al. YAP and TAZ control peripheral myelination and the expression of laminin receptors in Schwann cells. Nature Neuroscience. 19, 879-887 (2016).

Play Video

Cite This Article
Xu, Z., Orkwis, J. A., Harris, G. M. Preparation of Tunable Extracellular Matrix Microenvironments to Evaluate Schwann Cell Phenotype Specification. J. Vis. Exp. (160), e61496, doi:10.3791/61496 (2020).

View Video