Denna metod syftar till att illustrera de mekanismer genom vilka extracellulära matris ledtrådar såsom substrat stelhet, protein sammansättning och cell morfologi reglera Schwann cell (SC) fenotyp.
Traumatiska perifera nervsystemet (PNS) skador saknar för närvarande lämpliga behandlingar för att återfå full funktionell återhämtning. Schwann celler (SCs), som de viktigaste gliacellerna i PNS, spelar en viktig roll för att främja PNS förnyelse genom att dedifferentiating till en regenerativ cell fenotyp efter skada. Dedifferentierade tillståndet för betydande betydande betydande information är dock en utmaning att upprätthålla genom den tidsperiod som krävs för regenerering och påverkas av förändringar i den omgivande extracellulära matrisen (ECM). Därför är det viktigt att fastställa det komplexa samspelet mellan de rådgivande centralföretag och olika ECM för att tillhandahålla signaler om regenerativ potential hos de centralföretagare som är avgörande. För att ta itu med detta skapades en strategi där olika ECM-proteiner adsorbelades på ett avstämt polydimetylsiloxansubstrat (PDMS) som gav en plattform där styvhet och proteinsammansättning kan moduleras. SCs seeds på den oförstämda substrat och kritiska cellulära funktioner som representerar dynamiken i SC fenotyp mättes. För att illustrera samspelet mellan SC protein uttryck och cellulära morfologi, olika sådd tätheter av SCs utöver enskilda microcontact tryckta cellulära mönster utnyttjades och kännetecknas av immunofluorescens färgning och västra blot. Resultaten visade att celler med en mindre spridning område och högre utsträckning av cellulära töjning främjas högre nivåer av SC regenerativ fenotypiska markörer. Denna metod börjar inte bara att reda ut det betydande förhållandet mellan ECM och cellulära funktion avCS, men ger också riktlinjer för framtida optimering av biomaterial i perifera nerv reparation.
Skador på perifera nervsystemet (PNS) är fortfarande en stor klinisk utmaning inom hälso- och sjukvården genom att äventyra livskvaliteten för patienterna och skapa en betydande inverkan genom en mängd socioekonomiska faktorer1,2. Schwann celler (SC), som de viktigaste gliaceller i PNS, ge nödvändiga molekylära och fysiska ledtrådar för att inducera PNS förnyelse och stöd i funktionella återvinningar i korta gap skador. Detta beror på den anmärkningsvärda förmågan hos SCs att dedifferentiera till en “reparation” cell fenotyp från en myelinating eller Remak fenotyp3. Reparationen SC är en distinkt cell fenotyp på flera sätt. Efter skada, SCs öka sin spridning genom att åter komma in i cellcykeln och börja uttryck för flera transkriptionella faktorer för att underlätta reinnervation. Dessa faktorer, såsom c-Jun och p75 NTR, är uppreglerade medan myelinating SC markörer, såsom myelin grundläggande protein (MBP), är downregulated4,5. Dessutom ändrar SCs morfologi för att bli långsträckt och i linje med varandra för att bilda Büngner band över skadeområdet6. Detta ger en fysisk vägledningsmekanism för axoner att utvidgas till rätt distala mål7. Men trots förmågan att SCs har att främja nerv regenerering i korta gap skador, resultatet av funktionell återhämtning är fortfarande dålig i svåra skador. Detta beror delvis på en förlust av extracellulär matris (ECM) vägledning ledtrådar, liksom oförmågacs att upprätthålla regenerativ fenotyp under långa tidsperioder8.
Nervregenerering och återhämtningsprocessen är intimt knutna till tillståndet i den basala lamina efter skada. Den basala lamina är ett lager av ECM runt nerven som underlättar vägledning och ger ECM-bundna ledtrådar för axoner och SCs i de fall där det förblir intakt efter skada9. Tillståndet för ECM och dess förmåga att leverera matris bundna ledtrådar till celler är mycket viktigt och har tidigare undersökts i en mängd olika sammanhang10,11,12,13,14. Det har till exempel visats att styvheten i ECM kan styra cellfunktioner som spridning och differentiering11,15,16. Sammansättningen av ECM kan också leda till ett distinkt cellulärt svar och reglera cellbeteenden som migration och differentiering genom intracellulära signalvägar17,18. Dessutom spelar cellmorfologi, inklusive spridningsområde och cellulär töjning, en viktig roll i regleringen av funktionen och kan styras av ECM-bundna signaler19,20. Många tidigare studier har fokuserat på stamceller som skiljer sig till definierade härstamningar, men SCs har en liknande förmåga att ändra fenotyp från en homeostatisk, vuxen SC inom en frisk nerv, till en reparation SC kan utsöndra proteiner och tillväxtfaktorer medan remodeling ECM efter nervskada5,21. Därför är det särskilt viktigt att identifiera mekanismer som ligger till grund för förhållandet mellan den medfödda SC regenerativ kapacitet och ECM bundna ledtrådar för insikten att i slutändan utnyttja denna kapacitet för nervregenerering.
För att åtgärda detta har vi utvecklat en detaljerad metod för att ta fram ett cellodlingssubstrat där mekanisk styvhet och ligandtyp enkelt kan justeras i fysiologiskt relevanta områden. Polydi metylsiloxan (PDMS) valdes som substrat på grund av dess mycket avstämbara mekanik jämfört med polyakrylamidgel, där den maximala Youngs modul är cirka 12 kPa kontrasterad till PDMS på omkring 1000 kPa22,23,24. Detta är fördelaktigt för det arbete som finns, eftersom nyligen genomförda studier har visat att Youngs modulus av en kanin ischiasnerven kan överstiga 50 kPa under utveckling, vilket tyder på att utbudet av stelhet av nerver inom PNS är bredare än tidigare undersökts. Olika proteiner kan adsorption på PDMS substrat för att analysera kombinatorisk reglering av mekanik och ligander på SC beteende. Detta gör det möjligt för undersökning av flera mikromiljö signaler som finns i PNS regenereringsprocessen och jämförelse av en hög grad av tunability till arbetet fokuserar enbart på styvhet av substratet25. Vidare är dessa konstruerade cellodlingssubstrat kompatibla med en mängd kvantitativa analysmetoder som immunohistokemi, västra blot och kvantitativ polymeraskedjereaktion (q-PCR).
Denna konstruerade cellodlingsplattform är mycket lämplig för att analysera mekanistiska vägar på grund av den höga individuella tunabilityen hos varje ECM-bunden signal. Dessutom kan populära metoder för cellmikromönster, inklusive mikrokontakter, uppnås på substraten för att möjliggöra kontrollerad cellvidhäftning för att analysera cellform i förhållande till andra ECM bundna signaler24. Detta är avgörande eftersom linjemönstrade substrat, som främjar töjning i cellpopulationer, ger ett verktyg för att efterlikna och studera långsträckta och regenerativa SCs inom Büngner band under nervregenerering. Vidare, cellulär morfologi är en potent regulator av flera cellfunktioner och kan potentiellt införa förvirrande experimentella resultat om inte kontrolleras26,27. Betydande uppmärksamhet ägnas nu åt de mekanismer som styr SC regenerativ fenotyp som regleras av ECM cues28,29,30. Detta är viktigt för att ge insikt i utformningen av biomaterial som kan tillämpas som nerv vägledning ledningar för stöd i PNS nerv regenerering. Dessa detaljerade protokoll kan i slutändan tillämpas som ett potentiellt verktyg för att dechiffrera mekanismerna för SC och andra celltyp funktion som regleras av ECM bundna ledtrådar.
SCs kan främja nerv regenerering på grund av deras fenotypiska omvandling och regenerativ potential efter nerv skada. Men hur ECM signaler reglerar denna regenerativa kapacitet är fortfarande mestadels oklart, potentiellt hindrar inte bara utvecklingen av biomaterial som syftar till att främja nervregenerering men också förståelsen av de mekanismer som är involverade i nervregenerering. För att börja undersöka detta samspel, cellkultur substrat skapades där ECM ledtrådar såsom styvhet, protein beläggning, …
The authors have nothing to disclose.
Författarna erkänner tacksamt finansiering stöd från universitetet i Cincinnati. Författarna tackar också Ron Flenniken vid University of Cincinnati Advanced Materials Characterization laboratory för stöd.
Albumin from Bovine Serum (BSA), Texas Red conjugate | Thermo Fisher Scientific | A23017 | BSA staining to show micropatterns |
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7076S | Antibody used for western blot analysis |
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074S | Antibody used for western blot analysis |
BrdU | Thermo Fisher Scientific | B23151 | Reagent used to measure cell proliferation |
BrdU primary antibody conjugated with Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | B35130 | Used to visualize BrdU in cell proliferation assays |
Collagen I | Thermo Fisher Scientific | A10483-01 | Protein used to coat coverslips |
Compression force test machine | TestResources | Instrument to quantify mechanical properties of polymers | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | Cell culture medium |
Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | Cell culture medium supplemental |
Fibronectin | Thermo Fisher Scientific | 33010-018 | Protein used to coat coverslips |
Fluorescence microscope | Nikon | Eclipse Ti2 | Fluorescence microscope |
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Fisher Scientific | 78440 | Protease and Phosphatase Inhibitor |
Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017015 | Protein used to coat coverslips |
Mounting medium with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36971 | Coverslip mountant and nuclei staining |
Mouse c-Jun primary antibody | Thermo Fisher Scientific | 711202 | Primary antibody to visualize c-Jun protein |
Mouse β-Actin primary antibody | Cell Signaling Technology | 3700S | Loading control for western blot experiments |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Cell culture medium supplemental |
Photoresist SU 2010 | KAYAKU | SU8-2010 | Photoresist |
Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | P-2443 | Block non-specific protein binding |
Rabbit c-Jun primary antibody | Cell Signaling Technology | 9165S | Primary antibody for visualization of c-Jun protein |
Rabbit myelin basic protein primary antibody | Abcam | ab40390 | Primary antibody for visualization of MBP |
Rabbit p75NTR primary antibody | Cell Signaling Technology | 8238S | Primary antibody for visualization of p75NTR |
Rhodamine phalloidin | Thermo Fisher Scientific | R415 | Visualization of cell cytoskeleton |
RIPA buffer | Abcam | ab156034 | Cell lysis buffer |
RT4-D6P2T Schwann cell line | ATCC | CRL-2768 | Cell line used in experiments |
SYLGARD 184 PDMS base and curing agent | Sigma Aldrich | 761036 | Tunable polymer used to coat coverslips |
Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 15090-046 | Cell dissociation reagent |
UV-Ozone cleaner | Novascan | Increase hydrophicility of PDMS | |
Versene (1x) | Thermo Fisher Scientific | 15040066 | Cell dissociation reagent |