تهدف هذه المنهجية إلى توضيح الآليات التي تقوم بها الإشارات المصفوفة خارج الخلية مثل صلابة الركيزة وتكوين البروتين ومورفولوجيا الخلية بتنظيم النمط الظاهري للخلية Schwann (SC).
تفتقر إصابات الجهاز العصبي المحيطي الرضي (PNS) حاليًا إلى العلاجات المناسبة لاستعادة التعافي الوظيفي الكامل. تلعب خلايا Schwann (SCs) ، كخلايا دبقية رئيسية للـ PNS ، دورًا حيويًا في تعزيز تجديد PNS عن طريق إلغاء التنوع في النمط الظاهري للخلية المتجددة بعد الإصابة. ومع ذلك، فإن حالة اللجان SCs غير المتمايزة تشكل تحدياً للحفاظ على الفترة الزمنية اللازمة للتجديد وتتأثر بالتغييرات في المصفوفة المحيطة خارج الخلية (ECM). ولذلك، فإن تحديد التفاعل المعقد بين اللجان الإقليمية واختلاف نظام إدارة المحتوى لتوفير إشارات إلى الإمكانات التجديدية للSCS أمر ضروري. لمعالجة هذا، تم إنشاء استراتيجية حيث تم امتصاص بروتينات ECM مختلفة على الركيزة بوليديميثيلوكسيكان (PDMS) قابلة للتواؤم (PDMS) التي وفرت منصة حيث يمكن تعديل صلابة وتكوين البروتين. تم زرع SCs على ركائز قابلة للتواؤم وتم قياس الوظائف الخلوية الحرجة التي تمثل ديناميات النمط الظاهري SC. لتوضيح التفاعل بين التعبير البروتين SC ومورفولوجيا الخلوية، تم استخدام كثافة البذر المختلفة للSCs بالإضافة إلى أنماط الخلايا المطبوعة الدقيقة الفردية وتتميز بتلوين الفلوروسوس المناعي واللطخة الغربية. وأظهرت النتائج أن الخلايا مع منطقة انتشار أصغر ومدى أعلى من استطالة الخلوية عززت مستويات أعلى من علامات الظهارة التجدد SC. هذه المنهجية لا تبدأ فقط في كشف العلاقة الهامة بين ECM والوظيفة الخلوية للSCs ، ولكنها توفر أيضًا إرشادات لتحسين المواد الحيوية في المستقبل في إصلاح الأعصاب المحيطية.
لا تزال إصابات الجهاز العصبي المحيطي (PNS) تشكل تحديًا سريريًا كبيرًا في مجال الرعاية الصحية من خلال المساس بنوعية الحياة للمرضى وخلق تأثير كبير من خلال العديد من العوامل الاجتماعية والاقتصادية1،2. خلايا Schwann (SC)، كالخلايا الدبقية الرئيسية في PNS، وتوفير الإشارات الجزيئية والمادية اللازمة للحث على تجديد PNS والمساعدة في التعافي الوظيفي في إصابات الفجوة قصيرة. ويرجع ذلك إلى قدرة رائعة من SCs على إلغاء التمايز في “إصلاح” الخلية الظاهرية من myelinating أو Remak النمط الظاهري3. الإصلاح SC هو نوع ظاهري خلية مميزة في عدة طرق. بعد الإصابة، يزيد SCs من معدل انتشارها من خلال الدخول من جديد في دورة الخلية والبدء في التعبير عن العديد من العوامل النسخية لتسهيل إعادة التشجير. هذه العوامل، مثل ج يونيو و P75 NTR، هي upregulated في حين أن علامات SC myelinating، مثل البروتين الأساسي myelin (MBP)، هي downregulated4،5. وبالإضافة إلى ذلك، SCs تغيير مورفولوجيا لتصبح ممدود ومحاذية مع بعضها البعض لتشكيل عصابات Büngner عبر موقع الإصابة6. وهذا يوفر آلية التوجيه المادي لمحور عصبي لتمتد إلى الهدف الصحيح7. ومع ذلك، على الرغم من القدرة التي تمتلكها SCs لتعزيز تجديد الأعصاب في إصابات الفجوة القصيرة، لا تزال نتيجة الانتعاش الوظيفي ضعيفة في الإصابات الخطيرة. ويرجع ذلك جزئيا إلى فقدان الإشارات التوجيهية مصفوفة خارج الخلية (ECM)، فضلا عن عدم قدرة SCs للحفاظ على النمط الظاهري التجديدي على مدى فترات طويلة من الوقت8.
ترتبط عملية تجديد العصب والتعافي ارتباطًا وثيقًا بحالة الصفيحة القاعدية بعد الإصابة. لامينا القاعدية هي طبقة من ECM حول العصب الذي يسهل التوجيه ويوفر إشارات ECM ملزمة لaxons وSCs في الحالات التي لا تزال سليمة بعد الإصابة9. حالة ECM وقدرتها على تقديم الإشارات ملزمة مصفوفة للخلايا أمر حيوي ومهم وقد تم استكشافها سابقا في مجموعة متنوعة من سياقات مختلفة10،11،12،13،14. على سبيل المثال، فقد تبين أن صلابة من ECM يمكن أن توجه وظائف الخلية مثل انتشار والتمايز11و15و16. تكوين ECM يمكن أن يؤدي أيضا إلى استجابة خلوية متميزة وتنظيم سلوكيات الخلية مثل الهجرة والتمايز من خلال مسارات الإشارات داخل الخلايا17,18. وعلاوة على ذلك، فإن مورفولوجيا الخلية، بما في ذلك منطقة الانتشار والإطالة الخلوية، تلعب دوراً رئيسياً في تنظيم الوظيفة ويمكن أن تحكمها الإشارات التي تربط ECM19،20. وقد ركزت العديد من الدراسات السابقة على الخلايا الجذعية التي تميز إلى أنساب محددة، ولكن SCs تمتلك قدرة مماثلة لتغيير النمط الظاهري من homeostatic، SC الكبار داخل العصب الصحي، إلى SC إصلاح قادرة على إفراز البروتينات وعوامل النمو مع إعادة عرض ECM بعد إصابة الأعصاب5،21. ولذلك، من الأهمية بمكان تحديد الآليات التي تقوم عليها العلاقة بين القدرة التجديدية الفطرية SC وإشارات ملزمة ECM للبصيرة لتسخير هذه القدرة في نهاية المطاف لتجديد الأعصاب.
لمعالجة هذا، قمنا بتطوير منهجية مفصلة لإنتاج الركيزة ثقافة الخلية حيث يمكن ضبطها بسهولة صلابة الميكانيكية ونوع يغاند في نطاقات ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. تم اختيار البوليديميثيل سيلوكسان (PDMS) كركيزة بسبب ميكانيكاها القابلة للتواؤم للغاية مقارنة بجل polyacrylamide ، حيث يبلغ الحد الأقصى لم ومعامل يونغ حوالي 12 كيلو باسكال على النقيض من PDMS في حوالي 1000 كيلو باسكال22،23،24. وهذا مفيد للعمل في متناول اليد، كما أظهرت الدراسات الحديثة معامل يونغ من العصب الوركي أرنب يمكن أن تتجاوز 50 كيلو باسكال أثناء التنمية، مما يشير إلى أن مجموعة من صلابة الأعصاب داخل PNS أوسع مما سبق فحصها. البروتينات المختلفة قادرة على الامتزاز على ركائز PDMS لتحليل التنظيم الجمعي للميكانيكا والليغانات على سلوك SC. وهذا يسمح للتحقيق في الإشارات البيئة الدقيقة متعددة موجودة في عملية تجديد PNS ومقارنة درجة عالية من سمك التونة للعمل مع التركيز فقط على صلابة الركيزة25. علاوة على ذلك ، تتوافق ركائز ثقافة الخلايا المهندسة هذه مع العديد من طرق التحليل الكمي مثل الكيمياء المناعية ، واللطخة الغربية ، و تفاعل البوليميراز الكمي المتسلسل (q-PCR).
تعد منصة ثقافة الخلايا المهندسة هذه مناسبة للغاية لتحليل المسارات الآلية بسبب ارتفاع مستوى قابلية التونة الفردية لكل إشارة مرتبطة بـ ECM. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تحقيق طرق شعبية لmicropatterning الخلية، بما في ذلك الطباعة microcontact، على ركائز للسماح للالتصاق الخلوية التي تسيطر عليها لتحليل شكل الخلية فيما يتعلق غيرها من الإشارات ECM ملزمة24. وهذا أمر بالغ الأهمية لأن الركائز الخطية المنقوشة، التي تعزز استطالة في مجموعات الخلايا، توفر أداة لمحاكاة ودراسة SCs ممدود وتجديدي داخل نطاقات Büngner أثناء تجديد الأعصاب. علاوة على ذلك، مورفولوجيا الخلوية هو منظم قوي لوظائف الخلايا المتعددة ويمكن أن يحتمل أن يدخل نتائج تجريبية محيرة إذا لم يتم التحكم26،27. ويجري الآن إيلاء اهتمام كبير للآليات التي تحكم النمط الظاهري التجديدي SC كما ينظمها العظة ECM28,29,30. وهذا أمر ضروري لتوفير نظرة ثاقبة في تصميم المواد الحيوية التي يمكن تطبيقها كقناة توجيه الأعصاب للمساعدة في تجديد العصب PNS. ويمكن في نهاية المطاف تطبيق هذه البروتوكولات التفصيلية كأداة محتملة لفك آليات SC ودالة نوع الخلية الأخرى كما تنظمها الإشارات المقيدة في ECM.
يمكن أن تعزز SCs تجديد الأعصاب بسبب تحولها الظاهري وإمكانات التجدد بعد إصابة الأعصاب. ومع ذلك، فإن كيفية تنظيم الإشارات في إدارة المحتوى في الميكون هذه القدرة التجديدية لا تزال غير واضحة في معظمها، مما قد يعوق ليس فقط تطوير المواد الحيوية التي تهدف إلى تعزيز تجديد الأعصاب ولكن أيضا فهم الآ?…
The authors have nothing to disclose.
ويعترف المؤلفون بامتنان بالدعم التمويلي المقدم من جامعة سينسيناتي. كما يشكر المؤلفون رون فلنينكين من مختبر توصيف المواد المتقدمة بجامعة سينسيناتي على الدعم.
Albumin from Bovine Serum (BSA), Texas Red conjugate | Thermo Fisher Scientific | A23017 | BSA staining to show micropatterns |
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7076S | Antibody used for western blot analysis |
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074S | Antibody used for western blot analysis |
BrdU | Thermo Fisher Scientific | B23151 | Reagent used to measure cell proliferation |
BrdU primary antibody conjugated with Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | B35130 | Used to visualize BrdU in cell proliferation assays |
Collagen I | Thermo Fisher Scientific | A10483-01 | Protein used to coat coverslips |
Compression force test machine | TestResources | Instrument to quantify mechanical properties of polymers | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | Cell culture medium |
Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | Cell culture medium supplemental |
Fibronectin | Thermo Fisher Scientific | 33010-018 | Protein used to coat coverslips |
Fluorescence microscope | Nikon | Eclipse Ti2 | Fluorescence microscope |
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Fisher Scientific | 78440 | Protease and Phosphatase Inhibitor |
Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017015 | Protein used to coat coverslips |
Mounting medium with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36971 | Coverslip mountant and nuclei staining |
Mouse c-Jun primary antibody | Thermo Fisher Scientific | 711202 | Primary antibody to visualize c-Jun protein |
Mouse β-Actin primary antibody | Cell Signaling Technology | 3700S | Loading control for western blot experiments |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Cell culture medium supplemental |
Photoresist SU 2010 | KAYAKU | SU8-2010 | Photoresist |
Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | P-2443 | Block non-specific protein binding |
Rabbit c-Jun primary antibody | Cell Signaling Technology | 9165S | Primary antibody for visualization of c-Jun protein |
Rabbit myelin basic protein primary antibody | Abcam | ab40390 | Primary antibody for visualization of MBP |
Rabbit p75NTR primary antibody | Cell Signaling Technology | 8238S | Primary antibody for visualization of p75NTR |
Rhodamine phalloidin | Thermo Fisher Scientific | R415 | Visualization of cell cytoskeleton |
RIPA buffer | Abcam | ab156034 | Cell lysis buffer |
RT4-D6P2T Schwann cell line | ATCC | CRL-2768 | Cell line used in experiments |
SYLGARD 184 PDMS base and curing agent | Sigma Aldrich | 761036 | Tunable polymer used to coat coverslips |
Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 15090-046 | Cell dissociation reagent |
UV-Ozone cleaner | Novascan | Increase hydrophicility of PDMS | |
Versene (1x) | Thermo Fisher Scientific | 15040066 | Cell dissociation reagent |