Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Bioengineering

إعداد Tunable خارج الخلية مصفوفة microenvironments لتقييم شوان الخلية الظاهري مواصفات

doi: 10.3791/61496 Published: June 2, 2020

Summary

تهدف هذه المنهجية إلى توضيح الآليات التي تقوم بها الإشارات المصفوفة خارج الخلية مثل صلابة الركيزة وتكوين البروتين ومورفولوجيا الخلية بتنظيم النمط الظاهري للخلية Schwann (SC).

Abstract

تفتقر إصابات الجهاز العصبي المحيطي الرضي (PNS) حاليًا إلى العلاجات المناسبة لاستعادة التعافي الوظيفي الكامل. تلعب خلايا Schwann (SCs) ، كخلايا دبقية رئيسية للـ PNS ، دورًا حيويًا في تعزيز تجديد PNS عن طريق إلغاء التنوع في النمط الظاهري للخلية المتجددة بعد الإصابة. ومع ذلك، فإن حالة اللجان SCs غير المتمايزة تشكل تحدياً للحفاظ على الفترة الزمنية اللازمة للتجديد وتتأثر بالتغييرات في المصفوفة المحيطة خارج الخلية (ECM). ولذلك، فإن تحديد التفاعل المعقد بين اللجان الإقليمية واختلاف نظام إدارة المحتوى لتوفير إشارات إلى الإمكانات التجديدية للSCS أمر ضروري. لمعالجة هذا، تم إنشاء استراتيجية حيث تم امتصاص بروتينات ECM مختلفة على الركيزة بوليديميثيلوكسيكان (PDMS) قابلة للتواؤم (PDMS) التي وفرت منصة حيث يمكن تعديل صلابة وتكوين البروتين. تم زرع SCs على ركائز قابلة للتواؤم وتم قياس الوظائف الخلوية الحرجة التي تمثل ديناميات النمط الظاهري SC. لتوضيح التفاعل بين التعبير البروتين SC ومورفولوجيا الخلوية، تم استخدام كثافة البذر المختلفة للSCs بالإضافة إلى أنماط الخلايا المطبوعة الدقيقة الفردية وتتميز بتلوين الفلوروسوس المناعي واللطخة الغربية. وأظهرت النتائج أن الخلايا مع منطقة انتشار أصغر ومدى أعلى من استطالة الخلوية عززت مستويات أعلى من علامات الظهارة التجدد SC. هذه المنهجية لا تبدأ فقط في كشف العلاقة الهامة بين ECM والوظيفة الخلوية للSCs ، ولكنها توفر أيضًا إرشادات لتحسين المواد الحيوية في المستقبل في إصلاح الأعصاب المحيطية.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

لا تزال إصابات الجهاز العصبي المحيطي (PNS) تشكل تحديًا سريريًا كبيرًا في مجال الرعاية الصحية من خلال المساس بنوعية الحياة للمرضى وخلق تأثير كبير من خلال العديد من العوامل الاجتماعية والاقتصادية1،2. خلايا Schwann (SC)، كالخلايا الدبقية الرئيسية في PNS، وتوفير الإشارات الجزيئية والمادية اللازمة للحث على تجديد PNS والمساعدة في التعافي الوظيفي في إصابات الفجوة قصيرة. ويرجع ذلك إلى قدرة رائعة من SCs على إلغاء التمايز في "إصلاح" الخلية الظاهرية من myelinating أو Remak النمط الظاهري3. الإصلاح SC هو نوع ظاهري خلية مميزة في عدة طرق. بعد الإصابة، يزيد SCs من معدل انتشارها من خلال الدخول من جديد في دورة الخلية والبدء في التعبير عن العديد من العوامل النسخية لتسهيل إعادة التشجير. هذه العوامل، مثل ج يونيو و P75 NTR، هي upregulated في حين أن علامات SC myelinating، مثل البروتين الأساسي myelin (MBP)، هي downregulated4،5. وبالإضافة إلى ذلك، SCs تغيير مورفولوجيا لتصبح ممدود ومحاذية مع بعضها البعض لتشكيل عصابات Büngner عبر موقع الإصابة6. وهذا يوفر آلية التوجيه المادي لمحور عصبي لتمتد إلى الهدف الصحيح7. ومع ذلك، على الرغم من القدرة التي تمتلكها SCs لتعزيز تجديد الأعصاب في إصابات الفجوة القصيرة، لا تزال نتيجة الانتعاش الوظيفي ضعيفة في الإصابات الخطيرة. ويرجع ذلك جزئيا إلى فقدان الإشارات التوجيهية مصفوفة خارج الخلية (ECM)، فضلا عن عدم قدرة SCs للحفاظ على النمط الظاهري التجديدي على مدى فترات طويلة من الوقت8.

ترتبط عملية تجديد العصب والتعافي ارتباطًا وثيقًا بحالة الصفيحة القاعدية بعد الإصابة. لامينا القاعدية هي طبقة من ECM حول العصب الذي يسهل التوجيه ويوفر إشارات ECM ملزمة لaxons وSCs في الحالات التي لا تزال سليمة بعد الإصابة9. حالة ECM وقدرتها على تقديم الإشارات ملزمة مصفوفة للخلايا أمر حيوي ومهم وقد تم استكشافها سابقا في مجموعة متنوعة من سياقات مختلفة10،11،12،13،14. على سبيل المثال، فقد تبين أن صلابة من ECM يمكن أن توجه وظائف الخلية مثل انتشار والتمايز11و15و16. تكوين ECM يمكن أن يؤدي أيضا إلى استجابة خلوية متميزة وتنظيم سلوكيات الخلية مثل الهجرة والتمايز من خلال مسارات الإشارات داخل الخلايا17,18. وعلاوة على ذلك، فإن مورفولوجيا الخلية، بما في ذلك منطقة الانتشار والإطالة الخلوية، تلعب دوراً رئيسياً في تنظيم الوظيفة ويمكن أن تحكمها الإشارات التي تربط ECM19،20. وقد ركزت العديد من الدراسات السابقة على الخلايا الجذعية التي تميز إلى أنساب محددة، ولكن SCs تمتلك قدرة مماثلة لتغيير النمط الظاهري من homeostatic، SC الكبار داخل العصب الصحي، إلى SC إصلاح قادرة على إفراز البروتينات وعوامل النمو مع إعادة عرض ECM بعد إصابة الأعصاب5،21. ولذلك، من الأهمية بمكان تحديد الآليات التي تقوم عليها العلاقة بين القدرة التجديدية الفطرية SC وإشارات ملزمة ECM للبصيرة لتسخير هذه القدرة في نهاية المطاف لتجديد الأعصاب.

لمعالجة هذا، قمنا بتطوير منهجية مفصلة لإنتاج الركيزة ثقافة الخلية حيث يمكن ضبطها بسهولة صلابة الميكانيكية ونوع يغاند في نطاقات ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. تم اختيار البوليديميثيل سيلوكسان (PDMS) كركيزة بسبب ميكانيكاها القابلة للتواؤم للغاية مقارنة بجل polyacrylamide ، حيث يبلغ الحد الأقصى لم ومعامل يونغ حوالي 12 كيلو باسكال على النقيض من PDMS في حوالي 1000 كيلو باسكال22،23،24. وهذا مفيد للعمل في متناول اليد، كما أظهرت الدراسات الحديثة معامل يونغ من العصب الوركي أرنب يمكن أن تتجاوز 50 كيلو باسكال أثناء التنمية، مما يشير إلى أن مجموعة من صلابة الأعصاب داخل PNS أوسع مما سبق فحصها. البروتينات المختلفة قادرة على الامتزاز على ركائز PDMS لتحليل التنظيم الجمعي للميكانيكا والليغانات على سلوك SC. وهذا يسمح للتحقيق في الإشارات البيئة الدقيقة متعددة موجودة في عملية تجديد PNS ومقارنة درجة عالية من سمك التونة للعمل مع التركيز فقط على صلابة الركيزة25. علاوة على ذلك ، تتوافق ركائز ثقافة الخلايا المهندسة هذه مع العديد من طرق التحليل الكمي مثل الكيمياء المناعية ، واللطخة الغربية ، و تفاعل البوليميراز الكمي المتسلسل (q-PCR).

تعد منصة ثقافة الخلايا المهندسة هذه مناسبة للغاية لتحليل المسارات الآلية بسبب ارتفاع مستوى قابلية التونة الفردية لكل إشارة مرتبطة بـ ECM. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تحقيق طرق شعبية لmicropatterning الخلية، بما في ذلك الطباعة microcontact، على ركائز للسماح للالتصاق الخلوية التي تسيطر عليها لتحليل شكل الخلية فيما يتعلق غيرها من الإشارات ECM ملزمة24. وهذا أمر بالغ الأهمية لأن الركائز الخطية المنقوشة، التي تعزز استطالة في مجموعات الخلايا، توفر أداة لمحاكاة ودراسة SCs ممدود وتجديدي داخل نطاقات Büngner أثناء تجديد الأعصاب. علاوة على ذلك، مورفولوجيا الخلوية هو منظم قوي لوظائف الخلايا المتعددة ويمكن أن يحتمل أن يدخل نتائج تجريبية محيرة إذا لم يتم التحكم26،27. ويجري الآن إيلاء اهتمام كبير للآليات التي تحكم النمط الظاهري التجديدي SC كما ينظمها العظة ECM28,29,30. وهذا أمر ضروري لتوفير نظرة ثاقبة في تصميم المواد الحيوية التي يمكن تطبيقها كقناة توجيه الأعصاب للمساعدة في تجديد العصب PNS. ويمكن في نهاية المطاف تطبيق هذه البروتوكولات التفصيلية كأداة محتملة لفك آليات SC ودالة نوع الخلية الأخرى كما تنظمها الإشارات المقيدة في ECM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Tunable خلية ثقافة الركيزة إعداد وتوصيف

  1. إعداد الركيزة
    1. اخلطي مِن قاعدة PDMS والعوامل المعالجة باستخدام طرف ماصة بقوة عند نسبة تتراوح بين 10:1 و 60:1 حتى يتم تشتيت الفقاعات بشكل متجانس داخل الخليط. إزالة الفقاعات باستخدام الجفاف الفراغ حتى يتم تبديد فقاعات.
      ملاحظة: أثناء البلمرة PDMS، يعالج وكيل crosslinks مع مِسِر الأساس لتوفير الخصائص الميكانيكية المرغوبة النهائية للبوليمر. يمكن تعديل نسب التشابك المتقاطعة لتغيير صلابة PDMS.
    2. ضع قطرة (~ 0.2 مل) من خليط PDMS المجفف على غطاء مربع أو دائري (على سبيل المثال، 22 مم × 22 مم) وتناوب الغطاء على معطف دوران في 2500 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية.
    3. احتضان الغطاء في فرن إما في 60 درجة مئوية لمدة 1-2 ساعة أو درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها لPMS لترسيخ.
    4. علاج الغطاء باستخدام الأشعة فوق البنفسجية الأوزون نظافة لمدة 7 دقائق (الطول الموجي للأشعة فوق البنفسجية: 185 نانومتر و 254 نانومتر) لزيادة المياه السطحية. وضعه في طبق 6-جيدا معقمة.
    5. قبل استخدام لثقافة الخلية، احتضان ركائز في 70٪ الإيثانول لمدة 30 دقيقة على الأقل.
      تنبيه: UV-الأوزون يمكن أن تولد الأوزون الضارة للبشر. العمل في غطاء الدخان الكيميائي أو مع شكل من أشكال التهوية.
    6. غمر الأغطية في محلول البروتين (10 ميكروغرام / مل الكولاجين الأول، فيبرومينكتين، أو لامينين) لمدة 60 دقيقة في حاضنة معقمة في 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: بعد المعالجة فوق البنفسجية الأوزون، قد لا يزال سطح PDMS مسعور. تدوير لوحة جيدا لضمان تغطية كل غطاء مع محلول البروتين.
    7. استلهم محلول البروتين واغسل الغطاء مع الفوسفات المالحة المخزنة (PBS) 3x.
    8. إعادة تعليق RT4-D6P2T خط الخلية Schwann (SCs) من طبق passaging باستخدام حل EDTA المتاحة تجاريا (1x) مع 2.5٪ التربسين وعدد الخلايا مع قياس ال hemocytometer. بذور SCs على سطح PDMS قابلة للتواؤم في كثافة الخلية المطلوبة. قد تختلف كثافة البذر SC لكل تطبيق مختلف.
    9. الحفاظ على الخلايا في المعلمات الخلية ثقافة المطلوب (90٪ الرطوبة، 5٪ CO37 درجة مئوية، الخ) لطول التجربة. استخدام Dulbecco معدلة النسر المتوسط (DMEM) تكملها 10٪ مصل الأبقار الجنين (FBS) و 1٪ البنسلين-الستربتوميسين كما المتوسطة ثقافة الخلية.
  2. إعداد الركيزة الصغيرة
    1. رسم الهندسة المطلوبة ومناطق لاصقة الخلية (900 ميكرومتر2، 1600 ميكرومتر2 و 2500 μm2) باستخدام الكمبيوتر بمساعدة تصميم (CAD) البرمجيات. إنشاء قناع ضوئي كروم على أساس تلك الأنماط من مورد تجاري.
    2. في غرفة نظيفة أو بيئة خالية من الغبار، واستخدام تقنيات الطباعة الضوئية القياسية لتصنيع رقائق السيليكون (بروتوكولات مفصلة في مكان آخر31). وفيما يلي بارامترات حاسمة لهذا التطبيق الخاص: التصوير الضوئي: SU-8 2010؛ وSS-8 2010؛ وSS-8 2010؛ وSS-8 2010؛ وSS-8 2010؛ وSS-8 20 تدور الصورة الفوتوغرافية لتفريق photoresist: 500 دورة في الدقيقة لمدة 10 s مع تسارع 100 دورة في الدقيقة / ث، ثم 3500 دورة في الدقيقة لمدة 30 s مع تسارع 300 دورة في الدقيقة / الثانية؛ التعرض للطاقة من الأشعة فوق البنفسجية الخفيفة: 130 mJ / سم2.
      ملاحظة: ارتفاع الأنماط على رقائق السيليكون هو حوالي 10 ميكرومتر بعد هذه المعلمات. ويمكن رؤية الشقوق المحتملة حول الحافة خارج الأنماط المستطيلة أو الثلاثية باستخدام مجهر خفيف بعد الخطوة 1.2.2. الخبز رقاقة السيليكون في 190 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة يساعد على القضاء على الشقوق.
    3. ضع رقاقة السيليكون المنقوشة داخل قطر دائري 150 مم × 15 مم إرتفاع طبق بيتري وصب دي غازسد PDMS (نسبة الخلط 10:1) كما هي معدة في الخطوة 1.1.1 على رقاقة السيليكون.
      ملاحظة: تأكد من أن سمك PDMS لا يقل عن 5 مم لسهولة المعالجة أثناء خطوات الطباعة الدقيقة.
    4. ترسيخ PDMS على رقاقة السيليكون في فرن في 60 درجة مئوية بين عشية وضحاها. السماح لـ PDMS بتبريد درجة حرارة الغرفة. قطع الطوابع بدقة من 30 مم × 30 ملم المربعات التي تحتوي على أنماط الصحيح من رقاقة السيليكون باستخدام مشرط الجراحية. لا تضر رقاقة السيليكون.
      ملاحظة: يمكن إعادة استخدام رقائق السيليكون عدة مرات في هذه المرحلة لإنتاج المزيد من الطوابع بعد التنظيف مع ايزوبروبانول.
    5. تعقيم الطوابع PDMS وأغطية قابلة للتوابل (أعدت في الخطوة 1.1.1 إلى 1.1.3) عن طريق غمرها في 70٪ الإيثانول لمدة 30 دقيقة.
    6. لتأكيد فعالية micropattern من قبل الطوابع PDMS بعد الطباعة الدقيقة ، وتجفيف سطح الطوابع PDMS باستخدام تيار الهواء المصفاة والماصات 50 ميكروغرام / مل BSA (تكساس الأحمر مترافق) حل لتغطية الجانب الكامل منقوشة من ختم PDMS.
    7. احتضان الطوابع PDMS مع حل BSA لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة للسماح لامتزاز البروتين.
    8. جفف سطح الأغطية القابلة للتواؤم باستخدام تيار هواء مصفّاً، وزيادة ماء السطح كما هو موضح في الخطوة 1.1.5.
    9. الهواء الجافة الطوابع PDMS لإزالة الحل المتبقية BSA.
      ملاحظة: تأخذ عناية أن يتم إزالة حل BSA تماماً من الطابع لأن أي حل المتبقية سيؤدي الطوابع إلى الشريحة على الأغطية أثناء الطباعة microcontact.
    10. جلب الجانب منقوشة من الطابع في اتصال المطابقة مع غطاء tunable لSA الامتزاز على سطح غطاء. اضغط بلطف على الطابع ضد غطاء لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: لا تطبق القوة المفرطة على الطابع لأنه سوف ينحني ويسبب اتصال غير محدد بين ختم و coverlip. الكمية المناسبة من القوة المطبقة على الطابع ضروري لنجاح الطباعة الدقيقة.
    11. فحص micropattern باستخدام المجهر الفلوري مع FITC (الفلوريسين ايزوثيوسايانات) مرشح.
    12. لطباعة مناطق لاصقة الخلية بدلاً من أنماط الفلورسنت، استبدل اللامينيين ببروتين BSA وكرر الخطوة 1.2.5 إلى 1.2.10.
    13. إزالة الطوابع من الأغطية، ونقل الأغطية في لوحة 6-جيدا معقمة. إضافة 2 مل من 0.2٪ ث / v حل F-127 Pluronic في كل بئر لتغطية سطح غطاء واحتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: يمكن أن تكون مُزَمّة Puronic F-127 إلى سطح PDMS زيادة في التحلل المائي لسطح PDMS لمنع الخلايا من الالتصاق.
    14. الطامح Pluronic F-127 حل وغسل 5X مع برنامج تلفزيوني و1x مع خلية ثقافة المتوسطة قبل خلايا البذر. كثافة البذر نموذجية لCS هو 1000 خلية / سم2.
    15. 45 دقيقة بعد بذر الخلية، وإزالة خلية ثقافة المتوسطة وغسل الأغطية مع برنامج تلفزيوني 2x لمنع متعددة SCs من الالتزام بنفس النمط. الحفاظ على الخلايا في بيئة ثقافة الخلية المطلوبة لمدة 48 ساعة قبل القياس الكمي.
    16. لإنشاء ركائز ثقافة الخلية منقوشة بخط لفحص الخلايا المحاذية اتبع الخطوة 1.2.1 إلى 1.2.4 لإنشاء الطوابع للطباعة microcontact.
      ملاحظة: أبعاد الأخدود/التل من الأنماط المصطف على ختم هو 50 ميكرومتر × 50 ميكرومتر للخلايا المبينة. ويبلغ إجمالي أبعاد الطابع 10 مم × 10 ملم.
    17. قص الطوابع إلى أبعاد تحتوي على أنماط الخط المطلوب فقط.
      ملاحظة: عند إنشاء الطوابع في CAD، فإن المنطقة غير المُعاد ة من الطابع حول أنماط الخطوط سوف تتوافق مع منطقة لاصقة الخلية التالية للطباعة الدقيقة. وبالتالي، فمن الضروري للقضاء على المناطق غير الخاضعة للمعالجة عند الاستغناء عن ختم لضمان كل SC البذور على السطح يتبع أنماط.
    18. اتبع الخطوة 1.1.1 إلى 1.1.3 لإعداد طلاء سطح PDMS قابل للاستخدام طبقين من الأطباق بيتري.
      ملاحظة: هذا سيكون PDMS تغطي سطح طبق بيتري نفسه وليس على غطاء.
    19. اتبع الخطوة 1.2.5 إلى 1.2.10 لإجراء الطباعة الدقيقة لطباعة مناطق لاصقة خلية منقوشة بخط على أحد أطباق Petri المغلفة PDMS.
      ملاحظة: يمكن أن تحتوي مساحة طبق بيتري مقاس 60 مم × 15 مم على مناطق منقوشة بخط من 6 طوابع PDMS.
    20. إزالة الطوابع وملء طبق بيتري مع 4 مل من 0.2٪ ث / v Pluronic F-127 حل واحتضان لمدة 1 ساعة.
    21. بعد الطباعة الدقيقة، شطف كل جانب من الطوابع PDMS مع 70٪ الإيثانول 3x وجافة مع الهواء. تدوير الطوابع PDMS واتبع الخطوة 1.2.5 إلى 1.2.10 لطباعة منطقة لاصقة خلية unpatterned باستخدام الجانب unpatterned من الطابع على طبق بيتري الثاني. كرر الخطوة 1.2.13.
    22. حل اسبيرات F-127 من الأطباق، 3X غسل مع برنامج تلفزيوني تليها مع 1x غسل باستخدام خلية جديدة ثقافة المتوسطة. بذور SCs على الأطباق.
      ملاحظة: كثافة البذر لطبق خط منقوشة هو 5000 خلية / سم2 ولطبق unpatterned هو 10،000 الخلايا / سم2.
    23. الحفاظ على SCs في الظروف المطلوبة ل 48 ساعة واتبع بروتوكولات لإعداد SC lysates32.
      ملاحظة: كثافة بذر الخلايا للأطباق غير المُتَرَكّرة أعلى بـ 2x من تلك الخاصة بالأطباق المنقوشة بالخط، حيث أن الطبق المنقوش على الخط لا يحتوي إلا على نصف مساحة الزنزانة اللاصقة من الطبق غير المصفّد.
      1. لإعداد اللوّي، نقل مخزن التشريب المناعي الإشعاعي الملائم (RIPA) إلى أنبوب مركزي مخروطي 10 مل. تخفيف البروتياز ومثبطات الفوسفاتاز (100x) بنسبة 1:100 في العازلة RIPA، مزيج جيدا عن طريق الأنابيب.
      2. غسل الخلايا مع الثلج البارد برنامج تلفزيوني (1x) لمدة 2 دقيقة، إضافة 80 ميكرولتر من الحل المعدة من الخطوة 1.2.23.1 على كل منطقة لاصقة الخلية (المنطقة التي اتصلت مع الطوابع PDMS والبروتين الممتز) داخل أطباق بتري. احتضان الخلايا مع الحل على كتلة الجليد لمدة 15 دقيقة.
        ملاحظة: الحل سيبقى فقط على منطقة لاصقة الخلية بسبب hydrophobicity من الممتزة F-127 Pluronic في مكان آخر. هذه الميزة تمكن من استخراج البروتين ناجحة وكافية للخط منقوشة SCs.
      3. كشط SCs مع مكشطة الخلية لمدة 5 دقائق. جمع lysate في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل المسمى.
      4. microcentrifuge lysate في 12، 000 س ز لمدة 15 دقيقة في 4 °C. جمع فائق مع ماصة 1000 ميكرولتر ونقلها إلى أنبوبrifuge صغيرة نظيفة. تخزين الخلية في -20 درجة مئوية.
  3. توصيف الركيزة
    ملاحظة: لتوصيف ميكانيكا البوليمر على غطاء، تستخدم أساليب متعددة عموما بما في ذلك اختبار ضغطالسائبة 11،,33 أو اختبار مجهرية القوة الذرية34. هذا البروتوكول سوف تفصيلي اختبار ضغط مجمع.
    1. صب السلائف PDMS من نسبة الخلط المطلوب (الخطوة 1.1) في طبق بيتري 30 مم، وضمان سمك طبقة PDMS داخل طبق بيتري هو على الأقل 20 ملم.
    2. يُرفع طبق بيتري مع متانة بي إم بي إم من الفرن 60 درجة مئوية بعد ساعة والسماح بتبريده في درجة حرارة الغرفة. قطع البوليمر إلى 10 مم × 10 مم الساحات. قياس سمك PDMS باستخدام الفرجار.
    3. ضع PDMS على خشبة المسرح من قوة الضغط قياس الجهاز. سد في استشعار قوة الضغط (نموذج: 112C) لمنفذ الاستشعار وإصلاح جهاز استشعار لمحور آلة الاختبار.
    4. ضبط ارتفاع أجهزة الاستشعار إلى ما يقرب من 0.5 سم فوق طابع PDMS باستخدام "هرول" التحكم على اللوحة الأمامية من الصك.
    5. فتح البرامج المرتبطة باستخدام"اختبار الإعداد"نافذة، حدد"ملف تعريف Servo"، وفتح نافذة"الجزء". في "الجزء" نافذة الإدخال المطلوب "معدل التحكم" و " نهايةالمبلغ" للاختبار.
      ملاحظة: يحدد معدل التحكم معدل انتقال المستشعر لأسفل باتجاه PDMS. يحدد المبلغ النهائي المسافة الإجمالية التي يقطعها المستشعر.
    6. استخدم الزر"Z"الموجود على لوحة التحكم في البرنامج لإعادة ضبط جميع القياسات في هذه المرحلة.
    7. نقل الاستشعار إلى أسفل للاتصال برفق PDMS حتى يتم تحميل 1-2 نيوتن (N). سيتم عرض التحميل والمسافة التي يسافر بها المستشعر في البرنامج.
    8. بعد الاستفادة من "Z" زر ، وقياس تشغيل باستخدام "اللعب" ، وحفظ قوة تسجيل الملف والمسافة.
    9. كرر الخطوات من 1.3.3 إلى 1.3.8 لكل حالة تجريبية من PDMS.
    10. افتح الملف واستخدم الصيغة التالية لحساب معامل يونغ (E) من PDMS لكل نسبة. (F = قوة ضغط، أ = مساحة طابع PDMS، ستامبX L = المسافة المقطوعة من أجهزة الاستشعار، و L0 = السمة الأصلية لختم PDMS).
      Equation 1

2. القياس الكمي للخصائص الخلوية على ركائز قابلة للتواؤم

  1. انتشار التشايس
    1. بذور SCs على ركائز أعدت من الخطوة 1.1.9 في كثافة 5000 الخلايا / سم2 في لوحة 6-جيدا. السماح SCs لاحتضان لمدة 48 ساعة في ظروف ثقافة الخلية القياسية (37 درجة مئوية و 5٪ CO2).
    2. تمييع 12 ميكرولتر من 10 mM Bromodeoxyuridine (BrdU) حل الأسهم في 12 مل من 37 درجة مئوية خلية ثقافة المتوسطة، اخلط جيدا مع ماصة لجعل 10 μM BrdU حل التسمية.
    3. إزالة ثقافة الخلية المتوسطة وغسل SCs 2X مع برنامج تلفزيوني.
    4. إضافة 2 مل من BrdU وضع العلامات الحل في كل بئر واحتضان SCs لمدة 2 ساعة.
      ملاحظة: وقت حضانة حل وضع العلامات BrdU يعتمد على معدل انتشار الخلايا المحددة. خط RT4-D6P2T SC لديه معدل انتشار عالية لذلك تم استخدام 2 ساعة من وقت الحضانة.
    5. إزالة BrdU وضع العلامات الحل وغسل SCs 3X مع برنامج تلفزيوني. إضافة 1 مل من 3.7٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني إلى كل بئر واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة لتثبيت الخلية.
      تنبيه: الفورمالديهايد مادة مسرطنة للإنسان؛ لذلك، تنفيذ جميع الأعمال داخل غطاء محرك الدخان الكيميائية مع الحماية المناسبة.
      ملاحظة: عند الغسيل مع برنامج تلفزيوني، لا يوجد خلية ثقافة المتوسطة في البئر، وبالتالي قد يكون سطح PDMS مسعور. اتخاذ الاحتياطات اللازمة لعدم تجفيف سطح الركيزة تماما لمنع تلف الخلايا.
    6. محلول الفورمالديهايد السبيرات وغسل 3x مع برنامج تلفزيوني (3 دقائق لكل من). إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 1 مل من 0.2٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني لكل بئر لغشاء الخلية permeabilize. احتضان SCs مع تريتون X-100 حل لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    7. إزالة تريتون X-100 حل وغسل SCS 3x مع برنامج تلفزيوني (3 دقائق لكل من).
    8. إضافة 1 مل من 1 HCl ن في كل بئر واحتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة. إزالة 1 N HCl وإضافة 1 مل من 2 N HCl في كل بئر واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. HCl العلاج هو للتحلل المائي DNA.
    9. مزيج 182 مل من 0.2 mM نا2HPO4 و 18 مل من 0.1 mM حمض الستريك لإنتاج الفوسفات / حمض الستريك العازلة لاسترجاع المستضد. إزالة 2 N HCl وإضافة 1 مل الفوسفات / حمض الستريك العازلة في كل بئر واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
    10. غسل SCs 3x مع 0.2٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني. إضافة 2 مل من 3٪ الألبومين مصل البقر (BSA) في برنامج تلفزيوني في كل بئر واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على مدار الساعة غير محددة ملزمة من الجسم المضاد.
    11. تمييع الجسم المضاد الرئيسي BrdU المقترنة مع اليكسا فلور 488 في 3٪ BSA الحل بنسبة 1:300 لBrdU تلطيخ الحل. احتضان SCs مع حل تلطيخ بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة في حين يتم تغطية لوحة في رقائق الألومنيوم.
    12. لقياس الانتشار، صور SCs باستخدام قناة FITC و DAPI من المجهر الفلوري للكشف عن BrdU والنوية، على التوالي. حفظ الصور كملفات "nd.2".
    13. افتح ملفات "nd.2" لكل صورة مأخوذة في مواضع مكانية متطابقة.
    14. افتح برنامج تحليل الصور. انقر بزر الماوس الأيمن فوق الخلفية لفتح النافذة "نتائج القياس الآلي" و " القياسالآلي" في قسم "مراقبة التحليل".
    15. في "عدد وتصنيف" القائمة ، حدد "عدد". على صورة FITC، انقر على كل نواة تظهر الفلوريسين الخضراء (ردو إيجابية) وانقر بزر الماوس الأيمن على الصورة.
      ملاحظة: يتم عرض عدد الخلايا الإيجابية BrdU في نافذة"الأتمتة والقياسات".
    16. بالنسبة لصور DAPI، كرر الخطوة 2.1.14 لحساب عدد النوى الإجمالية. حساب النسبة المئوية للخلايا الموجبة BrdU لهذه الصورة.
    17. كرر الخطوة 2.1.13 إلى 2.1.16 للصور الأخرى للأغراض الإحصائية وحساب متوسط النسبة المئوية للخلايا الإيجابية BrdU لكل حالة الركيزة.
  2. القياس الكمي للتعبير c-Jun من خلال تحليل الصور المناعية
    1. يتم إصلاح الخلايا المعدة داخل 6 آبار من الخطوة 1.1.9 و 1.2.23 و permeabilized مع الإجراءات الموصوفة سابقا (الخطوة 2.1.5-2.1.7).
      ملاحظة: لإجراء مقارنات دقيقة من كثافة الفلورسنت عبر الخلايا من شروط ECM مختلفة، تطبيق إعدادات الكاميرا بشكل متطابق عبر كافة العينات مع جميع العينات لها نفس المعلمات.
    2. حفظ الصور كملفات .nd2.
    3. افتح برنامج تحليل الصور. انقر بزر الماوس الأيمن فوق الخلفية لفتح النافذة "نتائج القياس الآلي" و " القياسالآلي" في قسم "مراقبة التحليل".
    4. في "نتائج القياس الآلي"، حدد " بياناتالكائن". تنشيط "مواصلة تحديث القياس" زر.
    5. في اللوحة العلوية من البرنامج، حدد"قياس"متبوعاً بـ"ميزات الكائن". إضافة "متوسط كثافة" إلى قسم "مختارة للقياس".
    6. فتح ودمج اثنين من ملفات الصور nd2 "التي تحتوي على صور من ج يونيو والنوى.
    7. في اللوحة العلوية، حدد"ROI"وحدد"رسم عائد الاستثمار مستطيل". رسم منطقة مستطيلة تحتوي على المنطقة النووية من خلية واحدة.
      ملاحظة: c-يونيو التعبير يتركز داخل النوى35.
    8. في اللوحة العلوية من البرامج، حدد"ثنائي"و "تعريف عتبة" ، ستظهر نافذة جديدة لتحديد منطقة الفلورسنت c-Jun بدقة.
    9. في نافذة جديدة، انقر فوق "صورة كاملة / استخدام العائد على الاستثمار" للتبديل البرنامج من نموذج الصورة الكاملة إلى نموذج ROI. استخدم"كثافة"لضبط جدول البحث الموجود على الجانب الأيسر من الإطار لتعديل حجم/شكل المنطقة المميزة ضمن عائد الاستثمار المستطيل.
      ملاحظة: احرص على التأكد من أن حجم/شكل المنطقة المميزة مطابق للنواة.
    10. انقر فوق الزر "موافق" ، للحصول على متوسط كثافة FITC في إطار "نتائج القياس الآلي" ثم انقر فوق " بياناتالمتجر".
    11. في نافذة "القياس الآلي" ،"حذف الكائن" لإزالة المنطقة الحمراء المميزة. على الجانب الأيسر، استخدم"أداة الإشارة"لتحديد العائد على الاستثمار مستطيلة وحذف.
    12. كرر الخطوة 2.2.6 إلى 2.2.11 لقياس شدة FITC المتوسط لكل خلية إضافية.
    13. في منطقة النافذة من "نتائج القياس الآلي" ، حدد "مخزن" وسيتم تقديم جميع البيانات المخزنة. استخدم"تصدير"وظيفة وحدد"البيانات إلى Excel"لحفظ جدول البيانات المصدرة وإجراء عمليات حسابية إضافية.
  3. تحديد كمي للاتم بـاطالة نووية
    1. إصلاح و permeabilize من الخطوة 1.2.22 التالية الخطوات 2.1.5-2.1.7. تنفيذ تلطيخ نووي باستخدام تركيب متوسط مع DAPI.
    2. باستخدام قناة DAPI وعدسة الهدف 40x، الحصول على صور من العينة وحفظ الملفات كما ".nd2".
    3. اتبع الخطوة 2.2.3 و 2.2.4 لفتح"نتائج القياس الآلي"و "القياس الآلي" نافذة في برنامج تحليل الصور.
    4. في "نتائج القياس الآلي"، استخدم"الخيار"وظيفة متبوعة "حدد ميزة الكائن". في العمود"ميزة"،حدد"التهطال"وإضافة إلى "المحدد للقياسات" العمود. استخدم "استمر في تحديث القياس" لتنشيط هذه الوظيفة.
    5. افتح ملف الصورة "nd.2" الذي يحتوي على الصور النووية. في "القياس الآلي" نافذة ، حدد "الكشف التلقائي" وظيفة وحدد نواة. انقر بزر الماوس الأيمن على الصورة وقياس نسبة الجانب النووي سيتم عرضها في "نتائج القياس الآلي".
    6. كرر الخطوة 2.3.5 لتحديد نسب الارتقاء النووية للنيات الأخرى داخل الصورة. حدد "بيانات المتجر" في نافذة " نتائجالقياس الآلي".
    7. كرر 2.3.5 إلى 2.3.6 للصور الإضافية. تصدير البيانات إلى ملف جدول بيانات كما تم في 2.2.13 من قبل للتحليل.
  4. لطخة غربية لتحديد تعبير البروتين
    1. اتبع البروتوكولات القياسية لتحليل البقع الغربية مفصلة في مكان آخر32. وترد أدناه عمليات تخفيف الأجسام المضادة المستخدمة في الدراسة: الأرانب المضادة لـ c-Jun 1:2,000؛ الأرانب المضادة لـ C-Jun 1:2,000؛ الأرانب المضادة لـ C-Jun 1:2,000؛ الأرانب المضادة لـ 1:2,000؛ الأرانب المضادة لـ 1:2, الماوس المضادة β-actin 1:1,000; أرنب المضادة p75NTR 1:1,000; الأرانب المضادة myelin البروتين الأساسي 1:1,000; المضادة للماوس / أرنب IgG، HRP المرتبطة الأجسام المضادة 1:10،000.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

لتحليل وقياس التفاعل بين صلابة الركيزة وتكوين البروتين على النمط الظاهري SC، تم تطوير الركيزة الوراثية لثقافة الخلايا PDMS(الشكل 1A). اختبار ضغط البوليمر في قاعدة مختلفة: تم استخدام نسب عامل المعالجة لتحديد معامل يونغ (E) من الركيزة (الشكل 1B). يمثل النطاق الناتج من قيم المعامل الظروف الركيزة ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. بعد إعداد ركائز، تم استزراع SCs وتحليل الخصائص الخلوية على البيئة الدقيقة القابلة للتواؤم. تم أولا تحليل معدلات انتشار SCs على ركائز من تكوين البروتين المختلفة. أدّت ركائز لامينين المغلفة إلى ارتفاع معدل الانتشار عند مقارنتها بالكولاجين الأول وممتزة الليفية في جميعها عند 10 ميكروغرام/مل (الشكل 2A, B). أظهرت SCs على ركائز مع طلاء الماجهان و moduli مختلفة أن ركائز أكثر ليونة نسبيا (E = 3.85kPa) انخفاض معدلات انتشار الخلايا عبر جميع الظروف(الشكل 2C, D). ومع ذلك، كانت الاختلافات بين ركائز قاسية (E = 1119kPa) وركائز لينة نسبيا (E = 8.67kPa) كانت تافهة(الشكل 2D).

كما تم تحليل SCs للتعبير عن البروتين من خلال الكيمياء المناعية ولطخة الغربية. تم تحليل مستويات عامل النسخ c-Jun بواسطة المجهر المناعي(الشكل 3A)ويمثلها متوسط كثافة الفلورسنت بكسل(الشكل 3B-D). ج-يونيو التعبير تبين أن upregulated كما ركائز أصبحت أكثر ليونة (E = 1119 كيلو باسكال إلى E = 8.67 كيلو باسكال)، ومع ذلك، على أنعم ركائز (E = 3.85 كيلو باسكال)، c-يونيو التعبير كان إلى حد كبير downregulated. على ركائز قاسية (E = 1119 كيلو باسكال)، الكولاجين أنا ركائز المغلفة أسفرت عن أعلى تعبير ج يونيو، ولكن كما أصبحت ركائز ليونة (E = 8.67 كيلو باسكال و 3.85 كيلو باسكال)، وأظهرت اللامينيين أعلى مستويات ج يونيو(الشكل 3E). كما تم استخدام لطخة الغربية لتحليل كل من ج يونيو والبروتين الأساسي myelin (MBP) مع مستويات c-يونيو upregulated MBP و دون تنظيم على ركائز ليونة(الشكل 3F). علاوة على ذلك، أدى SCs المصنفة على ركائز المغلفة لامينين في التعبير c-يونيو أعلى بالمقارنة مع الكولاجين الأول وفيبرومينكتين.

ثم تم زرع خلايا من الكثافات البذر المختلفة وملطخة بالرودامين- phalloidin لاستكشاف دور انتشار الخلايا والمنطقة في التعبير c-Jun (الشكل 4A, B). للسيطرة على استطالة النووية من الخلايا، تم استخدام تقنية micropatterning المشتركة (الطباعة الدقيقة36) لإنشاء خطوط لاصقة الخلية على ركائز ثقافة الخلية. وتبين أن نسبة الارتفاع إلى الارتفاع النووية للخلايا المصنفة على ركيزة منقوشة على خط أعلى بكثير من الخلايا المصنفة على ركائز غير مُبطَّن(الشكل 4جيم، دال). ووجد أن التعبير عن كل من ج يونيو وعلامة أخرى هامة في الأنماط الظاهرية التجديدية SC، p75 مستقبلات المغذيات العصبية (P75 NTR)، كانت أعلى تنظيما في الخلايا الكثيفة مع منطقة انتشار أصغر (الشكل 4E). كما أدت الخلايا الخطية المنقوشة في تعبير أعلى من كل من ج يونيو و P75 NTR بالمقارنة مع الخلايا غير اصطناد (الشكل 4F). لذلك، تم إنشاء هندسات لاصقة الخلايا المطبوعة microcontact لمراقبة الخلايا بدقة نشر منطقة وامتداد مع القضاء على التفاعلات الخلية الخلية(الشكل 5A). كانت أبعاد إجمالي المساحات اللاصقة للخلايا 900 ميكرومتر2و1600 ميكرومتر2و2500 ميكرومتر2 مع نسبة عرض إلى ارتفاع إما 1 أو 4 (طول الخلية: عرض الخلية). تم استخدام الفلورسنت البوم مصل الأبقار (fBSA، تكساس الحمراء) تلطيخ للكشف عن حالة micropatterns على الركيزة ثقافة الخلية بعد الطباعة microcontact(الشكل 5B). تم قياس نسبة الارتفاع إلى الارتفاع النووي للـ SCs لكل منطقة من مناطق الخلايا، وتبين أنه بزيادة نسبة الارتفاع إلى الارتفاع النووية، يزداد الازدياد الخلوي(الشكل 5C). وبالإضافة إلى ذلك، مع زيادة نسبة العرض إلى الارتفاع في درجة السكر، تم رفع مستوى C-Jun(الشكل 5D). ومن المثير للاهتمام، ومع ذلك، فقد وجد أنه كما يزيد من منطقة انتشار الخلية c-يونيو التعبير downregulated(الشكل 5E). تم التحكم بشدة في تلطيخ الفلوروسنس لكل من النوى وأكتين منطقة انتشار الخلايا الممدودة والتسامي من خلال هذه الطريقة micropatterning (الشكل 5F).

Figure 1
الشكل 1: تُتَكُن ثقافة الخلية من الصلابة القابلة للتدّي وتكوين البروتين. (A) التخطيطي الذي يظهر تطور ركائز ثقافة خلية PDMS. (B) نسبة خلط PDMS الأولية للقاعدة: عامل المعالجة يحدد معامل يونغ. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: معدلات انتشار الـ SC التي تنظمها صلابة الركازة وتكوين البروتين. (أ)صور تمثيلية تظهر تلطيخ BrdU عندما تُزرع على ركائز من نفس المعامل. (ب) الرسم البياني يظهر النسبة المئوية من الخلايا الإيجابية BrdU لكل طلاء البروتين. (C) صور تمثيلية تظهر تأسيس BrdU في SCs مبذرة على ركائز من نفس طلاء البروتين. (D) رسم بياني يوضح النسبة المئوية للخلايا الموجبة لـ BrdU لقيمة معامل الشباب. أشرطة المقياس = 50 ميكرومتر. يتم عرض البيانات على أنها متوسط ± SEM. *p < .05, **p < .005, ***p < .0005. وقد عدلت أجزاء من الرقم من المرجع٢٤ الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: صلابة الركيزة والبروتين ينظم SC التعبير البروتين. (A)تظهر الصور التمثيلية c-Jun immunofluorescence تلطيخ لSCS مبذر على ركائز من صلابة مختلفة وتكوين البروتين. تم قياس متوسط كثافة الفلورسنت بكسل من c-Jun لSCs بذر على (B) الكولاجين الأول (C) fibronectin و (D) الركائز المغلفة laminin من صلابة مختلفة. (E) c-Jun مستوى الفلورس من SCs مجمعة بواسطة معامل يونغ من الركيزة. (F) لطخة الغربية تظهر ج يونيو والبروتين الأساسي myelin (MBP) من SCs بذر على ركائز. وقد استخدم الغليسيرالدههيد 3-فوسفات ديهيدروجيناز (GAPDH) كتحكم في التحميل. شريط مقياس = 50 ميكرومتر. يتم عرض البيانات على أنها متوسط ± SEM. *p < .05, **p < .005, ***p < .0005. وقد عدلت أجزاء من الرقم من المرجع٢٤ الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: يؤثر منطقة الانتشار الخلوية على التعبير البروتيني للـ SCs. (أ)تم تصور منطقة انتشار الخلايا ذات الكثافات البذرية المختلفة من خلال رودامين-phalloidin (أحمر) وصبغ النوى (الأزرق). (ب) رسم بياني يوضح متوسط مساحة الانتشار للـ SCs في كل حالة. (C) كانت نواة SCs مبذرة على ركائز غير مُتنقَبة أو منقوشة على خط مُطَطَّخ مع DAPI (الأزرق) لإظهار التشكل. (D) رسم بياني يوضح القياس الكمي لنسبة الارتفاع النووي على ركائز منقوشة وغير مُتَرَكَّرة. (E) لطخة الغربية تظهر التعبير عن ج يونيو وp75NTR من الخلايا مع منطقة انتشار مختلفة. (F) لطخة غربية تظهر التعبير البروتيني للSCs على ركائز غير مفككة ونقوش خط. شريط مقياس = 50 ميكرومتر. يتم عرض البيانات على أنها متوسط ± SEM. *p < .05, **p < .005, ***p < .0005. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: تأثير التشكل والتهطال على التعبير c-Jun عن SCs. (A) التخطيطي تظهر الخلية micropatterning لأشكال من نسبة العرض إلى الارتفاع مختلفة. (B) تلطيخ fBSA (أحمر) تظهر شكل micropatterns بعد الطباعة microcontact. شريط مقياس = 10 ميكرومتر. (C) الرسم البياني الذي يظهر نسبة الارتفاع النووية للCSS.(D, E) الرسم البياني يظهر متوسط كثافة الفلورسنت بكسل من c-Jun لكل من الظروف الهندسية. (F) رودامين- phalloidin (الأحمر)، النوى (الأزرق) وc-يونيو (الأخضر) كانت ملطخة على micropatterns مختلفة. شريط مقياس = 10 ميكرومتر. يتم عرض البيانات على أنها متوسط ± SEM. *p < .05, **p < .005, ***p < .0005. وقد عدلت أجزاء من الرقم من المرجع٢٤ الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

يمكن أن تعزز SCs تجديد الأعصاب بسبب تحولها الظاهري وإمكانات التجدد بعد إصابة الأعصاب. ومع ذلك، فإن كيفية تنظيم الإشارات في إدارة المحتوى في الميكون هذه القدرة التجديدية لا تزال غير واضحة في معظمها، مما قد يعوق ليس فقط تطوير المواد الحيوية التي تهدف إلى تعزيز تجديد الأعصاب ولكن أيضا فهم الآليات المشاركة في تجديد الأعصاب. للبدء في دراسة هذا التفاعل، تم إنشاء ركائز ثقافة الخلية حيث يمكن التحكم في إشارات ECM مثل التصلب وطلاء البروتين والتضاريس اللاصقة. القدرة على تضاريس لاصقة micropattern هو سمة رئيسية داخل البروتوكول ، وذلك باستخدام الطريقة الشائعة للطباعة microcontact. ومع ذلك، هذا الركيزة يختلف عن الزجاج في أن قوة الضغط التي يتم تطبيقها على الطوابع PDMS يجب أن تكون في مستوى مناسب لتحقيق الشكل المطلوب من المناطق اللاصقة الخلية على ركائز ثقافة الخلية. استخدام الفلورسنت بولين المصل الألبومين (fBSA) كبروتين نموذج لتصور مناطق لاصقة الخلية وضبط قوات الضغط على الطوابع PDMS يمكن أن تخفف في نهاية المطاف هذه المسألة. فارق رئيسي آخر من الزجاج هو إزالة فائض Pluronic F-127 التي تستخدم لجعل ما تبقى من الركيزة غير لاصقة. بعد هذا العلاج، وركائز ثقافة الخلية هي المائية للغاية، مما يجعل من الصعب الحفاظ على الخلايا الرطبة ثقافة ركائز في جميع أنحاء يغسل، وهو أمر مهم للسلامة الهيكلية للبروتين micropatterned37. لذلك ، يوصى باستخدام ماصات متعددة للتعرق وحقن الحلول في وقت واحد تقريبًا لمنع الركائز من الجفاف تمامًا.

على الرغم من أن micropatterning يمكن أن تسيطر على وجه التحديد شكل الخلية ولا تتطلب إجراءات معقدة الاصطناعية باستخدام البوليمرات حجب الخلايا مثل OEGMA، والطرق المستخدمة لقياس التعبير البروتين من الخلايا micropatterned محدودة في بعض الأحيان38. على سبيل المثال، تقتصر العينات المتوفرة من micropatterning بشكل عام إلى بضع مئات من الخلايا لكل غطاء، وهو غير كاف لإعداد الخلايا ليتم استخدامها في البقع الغربية أو qPCR. وبالنظر إلى ذلك، تم استخدام تلطيخ الفلوروسينت المناعي وحده لقياس التعبير البروتيني للخلايا الصغيرة، مما يحد من تنوع البروتينات التي يمكن تحديدها كمياً. لمعالجة هذا، استخدمنا أنماط الخط لتعزيز استطالة الخلية للسكان الخلايا أكبر وأعد بنجاح lysates الخلايا التي تم تحليلها بواسطة لطخة الغربية. يمكن أيضاً تطبيق أساليب أخرى مثل الحقول الكهربائية التطبيقية أو ألياف كهربية الانحياز للتحكم في امتطالة الخلايا39,40. ومع ذلك، قد لا يصلح المجالات الكهربائية في جميع التطبيقات ل NGCs منذ التوصيلية من المواد الحيوية المستخدمة عادة مثل البوليمر الكولاجين القائم والحرير منخفضة جدا28،41،42. في المقابل، تم زرع ألياف نانوية محاذاة كهربية بنجاح في NGCs لتعزيز محاذاة SC، استطالة والهجرة، فضلا عن نوريت ينم43،44. قد يكون أيضا مقنعة لمقارنة السلوك SC على ركائز خط منقوشة ضد تلك على ركائز مع ألياف نانو الانحياز، منذ أنماط مبطنة وألياف nanofibers الانحياز هما من آليات التوجيه الأكثر شيوعا دمجها في NGCs45.

بروتوكول micropatterning مفصلة يستخدم غطاء PDMS المغلفة كركائز ثقافة الخلية، مع معامل سطح أقصى يونغ من 1119 كيلو باسكال. هذه الصلابة تحاكي العديد من الأنسجة، ومع ذلك قد لا يكون من الممكن لنموذج تكوين العظم من الخلايا الجذعية الليسينشيمال، والتي تتطلب عموما معامل سطح يونغ لتتجاوز 1 Gpa46. لمثل هذه الحالات، والزجاج هو مرشح بديل، ولكن الامتزاز من F-127 Pluronic يتطلب ارتفاع نسبيا المياه الهدّية السطحية التي لا تملك الزجاج. لزيادة الرهاب الهدّي، يمكن معالجة الزجاج بدين كلوروسيل ثنائي كلور ثنائي كلوريل ثنائي كلوريل ثنائي كلور البنزين. بعد ذلك، يمكن استخدام المعالجة فوق البنفسجية الأوزون لزيادة hydrophilicity للطباعة microcontact47.

في نهاية المطاف، تم تطوير منصة ثقافة الخلية حيث يمكن ضبطها ECM المحفزات بشكل فردي مع تعبير البروتين كميا. لقد قررنا أن يتم تعزيز القدرة التجديدية SC من خلال بعض الإشارات الميكانيكية والكيميائية ECM، والتي يمكن أن توفر في وقت لاحق إلهام في تصميم التطبيقات الحيوية مثل NGCs وعمليات زرع الخلايا حيث قد تحتاج ميزات إدارة المحتوى إلى تحسين24. ومع ذلك، يمكن ضبط هذه العظة ECM يكون مهمة صعبة، لا سيما في الجسم الحي. وبالمضي قدماً، يمكن استخدام هذه المنصة لتحليل الآليات الرئيسية المشاركة في عملية الانتقال الظاهرية للCS وفقاً لتنظيم نظام إدارة المحتوى. من خلال تحقيق ذلك، قد يكون من الممكن التلاعب في الإشارات داخل الخلايا لتعزيز القدرة التجديدية SC دون الحاجة إلى منصات مخصصة في المختبر48،49. وهذا لديه القدرة على العمل الرائد في تطوير تكنولوجيات لإصلاح الأعصاب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ولم يبلغ أصحاب البلاغ عن أي تضارب محتمل في المصالح.

Acknowledgments

ويعترف المؤلفون بامتنان بالدعم التمويلي المقدم من جامعة سينسيناتي. كما يشكر المؤلفون رون فلنينكين من مختبر توصيف المواد المتقدمة بجامعة سينسيناتي على الدعم.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Albumin from Bovine Serum (BSA), Texas Red conjugate Thermo Fisher Scientific A23017 BSA staining to show micropatterns
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7076S Antibody used for western blot analysis
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7074S Antibody used for western blot analysis
BrdU Thermo Fisher Scientific B23151 Reagent used to measure cell proliferation
BrdU primary antibody conjugated with Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific B35130 Used to visualize BrdU in cell proliferation assays
Collagen I Thermo Fisher Scientific A10483-01 Protein used to coat coverslips
Compression force test machine TestResources Instrument to quantify mechanical properties of polymers
Dulbecco's Modified Eagle Medium Thermo Fisher Scientific 11965092 Cell culture medium
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 16000044 Cell culture medium supplemental
Fibronectin Thermo Fisher Scientific 33010-018 Protein used to coat coverslips
Fluorescence microscope Nikon Eclipse Ti2 Fluorescence microscope
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) Thermo Fisher Scientific 78440 Protease and Phosphatase Inhibitor
Laminin Thermo Fisher Scientific 23017015 Protein used to coat coverslips
Mounting medium with DAPI Thermo Fisher Scientific P36971 Coverslip mountant and nuclei staining
Mouse c-Jun primary antibody Thermo Fisher Scientific 711202 Primary antibody to visualize c-Jun protein
Mouse β-Actin primary antibody Cell Signaling Technology 3700S Loading control for western blot experiments
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 Cell culture medium supplemental
Photoresist SU 2010 KAYAKU SU8-2010 Photoresist
Pluronic F-127 Sigma Aldrich P-2443 Block non-specific protein binding
Rabbit c-Jun primary antibody Cell Signaling Technology 9165S Primary antibody for visualization of c-Jun protein
Rabbit myelin basic protein primary antibody Abcam ab40390 Primary antibody for visualization of MBP
Rabbit p75NTR primary antibody Cell Signaling Technology 8238S Primary antibody for visualization of p75NTR
Rhodamine phalloidin Thermo Fisher Scientific R415 Visualization of cell cytoskeleton
RIPA buffer Abcam ab156034 Cell lysis buffer
RT4-D6P2T Schwann cell line ATCC CRL-2768 Cell line used in experiments
SYLGARD 184 PDMS base and curing agent Sigma Aldrich 761036 Tunable polymer used to coat coverslips
Trypsin Thermo Fisher Scientific 15090-046 Cell dissociation reagent
UV-Ozone cleaner Novascan Increase hydrophicility of PDMS
Versene (1x) Thermo Fisher Scientific 15040066 Cell dissociation reagent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Taylor, C. A., Braza, D., Rice, J. B., Dillingham, T. The Incidence of Peripheral Nerve Injury in Extremity Trauma. American Journal of Physical Medicine & Rehabilitation. 87, 381-385 (2008).
  2. Noble, J., Munro, C. A., Prasad, V. S. S. V., Midha, R. Analysis of Upper and Lower Extremity Peripheral Nerve Injuries in a Population of Patients with Multiple Injuries. Journal of Trauma and Acute Care Surgery. 45, 116-122 (1998).
  3. Jessen, K. R., Mirsky, R. The repair Schwann cell and its function in regenerating nerves. Journal of Physiology. 594, 3521-3531 (2016).
  4. Arthur-Farraj, P. J., et al. c-Jun Reprograms Schwann Cells of Injured Nerves to Generate a Repair Cell Essential for Regeneration. Neuron. 75, 633-647 (2012).
  5. Jessen, K. R., Mirsky, R. The Success and Failure of the Schwann Cell Response to Nerve Injury. Frontiers in Cell Neurosciences. 13, 33 (2019).
  6. Gomez-Sanchez, J. A., et al. After Nerve Injury, Lineage Tracing Shows That Myelin and Remak Schwann Cells Elongate Extensively and Branch to Form Repair Schwann Cells, Which Shorten Radically on Remyelination. Journal of Neuroscience. 37, (37), 9086-9099 (2017).
  7. Deumens, R., et al. Repairing injured peripheral nerves: Bridging the gap. Progress in Neurobiology. 92, 245-276 (2010).
  8. Höke, A., Gordon, T., Zochodne, D. W., Sulaiman, O. A. R. A decline in glial cell-line-derived neurotrophic factor expression is associated with impaired regeneration after long-term Schwann cell denervation. Experimental Neurology. 173, 77-85 (2002).
  9. Jones, S., Eisenberg, H. M., Jia, X. Advances and future applications of augmented peripheral nerve regeneration. International Journal of Molecular Sciences. 17, 1-17 (2016).
  10. Harris, G. M., et al. Nerve Guidance by a Decellularized Fibroblast Extracellular Matrix. Matrix Biology. 60-61, 176-189 (2017).
  11. Harris, G. M., Piroli, M. E., Jabbarzadeh, E. Deconstructing the Effects of Matrix Elasticity and Geometry in Mesenchymal Stem Cell Lineage Commitment. Advanced Function Mater. 24, (16), 2396-2403 (2014).
  12. Pryzhkova, M. V., Harris, G. M., Ma, S., Jabbarzadeh, E. Patterning pluripotent stem cells at a single cell level. Journal of Biomaterials and Tissue Engineering. 3, (4), 461-471 (2013).
  13. Engler, A. J., Sweeney, H. L., Discher, D. E., Schwarzbauer, J. E. Extracellular matrix elasticity directs stem cell differentiation. Journal of Musculoskeleton and Neuronal Interaction. 7, (4), 335 (2007).
  14. Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276, (5317), 1425-1428 (1997).
  15. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
  16. Pickup, M. W., Mouw, J. K., Weaver, V. M. The extracellular matrix modulates the hallmarks of cancer. EMBO Reports. 15, 1243-1253 (2014).
  17. Chernousov, M. A., Carey, D. J. Schwann cell extracellular matrix molecules and their receptors. Histology and Histopathology. 15, 593-601 (2000).
  18. Shibata, S., et al. Selective Laminin-Directed Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Distinct Ocular Lineages. Cell Reports. 25, (6), 1668-1679 (2018).
  19. Mcbeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell Shape, Cytoskeletal tenstion and RhoA regulate stem cell lineage committment. Developmental Cell. 6, 483-495 (2004).
  20. Halder, G., Dupont, S., Piccolo, S. Transduction of mechanical and cytoskeletal cues by YAP and TAZ. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13, 591-600 (2012).
  21. Jessen, K. R., Mirsky, R. The repair Schwann cell and its function in regenerating nerves. Journal of Physiology. 594, (13), 3521-3531 (2016).
  22. Lopez-Fagundo, C., Bar-Kochba, E., Livi, L. L., Hoffman-Kim, D., Franck, C. Three-dimensional traction forces of Schwann cells on compliant substrates. Journal of The Royal Society Interface. 11, 20140247 (2014).
  23. Gu, Y., et al. The influence of substrate stiffness on the behavior and functions of Schwann cells in culture. Biomaterials. 33, 6672-6681 (2012).
  24. Xu, Z. Y., Orkwis, J. A., DeVine, B. M., Harris, G. M. Extracellular matrix cues modulate Schwann cell morphology, proliferation, and protein expression. Journal of Tissue Engineering and Regenerative. (2019).
  25. Urbanski, M. M., et al. Myelinating glia differentiation is regulated by extracellular matrix elasticity. Scientific Reports. 6, 1-12 (2016).
  26. Sun, Y., et al. Tunable stiffness of graphene oxide/polyacrylamide composite scaffolds regulates cytoskeleton assembly. Chemical Sciences. 9, (31), 6516-6522 (2018).
  27. Hwang, J. H., et al. Extracellular matrix stiffness regulates osteogenic differentiation through MAPK activation. PLoS One. 10, 1-16 (2015).
  28. Ryan, A. J., et al. A Physicochemically Optimized and Neuroconductive Biphasic Nerve Guidance Conduit for Peripheral Nerve Repair. Advanced Healthcare Materials. 6, 1-13 (2017).
  29. Du, J., et al. Prompt peripheral nerve regeneration induced by a hierarchically aligned fibrin nanofiber hydrogel. Acta Biomaterialia. 55, 296-309 (2017).
  30. Huang, L., et al. A compound scaffold with uniform longitudinally oriented guidance cues and a porous sheath promotes peripheral nerve regeneration in vivo. Acta Biomaterialia. 68, 223-236 (2018).
  31. Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices. Jouranl of Visualized Experiments. (119), e55276 (2017).
  32. Gupta, R., et al. Shear stress alters the expression of myelin-associated glycoprotein (MAG) and myelin basic protein (MBP) in Schwann cells. Journal of Orthopaedic Research : Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 23, 1232-1239 (2005).
  33. Harris, G. M., Shazly, T., Jabbarzadeh, E. Deciphering the combinatorial roles of geometric, mechanical, and adhesion cues in regulation of cell spreading. PLoS One. 8, (11), (2013).
  34. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, (4), 677-689 (2006).
  35. Schreck, I., et al. C-Jun localizes to the nucleus independent of its phosphorylation by and interaction with JNK and vice versa promotes nuclear accumulation of JNK. Biochemical and Biophysical Research Communications. 407, 735-740 (2011).
  36. Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact printing of proteins for cell biology. Journal Visualized Experiments. (22), e1065 (2008).
  37. Treter, J., et al. Washing-resistant surfactant coated surface is able to inhibit pathogenic bacteria adhesion. Applied Surface Science. 303, 147-154 (2014).
  38. Lutz, J. F. Polymerization of oligo(ethylene glycol) (meth)acrylates: Toward new generations of smart biocompatible materials. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 46, (11), 3459-3470 (2008).
  39. Marcus, M., et al. Interactions of Neurons with Physical Environments. Advanced Healthcare Materials. 6, (2017).
  40. Pu, J. Golgi polarization in a strong electric field. Journal of Cell Science. 118, 1117-1128 (2005).
  41. Blaker, J. J., et al. Bioactive Silk-Based Nerve Guidance Conduits for Augmenting Peripheral Nerve Repair. Advanced Healthcare Materials. 7, 1800308 (2018).
  42. Daly, W., Yao, L., Zeugolis, D., Windebank, A., Pandit, A. A biomaterials approach to peripheral nerve regeneration : bridging the peripheral nerve gap and enhancing functional recovery. Journal of the Royal Society of Interface. 9, (67), 202-221 (2012).
  43. Xia, H., et al. Directed neurite growth of rat dorsal root ganglion neurons and increased colocalization with Schwann cells on aligned poly(methyl methacrylate) electrospun nanofibers. Brain Research. 1565, 18-27 (2014).
  44. Wang, H. B., Mullins, M. E., Cregg, J. M., McCarthy, C. W., Gilbert, R. J. Varying the diameter of aligned electrospun fibers alters neurite outgrowth and Schwann cell migration. Acta Biomaterialia. 6, 2970-2978 (2010).
  45. Carvalho, C. R., Oliveira, J. M., Reis, R. L. Modern Trends for Peripheral Nerve Repair and Regeneration: Beyond the Hollow Nerve Guidance Conduit. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 337 (2019).
  46. Yang, Y., Wang, K., Gu, X., Leong, K. W. Biophysical Regulation of Cell Behavior - Cross Talk between Substrate Stiffness and Nanotopography. Engineering. 3, 36-54 (2017).
  47. Tan, J. L., Liu, W., Nelson, C. M., Raghavan, S., Chen, C. S. Simple Approach to Micropattern Cells on Common Culture Substrates by Tuning Substrate Wettability. Tissue Engineering. 10, 865-872 (2004).
  48. Grove, M., et al. YAP/TAZ initiate and maintain schwann cell myelination. Elife. 6, 1-27 (2017).
  49. Poitelon, Y., et al. YAP and TAZ control peripheral myelination and the expression of laminin receptors in Schwann cells. Nature Neuroscience. 19, 879-887 (2016).
إعداد Tunable خارج الخلية مصفوفة microenvironments لتقييم شوان الخلية الظاهري مواصفات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xu, Z., Orkwis, J. A., Harris, G. M. Preparation of Tunable Extracellular Matrix Microenvironments to Evaluate Schwann Cell Phenotype Specification. J. Vis. Exp. (160), e61496, doi:10.3791/61496 (2020).More

Xu, Z., Orkwis, J. A., Harris, G. M. Preparation of Tunable Extracellular Matrix Microenvironments to Evaluate Schwann Cell Phenotype Specification. J. Vis. Exp. (160), e61496, doi:10.3791/61496 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter