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Bioengineering

Vorbereitung von tunable Extracellular Matrix Microenvironments zur Bewertung der Schwann Cell Phänotyp Specification

doi: 10.3791/61496 Published: June 2, 2020

Summary

Diese Methode soll die Mechanismen veranschaulichen, mit denen extrazelluläre Matrix-Cues wie Substratsteifigkeit, Proteinzusammensetzung und Zellmorphologie Schwann-Zell(SC)-Phänotyp regulieren.

Abstract

Traumatische Verletzungen des peripheren Nervensystems (PNS) verfügen derzeit nicht über geeignete Behandlungen, um die volle funktionelle Genesung wiederzuerlangen. Schwann-Zellen (SCs), als die wichtigsten Gliazellen des PNS, spielen eine wichtige Rolle bei der Förderung der PNS-Regeneration, indem sie sich nach einer Verletzung zu einem regenerativen Zellphänotyp verleiten. Der dedifferenzierte Zustand von SCs ist jedoch eine Herausforderung für die Regeneration sanierbare Zeit und wird durch Veränderungen in der umgebenden extrazellulären Matrix (ECM) beeinflusst. Daher ist es von wesentlicher Bedeutung, das komplexe Zusammenspiel zwischen SCs und unterschiedlichem ECM zu bestimmen, um Hinweise auf das regenerative Potenzial von SCs zu liefern. Um diesem Problem zu begegnen, wurde eine Strategie entwickelt, bei der verschiedene ECM-Proteine auf ein abstimmbares Polydimethylsiloxan (PDMS)-Substrat adsorbiert wurden, das eine Plattform bot, auf der Steifigkeit und Proteinzusammensetzung moduliert werden können. SCs wurden auf die abstimmbaren Substrate gesät und kritische zelluläre Funktionen, die die Dynamik des SC-Phänotyps darstellen, wurden gemessen. Zur Veranschaulichung des Zusammenspiels zwischen SC-Proteinexpression und zellulärer Morphologie wurden neben individuellen mikrokontaktbedruckten Zellmustern auch unterschiedliche Sädichten von SCs verwendet und durch Immunfluoreszenzfärbung und Western Blot gekennzeichnet. Die Ergebnisse zeigten, dass Zellen mit einer kleineren Verbreitungsfläche und einem höheren Ausmaß der zellulären Dehnung höhere Konzentrationen von SC-regenerativen phänotypischen Markern förderten. Diese Methode beginnt nicht nur, die signifikante Beziehung zwischen dem ECM und der zellulären Funktion von SCs zu entwirren, sondern liefert auch Richtlinien für die zukünftige Optimierung von Biomaterialien in der peripheren Nervenreparatur.

Introduction

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Verletzungen des peripheren Nervensystems (PNS) stellen nach wie vor eine große klinische Herausforderung im Gesundheitswesen dar, da sie die Lebensqualität der Patienten gefährden und durch eine Vielzahl sozioökonomischer Faktoren eine signifikante Wirkung erzielen1,2. Schwann-Zellen (SC), als die wichtigsten Gliazellen im PNS, bieten notwendige molekulare und physikalische Hinweise, um die PNS-Regeneration zu induzieren und bei funktionellen Erholungen bei Kurzspaltverletzungen zu helfen. Dies ist auf die bemerkenswerte Fähigkeit von SCs zurückzuführen, sich in einen "Reparatur"-Zellphänotyp von einem myelinisierenden oder Remak-Phänotyp3zu unterscheiden. Die Reparatur SC ist ein unverwechselbarer Zellphänotyp in mehrfacher Hinsicht. Nach der Verletzung erhöhen SCs ihre Proliferationsrate, indem sie wieder in den Zellzyklus eintreten und mit der Expression mehrerer Transkriptionsfaktoren beginnen, um die Reinnervation zu erleichtern. Diese Faktoren, wie c-Jun und p75 NTR, sind hochreguliert, während myelinierende SC-Marker, wie Myelin-Basisprotein (MBP), nach unten reguliert werden4,5. Darüber hinaus ändern SCs die Morphologie, um sich zu verlängen und aufeinander auszurichten, um Büngner-Bänder über die Verletzungsstelle6zu bilden. Dies bietet einen physikalischen Leitmechanismus für die Axone, um sich auf das richtige distale Ziel7auszudehnen. Trotz der Fähigkeit, die SCs besitzen, um die Nervenregeneration bei Kurzstreckenverletzungen zu fördern, bleibt das Ergebnis der funktionellen Erholung bei schweren Verletzungen schlecht. Dies ist zum Teil auf den Verlust von extrazellulären Matrix (ECM) Leitfäden zurückzuführen, sowie die Unfähigkeit von SCs, den regenerativen Phänotyp über lange Zeiträume zu erhalten8.

Der Nervenregenerations- und Erholungsprozess ist eng mit dem Zustand der Basallamina nach verletzungen verbunden. Die Basallamina ist eine Schicht eCM um den Nerv, die die Führung erleichtert und ECM-gebundene Hinweise für Axone und SCs in Fällen liefert, in denen sie nach Verletzung intakt bleibt9. Der Zustand des ECM und seine Fähigkeit, Matrix gebundene Hinweise an Zellen zu liefern, ist von entscheidender Bedeutung und wurde zuvor in einer Vielzahl von verschiedenen Kontexten10,11,12,13,14untersucht. Beispielsweise wurde gezeigt, dass die Steifigkeit des ECM Zellfunktionen wie Proliferation und Differenzierung11,15,16steuern kann. Die Zusammensetzung des ECM kann auch zu einer deutlichen zellulären Reaktion führen und Zellverhalten wie Migration und Differenzierung durch intrazelluläre Signalwege17,18regulieren. Darüber hinaus spielt die Zellmorphologie, einschließlich Verbreitungsgebiet und zellulärer Dehnung, eine wichtige Rolle bei der Regelung der Funktion und kann durch ECM-gebundene Hinweise19,20geregelt werden. Viele frühere Studien haben sich auf Stammzellen konzentriert, die sich in definierte Abstammungslinien differenzieren, aber SCs besitzen eine ähnliche Fähigkeit, Phänotyp von einem homöostatischen, erwachsenen SC innerhalb eines gesunden Nervs zu einem Reparatur-SC zu verändern, der in der Lage ist, Proteine und Wachstumsfaktoren zu sezernieren, während das ECM nach einer Nervenverletzung5,21umgestaltet wird. Daher ist es besonders wichtig, Mechanismen zu identifizieren, die der Beziehung zwischen der angeborenen SC-Regenerationsfähigkeit und eCM gebundenen Hinweisen für die Einsicht zugrunde liegen, um diese Fähigkeit zur Nervenregeneration letztendlich zu nutzen.

Um diesem Problem zu begegnen, haben wir eine detaillierte Methodik entwickelt, um ein Zellkultursubstrat zu produzieren, bei dem mechanische Steifigkeit und Ligandentyp leicht in physiologisch relevanten Bereichen abgestimmt werden können. Polydimethylsiloxan (PDMS) wurde aufgrund seiner hochgradig einstellbaren Mechanik im Vergleich zu Polyacrylamid-Gel als Substrat gewählt, wobei der maximale Young-Modul etwa 12 kPa beträgt, der mit PDMS bei etwa 1000 kPa22,23,24kontrastiert wird. Dies ist von Vorteil für die vorstehende Arbeit, da neuere Studien gezeigt haben, dass der Young-Modul eines Kaninchen-Ischiasnervs während der Entwicklung 50 kPa überschreiten kann, was darauf hindeutet, dass der Steifigkeitsbereich der Nerven innerhalb des PNS größer ist als bisher untersucht. Verschiedene Proteine sind in der Lage, auf PDMS-Substrate natobieren, um die kombinatorische Regulierung von Mechanik und Liganden auf SC-Verhalten zu analysieren. Dies ermöglicht die Untersuchung mehrerer mikroökologischer Hinweise im PNS-Regenerationsprozess und den Vergleich eines hohen Grades an Tunabilität mit der Arbeit, die sich ausschließlich auf die Steifigkeit des Substrats25konzentriert. Darüber hinaus sind diese technisch entwickelten Zellkultursubstrate mit einer Vielzahl von quantitativen Analysemethoden wie Immunhistochemie, Western Blot und quantitative Polymerase-Kettenreaktion (q-PCR) kompatibel.

Diese entwickelte Zellkulturplattform eignet sich aufgrund der hohen individuellen Abstimmungsfähigkeit jedes ECM-gebundenen Signals hervorragend zur Analyse mechanistischer Bahnen. Darüber hinaus können auf den Substraten gängige Methoden für das Zellmikromusterung, einschließlich des Mikrokontaktdrucks, erreicht werden, um eine kontrollierte zelluläre Haftung zu ermöglichen, um die Zellform im Verhältnis zu anderen ECM-gebundenen Cues24zu analysieren. Dies ist von entscheidender Bedeutung, da liniengemusterte Substrate, die die Dehnung in Zellpopulationen fördern, ein Werkzeug zur Nachahmung und Untersuchung von länglichen und regenerativen SCs innerhalb von Büngner-Bändern während der Nervenregeneration darstellen. Darüber hinaus ist die zelluläre Morphologie ein potenter Regler mehrerer Zellfunktionen und kann potenziell verwirrende experimentelle Ergebnisse liefern, wenn sie nicht kontrolliert26,27. Den Mechanismen, die den regenerativen Phänotyp SC gemäß den ECM-Cues28,29,30regeln, wird nun große Aufmerksamkeit geschenkt. Dies ist wichtig, um Einblicke in die Gestaltung von Biomaterialien zu geben, die als Nervenleitschläuche zur Unterstützung der PNS-Nervenregeneration eingesetzt werden können. Diese detaillierten Protokolle können letztlich als potenzielles Werkzeug zur Entschlüsselung der Mechanismen der SC- und anderer Zelltypfunktionen eingesetzt werden, wie sie durch ECM-gebundene Cues reguliert werden.

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Protocol

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1. Tunable Zellkultur Substrat Vorbereitung und Charakterisierung

  1. Substratvorbereitung
    1. Mischen Sie das PDMS-Basiselastomer und die Härtungsmittel mit einer Pipettenspitze kräftig im Verhältnis zwischen 10:1 und 60:1, bis Blasen in der Mischung homogen dispergiert werden. Entfernen Sie Blasen mit Vakuum-Austrocknung, bis Blasen abgeführt werden.
      HINWEIS: Während der PDMS-Polymerisation kreuzt das Härtungsmittel mit dem Basiselastomer, um die gewünschten mechanischen Eigenschaften des endgültigen Polymers zu liefern. Crosslink-Verhältnisse können angepasst werden, um die PDMS-Steifigkeit zu ändern.
    2. Legen Sie einen Tropfen (0,2 ml) der getrockneten PDMS-Mischung auf einen quadratischen oder kreisförmigen Deckslip (z. B. 22 mm x 22 mm) und drehen Sie den Deckelaufschuh auf einem Spincoater bei 2500 U/min für 30 s.
    3. Inkubieren Sie den Deckelinrutsch entweder in einem Ofen bei 60 °C für 1-2 h oder Raumtemperatur über Nacht, damit PDMS erstarren kann.
    4. Behandeln Sie den Deckelrutsch mit UV-Ozonreiniger für 7 min (UV-Wellenlänge: 185 nm und 254 nm), um die Oberflächenhydrophilitizität zu erhöhen. Legen Sie es in eine sterilisierte 6-Well-Platte.
    5. Vor der Verwendung für die Zellkultur, inkubieren Substrate in 70% Ethanol für mindestens 30 min.
      VORSICHT: UV-Ozonreiniger kann für den Menschen schädliches Ozon erzeugen. Arbeiten Sie in einer chemischen Dunstabzugshaube oder mit irgendeiner Form der Belüftung.
    6. Eintauchen in die Proteinlösung (10 g/ml Kollagen I, Fibronectin oder Laminin) für 60 min in einem sterilen Inkubator bei 37 °C.
      HINWEIS: Nach der UV-Ozon-Behandlung kann die PDMS-Oberfläche noch hydrophob sein. Drehen Sie die Wellplatte, um sicherzustellen, dass jeder Coverslip mit der Proteinlösung abgedeckt ist.
    7. Die Proteinlösung ansaugen und den Deckelschlupf mit Phosphatgepufferter Saline (PBS) 3x waschen.
    8. Re-suspend RT4-D6P2T Schwann Zelllinie (SCs) von Passaging Schale mit handelsüblichen EDTA-Lösung (1x) mit 2,5% Trypsin und zählen Zellen mit Hämozytometer. Seed SCs auf der abstimmbaren PDMS-Oberfläche bei der gewünschten Zelldichte. SC-Saatdichten können für jede Anwendung variieren.
    9. Halten Sie Zellen in den gewünschten Zellkulturparametern (90% Luftfeuchtigkeit, 5%CO2, 37 °C, etc.) für die Dauer des Experiments. Verwenden Sie Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin-Streptomycin als Zellkulturmedium.
  2. Mikromuster-Substratpräparation
    1. Zeichnen Sie die gewünschten Geometrie- und Zellklebstoffflächen (900 m2, 1.600 m2 und 2.500m2) mit computergestützter Design-Software (CAD). Erstellen Sie eine Chrom-Fotomaske basierend auf diesen Mustern von einem kommerziellen Anbieter.
    2. Verwenden Sie in einem Reinraum oder in einer staubfreien Umgebung Standard-Photolithographie-Techniken, um Siliziumwafer herzustellen (Protokolle werden an anderer Stelle detailliert beschrieben31). Kritische Parameter für diese spezielle Anwendung sind wie folgt: Photoresist: SU-8 2010; Spin-Profil, um den Photoresist zu zerstreuen: 500 U/min für 10 s mit einer Beschleunigung von 100 U/min/ s, dann 3500 U/min für 30 s mit einer Beschleunigung von 300 U/min; Belichtungsenergie von UV-Licht: 130 mJ/cm2.
      ANMERKUNG: Die Höhe der Muster auf den Siliziumwafern beträgt ca. 10 m nach diesen Parametern. Potenzielle Risse am Rand außerhalb der rechteckigen oder dreieckigen Muster können mit einem Lichtmikroskop nach Schritt 1.2.2 beobachtet werden. Das Backen des Siliziumwafers bei 190 °C für 30 min hilft, die Risse zu beseitigen.
    3. Legen Sie den gemusterten Siliziumwafer in eine kreisförmige 150 mm Durchmesser x 15 mm Höhe Petrischale und gießen Sie entgastiertes PDMS (Mischverhältnis 10:1) wie in Schritt 1.1.1 auf den Siliziumwafer vorbereitet.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Dicke von PDMS mindestens 5 mm beträgt, um die Handhabung während der Druckschritte mit Mikrokontakt zu vereinfachen.
    4. VERfestigen SIE PDMS auf Siliziumwafer n. Chr. bei 60 °C über Nacht. PDMS auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Präzise geschnittene Stempel von 30 mm x 30 mm Quadraten, die die richtigen Muster aus dem Siliziumwafer mit einem chirurgischen Skalpell enthalten. Beschädigen Sie den Siliziumwafer nicht.
      HINWEIS: Siliziumwafer können an dieser Stelle mehrmals wiederverwendet werden, um nach der Reinigung mit Isopropanol mehr Stempel zu produzieren.
    5. Sterilisieren Sie PDMS-Stempel und die abstimmbaren Abdeckungen (in Schritt 1.1.1 bis 1.1.3) durch Eintauchen in 70% Ethanol für 30 min.
    6. Um die Wirksamkeit von Mikromustern durch PDMS-Stempel nach Mikrokontaktdruck zu bestätigen, trocknen Sie die Oberfläche von PDMS-Stempeln mit einem gefilterten Luftstrom und einer Pipetten-Lösung 50 g/ml BSA (Texas Red conjugated), um die gesamte gemusterte Seite des PDMS-Stempels abzudecken.
    7. Inkubieren Sie PDMS-Stempel mit BSA-Lösung für 1 h bei Raumtemperatur, um eine Proteinadsorption zu ermöglichen.
    8. Trocknen Sie die Oberfläche der abstimmbaren Abdeckungen mit einem gefilterten Luftstrom, erhöhen Sie die Oberflächenhydrophiliität, wie in Schritt 1.1.5 beschrieben.
    9. Trocknen Sie die PDMS-Stempel an die Luft, um die verbleibende BSA-Lösung zu entfernen.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, dass die BSA-Lösung vollständig aus dem Stempel entfernt wird, da jede verbleibende Lösung dazu führt, dass Während des Mikrokontaktdrucks Stempel auf dem Deckblatt gleiten.
    10. Bringen Sie die gemusterte Seite des Stempels in konformen Kontakt mit dem abstimmbaren Deckschein für die BSA-Adsorption auf der Deckslip-Oberfläche. Drücken Sie den Stempel vorsichtig 5 min gegen den Deckel.
      HINWEIS: Wenden Sie keine übermäßige Kraft auf den Stempel an, da er sich verbiegt und einen unspezifischen Kontakt zwischen Stempel und Deckblatt verursacht. Die entsprechende Kraft, die auf den Stempel ausgeübt wird, ist für den erfolgreichen Mikrokontaktdruck unerlässlich.
    11. Untersuchen Sie das Mikromuster mit einem Fluoreszenzmikroskop mit einem FITC-Filter (Fluorescein isothiocyanate).
    12. Um Zellklebeflächen statt fluoreszierender Muster zu drucken, ersetzen Sie Laminin gegen BSA-Protein und wiederholen Sie Schritt 1.2.5 bis 1.2.10.
    13. Stempel von Coverlips entfernen, Coverlips in eine sterilisierte 6-Well-Platte übertragen. Fügen Sie 2 ml 0,2% mit pluronischer F-127-Lösung in jeden Brunnen ein, um die Oberfläche des Deckels zu bedecken und 1 h bei Raumtemperatur zu brüten.
      HINWEIS: Pluronische F-127 kann auf PDMS-Oberfläche adsorbiert werden, was die Hydrophobie der PDMS-Oberfläche erhöht, um Zellen vor der Haftung zu blockieren.
    14. Aspirieren Pluronische F-127 Lösung und waschen 5x mit PBS und 1x mit dem Zellkulturmedium vor der Aussaat zellen. Eine typische Sädichte für SCs beträgt 1.000 Zellen/cm2.
    15. 45 min nach dem Aussaat der Zelle, entfernen Sie das Zellkulturmedium und waschen Sie Abdeckungen mit PBS 2x, um zu verhindern, dass mehrere SCs an demselben Muster haften. Bewahren Sie Zellen in der gewünschten Zellkulturumgebung für 48 h vor der Quantifizierung.
    16. Um liniengemusterte Zellkultursubstrate zu erstellen, um ausgerichtete Zellen zu untersuchen, führen Sie Schritt 1.2.1 bis 1.2.4 aus, um Stempel für den Mikrokontaktdruck zu erstellen.
      ANMERKUNG: Die Abmessungen der Nut/Grat der gefütterten Muster auf Stempel sind 50 x 50 m für die umrissenen Zellen. Die Gesamtabmessungen des Stempels betragen 10 mm x 10 mm.
    17. Schneiden Sie Stempel in Maße, die nur gewünschte Linienmuster enthalten.
      HINWEIS: Beim Erstellen von Stempeln in CAD entspricht der ungemusterte Bereich des Stempels um die Linienmuster dem Zellklebstoffbereich nach dem Mikrokontaktdruck. Daher ist es notwendig, ungemusterte Bereiche beim Ausschneiden des Stempels zu beseitigen, um sicherzustellen, dass jeder SC, der auf der Oberfläche gesät wird, den Mustern folgt.
    18. Folgen Sie Schritt 1.1.1 bis 1.1.3, um eine abstimmbare PDMS-Oberflächenbeschichtung von zwei Petrischalen vorzubereiten.
      HINWEIS: Dies wird PDMS, das die Petrischale Oberfläche selbst und nicht auf einem Deckschein bedeckt.
    19. Folgen Sie Schritt 1.2.5 bis 1.2.10, um Mikrokontaktdruck durchzuführen, um liniengemusterte Zellklebstoffbereiche auf einem der PDMS-beschichteten Petrischalen zu drucken.
      HINWEIS: Die Oberfläche einer 60 mm x 15 mm Petrischale kann liniengemusterte Flächen aus 6 PDMS-Stempeln enthalten.
    20. Stempel entfernen und die Petrischale mit 4 ml 0,2% mit Pluronischer F-127 Lösung füllen und 1 h brüten.
    21. Nach dem Mikrokontaktdruck spülen Sie jede Seite der PDMS-Stempel mit 70% Ethanol 3x und trocknen Sie mit Luft. Drehen Sie PDMS-Stempel und folgen Sie Schritt 1.2.5 bis 1.2.10, um den ungemusterten Zellklebstoffbereich mit der ungemusterten Seite des Stempels auf der zweiten Petrischale zu drucken. Wiederholen Sie Schritt 1.2.13.
    22. Aspirat F-127 Lösung aus Geschirr, waschen 3x mit PBS gefolgt mit 1x Waschen mit frischer Zellkultur Medium. Samen SCs auf Geschirr.
      HINWEIS: Die Saatdichte für eine liniengemusterte Schale beträgt 5.000 Zellen/cm2 und für eine ungemusterte Schale 10.000 Zellen/cm2.
    23. Verwalten Sie SCs zu den gewünschten Bedingungen für 48 h und befolgen Sie Protokolle, um SC-Lysatevorzubereiten 32.
      HINWEIS: Die Zellsädichte für ungemusterte Gerichte ist 2x höher als die für liniengemusterte Gerichte, da die liniegemusterte Schale nur die Hälfte der Zellklebstofffläche der ungemusterten Schale hat.
      1. Zur Herstellung von Lysaten einen ausreichenden Radioimmunpräzipitations-Assay (RIPA) auf ein 10 ml konisches Zentrifugenrohr übertragen. Protease- und Phosphatase-Inhibitor (100x) im Verhältnis 1:100 im RIPA-Puffer verdünnen, durch Pipettieren gut vermischen.
      2. Waschen Sie Zellen mit eiskaltem PBS (1x) für 2 min, fügen Sie 80 l der Lösung, die ab Schritt 1.2.23.1 hergestellt wird, auf jeden Zellklebstoffbereich (den Bereich, der mit PDMS-Stempeln und adsorbiertem Protein kontaktiert wurde) in Petrischalen hinzu. Inkubieren Sie Zellen mit der Lösung auf einem Eisblock für 15 min.
        HINWEIS: Die Lösung bleibt aufgrund der Hydrophobie der Pluronischen F-127 Adsorption an anderer Stelle nur auf dem Zellklebstoffbereich. Diese Funktion ermöglicht eine erfolgreiche und ausreichende Proteinextraktion für liniengemusterte SCs.
      3. Schrott-SCs mit einem Zellschaber für 5 min. Lysat in ein beschriftetes 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr sammeln.
      4. Mikrozentrifugieren Lysat bei 12.000 x g für 15 min bei 4°C. Überstand mit einer 1.000-L-Pipette sammeln und in ein sauberes Mikrozentrifugenrohr geben. Zelle lysieren bei -20 °C.
  3. Substratcharakterisierung
    HINWEIS: Um die Mechanik des Polymers auf dem Deckblatt zu charakterisieren, werden in der Regel mehrere Methoden eingesetzt, einschließlich Massenkompressionstests11,33 oder Atomkraftmikroskopie-Tests34. Dieses Protokoll beschreibt Massenkomprimierungstests.
    1. Gießen Sie den PDMS-Vorläufer des gewünschten Mischungsverhältnisses (Schritt 1,1) in eine 30 mm Petrischale, stellen Sie sicher, dass die Dicke der PDMS-Schicht innerhalb der Petrischale mindestens 20 mm beträgt.
    2. Die Petrischale mit erstarrtem PDMS nach 1 H aus dem 60 °C-Ofen nehmen und bei Raumtemperatur abkühlen lassen. Polymer in 10 mm x 10 mm Quadrate schneiden. Messen Sie die Dicke von PDMS mit Bremssätteln.
    3. PdMS auf die Bühne der Kompressionskraftmessmaschine stellen. Stecken Sie den Kompressionskraftsensor (Modell: 112C) an den Sensoranschluss und fixieren Sie den Sensor an der Achse der Prüfmaschine.
    4. Stellen Sie die Höhe des Sensors auf ca. 0,5 cm über dem PDMS-Stempel ein, indem Sie die "Jog"-Steuerung auf der Vorderseite des Instruments verwenden.
    5. Öffnen Sie die zugehörige Software mit "Test Setup" Fenster, wählen Sie "Servoprofil", und öffnen Sie das "Segment" Fenster. Geben Sie imFensterSegment " " " " "Control Rate" und "End Amount" für den Test ein.
      HINWEIS: Die Steuerrate bestimmt die Geschwindigkeit, mit der der Sensor nach unten zum PDMS fährt. Der Endbetrag bestimmt die Gesamtentfernung, die der Sensor zurücklegt.
    6. Verwenden Sie die Taste "Z" auf dem Bedienfeld der Software, um alle Messungen an dieser Stelle zurückzusetzen.
    7. Bewegen Sie den Sensor nach unten, um PDMS leicht zu berühren, bis 1-2 Newton (N) geladen sind. Die Beladung und der Abstand, den der Sensor zurücklegt, werden in der Software angezeigt.
    8. Nachdem Sie die Schaltfläche "Z" verwendet haben, führen Sie die Messung mit "Play" aus und speichern Sie die Dateiaufnahmekraft und -entfernung.
    9. Wiederholen Sie die Schritte 1.3.3 bis 1.3.8 für jede experimentelle Erkrankung von PDMS.
    10. Öffnen Sie die Datei und verwenden Sie die folgende Formel, um den Young-Modul (E) von PDMS für jedes Verhältnis zu berechnen. (F = Kompressionskraft, A = Bereich des PDMS-Stempels, -L = Fahrabstand des Sensors und L0 = Originaldicke des PDMS-Stempels).
      Equation 1

2. Quantifizierung der zellulären Eigenschaften auf abstimmbaren Substraten

  1. Proliferation assay
    1. Samen-SCs auf Substraten, die ab Schritt 1.1.9 mit einer2 Dichte von 5.000 Zellen/cm2 in einer 6-Well-Platte hergestellt werden. Lassen Sie SCs für 48 h unter Standard-Zellkulturbedingungen (37 °C und 5%CO2)inkubieren.
    2. 12 l von 10 mM Bromodeoxyuridin (BrdU) Stammlösung in 12 ml 37 °C Zellkulturmedium verdünnen, gut mit Pipette mischen, um 10 M BrdU Etikettierlösung zu machen.
    3. Entfernen Sie das Zellkulturmedium und waschen Sie SCs 2x mit PBS.
    4. Fügen Sie 2 ml BrdU-Etikettierlösung in jeden Brunnen und inkubieren SCs für 2 h.
      HINWEIS: Die Inkubationszeit der BrdU-Etikettierungslösung hängt von der spezifischen Zellproliferationsrate ab. Die RT4-D6P2T SC-Linie hat eine hohe Proliferationsrate, so dass 2 h Inkubationszeit verwendet wurde.
    5. BrdU-Etikettierlösung entfernen und SCs 3x mit PBS waschen. Fügen Sie 1 ml 3,7% Formaldehyd in PBS zu jedem Brunnen hinzu und brüten bei Raumtemperatur für 15 min zur Zellfixierung.
      VORSICHT: Formaldehyd ist ein menschliches Karzinogen; führen Sie daher alle Arbeiten innerhalb einer chemischen Rauchhaube mit entsprechendem Schutz durch.
      HINWEIS: Beim Waschen mit PBS gibt es kein Zellkulturmedium im Brunnen, und daher kann die PDMS-Oberfläche hydrophob sein. Ergreifen Sie Vorsichtsmaßnahmen, um die Oberfläche des Substrats nicht vollständig zu trocknen, um Zellschäden zu verhindern.
    6. Formaldehydlösung ansaugen und 3x mit PBS (je 3 min) waschen. Entfernen Sie PBS und fügen Sie 1 ml 0,2% Triton X-100 in PBS zu jedem Brunnen hinzu, um die Zellmembran zu permeabilisieren. Inkubieren Sie SCs mit Triton X-100 Lösung für 20 min bei Raumtemperatur.
    7. Entfernen Sie Triton X-100 Lösung und waschen Sie SCs 3x mit PBS (jeweils 3 min).
    8. Fügen Sie 1 ml 1 N HCl in jeden Brunnen und inkubieren auf Eis für 10 min. Entfernen Sie 1 N HCl und fügen Sie 1 ml 2 N HCl in jedem Brunnen und inkubieren bei Raumtemperatur für 10 min. HCl Behandlung ist für DNA-Hydrolyse.
    9. Mischen Sie 182 ml 0,2 mM Na2HPO4 und 18 ml 0,1 ml Zitronensäure, um einen Phosphat-/Zitronensäurepuffer für die Antigenrückgewinnung zu erzeugen. 2 N HCl entfernen und 1 ml Phosphat/Zitronensäurepuffer in jeden Brunnen geben und bei Raumtemperatur 10 min inkubieren.
    10. Waschen Sie SCs 3x mit 0,2% Triton X-100 in PBS. Fügen Sie 2 ml 3% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS in jeden Brunnen und inkubieren für 30 min bei Raumtemperatur, um unspezifische Bindung des Antikörpers zu takten.
    11. Verdünnung des BrdU-Primärantikörpers mit Alexa Fluor 488 in 3% BSA-Lösung im Verhältnis 1:300 für BrdU-Färbelösung. Inkubieren Sie SCs mit Färbelösung über Nacht bei Raumtemperatur, während die Platte mit Aluminiumfolie bedeckt ist.
    12. Zur Quantifizierung der Proliferation werden Bild-SCs mit dem FITC- und DAPI-Kanal eines Fluoreszenzmikroskops zum Nachweis von BrdU bzw. Kernen verwendet. Speichern Sie Bilder als "nd.2"-Dateien.
    13. Öffnen Sie "nd.2"-Dateien für jedes Bild, das an identischen räumlichen Positionen aufgenommen wurde.
    14. Öffnen Sie die Bildanalysesoftware. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Hintergrund, um das Fenster "Automatisierte Messergebnisse" und "Automatisierte Messung" im Abschnitt "Analysesteuerung" zu öffnen.
    15. Wählen Sie im Menü" Count & Taxonomy" "Count" aus. Klicken Sie auf dem FITC-Bild auf jeden Kern mit grüner Fluoreszenz (BrdU-positiv) und mit der rechten Maustaste auf das Bild.
      HINWEIS: Die Anzahl der BrdU-positiven Zellen wird im Fenster"Automatisierungen und Messungen" angezeigt.
    16. Wiederholen Sie für DAPI-Bilder Schritt 2.1.14, um die Anzahl der Gesamtkerne zu zählen. Berechnen Sie den Prozentsatz der BrdU-positiven Zellen für dieses Bild.
    17. Wiederholen Sie Schritt 2.1.13 bis 2.1.16 für andere Bilder zu statistischen Zwecken und berechnen Sie den durchschnittlichen Prozentsatz der BrdU-positiven Zellen für jede Substratbedingung.
  2. Quantifizierung der c-Jun-Expression durch immunfluoreszierende Bildanalyse
    1. Zellen, die in 6-Well-Platten aus Schritt 1.1.9 und 1.2.23 hergestellt werden, werden mit den zuvor beschriebenen Verfahren fixiert und permeabilisiert (Schritt 2.1.5-2.1.7).
      HINWEIS: Um genaue Vergleiche der Fluoreszenzintensität über Zellen unterschiedlicher ECM-Bedingungen hinweg durchzuführen, wenden Sie kameraeinstellungen auf alle Proben identisch an, wobei alle Proben die gleichen Parameter aufweisen.
    2. Speichern Sie Bilder als ".nd2"-Dateien.
    3. Öffnen Sie die Bildanalysesoftware. Rechtsklick Hintergrund, um das Fenster "Automatisierte Messergebnisse" und "Automatisierte Messung" im Abschnitt "Analysesteuerung" zu öffnen.
    4. Wählen Sie unter "Automatisierte Messergebnisse" "Objektdaten" aus. Aktivieren Sie die Schaltfläche "Messung aktualisieren".
    5. Wählen Sie im oberen Bereich der Software "Measure" gefolgt von "Objektfunktionen" aus. Fügen Sie "Mean Intensity" dem Abschnitt von "Selected for Measurement" hinzu.
    6. Öffnen und verschmelzen Sie zwei ".nd2"-Bilddateien, die Bilder von c-Jun und Kernen enthalten.
    7. Wählen Sie im oberen Bereich "ROI" und "Zeichnen des rechteckigen ROI" aus. Zeichnen Sie einen rechteckigen Bereich, der den Kernbereich einer einzelnen Zelle enthält.
      HINWEIS: der c-Jun-Ausdruck ist innerhalb der Kerne35konzentriert.
    8. Wählen Sie im oberen Bereich der Software "Binary" und "Define Threshold" ein neues Fenster aus, um den c-Jun-Fluoreszenzbereich genau zu definieren.
    9. Klicken Sie im neuen Fenster auf"Vollbild/ROIverwenden ", um das Programm vom vollständigen Bildmodell zum ROI-Modell zu wechseln. Verwenden Sie "Intensität", um die Nachschlagetabelle auf der linken Seite des Fensters anzupassen, um die Größe/Form des hervorgehobenen Bereichs innerhalb des rechteckigen ROI anzupassen.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, dass die Größe/Form des hervorgehobenen Bereichs mit dem Kern identisch ist.
    10. Klicken Sie auf die Schaltfläche "OK", um die mittlere FITC-Intensität im Fenster"Automatisierte Messergebnisse" zu erhalten, und klicken Sie dann auf "Daten speichern".
    11. Im Fenster "Automatisierte Messung", " Objektlöschen", um den rot markierten Bereich zu entfernen. Verwenden Sie auf der linken Seitenseite "Zeigewerkzeug", um den rechteckigen ROI auszuwählen und zu löschen.
    12. Wiederholen Sie Schritt 2.2.6 bis 2.2.11, um die mittlere FITC-Intensität für jede weitere Zelle zu messen.
    13. Wählen Sie im Fensterbereich von "Automatisierte Messergebnisse" "Gespeichert" aus und alle gespeicherten Daten werden angezeigt. Verwenden Sie die Funktion "Exportieren" und wählen Sie "Daten nach Excel", um die exportierte Kalkulationstabelle zu speichern und zusätzliche Berechnungen durchzuführen.
  3. Quantifizierung der nuklearen Dehnung
    1. Fix- und Permeabilize-SCs, die ab Schritt 1.2.22 nach den Schritten 2.1.5-2.1.7 erstellt wurden. Führen Sie die Kernfärbung mit Montagemedium mit DAPI durch.
    2. Mit dem DAPI-Kanal und einem 40-fachen Objektiv können Sie Bilder des Samples erfassen und als ".nd2"-Dateien speichern.
    3. Folgen Sie den Schritten 2.2.3 und 2.2.4, um das Fenster"Automatisierte Messergebnisse" und"Automatisierte Messung" in der Bildanalysesoftware zu öffnen.
    4. Verwenden Sie in "Automated Measurement Results" die Funktion Option, gefolgt von "Objektfeatureauswählen ".Option Wählen Sie in der Spalte "Feature" " "" "Dehnung" aus und fügen Sie der Spalte "Ausgewählt für Messungen" hinzu. Verwenden Sie "Aktualisierungsmessung beibehalten", um diese Funktion zu aktivieren.
    5. Öffnen Sie die Bilddatei "nd.2", die die Kernbilder enthält. Wählen Sie im Fenster"Automatisierte Messung" die Funktion"Auto-Erkennung" und wählen Sie einen Kern aus. Rechtsklick auf das Bild und das gemessene kerntechnische Seitenverhältnis wird in "Automatisierte Messergebnisse" angezeigt.
    6. Wiederholen Sie Schritt 2.3.5, um die nuklearen Seitenverhältnisse für andere Kerne innerhalb des Bildes zu quantifizieren. Wählen Sie "Daten speichern" im Fenster "Automatisierte Messergebnisse" aus.
    7. Wiederholen Sie 2.3.5 bis 2.3.6 für zusätzliche Bilder. Exportieren Sie die Daten zur Analyse in eine Tabellenkalkulationsdatei, wie zuvor in 2.2.13.
  4. Western Blot zur Quantifizierung der Proteinexpression
    1. Befolgen Sie Standardprotokolle für die Western Blot-Analyse, die an anderer Stelle detailliert sind32. Die Verdünnungen der in der Studie verwendeten Antikörper sind unten dargestellt: Rabbit anti c-Jun 1:2,000; Maus-Anti-Actin 1:1.000; Kaninchen anti p75NTR 1:1.000; Kaninchen anti Myelin Grundprotein 1:1.000; Anti-Maus/Kaninchen IgG, HRP-gebundener Antikörper 1:10.000.

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Representative Results

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Um das Zusammenspiel zwischen Substratsteifigkeit und Proteinzusammensetzung auf SC-Phänotyp zu analysieren und zu quantifizieren, wurde ein abstimmbares PDMS-Zellkultursubstrat entwickelt (Abbildung 1A). Kompressionsprüfung des Polymers auf unterschiedlicher Basis: Härtungsmittelverhältnisse wurden verwendet, um den Young-Modul (E) des Substrats zu quantifizieren (Abbildung 1B). Der resultierende Modulbereich stellt physiologisch relevante Substratbedingungen dar. Nach der Herstellung von Substraten wurden SCs kultiviert und zelluläre Eigenschaften auf der abstimmbaren Mikroumgebung analysiert. Die Proliferationsraten von SCs auf Substraten unterschiedlicher Proteinzusammensetzung wurden zuerst analysiert. Lamininbeschichtete Substrate führten zu einer höheren Proliferationsrate im Vergleich zu Kollagen I und Fibronectin-Adsorption alle bei 10 g/ml (Abbildung 2A,B). SCs auf Substraten mit Lamininbeschichtung und unterschiedlichen Moduli zeigten, dass relativ weichere Substrate (E=3,85kPa) die Zellproliferationsraten über alle Bedingungen hinweg verringern(Abbildung 2C,D). Die Unterschiede zwischen steifen Substraten (E=1119kPa) und relativ weichen Substraten (E=8,67kPa) waren jedoch unbedeutend (Abbildung 2D).

SCs wurden auch auf Proteinexpression durch Immunhistochemie und Western Blot analysiert. Die Konzentrationen des Transkriptionsfaktors c-Jun wurden durch immunfluoreszierende Mikroskopie analysiert (Abbildung 3A) und durch die mittlere Pixelfluoreszenzintensität dargestellt (Abbildung 3B-D). Die c-Jun-Expression erwies sich als upreguliert, da substrate weicher wurden (E=1119 kPa bis E=8,67 kPa), jedoch wurde auf den weichsten Substraten (E=3,85 kPa) die c-Jun-Expression signifikant downreguliert. Auf steifen Substraten (E=1119 kPa) ergaben Kollagen-I-beschichtete Substrate die höchste c-Jun-Expression, doch als Substrate weicher wurden (E=8,67 kPa und 3,85 kPa), zeigte Laminin die höchsten Konzentrationen von c-Jun(Abbildung 3E). Western Blot wurde auch verwendet, um sowohl c-Jun und Myelin Basisprotein (MBP) mit c-Jun-Spiegeln upregulated und MBP downregulated auf weicheren Substraten zu analysieren (Abbildung 3F). Darüber hinaus ergaben SCs, die auf lamininbeschichteten Substraten gesät wurden, die höchste c-Jun-Expression im Vergleich zu Kollagen I und Fibronectin.

Zellen unterschiedlicher Sädichten wurden dann kultiviert und mit Rhodaamin-Phalloidin befleckt, um die Rolle der Zellausbreitung und der Fläche in der c-Jun-Expression zu erforschen (Abbildung 4A,B). Zur Kontrolle der nuklearen Dehnung von Zellen wurde eine gängige Mikromustertechnik (Mikrokontaktdruck36) eingesetzt, um Zellklebelinien auf den Zellkultursubstraten zu erstellen. Das kernnukleare Seitenverhältnis von Zellen, die auf einem liniengemusterten Substrat gesät wurden, war signifikant höher als zellen, die auf ungemusterten Substraten gesät wurden (Abbildung 4C,D). Es wurde festgestellt, dass die Expression sowohl von c-Jun als auch von einem anderen Marker, der bei SC-regenerativen Phänotypen signifikant ist, p75 Neurotrophin-Rezeptor (p75 NTR), in dichten Zellen mit einem kleineren Verbreitungsgebiet hochreguliert wurde (Abbildung 4E). Liniengemusterte Zellen führten auch zu einer höheren Expression von c-Jun und p75 NTR im Vergleich zu nicht gemusterten Zellen (Abbildung 4F). Daher wurden mikrokontaktbedruckte Zellklebstoffgeometrien erstellt, um Zellstreufläche und Dehnung präzise zu steuern und gleichzeitig Zell-Zell-Wechselwirkungen zu eliminieren (Abbildung 5A). Die Abmessungen der gesamten Zellklebstoffflächen betrugen 900 m2, 1.600 m2und 2.500m2 mit einem Seitenverhältnis von 1 oder 4 (Zelllänge: Zellbreite). Fluoreszierendes Rinderserumalbumin (fBSA, Texas rot) Färbung wurde verwendet, um den Status von Mikromustern auf Zellkultursubstrat nach Mikrokontaktdruck zu offenbaren (Abbildung 5B). Das kernnukleare Seitenverhältnis von SCs für jeden Zellbereich wurde gemessen, und es wurde gezeigt, dass durch die Erhöhung des nuklearen Seitenverhältnisses die zelluläre Dehnung zunimmt (Abbildung 5C). Darüber hinaus wurde c-Jun mit zunehmendem SC-Seitenverhältnis hochreguliert (Abbildung 5D). Interessanterweise wurde jedoch festgestellt, dass die c-Jun-Expression mit zunehmender Zellstreufläche downreguliert ist (Abbildung 5E). Die Immunfluoreszenzfärbung sowohl für Kerne als auch für den aktinbestätigten Zellstreubereich und die Dehnung wurden durch diese Mikromustermethode stark kontrolliert (Abbildung 5F).

Figure 1
Abbildung 1: Zellkultursubstrate mit einstellbarer Steifigkeit und Proteinzusammensetzung. (A) Schemat, das die Entwicklung von PDMS-Zellkultursubstraten zeigt. (B) Das anfängliche PDMS-Mischverhältnis der Basis: Härtungsmittel bestimmt Youngs Modul. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: SC-Proliferationsraten, die durch Substratsteifigkeit und Proteinzusammensetzung reguliert werden. (A) Repräsentative Bilder, die BrdU-Färbung zeigen, wenn sie auf Substraten desselben Moduls kultiviert werden. (B) Histogramm mit dem Prozentsatz der BrdU-positiven Zellen für jede Proteinbeschichtung. (C) Repräsentative Bilder, die die BrdU-Einarbeitung in SCs zeigen, die auf Substraten derselben Proteinbeschichtung gesät sind. (D) Histogramm mit dem Prozentsatz der BrdU-positiven Zellen für den Modulwert jedes Youngs. Skalenbalken = 50 m. Die Daten werden als Mittelwert dargestellt. *p < .05, **p < .005, ***p < .0005. Teile der Figur wurden ab Ref.24geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Substratsteifigkeit und proteinregulierte SC-Proteinexpression. (A) Repräsentative Bilder zeigen c-Jun-Immunfluoreszenzfärbung für SCs, die auf Substraten unterschiedlicher Steifigkeit und Proteinzusammensetzung gesät sind. Die mittlere Pixelfluoreszenzintensität von c-Jun wurde für SCs gemessen, die auf (B) Kollagen I (C) Fibronectin und (D) laminbeschichteten Substraten unterschiedlicher Steifigkeit gesät wurden. (E) c-Jun Fluoreszenzniveau von SCs, gruppiert nach Youngs Substratmodul. (F) Western Blot zeigt c-Jun und Myelin-Basisprotein (MBP) von SCs, die auf Substraten gesät sind. Glyceraldehyd 3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) wurde als Ladekontrolle verwendet. Skalenbalken = 50 m. Die Daten werden als Mittelwert dargestellt. *p < .05, **p < .005, ***p < .0005. Teile der Figur wurden ab Ref.24geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Zelluläre Streufläche beeinflusst die Proteinexpression von SCs. (A) Zellstreufläche unterschiedlicher Sädichten wurde durch Rhodamine-Phalloidin (rot) und Kernfärbung (blau) visualisiert. (B) Histogramm mit der durchschnittlichen Verbreitungsfläche von SCs in jeder Bedingung. (C) Die Kerne von SCs, die auf ungemusterten oder liniengemusterten Substraten gesät wurden, wurden mit DAPI (blau) gebeizt, um morphologien zu zeigen. (D) Histogramm mit Quantifizierung des nuklearen Seitenverhältnisses auf gemusterten und ungemusterten Substraten. (E) Westlicher Fleck mit Expression von c-Jun und p75NTR von Zellen mit unterschiedlichem Verbreitungsgebiet. (F) Western Blot zeigt die Proteinexpression von SCs auf ungemusterten und liniengemusterten Substraten. Skalenbalken = 50 m. Die Daten werden als Mittelwert dargestellt. *p < .05, **p < .005, ***p < .0005. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: SC-Morphologie und Dehnungseffekt c-Jun-Expression von SCs. (A) Schematische Darstellung von Zellmikromustern für Formen unterschiedlichen Seitenverhältnisses. (B) fBSA-Färbung (rot) mit der Form von Mikromustern nach Mikrokontaktdruck. Skalenbalken = 10 m. (C) Histogramm mit kerntechnischem Seitenverhältnis von mikromusterten SCs. (D, E) Histogramm, das die mittlere Pixelfluoreszenzintensität von c-Jun für jede der geometrischen Bedingungen zeigt. (F) Rhodamine-Phalloidin (rot), Kerne (blau) und c-Jun (grün) wurden auf den unterschiedlichen Mikromustern gefärbt. Skalenbalken = 10 m. Die Daten werden als Mittelwert dargestellt. *p < .05, **p < .005, ***p < .0005. Teile der Figur wurden ab Ref.24geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

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SCs können die Nervenregeneration aufgrund ihrer phänotypischen Transformation und des regenerativen Potenzials nach Einer Nervenverletzung fördern. Wie ECM-Cues diese regenerative Neutungsfähigkeit regulieren, bleibt jedoch weitgehend unklar, was möglicherweise nicht nur die Entwicklung von Biomaterialien behindert, die die Nervenregeneration fördern sollen, sondern auch das Verständnis der Mechanismen, die an der Nervenregeneration beteiligt sind. Um dieses Zusammenspiel zu untersuchen, wurden Zellkultursubstrate geschaffen, auf denen ECM-Cues wie Steifigkeit, Proteinbeschichtung und Klebstofftopographie gesteuert werden können. Die Fähigkeit, die Totopographie von Klebstoffen mit Mikromuster zu erstellen, ist ein Schlüsselmerkmal innerhalb des Protokolls, wobei die gängige Methode des Mikrokontaktdrucks verwendet wird. Dieses Substrat unterscheidet sich jedoch von dem Glas dadurch, dass die Aufbringen der Kompressionskraft auf die PDMS-Stempel auf einem angemessenen Niveau sein muss, um die gewünschte Form von Zellklebstoffflächen auf Zellkultursubstraten zu erreichen. Die Verwendung von fluoreszierendem Rinderserumalbumin (fBSA) als Modellprotein zur Visualisierung von Zellklebstoffbereichen und zur Anpassung der Kompressionskräfte auf den PDMS-Stempeln kann dieses Problem letztlich mildern. Ein weiterer wichtiger Unterschied zum Glas ist die Entfernung von überschüssigem Pluronischem F-127, der verwendet wird, um den Rest des Substrats nicht klebend zu machen. Nach dieser Behandlung sind Zellkultursubstrate hochhydrophob, was es schwierig macht, Feuchtzellkultursubstrate während der Gesamten der Wärmittel zu erhalten, was für die strukturelle Integrität des mikrogemusterten Proteins37wichtig ist. Daher wird empfohlen, mehrere Pipetten zu verwenden, um Lösungen nahezu gleichzeitig zu aspirieren und zu injizieren, um zu verhindern, dass Substrate vollständig austrocknen.

Obwohl Mikromustern die Zellform präzise steuern können und keine komplizierten synthetischen Verfahren mit Zellblockierpolymeren wie OEGMA erfordern, sind die Methoden zur Quantifizierung der Proteinexpression von mikrogemusterten Zellen manchmal begrenzt38. Beispielsweise sind Proben, die aus Mikromustern zur Verfügung stehen, in der Regel auf einige hundert Zellen pro Deckslip beschränkt, was nicht ausreicht, um Zelllysate für westliche Flecken oder qPCR vorzubereiten. In Anbetracht dessen wurde allein die Immunfluoreszenzfärbung verwendet, um die Proteinexpression für mikrogemusterte Zellen zu quantifizieren und die Vielfalt der Proteine zu begrenzen, die quantifiziert werden können. Um diesem Problem zu begegnen, nutzten wir Linienmuster, um die Zelldehnung für größere Zellpopulationen zu fördern, und bereiteten erfolgreich Zelllysate vor, die durch Western Blot analysiert wurden. Andere Methoden wie angewandte elektrische Felder oder ausgerichtete elektrogesponnene Fasern können auch angewendet werden, um die Dehnung der Zellpopulationen39,40zu steuern. Allerdings passen elektrische Felder möglicherweise nicht in alle Anwendungen für NGCs, da die Leitfähigkeit von häufig verwendeten Biomaterialien wie Kollagen-basiertem Polymer und Seide sehr niedrig ist28,41,42. Im Gegensatz dazu wurden ausgerichtete elektrogesponnene Nanofasern erfolgreich in NGCs implantiert, um SC-Ausrichtung, Dehnung und Migration sowie Neuritenauswüchse43,44zu fördern. Es kann sich auch als überzeugend erweisen, sc-Verhalten auf liniengemusterten Substraten mit denen auf Substraten mit ausgerichteten Nanofasern zu vergleichen, da gefütterte Muster und ausgerichtete Nanofasern zwei der häufigsten Leitmechanismen sind, die in NGCs45integriert sind.

Das mikromusterende Protokoll verwendet PDMS-beschichtete Coverlips als Zellkultursubstrate mit einem maximalen Oberflächenmodul von 1119 kPa. Eine solche Steifigkeit imitiert viele Gewebe, aber es kann nicht möglich sein, Osteogenese von mesenchymalen Stammzellen zu modellieren, die in der Regel erfordern, dass die Oberfläche Youngs Modul 1 Gpa46überschreiten. Für solche Situationen ist Glas ein alternativer Kandidat, aber die Adsorption von Pluronic F-127 erfordert eine relativ hohe Oberflächenhydrophobie, die Glas nicht besitzt. Um die Hydrophobie zu erhöhen, kann Glas mit Dimethyldichlorsilan in Dichlorbenzol behandelt werden. Im Anschluss daran kann die UV-Ozon-Behandlung verwendet werden, um die Hydrophilie beim Mikrokontaktdruck zu erhöhen47.

Schließlich wurde eine Zellkulturplattform entwickelt, auf der ECM-Reize individuell mit quantifizierter Proteinexpression abgestimmt werden können. Wir haben festgestellt, dass die Sc-Regenerationskapazität durch bestimmte mechanische und chemische ECM-Hinweise gefördert wird, die in der Folge an der zukünftigen Gestaltung von Biomaterialanwendungen wie NGCs und Zelltransplantationsprozessen anregen können, bei denen ECM-Funktionen möglicherweise optimiert werden müssen24. Nichtsdestotrotz kann die Abstimmung dieser ECM-Hinweise ein schwieriges Unterfangen sein, insbesondere in vivo. In Zukunft kann diese Plattform genutzt werden, um Schlüsselmechanismen zu analysieren, die am phänotischen Übergang von SCs beteiligt sind, wie sie vom ECM reguliert werden. Dadurch kann die Manipulation intrazellulärer Hinweise möglich sein, die Sc-Regenerationsfähigkeit ohne spezielle Plattformen in vitro zu fördern48,49. Dies hat das Potenzial für wegweisende Arbeiten in der Entwicklung von Technologien für die Nervenreparatur.

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Disclosures

Die Autoren berichteten über keinen möglichen Interessenkonflikt.

Acknowledgments

Die Autoren danken der Förderung durch die Universität Cincinnati. Die Autoren danken auch Ron Flenniken von der University of Cincinnati Advanced Materials Characterization Laboratory für die Unterstützung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Albumin from Bovine Serum (BSA), Texas Red conjugate Thermo Fisher Scientific A23017 BSA staining to show micropatterns
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7076S Antibody used for western blot analysis
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7074S Antibody used for western blot analysis
BrdU Thermo Fisher Scientific B23151 Reagent used to measure cell proliferation
BrdU primary antibody conjugated with Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific B35130 Used to visualize BrdU in cell proliferation assays
Collagen I Thermo Fisher Scientific A10483-01 Protein used to coat coverslips
Compression force test machine TestResources Instrument to quantify mechanical properties of polymers
Dulbecco's Modified Eagle Medium Thermo Fisher Scientific 11965092 Cell culture medium
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 16000044 Cell culture medium supplemental
Fibronectin Thermo Fisher Scientific 33010-018 Protein used to coat coverslips
Fluorescence microscope Nikon Eclipse Ti2 Fluorescence microscope
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) Thermo Fisher Scientific 78440 Protease and Phosphatase Inhibitor
Laminin Thermo Fisher Scientific 23017015 Protein used to coat coverslips
Mounting medium with DAPI Thermo Fisher Scientific P36971 Coverslip mountant and nuclei staining
Mouse c-Jun primary antibody Thermo Fisher Scientific 711202 Primary antibody to visualize c-Jun protein
Mouse β-Actin primary antibody Cell Signaling Technology 3700S Loading control for western blot experiments
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 Cell culture medium supplemental
Photoresist SU 2010 KAYAKU SU8-2010 Photoresist
Pluronic F-127 Sigma Aldrich P-2443 Block non-specific protein binding
Rabbit c-Jun primary antibody Cell Signaling Technology 9165S Primary antibody for visualization of c-Jun protein
Rabbit myelin basic protein primary antibody Abcam ab40390 Primary antibody for visualization of MBP
Rabbit p75NTR primary antibody Cell Signaling Technology 8238S Primary antibody for visualization of p75NTR
Rhodamine phalloidin Thermo Fisher Scientific R415 Visualization of cell cytoskeleton
RIPA buffer Abcam ab156034 Cell lysis buffer
RT4-D6P2T Schwann cell line ATCC CRL-2768 Cell line used in experiments
SYLGARD 184 PDMS base and curing agent Sigma Aldrich 761036 Tunable polymer used to coat coverslips
Trypsin Thermo Fisher Scientific 15090-046 Cell dissociation reagent
UV-Ozone cleaner Novascan Increase hydrophicility of PDMS
Versene (1x) Thermo Fisher Scientific 15040066 Cell dissociation reagent

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References

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Xu, Z., Orkwis, J. A., Harris, G. M. Preparation of Tunable Extracellular Matrix Microenvironments to Evaluate Schwann Cell Phenotype Specification. J. Vis. Exp. (160), e61496, doi:10.3791/61496 (2020).More

Xu, Z., Orkwis, J. A., Harris, G. M. Preparation of Tunable Extracellular Matrix Microenvironments to Evaluate Schwann Cell Phenotype Specification. J. Vis. Exp. (160), e61496, doi:10.3791/61496 (2020).

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