Diese Methode soll die Mechanismen veranschaulichen, mit denen extrazelluläre Matrix-Cues wie Substratsteifigkeit, Proteinzusammensetzung und Zellmorphologie Schwann-Zell(SC)-Phänotyp regulieren.
Traumatische Verletzungen des peripheren Nervensystems (PNS) verfügen derzeit nicht über geeignete Behandlungen, um die volle funktionelle Genesung wiederzuerlangen. Schwann-Zellen (SCs), als die wichtigsten Gliazellen des PNS, spielen eine wichtige Rolle bei der Förderung der PNS-Regeneration, indem sie sich nach einer Verletzung zu einem regenerativen Zellphänotyp verleiten. Der dedifferenzierte Zustand von SCs ist jedoch eine Herausforderung für die Regeneration sanierbare Zeit und wird durch Veränderungen in der umgebenden extrazellulären Matrix (ECM) beeinflusst. Daher ist es von wesentlicher Bedeutung, das komplexe Zusammenspiel zwischen SCs und unterschiedlichem ECM zu bestimmen, um Hinweise auf das regenerative Potenzial von SCs zu liefern. Um diesem Problem zu begegnen, wurde eine Strategie entwickelt, bei der verschiedene ECM-Proteine auf ein abstimmbares Polydimethylsiloxan (PDMS)-Substrat adsorbiert wurden, das eine Plattform bot, auf der Steifigkeit und Proteinzusammensetzung moduliert werden können. SCs wurden auf die abstimmbaren Substrate gesät und kritische zelluläre Funktionen, die die Dynamik des SC-Phänotyps darstellen, wurden gemessen. Zur Veranschaulichung des Zusammenspiels zwischen SC-Proteinexpression und zellulärer Morphologie wurden neben individuellen mikrokontaktbedruckten Zellmustern auch unterschiedliche Sädichten von SCs verwendet und durch Immunfluoreszenzfärbung und Western Blot gekennzeichnet. Die Ergebnisse zeigten, dass Zellen mit einer kleineren Verbreitungsfläche und einem höheren Ausmaß der zellulären Dehnung höhere Konzentrationen von SC-regenerativen phänotypischen Markern förderten. Diese Methode beginnt nicht nur, die signifikante Beziehung zwischen dem ECM und der zellulären Funktion von SCs zu entwirren, sondern liefert auch Richtlinien für die zukünftige Optimierung von Biomaterialien in der peripheren Nervenreparatur.
Verletzungen des peripheren Nervensystems (PNS) stellen nach wie vor eine große klinische Herausforderung im Gesundheitswesen dar, da sie die Lebensqualität der Patienten gefährden und durch eine Vielzahl sozioökonomischer Faktoren eine signifikante Wirkung erzielen1,2. Schwann-Zellen (SC), als die wichtigsten Gliazellen im PNS, bieten notwendige molekulare und physikalische Hinweise, um die PNS-Regeneration zu induzieren und bei funktionellen Erholungen bei Kurzspaltverletzungen zu helfen. Dies ist auf die bemerkenswerte Fähigkeit von SCs zurückzuführen, sich in einen “Reparatur”-Zellphänotyp von einem myelinisierenden oder Remak-Phänotyp3zu unterscheiden. Die Reparatur SC ist ein unverwechselbarer Zellphänotyp in mehrfacher Hinsicht. Nach der Verletzung erhöhen SCs ihre Proliferationsrate, indem sie wieder in den Zellzyklus eintreten und mit der Expression mehrerer Transkriptionsfaktoren beginnen, um die Reinnervation zu erleichtern. Diese Faktoren, wie c-Jun und p75 NTR, sind hochreguliert, während myelinierende SC-Marker, wie Myelin-Basisprotein (MBP), nach unten reguliert werden4,5. Darüber hinaus ändern SCs die Morphologie, um sich zu verlängen und aufeinander auszurichten, um Büngner-Bänder über die Verletzungsstelle6zu bilden. Dies bietet einen physikalischen Leitmechanismus für die Axone, um sich auf das richtige distale Ziel7auszudehnen. Trotz der Fähigkeit, die SCs besitzen, um die Nervenregeneration bei Kurzstreckenverletzungen zu fördern, bleibt das Ergebnis der funktionellen Erholung bei schweren Verletzungen schlecht. Dies ist zum Teil auf den Verlust von extrazellulären Matrix (ECM) Leitfäden zurückzuführen, sowie die Unfähigkeit von SCs, den regenerativen Phänotyp über lange Zeiträume zu erhalten8.
Der Nervenregenerations- und Erholungsprozess ist eng mit dem Zustand der Basallamina nach verletzungen verbunden. Die Basallamina ist eine Schicht eCM um den Nerv, die die Führung erleichtert und ECM-gebundene Hinweise für Axone und SCs in Fällen liefert, in denen sie nach Verletzung intakt bleibt9. Der Zustand des ECM und seine Fähigkeit, Matrix gebundene Hinweise an Zellen zu liefern, ist von entscheidender Bedeutung und wurde zuvor in einer Vielzahl von verschiedenen Kontexten10,11,12,13,14untersucht. Beispielsweise wurde gezeigt, dass die Steifigkeit des ECM Zellfunktionen wie Proliferation und Differenzierung11,15,16steuern kann. Die Zusammensetzung des ECM kann auch zu einer deutlichen zellulären Reaktion führen und Zellverhalten wie Migration und Differenzierung durch intrazelluläre Signalwege17,18regulieren. Darüber hinaus spielt die Zellmorphologie, einschließlich Verbreitungsgebiet und zellulärer Dehnung, eine wichtige Rolle bei der Regelung der Funktion und kann durch ECM-gebundene Hinweise19,20geregelt werden. Viele frühere Studien haben sich auf Stammzellen konzentriert, die sich in definierte Abstammungslinien differenzieren, aber SCs besitzen eine ähnliche Fähigkeit, Phänotyp von einem homöostatischen, erwachsenen SC innerhalb eines gesunden Nervs zu einem Reparatur-SC zu verändern, der in der Lage ist, Proteine und Wachstumsfaktoren zu sezernieren, während das ECM nach einer Nervenverletzung5,21umgestaltet wird. Daher ist es besonders wichtig, Mechanismen zu identifizieren, die der Beziehung zwischen der angeborenen SC-Regenerationsfähigkeit und eCM gebundenen Hinweisen für die Einsicht zugrunde liegen, um diese Fähigkeit zur Nervenregeneration letztendlich zu nutzen.
Um diesem Problem zu begegnen, haben wir eine detaillierte Methodik entwickelt, um ein Zellkultursubstrat zu produzieren, bei dem mechanische Steifigkeit und Ligandentyp leicht in physiologisch relevanten Bereichen abgestimmt werden können. Polydimethylsiloxan (PDMS) wurde aufgrund seiner hochgradig einstellbaren Mechanik im Vergleich zu Polyacrylamid-Gel als Substrat gewählt, wobei der maximale Young-Modul etwa 12 kPa beträgt, der mit PDMS bei etwa 1000 kPa22,23,24kontrastiert wird. Dies ist von Vorteil für die vorstehende Arbeit, da neuere Studien gezeigt haben, dass der Young-Modul eines Kaninchen-Ischiasnervs während der Entwicklung 50 kPa überschreiten kann, was darauf hindeutet, dass der Steifigkeitsbereich der Nerven innerhalb des PNS größer ist als bisher untersucht. Verschiedene Proteine sind in der Lage, auf PDMS-Substrate natobieren, um die kombinatorische Regulierung von Mechanik und Liganden auf SC-Verhalten zu analysieren. Dies ermöglicht die Untersuchung mehrerer mikroökologischer Hinweise im PNS-Regenerationsprozess und den Vergleich eines hohen Grades an Tunabilität mit der Arbeit, die sich ausschließlich auf die Steifigkeit des Substrats25konzentriert. Darüber hinaus sind diese technisch entwickelten Zellkultursubstrate mit einer Vielzahl von quantitativen Analysemethoden wie Immunhistochemie, Western Blot und quantitative Polymerase-Kettenreaktion (q-PCR) kompatibel.
Diese entwickelte Zellkulturplattform eignet sich aufgrund der hohen individuellen Abstimmungsfähigkeit jedes ECM-gebundenen Signals hervorragend zur Analyse mechanistischer Bahnen. Darüber hinaus können auf den Substraten gängige Methoden für das Zellmikromusterung, einschließlich des Mikrokontaktdrucks, erreicht werden, um eine kontrollierte zelluläre Haftung zu ermöglichen, um die Zellform im Verhältnis zu anderen ECM-gebundenen Cues24zu analysieren. Dies ist von entscheidender Bedeutung, da liniengemusterte Substrate, die die Dehnung in Zellpopulationen fördern, ein Werkzeug zur Nachahmung und Untersuchung von länglichen und regenerativen SCs innerhalb von Büngner-Bändern während der Nervenregeneration darstellen. Darüber hinaus ist die zelluläre Morphologie ein potenter Regler mehrerer Zellfunktionen und kann potenziell verwirrende experimentelle Ergebnisse liefern, wenn sie nicht kontrolliert26,27. Den Mechanismen, die den regenerativen Phänotyp SC gemäß den ECM-Cues28,29,30regeln, wird nun große Aufmerksamkeit geschenkt. Dies ist wichtig, um Einblicke in die Gestaltung von Biomaterialien zu geben, die als Nervenleitschläuche zur Unterstützung der PNS-Nervenregeneration eingesetzt werden können. Diese detaillierten Protokolle können letztlich als potenzielles Werkzeug zur Entschlüsselung der Mechanismen der SC- und anderer Zelltypfunktionen eingesetzt werden, wie sie durch ECM-gebundene Cues reguliert werden.
SCs können die Nervenregeneration aufgrund ihrer phänotypischen Transformation und des regenerativen Potenzials nach Einer Nervenverletzung fördern. Wie ECM-Cues diese regenerative Neutungsfähigkeit regulieren, bleibt jedoch weitgehend unklar, was möglicherweise nicht nur die Entwicklung von Biomaterialien behindert, die die Nervenregeneration fördern sollen, sondern auch das Verständnis der Mechanismen, die an der Nervenregeneration beteiligt sind. Um dieses Zusammenspiel zu untersuchen, wurden Zellkultursubstrat…
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren danken der Förderung durch die Universität Cincinnati. Die Autoren danken auch Ron Flenniken von der University of Cincinnati Advanced Materials Characterization Laboratory für die Unterstützung.
Albumin from Bovine Serum (BSA), Texas Red conjugate | Thermo Fisher Scientific | A23017 | BSA staining to show micropatterns |
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7076S | Antibody used for western blot analysis |
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074S | Antibody used for western blot analysis |
BrdU | Thermo Fisher Scientific | B23151 | Reagent used to measure cell proliferation |
BrdU primary antibody conjugated with Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | B35130 | Used to visualize BrdU in cell proliferation assays |
Collagen I | Thermo Fisher Scientific | A10483-01 | Protein used to coat coverslips |
Compression force test machine | TestResources | Instrument to quantify mechanical properties of polymers | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | Cell culture medium |
Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | Cell culture medium supplemental |
Fibronectin | Thermo Fisher Scientific | 33010-018 | Protein used to coat coverslips |
Fluorescence microscope | Nikon | Eclipse Ti2 | Fluorescence microscope |
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Fisher Scientific | 78440 | Protease and Phosphatase Inhibitor |
Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017015 | Protein used to coat coverslips |
Mounting medium with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36971 | Coverslip mountant and nuclei staining |
Mouse c-Jun primary antibody | Thermo Fisher Scientific | 711202 | Primary antibody to visualize c-Jun protein |
Mouse β-Actin primary antibody | Cell Signaling Technology | 3700S | Loading control for western blot experiments |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Cell culture medium supplemental |
Photoresist SU 2010 | KAYAKU | SU8-2010 | Photoresist |
Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | P-2443 | Block non-specific protein binding |
Rabbit c-Jun primary antibody | Cell Signaling Technology | 9165S | Primary antibody for visualization of c-Jun protein |
Rabbit myelin basic protein primary antibody | Abcam | ab40390 | Primary antibody for visualization of MBP |
Rabbit p75NTR primary antibody | Cell Signaling Technology | 8238S | Primary antibody for visualization of p75NTR |
Rhodamine phalloidin | Thermo Fisher Scientific | R415 | Visualization of cell cytoskeleton |
RIPA buffer | Abcam | ab156034 | Cell lysis buffer |
RT4-D6P2T Schwann cell line | ATCC | CRL-2768 | Cell line used in experiments |
SYLGARD 184 PDMS base and curing agent | Sigma Aldrich | 761036 | Tunable polymer used to coat coverslips |
Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 15090-046 | Cell dissociation reagent |
UV-Ozone cleaner | Novascan | Increase hydrophicility of PDMS | |
Versene (1x) | Thermo Fisher Scientific | 15040066 | Cell dissociation reagent |