Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Bioengineering

Utarbeidelse av justerbare ekstracellulære matrisemikromiljøer for å evaluere Schwann Cell Phenotype Specification

doi: 10.3791/61496 Published: June 2, 2020

Summary

Denne metodikken tar sikte på å illustrere mekanismene som ekstracellulære matrisesignaler som substratstivhet, proteinsammensetning og cellemorfologi regulerer Schwann celle (SC) fenotype.

Abstract

Traumatiske perifere nervesystemet (PNS) skader mangler for tiden egnede behandlinger for å gjenvinne full funksjonell gjenoppretting. Schwann celler (SCs), som de viktigste glial cellene i PNS, spiller en viktig rolle i å fremme PNS regenerering ved å dedifferentiating inn i en regenerativ celle fenotype etter skade. Den avdifferentiated tilstanden til SCer er imidlertid utfordrende å opprettholde gjennom tidsperioden som trengs for regenerering og påvirkes av endringer i den omkringliggende ekstracellulære matrisen (ECM). Derfor er det viktig å bestemme det komplekse samspillet mellom SCer og ulike ECM for å gi signaler om regenerativt potensial for SCer. For å løse dette ble det opprettet en strategi der forskjellige ECM-proteiner ble adsorbert på et tunable polydimethylsiloxane (PDMS) substrat som ga en plattform der stivhet og proteinsammensetning kan moduleres. SCer ble seedet på de justerbare substratene og kritiske cellulære funksjoner som representerer dynamikken i SC-fenotype ble målt. For å illustrere samspillet mellom SC protein uttrykk og cellulær morfologi, ulike seeding tettheter av SCs i tillegg til individuelle mikrokontakt trykte cellulære mønstre ble benyttet og preget av immunofluorescens farging og vestlige blot. Resultatene viste at celler med et mindre spredningsområde og høyere grad av cellulær forlengelse fremmet høyere nivåer av SC regenerative fenotypiske markører. Denne metodikken begynner ikke bare å løse det betydelige forholdet mellom ECM og cellulær funksjon av SCer, men gir også retningslinjer for fremtidig optimalisering av biomaterialer i perifer nervereparasjon.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Perifere nervesystemet (PNS) skader forblir en stor klinisk utfordring i helsevesenet ved å kompromittere livskvaliteten for pasienter og skape en betydelig innvirkning gjennom en rekke sosioøkonomiske faktorer1,,2. Schwann celler (SC), som de viktigste glial cellene i PNS, gir nødvendige molekylære og fysiske signaler for å indusere PNS regenerering og hjelp til funksjonelle gjenopprettinger i korte gap skader. Dette skyldes den bemerkelsesverdige evnen til SCs å avdifferentiate i en "reparasjon" celle fenotype fra en myelinating eller Remak fenotype3. Reparasjons-SC er en særegen cellefenotype på flere måter. Etter skade øker SCer spredningsraten ved å gå inn i cellesyklusen igjen og begynne uttrykk for flere transkripsjonelle faktorer for å lette gjeninnjevning. Disse faktorene, for eksempel c-Jun og p75 NTR, er upregulert mens myelinating SC markører, for eksempel myelin grunnleggende protein (MBP), er downregulert4,5. I tillegg endrer SCs morfologi til å bli langstrakt og på linje med hverandre for å danne Büngner-bånd over skadestedet6. Dette gir en fysisk veiledningsmekanisme for at aksonene skal utvides til riktig distal mål7. Men til tross for evnen som SCs har til å fremme nerveregenerering i korte gapskader, er utfallet av funksjonell gjenoppretting fortsatt dårlig i alvorlige skader. Dette skyldes delvis tap av ekstracellulære matrise (ECM) veiledningssignaler, samt manglende evne til SCer for å opprettholde den regenerative fenotypen over lange perioder8.

Nerveregenerering og gjenopprettingsprosessen er nært knyttet til tilstanden til basal lamina etter skade. Basal lamina er et lag av ECM rundt nerven som letter veiledning og gir ECM-bundne signaler for aksoner og SCer i tilfeller der det forblir intakt etter skade9. Tilstanden til ECM og dens evne til å levere matrisebundne signaler til celler er svært viktig og har tidligere blitt utforsket i en rekke forskjellige sammenhenger10,11,12,13,14. Det har for eksempel vist seg at stivheten i ECM kan veilede cellefunksjoner som spredning og differensiering11,,15,,16. Sammensetning av ECM kan også føre til en distinkt cellulær respons og regulere celleatferd som migrering og differensiering gjennom intracellulære signalveier17,18. Videre spiller cellemorfologi, inkludert spredningsområde og cellulær forlengelse, en viktig rolle i reguleringen av funksjonen og kan styres av ECM-bundne signaler19,20. Mange tidligere studier har fokusert på stamceller som differensierer til definerte linjer, men SCs har en lignende evne til å endre fenotype fra en homeostatisk, voksen SC i en sunn nerve, til en reparasjon SC i stand til å skille ut proteiner og vekstfaktorer mens remodeling ECM etter nerveskade5,21. Derfor er det spesielt viktig å identifisere mekanismer som ligger til grunn for forholdet mellom den medfødte SC regenerative kapasiteten og ECM-bundne signaler for innsikten til slutt å utnytte denne kapasiteten for nerveregenerering.

For å løse dette har vi utviklet en detaljert metodikk for å produsere et cellekultursubstrat der mekanisk stivhet og ligandtype lett kan justeres i fysiologisk relevante områder. Polydimetyl siloxane (PDMS) ble valgt som et substrat på grunn av sin svært tunable mekanikk sammenlignet med polyakrylamid gel, hvor den maksimale Youngs modulus er rundt 12 kPa i kontrast til PDMS på rundt 1000 kPa22,23,24. Dette er gunstig for det forestående arbeidet, da nyere studier har vist at Youngs modulus av en kanin isjiasnerve kan overstige 50 kPa under utvikling, og dermed tyder på at omfanget av stivhet av nerver i PNS er bredere enn tidligere undersøkt. Ulike proteiner er i stand til adsorpsjon på PDMS-underlag for å analysere kombinatorisk regulering av mekanikk og ligander på SC-atferd. Dette gjør det mulig for undersøkelse av flere mikromiljøsignaler som finnes i PNS regenereringsprosessen og sammenligning av en høy grad av tunability til arbeidet med å fokusere utelukkende på stivhet i substratet25. Videre er disse konstruerte cellekultursubstratene kompatible med en rekke kvantitative analysemetoder som immunohistochemistry, vestlig blot og kvantitativ polymerasekjedereaksjon (q-PCR).

Denne konstruerte cellekulturplattformen er svært egnet for å analysere mekanistiske veier på grunn av det høye nivået av individuell tunability av hvert ECM-bundet signal. I tillegg kan populære metoder for cellemikring, inkludert mikrokontaktutskrift, oppnås på substratene for å tillate kontrollert cellulær vedheft å analysere celleform i forhold til andre ECM-bundne signaler24. Dette er avgjørende fordi linjemønstrede substrater, som fremmer forlengelse i cellepopulasjoner, gir et verktøy for å etterligne og studere langstrakte og regenerative SCer i Büngner-bånd under nerveregenerering. Videre er cellulær morfologi en potent regulator av flere cellefunksjoner og kan potensielt introdusere forvirrende eksperimentelle resultater hvis ikke kontrollert26,27. Det gis nå betydelig oppmerksomhet til mekanismene som styrer SC regenerativ fenotype som regulert av ECM-signaler28,,29,,30. Dette er viktig for å gi innsikt i utformingen av biomaterialer som kan brukes som nerveveiledningskanaler for hjelp i PNS nerveregenerering. Disse detaljerte protokollene kan til slutt brukes som et potensielt verktøy for å dechiffrere mekanismene til SC og annen celletypefunksjon som regulert av ECM-bundne signaler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Tunable celle kultur substrat forberedelse og karakterisering

  1. Substrat forberedelse
    1. Bland PDMS base elastomer og herdingsmidler ved hjelp av en pipettespiss kraftig i forholdet mellom 10:1 og 60:1 til boblene er homogent dispergert i blandingen. Fjern bobler ved hjelp av vakuumtørke til bobler forsvinner.
      MERK: Under PDMS polymerisering, herding agent krysskoblinger med basen elastomer for å gi endelig polymer ønskede mekaniske egenskaper. Crosslink-forhold kan justeres for å endre PDMS-stivhet.
    2. Plasser en dråpe (~ 0,2 ml) av uttørket PDMS-blanding på en firkantet eller sirkulær dekslerslip (f.eks. 22 mm x 22 mm) og drei dekkslippen på et sentrifuger ved 2500 o/min i 30 s.
    3. Inkuber dekkslippen i enten en ovn ved 60 °C i 1-2 timer eller romtemperatur over natten for PDMS å stivne.
    4. Behandle dekkslippen med UV-ozonrenser i 7 min (UV-bølgelengde: 185 nm og 254 nm) for å øke overflatens hydrofiliitet. Plasser den i en sterilisert 6-brønnplate.
    5. Før du bruker for cellekultur, inkuber substrater i 70% etanol i minst 30 min.
      FORSIKTIG: UV-ozonrenser kan generere ozon som er skadelig for mennesker. Arbeid i en kjemisk røykhette eller med en eller annen form for ventilasjon.
    6. Nedsenking av dekklips i proteinoppløsningen (10 μg/ml kollagen I, fibronektin eller laminin) i 60 min i en steril inkubator ved 37 °C.
      MERK: Etter UV-ozonbehandling kan PDMS-overflaten fortsatt være hydrofob. Roter brønnplaten for å sikre at hver dekkslip er dekket med proteinoppløsningen.
    7. Aspirer proteinoppløsningen og vask dekkslippen med fosfatbufret saltvann (PBS) 3x.
    8. Re-suspender RT4-D6P2T Schwann cellelinje (SCer) fra passaging parabolen ved hjelp av kommersielt tilgjengelig EDTA løsning (1x) med 2,5% trypsin og telle celler med hemocytometer. Frø-SCer på den justerbare PDMS-overflaten med ønsket celletetthet. SC seeding tettheter kan variere for hver enkelt applikasjon.
    9. Oppretthold celler i de ønskede cellekulturparametrene (90 % fuktighet, 5 % CO2,37 °C osv.) for lengden på eksperimentet. Bruk Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) supplert med 10% foster storfe serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin som cellekultur medium.
  2. Micropatterned substrat forberedelse
    1. Tegn de ønskede geometri- og cellelimområdene (900 μm2,1600 μm2 og 2500 μm2) ved hjelp av programvare for dataassistert design (CAD). Lag en krom fotomaske basert på disse mønstrene fra en kommersiell leverandør.
    2. I et rent rom eller støvfritt miljø, bruk standard fotolitografiteknikker for å fremstille silisiumwafers (protokoller er beskrevet andre steder31). Kritiske parametere for dette programmet er som følger: Fotoresist: SU-8 2010; Spin profil for å spre fotoresist: 500 rpm for 10 s med en akselerasjon på 100 rpm / s, deretter 3500 rpm for 30 s med en akselerasjon på 300 rpm / s; Eksponeringsenergi for UV-lys: 130 mJ/cm2.
      MERK: Høyden på mønstrene på silisiumwaferene er ca. 10 μm etter disse parametrene. Potensielle sprekker rundt kanten utenfor de rektangulære eller trekantede mønstrene kan ses ved hjelp av et lett mikroskop etter trinn 1.2.2. Baking av silisium wafer ved 190 ° C i 30 min bidrar til å eliminere sprekker.
    3. Plasser den mønstrede silisiumwaferen i en sirkulær 150 mm diameter x 15 mm høyde Petriskål og hell gasset PDMS (blandeforhold 10:1) som klargjort i trinn 1.1.1 på silisiumwaferen.
      MERK: Kontroller at tykkelsen på PDMS er minst 5 mm for enkel håndtering under mikrokontaktutskriftstrinn.
    4. Stivner PDMS på silisiumwafer i en ovn ved 60 °C over natten. La PDMS avkjøles til romtemperatur. Klipp stempler på 30 mm x 30 mm firkanter som inneholder de riktige mønstrene fra silisiumwaferen ved hjelp av en kirurgisk skalpell. Ikke skad silisiumwaferen.
      MERK: Silisiumwafers kan gjenbrukes mange ganger på dette tidspunktet for å produsere flere frimerker etter rengjøring med isopropanol.
    5. Steriliser PDMS-frimerker og de justerbare deksler (klargjort i trinn 1.1.1 til 1.1.3) ved å senke dem ned i 70% etanol i 30 min.
    6. For å bekrefte effekten av mikropattern av PDMS-frimerker etter mikrokontaktutskrift, tørk overflaten av PDMS-frimerker ved hjelp av en filtrert luftstrøm og pipette 50 μg/ml BSA (Texas Red conjugated) løsning for å dekke hele mønstret side av PDMS-stempelet.
    7. Inkuber PDMS-frimerker med BSA-løsning i 1 timer ved romtemperatur for å muliggjøre protein adsorpsjon.
    8. Tørk overflaten av tunbare dekklips ved hjelp av en filtrert luftstrøm, øk overflaten hydrofilisitet som beskrevet i trinn 1.1.5.
    9. Luft tørk PDMS-stemplene for å fjerne den gjenværende BSA-løsningen.
      MERK: Pass på at BSA-løsningen er fullstendig fjernet fra stempelet fordi en gjenværende løsning vil føre til at frimerker glir på dekkslippen under mikrokontaktutskrift.
    10. Få den mønstrede siden av stempelet i samsvar med den justerbare dekkslippen for BSA-adsorpsjon på dekksoverflaten. Trykk stempelet forsiktig mot dekkslippen i 5 min.
      MERK: Ikke bruk for mye kraft på stempelet, siden det vil bøye og forårsake ikke-spesifikk kontakt mellom stempel og dekkslip. Den riktige mengden kraft som brukes på stempelet er avgjørende for vellykket mikrokontaktutskrift.
    11. Undersøk mikropatternen ved hjelp av fluorescensmikroskop med et FITC-filter (Fluoresceinisothiocyanat).
    12. Hvis du vil skrive ut cellelimområder i stedet for fluorescerende mønstre, erstatter du lamin for BSA-protein og gjentar trinn 1.2.5 til 1.2.10.
    13. Fjern frimerker fra coverslips, overføre coverslips til en sterilisert 6-brønnplate. Tilsett 2 ml 0,2 % m/v Pluronic F-127-oppløsning i hver brønn for å dekke overflaten av dekklippen og inkubere i 1 timer ved romtemperatur.
      MERK: Pluronic F-127 kan adsorberes til PDMS overflate øke hydrofobiteten av PDMS overflate for å blokkere celler fra vedheft.
    14. Aspirer Pluronic F-127 oppløsning og vask 5x med PBS og 1x med cellekulturmediet før såingsceller. En typisk såingstetthet for SCer er 1000 celler/cm2.
    15. 45 min etter cellesåing, fjern cellekulturmediet og vask dekkslepper med PBS 2x for å hindre at flere SCer følger samme mønster. Oppretthold celler i ønsket cellekulturmiljø i 48 timer før kvantifisering.
    16. Hvis du vil opprette linjemønstrede cellekulturunderlag for å undersøke justerte celler, følger du trinn 1.2.1 til 1.2.4 for å opprette stempler for mikrokontaktutskrift.
      MERK: Dimensjonene på sporet/ryggen på de forede mønstrene på stempelet er 50 μm x 50 μm for de skisserte cellene. De totale dimensjonene på stempelet er 10 mm x 10 mm.
    17. Skjær stempler i dimensjoner som bare inneholder ønskede linjemønstre.
      MERK: Når du oppretter frimerker i CAD, vil det umønstrede området av stempelet rundt linjemønstrene tilsvare celleklebende område etter mikrokontaktutskrift. Dermed er det nødvendig å eliminere umønstrede områder når du kutter ut stempelet for å sikre at hver SC seeded på overflaten følger mønstrene.
    18. Følg trinn 1.1.1 til 1.1.3 for å klargjøre tunable PDMS overflatebelegg to Petri retter.
      MERK: Dette vil være PDMS som dekker petriskåloverflaten selv og ikke på en dekkslip.
    19. Følg trinn 1.2.5 til 1.2.10 for å utføre mikrokontaktutskrift for å skrive ut linjemønstrede cellelimområder på en av PDMS-belagte Petri-retter.
      MERK: Overflatearealet på en 60 mm x 15 mm Petriskål kan inneholde linjemønstrede områder fra 6 PDMS-frimerker.
    20. Fjern frimerker og fyll petriskålen med 4 ml 0,2 % m/v Pluronic F-127-oppløsning og inkuber i 1 time.
    21. Etter mikrokontaktutskrift skyller du hver side av PDMS-stemplene med 70 % etanol 3x og tørker med luft. Roter PDMS-frimerker og følg trinn 1.2.5 til 1.2.10 for å skrive ut umønstret cellelimområde ved hjelp av den umønstrede siden av stempelet på den andre petriskålen. Gjenta trinn 1.2.13.
    22. Aspirer F-127 løsning fra oppvasken, vask 3x med PBS etterfulgt med 1x vask ved hjelp av frisk celle kultur medium. Frø SCer på retter.
      MERK: Såingstettheten for en linjemønstret tallerken er 5000 celler/cm2 og for en umønstret tallerken er 10 000 celler/cm2.
    23. Oppretthold SCer under ønskede forhold i 48 timer og følg protokollene for å klargjøre SC-lysates32.
      MERK: Cellesåingtettheten for umønstrede retter er 2x høyere enn for linjemønstrede retter, da den linjemønstrede parabolen bare har halvparten av cellelimområdet til den umønstrede parabolen.
      1. For å forberede lysater, overfør adekvat radioimmunoprecipitation analyse (RIPA) buffer til en 10 ml konisk sentrifuge rør. Fortynn protease- og fosfatasehemmer (100x) med et forhold på 1:100 i RIPA-buffer, bland godt ved pipettering.
      2. Vask celler med iskald PBS (1x) i 2 min, tilsett 80 μL av løsningen tilberedt fra trinn 1.2.23.1 på hvert cellelimområde (området som kontaktet med PDMS-frimerker og adsorbert protein) i petriskåler. Inkuber celler med løsningen på en isblokk i 15 min.
        MERK: Løsningen vil bare forbli på cellelimområdet på grunn av hydrofobiteten til Pluronic F-127 adsorpsjon andre steder. Denne funksjonen muliggjør en vellykket og tilstrekkelig proteinekstraksjon for linjemønstrede SCer.
      3. Skrape SCs med en celle skraper i 5 min. Samle lysate i en merket 1,5 ml mikrocentrifuge rør.
      4. Mikrosytrifuvellysat ved 12, 000 x g i 15 min ved 4 °C. Samle supernatant med en 1000 μL pipette og overfør til et rent mikrocentrifugerør. Oppbevar cellelysat ved -20 °C.
  3. Underlaget karakterisering
    MERK: For å karakterisere mekanikken i polymeren på dekklip, er flere metoder vanligvis ansatt, inkludert bulkkomprimeringstesting11,,33 eller atomkraftmikroskopitesting34. Denne protokollen vil skissere massekomprimeringstesting.
    1. Hell PDMS-forløperen til ønsket blandeforhold (trinn 1.1) i en 30 mm petriskål, sørg for at tykkelsen på PDMS-laget i petriskålen er minst 20 mm.
    2. Fjern petriskålen med størknet PDMS fra 60 °C-ovnen etter 1 time og la den avkjøles ved romtemperatur. Skjær polymer i 10 mm x 10 mm firkanter. Mål tykkelsen på PDMS ved hjelp av kalipere.
    3. Plasser PDMS på scenen på målemaskinen for kompresjonskraft. Koble til kompresjonskraftsensoren (modell: 112C) til sensorporten og fest sensoren til aksen til testmaskinen.
    4. Juster høyden på sensoren til ca. 0,5 cm over PDMS-stempelet ved hjelp av "jogge"-kontrollen på frontpanelet på instrumentet.
    5. Åpne den tilknyttede programvaren ved hjelp av"Test Setup"-vinduet, velg "Servo-profil", og åpne vinduet" Segment". I vinduet"Segment"skriver du inn ønsket "Kontrollhastighet"og "Sluttbeløp"for testen.
      MERK: Kontrollhastigheten bestemmer hvor raskt sensoren beveger seg ned mot PDMS. Sluttbeløpet bestemmer den totale avstanden sensoren reiser.
    6. Bruk tasten "Z" på kontrollpanelet på programvaren for å tilbakestille alle målinger på dette tidspunktet.
    7. Flytt sensoren ned til lett kontakt med PDMS til 1-2 newtons (N) er lastet inn. Lasting og avstanden som sensoren reiser vil bli vist i programvaren.
    8. Etter å ha brukt "Z" -knappen, kjør måling ved hjelp av "Spillav ", og lagre filopptaksstyrken og avstanden.
    9. Gjenta trinn 1.3.3 til 1.3.8 for hver eksperimentelle tilstand av PDMS.
    10. Åpne filen, og bruk følgende formel til å beregne Youngs modulus (E) av PDMS for hvert forhold. (F = kompresjonskraft, A = område av PDMS-stempel, ➞L = reiseavstand på sensor og L0 = original tykkelse på PDMS-stempelet).
      Equation 1

2. Kvantifisering av cellulære egenskaper på justerbare underlag

  1. Spredningsanalyse
    1. Frø SCer på substrater utarbeidet fra trinn 1.1.9 med en tetthet på 5000 celler / cm2 i en 6-brønns plate. La SCer inkubere i 48 timer under standard cellekulturforhold (37 °C og 5 % CO2).
    2. Fortynn 12 μL av 10 mM Bromodeoxyuridine (BrdU) lageroppløsning i 12 ml 37 °C cellekulturmedium, bland godt med pipette for å lage 10 μM BrdU merkeoppløsning.
    3. Fjern cellekulturmediet og vask SCs 2x med PBS.
    4. Tilsett 2 ml BrdU-merkingsløsning i hver brønn og inkubere SCer i 2 timer.
      MERK: Inkubasjonstiden for BrdU-merkingsløsningen avhenger av den spesifikke cellespredningshastigheten. RT4-D6P2T SC-linjen har en høy spredningshastighet, slik at 2 timer med inkubasjonstid ble brukt.
    5. Fjern BrdU-merkingsløsning og vask SCs 3x med PBS. Tilsett 1 ml 3,7% formaldehyd i PBS til hver brønn og inkuber ved romtemperatur i 15 min for cellefiksering.
      FORSIKTIG: Formaldehyd er et humant kreftfremkallende stoff; Utfør derfor alt arbeid inne i en kjemisk røykhette med passende beskyttelse.
      MERK: Ved vasking med PBS er det ingen cellekulturmedium i brønnen, og dermed kan PDMS-overflaten være hydrofob. Ta forholdsregler for å ikke tørke overflaten av underlaget helt for å forhindre celleskade.
    6. Aspirer formaldehydoppløsning og vask 3x med PBS (3 min hver). Fjern PBS og tilsett 1 ml 0,2% Triton X-100 i PBS til hver brønn for å permeabilisere cellemembran. Inkuber-IC-er med Triton X-100-oppløsning i 20 min ved romtemperatur.
    7. Fjern Triton X-100 oppløsning og vask SCs 3x med PBS (3 min hver).
    8. Tilsett 1 ml 1 N HCl i hver brønn og inkuber på is i 10 min. Fjern 1 N HCl og tilsett 1 ml 2 N HCl i hver brønn og inkuber ved romtemperatur i 10 min. HCl behandling er for DNA hydrolyse.
    9. Bland 182 ml sitronsyre på 0,2 mM Na2HPO4 og 18 ml 0,1 mM sitronsyre for å produsere en fosfat/sitronsyrebuffer for antigengjenfinning. Fjern 2 N HCl og tilsett 1 ml fosfat/sitronsyrebuffer i hver brønn og inkuber ved romtemperatur i 10 min.
    10. Vask SCs 3x med 0,2% Triton X-100 i PBS. Tilsett 2 ml 3% storfe serum albumin (BSA) i PBS i hver brønn og inkuber i 30 min ved romtemperatur for å klokke uspesifikk binding av antistoffet.
    11. Fortynn BrdU primære antistoffkonjugert med Alexa Fluor 488 i 3% BSA-oppløsning med et forhold på 1:300 for BrdU fargingsløsning. Inkuber SCs med fargingsløsning over natten ved romtemperatur mens platen er dekket av aluminiumsfolie.
    12. For å kvantifisere spredning, bilde-SCer ved hjelp av FITC- og DAPI-kanalen til et fluorescerende mikroskop for å oppdage henholdsvis BrdU og kjerner. Lagre bilder som "nd.2" filer.
    13. Åpne "nd.2" filer for hvert bilde tatt på identiske romlige posisjoner.
    14. Åpne bildeanalyseprogramvaren. Høyreklikk på bakgrunnen for å åpne vinduet"Automatiserte måleresultater"og "Automatisert måling"i delen"Analysekontroll".
    15. I"Count & Taxonomy"-menyen velger du "Count". På FITC-bilde klikker du på hver kjerne som viser grønn fluorescens (BrdU positiv) og høyreklikker på bildet.
      MERK: Antall BrdU positive celler vises i vinduet"Automatiseringer og målinger".
    16. For DAPI-bilder gjentar du trinn 2.1.14 for å telle antall totale kjerner. Beregn prosentandelen av BrdU-positive celler for dette bildet.
    17. Gjenta trinn 2.1.13 til 2.1.16 for andre bilder for statistiske formål og beregn gjennomsnittlig prosentandel av BrdU-positive celler for hver substrattilstand.
  2. Kvantifisering av c-Jun-uttrykk gjennom immunfluorescerende bildeanalyse
    1. Celler tilberedt inne 6-brønnplater fra trinn 1.1.9 og 1.2.23 er faste og permeabilized med prosedyrene tidligere beskrevet (trinn 2.1.5-2.1.7).
      MERK: Hvis du vil utføre nøyaktige sammenligninger av fluorescerende intensitet på tvers av celler med forskjellige ECM-forhold, bruker du kamerainnstillingene på tvers av alle eksempler med alle eksempler som har de samme parametrene.
    2. Lagre bilder som ".nd2"-filer.
    3. Åpne bildeanalyseprogramvaren. Høyreklikk bakgrunn for å åpne vinduet"Automatiserte måleresultater"og "Automatisert måling"i delen"Analysekontroll".
    4. I "Automatiserte målingsresultater",velg "Objektdata". Aktiver"Fortsett å oppdatere målingen" -knappen.
    5. I det øverste panelet i programvaren velger du"Mål"etterfulgt av "Objektfunksjoner". Legg til "Mean Intensity" i delen " Valgtfor måling".
    6. Åpne og slå sammen to ".nd2" bildefiler som inneholder bilder av c-Jun og kjerner.
    7. Velg"ROI"i topppanelet, og velg"Tegn rektangulær avkastning". Tegn et rektangulært område som inneholder kjerneområdet til en enkelt celle.
      MERK: c-Jun uttrykket er konsentrert innenfor kjerner35.
    8. I topppanel av programvare, velg "Binary" og "Definer terskel", et nytt vindu vil synes å nøyaktig definere c-Jun fluorescerende området.
    9. I nytt vindu klikker du på"Full Image/Use ROI"for å bytte program fra fullbildemodell til ROI-modellen. Bruk "Intensitet"til å justere oppslagstabellen på venstre side av vinduet for justering av størrelse/form for det uthevede området innenfor den rektangulære avkastningen.
      MERK: Pass på at størrelsen/formen på det uthevede området er identisk med kjernen.
    10. Klikk på"OK"-knappen for å få den gjennomsnittlige FITC-intensiteten i vinduet"Automatiserte måleresultater"og klikk deretter "Lagre data".
    11. I vinduet"Automatisert måling","Slett objekt"for å fjerne rødt uthevet område. På venstre sidepanel bruker du"Pekeverktøy"til å velge rektangulær avkastning og slette.
    12. Gjenta trinn 2.2.6 til 2.2.11 for å måle gjennomsnittlig FITC-intensitet for hver ekstra celle.
    13. I vindusområdet"Automatiserte måleresultater",velg "Lagret" og alle lagrede data vil bli presentert. Bruk funksjonen"Eksporter"og velg "Data til Excel"for å lagre det eksporterte regnearket og utføre flere beregninger.
  3. Kvantifisere kjernefysisk forlengelse
    1. Løs og permeabilize SCs utarbeidet fra trinn 1.2.22 følgende trinn 2.1.5-2.1.7. Utfør kjernefysisk farging ved hjelp av monteringsmedium med DAPI.
    2. Ved hjelp av DAPI-kanalen og et 40x objektiv, skaffe bilder av prøven og lagre som ".nd2" filer.
    3. Følg trinn 2.2.3 og 2.2.4 for å åpne"Automated Measurement Results"og "Automated Measurement"-vinduet i bildeanalyseprogramvaren.
    4. I "Automatiserte måleresultater",bruk"Option"-funksjonen etterfulgt av "Velg objektfunksjon". I kolonnen"Funksjon"velger du"Elongation"og legger til i"Valgt for målinger"-kolonnen. Bruk "Keep Updating Measurement" for å aktivere denne funksjonen.
    5. Åpne bildefilen "nd.2" som inneholder kjernefysiske bilder. I"Automatisert måling"-vinduet velger du"Auto Detect"-funksjonen og velger en kjerne. Høyreklikk på bildet og målt kjernefysiske sideforhold vil bli vist i "Automatiserte måleresultater".
    6. Gjenta trinn 2.3.5 for å kvantifisere kjernefysiske sideforhold for andre kjerner i bildet. Velg "Lagre data" i vinduet"Automatiserte målingsresultater".
    7. Gjenta 2.3.5 til 2.3.6 for flere bilder. Eksporter dataene til en regnearkfil som tidligere gjort i 2.2.13 for analyse.
  4. Vestlig blot for å kvantifisere proteinuttrykk
    1. Følg standardprotokoller for vestlig blot analyse detaljert andre steder32. Fortynninger av antistoffer som brukes i studien er vist nedenfor: Kanin anti c-jun 1:2,000; Mus anti β-actin 1:1,000; Kanin anti p75NTR 1:1,000; Kanin anti myelin grunnleggende protein 1:1,000; Anti-mus / kanin IgG, HRP-koblet antistoff 1:10,000.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

For å analysere og kvantifisere samspillet mellom substratstivhet og proteinsammensetning på SC-fenotype, ble det utviklet et tunable PDMS cellekultursubstrat (figur 1A). Kompresjonstesting av polymeren ved forskjellig base: herdingsmiddelforhold ble benyttet til å kvantifisere Youngs modulus (E) av substratet (Figur 1B). Det resulterende utvalget av modulære verdier representerer fysiologisk relevante substratforhold. Etter utarbeidelse av substrater ble SCs kultivert og cellulære egenskaper analysert på det justerbare mikromiljøet. Spredningsrater av SCer på substrater av forskjellig proteinsammensetning ble først analysert. Lamininbelagte underlag resulterte i en høyere spredningshastighet sammenlignet med kollagen I og fibronectin adsorpsjon på 10 μg/ml (figur 2A,B). SCs på substrater med lamininbelegg og forskjellige moduli viste at relativt mykere substrater (E = 3.85kPa) redusere celle spredningshastigheter på tvers av alle forhold (Figur 2C, D). Forskjellene mellom stive substrater (E=1119kPa) og relativt myke underlag (E=8,67 kPa) var imidlertid ubetydelige (figur 2D).

SCs ble også analysert for proteinuttrykk gjennom immunohistochemistry og vestlige blot. Nivåer av transkripsjonsfaktor c-Jun ble analysert av immunfluorescerende mikroskopi (figur 3A) og representert ved gjennomsnittlig pikselfluorescerende intensitet (figur 3B-D). c-Jun uttrykket ble vist å være upregulert som substrater ble mykere (E = 1119 kPa til E = 8,67 kPa), men på de mykeste underlagene (E = 3,85 kPa), c-Jun uttrykket ble betydelig nedregulert. På stive substrater (E = 1119 kPa), kollagen jeg belagt substrater resulterte i den høyeste c-Jun uttrykk, men som substrater ble mykere (E = 8,67 kPa og 3,85 kPa), laminin viste de høyeste nivåene av c-Jun (Figur 3E). Western blot ble også brukt til å analysere både c-jun og myelin grunnleggende protein (MBP) med c-Jun nivåer upregulert og MBP nedregulert på mykere underlag (Figur 3F). Videre, SCs seeded på laminin belagt substrater resulterte i den høyeste c-Jun uttrykk sammenlignet med kollagen I og fibronectin.

Celler av ulike såing tettheter ble deretter dyrket og farget med rhodamine-phalloidin å utforske rollen som celle spredning og område i c-Jun uttrykk (Figur 4A, B). For å kontrollere kjernefysisk forlengelse av celler, ble en vanlig mikropatterning teknikk (mikrokontakt utskrift36) benyttet til å lage celleklebende linjer på cellekulturen substrater. Kjernesideforholdet mellom celler som er sett på et linjemønstret substrat, viste seg å være betydelig høyere enn celler som er sett på ikke-oppdaterte underlag (figur 4C,D). Det ble funnet at uttrykk for både c-jun og en annen markør signifikant i SC regenerative fenotyper, p75 neurotrophin reseptor (p75 NTR), ble oppregulert i tette celler med et mindre spredningsområde (Figur 4E). Linjemønstrede celler resulterte også i et høyere uttrykk for både c-jun og p75 NTR sammenlignet med ikke-mønstrede celler (figur 4F). Derfor ble mikrokontakt trykte cellelimgeometrier opprettet for å nøyaktig kontrollere cellespredningsområdet og forlengelsen mens de eliminerer cellecelleinteraksjoner (figur 5A). Dimensjoner på totale cellelimområder var 900 μm2,1600 μm2og 2500 μm2 med et sideforhold på enten 1 eller 4 (cellelengde: cellebredde). Fluorescerende storfe serum albumin (fBSA, Texas rød) farging ble brukt til å avsløre status for mikromønstre på cellekultur substrat etter mikrokontakt utskrift (Figur 5B). Kjernesideforholdet mellom SCer for hvert celleområde ble målt, og det ble vist at ved å øke kjerneforholdet for kjernefysiske sideforhold øker den cellulære forlengelsen (figur 5C). I tillegg, etter hvert som SC-størrelsesforholdet økte, ble c-Jun oppregulert (figur 5D). Interessant ble det imidlertid funnet at etter hvert som cellespredningsområdet øker c-Jun-uttrykket, nedreguleres (Figur 5E). Immunofluorescensfarging for både kjerner og actin bekreftet cellespredningsområde og forlengelse ble sterkt kontrollert gjennom denne mikropatterningmetoden (figur 5F).

Figure 1
Figur 1: Cellekultur substrater med tunabel stivhet og proteinsammensetning. (A)Skjematisk som viser utviklingen av PDMS cellekultur underlag. (B) Det første PDMS-blandingsforholdet mellom basen: herdemiddel bestemmer Youngs modulus. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: SC-spredningsrater regulert av substratstivhet og proteinsammensetning. (A)Representative bilder som viser BrdU-farging når de dyrkes på underlag av samme modulus. (B)Histogrammet viser prosentandelen av BrdU positive celler for hvert proteinbelegg. (C)Representative bilder som viser BrdU inkorporering i SCs seeded på substrater av samme protein belegg. (D)Histogram som viser prosentandelen av BrdU positive celler for hver Youngs modulusverdi. Skalalinjer = 50 μm. Data presenteres som gjennomsnitt ± SEM. *p < .05, **p < .005, ***p < .0005. Deler av figuren er endret fra ref.24. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Substrat stivhet og proteinregulert SC protein uttrykk. (A)Representative bilder viser c-Jun immunofluorescens farging for SCs seeded på substrater av forskjellig stivhet og proteinsammensetning. Gjennomsnittlig pikselfluorescerende intensitet av c-jun ble målt for SCs seeded på (B) kollagen I (C) fibronectin og (D) laminin belagt substrater av forskjellig stivhet. (E)c-Jun fluorescens nivå av SCs gruppert av Youngs modul av substrat. (F)Vestlig blot som viser c-jun og myelin grunnleggende protein (MBP) av SCs seeded på substrater. Glyseraldehyd 3-fosfatdehydrogenase (GAPDH) ble brukt som lastekontroll. Skala bar = 50 μm. Data presenteres som gjennomsnitt ± SEM. *p < .05, **p < .005, ***p < .0005. Deler av figuren er endret fra ref.24. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Cellulær spredningsområde påvirker proteinuttrykket til SCer. (A) Cellespredningsområde med forskjellige såingstettheter ble visualisert gjennom rhodamin-phalloidin (rød) og kjernefarging (blå). (B)Histogrammet viser det gjennomsnittlige spredningsområdet av SCer i hver tilstand. (C) Kjernen av SCs seeded på umønstret eller linjemønstrede substrater ble farget med DAPI (blå) for å vise morfologi. (D)Histogrammet som viser kvantifisering av kjernefysisk sideforhold på mønstrede og uforutskjærede underlag. (E)Vestlig blot som viser uttrykk for c-jun og p75NTR av celler med forskjellig spredningsområde. (F) Vestlig blot som viser proteinuttrykket til SCer på umønstrede og linjemønstrede underlag. Skala bar = 50 μm. Data presenteres som gjennomsnitt ± SEM. *p < .05, **p < .005, ***p < .0005. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: SC-morfologi og forlengelseseffekt c-Jun-uttrykk for SCer. (A)Skjematisk viser cellemikring for former med forskjellig sideforhold. (B) fBSA farging (rød) som viser formen på mikromønstre etter mikrokontaktutskrift. Skala bar = 10 μm. (C)Histogram som viser kjernefysiske sideforhold mellom mikromønstrede SCer. (D, E) Histogram som viser gjennomsnittlig pikselfluorescerende intensitet av c-jun for hver av de geometriske forholdene. (F)Rhodamine-phalloidin (rød), kjerner (blå) og c-Jun (grønn) ble farget på de forskjellige mikromønstrene. Skala bar = 10 μm. Data presenteres som gjennomsnitt ± SEM. *p < .05, **p < .005, ***p < .0005. Deler av figuren er endret fra ref.24. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

SCs kan fremme nerve regenerering på grunn av deres fenotypiske transformasjon og regenerative potensial etter nerveskade. Men hvordan ECM-signaler regulerer denne regenerative kapasiteten forblir for det meste uklar, noe som potensielt hindrer ikke bare utviklingen av biomaterialer som tar sikte på å fremme nerveregenerering, men også forståelsen av mekanismene som er involvert i nerveregenerering. For å begynne å undersøke dette samspillet, ble cellekultur substrater opprettet der ECM-signaler som stivhet, proteinbelegg og klebende topografi kan kontrolleres. Evnen til å mikropattern klebende topografi er en viktig funksjon i protokollen, ved hjelp av den vanlige metoden for mikrokontaktutskrift. Dette substratet er imidlertid forskjellig fra glasset ved at kompresjonskraften som påføres PDMS-frimerkene, må være på et passende nivå for å oppnå ønsket form av celleklebende områder på cellekulturens underlag. Ved hjelp av fluorescerende storfe serum albumin (fBSA) som en modell protein for å visualisere cellelim områder og justere kompresjonskrefter på PDMS frimerker kan til slutt redusere dette problemet. En annen viktig forskjell fra glass er fjerning av overflødig Pluronic F-127 som brukes til å gjengi resten av substratet ikke-klebemiddel. Etter denne behandlingen er cellekultur substrater svært hydrofobe, noe som gjør det utfordrende å opprettholde våtcellekultur substrater i hele vasker, noe som er viktig for den strukturelle integriteten til mikromønstret protein37. Derfor anbefales det å bruke flere pipetter for å aspirere og injisere løsninger nesten samtidig for å hindre at substrater dehydrerer helt.

Selv om mikropatterning kan nøyaktig kontrollere celleform og ikke krever kompliserte syntetiske prosedyrer ved hjelp av celleblokkerende polymerer som OEGMA, er metodene som brukes til å kvantifisere proteinuttrykk av mikromønstrede celler noen ganger begrenset38. For eksempel er prøver som er tilgjengelige fra mikropatterning generelt begrenset til noen få hundre celler per coverslip, noe som er utilstrekkelig til å forberede cellelysatser som skal brukes til vestlige flekker eller qPCR. Tatt i betraktning dette, immunofluorescens farging alene ble brukt til å kvantifisere protein uttrykk for mikromønstrede celler, begrense mangfoldet av proteiner som kan kvantifiseres. For å løse dette benyttet vi linjemønstre for å fremme celleelongasjon for større cellepopulasjoner og vellykket forberedt cellelysatser som ble analysert av vestlige blot. Andre metoder som påførte elektriske felt eller justerte elektrospunfibre kan også brukes til å kontrollere forlengelsen av cellepopulasjoner39,,40. Elektriske felt passer imidlertid kanskje ikke inn i alle applikasjoner for frivillige organisasjoner, siden ledningsevnen til vanlige biomaterialer som kollagenbasert polymer og silke er svært lav28,,41,,42. I motsetning har justerte elektrospunnanofiber blitt implantert i NGCer for å fremme SC-justering, forlengelse og migrasjon, samt neurite utvekst43,44. Det kan også vise seg å være overbevisende å sammenligne SC-oppførsel på linjemønstrede substrater mot de på substrater med justerte nanofiber, siden forede mønstre og justerte nanofiber er to av de vanligste veiledningsmekanismene innlemmet i NGCs45.

Den mikromønstrende protokollen som er beskrevet, benytter PDMS-belagte dekkslips som cellekulturunderlag, med en maksimal overflate Youngs modulus på 1119 kPa. Slik stivhet etterligner mange vev, men det kan ikke være mulig å modellere osteogenese av mesenchymale stamceller, som vanligvis krever overflaten Youngs modulus å overstige 1 Gpa46. For slike situasjoner er glass en alternativ kandidat, men adsorpsjonen av Pluronic F-127 krever relativt høy overflatehydrofobitet som glass ikke har. For å øke hydrofobiteten kan glass behandles med dimetyldikloretilan i diklorben. Etter dette kan UV-ozonbehandling brukes til å øke hydrofilien for mikrokontaktutskrift47.

Til syvende og sist ble det utviklet en cellekulturplattform der ECM-stimuli kan justeres individuelt med proteinuttrykk kvantifisert. Vi har fastslått at SC regenerativ kapasitet fremmes av visse mekaniske og kjemiske ECM-signaler, som senere kan gi inspirasjon i fremtidig design av biomaterialeapplikasjoner som frivillige organisasjoner og celletransplantasjonsprosesser der ECM-funksjoner kanskje må optimaliseres24. Likevel kan tuning av disse ECM-signalene være et utfordrende foretak, spesielt in vivo. Fremover kan denne plattformen benyttes til å analysere viktige mekanismer som er involvert i den fenotypiske overgangen av SCer som regulert av ECM. Ved å oppnå dette, kan manipulering av intracellulære signaler være mulig å fremme SC regenerativ kapasitet uten behov for dedikerte plattformer in vitro48,49. Dette har potensial for banebrytende arbeid i utviklingen av teknologier for nervereparasjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen potensiell interessekonflikt ble rapportert av forfatterne.

Acknowledgments

Forfatterne anerkjenner takknemlig finansieringsstøtte fra University of Cincinnati. Forfatterne takker også Ron Flenniken fra University of Cincinnati Advanced Materials Characterization laboratory for støtte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Albumin from Bovine Serum (BSA), Texas Red conjugate Thermo Fisher Scientific A23017 BSA staining to show micropatterns
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7076S Antibody used for western blot analysis
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7074S Antibody used for western blot analysis
BrdU Thermo Fisher Scientific B23151 Reagent used to measure cell proliferation
BrdU primary antibody conjugated with Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific B35130 Used to visualize BrdU in cell proliferation assays
Collagen I Thermo Fisher Scientific A10483-01 Protein used to coat coverslips
Compression force test machine TestResources Instrument to quantify mechanical properties of polymers
Dulbecco's Modified Eagle Medium Thermo Fisher Scientific 11965092 Cell culture medium
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 16000044 Cell culture medium supplemental
Fibronectin Thermo Fisher Scientific 33010-018 Protein used to coat coverslips
Fluorescence microscope Nikon Eclipse Ti2 Fluorescence microscope
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) Thermo Fisher Scientific 78440 Protease and Phosphatase Inhibitor
Laminin Thermo Fisher Scientific 23017015 Protein used to coat coverslips
Mounting medium with DAPI Thermo Fisher Scientific P36971 Coverslip mountant and nuclei staining
Mouse c-Jun primary antibody Thermo Fisher Scientific 711202 Primary antibody to visualize c-Jun protein
Mouse β-Actin primary antibody Cell Signaling Technology 3700S Loading control for western blot experiments
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 Cell culture medium supplemental
Photoresist SU 2010 KAYAKU SU8-2010 Photoresist
Pluronic F-127 Sigma Aldrich P-2443 Block non-specific protein binding
Rabbit c-Jun primary antibody Cell Signaling Technology 9165S Primary antibody for visualization of c-Jun protein
Rabbit myelin basic protein primary antibody Abcam ab40390 Primary antibody for visualization of MBP
Rabbit p75NTR primary antibody Cell Signaling Technology 8238S Primary antibody for visualization of p75NTR
Rhodamine phalloidin Thermo Fisher Scientific R415 Visualization of cell cytoskeleton
RIPA buffer Abcam ab156034 Cell lysis buffer
RT4-D6P2T Schwann cell line ATCC CRL-2768 Cell line used in experiments
SYLGARD 184 PDMS base and curing agent Sigma Aldrich 761036 Tunable polymer used to coat coverslips
Trypsin Thermo Fisher Scientific 15090-046 Cell dissociation reagent
UV-Ozone cleaner Novascan Increase hydrophicility of PDMS
Versene (1x) Thermo Fisher Scientific 15040066 Cell dissociation reagent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Taylor, C. A., Braza, D., Rice, J. B., Dillingham, T. The Incidence of Peripheral Nerve Injury in Extremity Trauma. American Journal of Physical Medicine & Rehabilitation. 87, 381-385 (2008).
  2. Noble, J., Munro, C. A., Prasad, V. S. S. V., Midha, R. Analysis of Upper and Lower Extremity Peripheral Nerve Injuries in a Population of Patients with Multiple Injuries. Journal of Trauma and Acute Care Surgery. 45, 116-122 (1998).
  3. Jessen, K. R., Mirsky, R. The repair Schwann cell and its function in regenerating nerves. Journal of Physiology. 594, 3521-3531 (2016).
  4. Arthur-Farraj, P. J., et al. c-Jun Reprograms Schwann Cells of Injured Nerves to Generate a Repair Cell Essential for Regeneration. Neuron. 75, 633-647 (2012).
  5. Jessen, K. R., Mirsky, R. The Success and Failure of the Schwann Cell Response to Nerve Injury. Frontiers in Cell Neurosciences. 13, 33 (2019).
  6. Gomez-Sanchez, J. A., et al. After Nerve Injury, Lineage Tracing Shows That Myelin and Remak Schwann Cells Elongate Extensively and Branch to Form Repair Schwann Cells, Which Shorten Radically on Remyelination. Journal of Neuroscience. 37, (37), 9086-9099 (2017).
  7. Deumens, R., et al. Repairing injured peripheral nerves: Bridging the gap. Progress in Neurobiology. 92, 245-276 (2010).
  8. Höke, A., Gordon, T., Zochodne, D. W., Sulaiman, O. A. R. A decline in glial cell-line-derived neurotrophic factor expression is associated with impaired regeneration after long-term Schwann cell denervation. Experimental Neurology. 173, 77-85 (2002).
  9. Jones, S., Eisenberg, H. M., Jia, X. Advances and future applications of augmented peripheral nerve regeneration. International Journal of Molecular Sciences. 17, 1-17 (2016).
  10. Harris, G. M., et al. Nerve Guidance by a Decellularized Fibroblast Extracellular Matrix. Matrix Biology. 60-61, 176-189 (2017).
  11. Harris, G. M., Piroli, M. E., Jabbarzadeh, E. Deconstructing the Effects of Matrix Elasticity and Geometry in Mesenchymal Stem Cell Lineage Commitment. Advanced Function Mater. 24, (16), 2396-2403 (2014).
  12. Pryzhkova, M. V., Harris, G. M., Ma, S., Jabbarzadeh, E. Patterning pluripotent stem cells at a single cell level. Journal of Biomaterials and Tissue Engineering. 3, (4), 461-471 (2013).
  13. Engler, A. J., Sweeney, H. L., Discher, D. E., Schwarzbauer, J. E. Extracellular matrix elasticity directs stem cell differentiation. Journal of Musculoskeleton and Neuronal Interaction. 7, (4), 335 (2007).
  14. Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276, (5317), 1425-1428 (1997).
  15. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
  16. Pickup, M. W., Mouw, J. K., Weaver, V. M. The extracellular matrix modulates the hallmarks of cancer. EMBO Reports. 15, 1243-1253 (2014).
  17. Chernousov, M. A., Carey, D. J. Schwann cell extracellular matrix molecules and their receptors. Histology and Histopathology. 15, 593-601 (2000).
  18. Shibata, S., et al. Selective Laminin-Directed Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Distinct Ocular Lineages. Cell Reports. 25, (6), 1668-1679 (2018).
  19. Mcbeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell Shape, Cytoskeletal tenstion and RhoA regulate stem cell lineage committment. Developmental Cell. 6, 483-495 (2004).
  20. Halder, G., Dupont, S., Piccolo, S. Transduction of mechanical and cytoskeletal cues by YAP and TAZ. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13, 591-600 (2012).
  21. Jessen, K. R., Mirsky, R. The repair Schwann cell and its function in regenerating nerves. Journal of Physiology. 594, (13), 3521-3531 (2016).
  22. Lopez-Fagundo, C., Bar-Kochba, E., Livi, L. L., Hoffman-Kim, D., Franck, C. Three-dimensional traction forces of Schwann cells on compliant substrates. Journal of The Royal Society Interface. 11, 20140247 (2014).
  23. Gu, Y., et al. The influence of substrate stiffness on the behavior and functions of Schwann cells in culture. Biomaterials. 33, 6672-6681 (2012).
  24. Xu, Z. Y., Orkwis, J. A., DeVine, B. M., Harris, G. M. Extracellular matrix cues modulate Schwann cell morphology, proliferation, and protein expression. Journal of Tissue Engineering and Regenerative. (2019).
  25. Urbanski, M. M., et al. Myelinating glia differentiation is regulated by extracellular matrix elasticity. Scientific Reports. 6, 1-12 (2016).
  26. Sun, Y., et al. Tunable stiffness of graphene oxide/polyacrylamide composite scaffolds regulates cytoskeleton assembly. Chemical Sciences. 9, (31), 6516-6522 (2018).
  27. Hwang, J. H., et al. Extracellular matrix stiffness regulates osteogenic differentiation through MAPK activation. PLoS One. 10, 1-16 (2015).
  28. Ryan, A. J., et al. A Physicochemically Optimized and Neuroconductive Biphasic Nerve Guidance Conduit for Peripheral Nerve Repair. Advanced Healthcare Materials. 6, 1-13 (2017).
  29. Du, J., et al. Prompt peripheral nerve regeneration induced by a hierarchically aligned fibrin nanofiber hydrogel. Acta Biomaterialia. 55, 296-309 (2017).
  30. Huang, L., et al. A compound scaffold with uniform longitudinally oriented guidance cues and a porous sheath promotes peripheral nerve regeneration in vivo. Acta Biomaterialia. 68, 223-236 (2018).
  31. Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices. Jouranl of Visualized Experiments. (119), e55276 (2017).
  32. Gupta, R., et al. Shear stress alters the expression of myelin-associated glycoprotein (MAG) and myelin basic protein (MBP) in Schwann cells. Journal of Orthopaedic Research : Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 23, 1232-1239 (2005).
  33. Harris, G. M., Shazly, T., Jabbarzadeh, E. Deciphering the combinatorial roles of geometric, mechanical, and adhesion cues in regulation of cell spreading. PLoS One. 8, (11), (2013).
  34. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, (4), 677-689 (2006).
  35. Schreck, I., et al. C-Jun localizes to the nucleus independent of its phosphorylation by and interaction with JNK and vice versa promotes nuclear accumulation of JNK. Biochemical and Biophysical Research Communications. 407, 735-740 (2011).
  36. Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact printing of proteins for cell biology. Journal Visualized Experiments. (22), e1065 (2008).
  37. Treter, J., et al. Washing-resistant surfactant coated surface is able to inhibit pathogenic bacteria adhesion. Applied Surface Science. 303, 147-154 (2014).
  38. Lutz, J. F. Polymerization of oligo(ethylene glycol) (meth)acrylates: Toward new generations of smart biocompatible materials. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 46, (11), 3459-3470 (2008).
  39. Marcus, M., et al. Interactions of Neurons with Physical Environments. Advanced Healthcare Materials. 6, (2017).
  40. Pu, J. Golgi polarization in a strong electric field. Journal of Cell Science. 118, 1117-1128 (2005).
  41. Blaker, J. J., et al. Bioactive Silk-Based Nerve Guidance Conduits for Augmenting Peripheral Nerve Repair. Advanced Healthcare Materials. 7, 1800308 (2018).
  42. Daly, W., Yao, L., Zeugolis, D., Windebank, A., Pandit, A. A biomaterials approach to peripheral nerve regeneration : bridging the peripheral nerve gap and enhancing functional recovery. Journal of the Royal Society of Interface. 9, (67), 202-221 (2012).
  43. Xia, H., et al. Directed neurite growth of rat dorsal root ganglion neurons and increased colocalization with Schwann cells on aligned poly(methyl methacrylate) electrospun nanofibers. Brain Research. 1565, 18-27 (2014).
  44. Wang, H. B., Mullins, M. E., Cregg, J. M., McCarthy, C. W., Gilbert, R. J. Varying the diameter of aligned electrospun fibers alters neurite outgrowth and Schwann cell migration. Acta Biomaterialia. 6, 2970-2978 (2010).
  45. Carvalho, C. R., Oliveira, J. M., Reis, R. L. Modern Trends for Peripheral Nerve Repair and Regeneration: Beyond the Hollow Nerve Guidance Conduit. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 337 (2019).
  46. Yang, Y., Wang, K., Gu, X., Leong, K. W. Biophysical Regulation of Cell Behavior - Cross Talk between Substrate Stiffness and Nanotopography. Engineering. 3, 36-54 (2017).
  47. Tan, J. L., Liu, W., Nelson, C. M., Raghavan, S., Chen, C. S. Simple Approach to Micropattern Cells on Common Culture Substrates by Tuning Substrate Wettability. Tissue Engineering. 10, 865-872 (2004).
  48. Grove, M., et al. YAP/TAZ initiate and maintain schwann cell myelination. Elife. 6, 1-27 (2017).
  49. Poitelon, Y., et al. YAP and TAZ control peripheral myelination and the expression of laminin receptors in Schwann cells. Nature Neuroscience. 19, 879-887 (2016).
Utarbeidelse av justerbare ekstracellulære matrisemikromiljøer for å evaluere Schwann Cell Phenotype Specification
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xu, Z., Orkwis, J. A., Harris, G. M. Preparation of Tunable Extracellular Matrix Microenvironments to Evaluate Schwann Cell Phenotype Specification. J. Vis. Exp. (160), e61496, doi:10.3791/61496 (2020).More

Xu, Z., Orkwis, J. A., Harris, G. M. Preparation of Tunable Extracellular Matrix Microenvironments to Evaluate Schwann Cell Phenotype Specification. J. Vis. Exp. (160), e61496, doi:10.3791/61496 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter