Beredning av Tunable Extracellular Matrix Microenvironments att utvärdera Schwann Cell Fenotyp Specifikation

Summary

Denna metod syftar till att illustrera de mekanismer genom vilka extracellulära matris ledtrådar såsom substrat stelhet, protein sammansättning och cell morfologi reglera Schwann cell (SC) fenotyp.

Abstract

Traumatiska perifera nervsystemet (PNS) skador saknar för närvarande lämpliga behandlingar för att återfå full funktionell återhämtning. Schwann celler (SCs), som de viktigaste gliacellerna i PNS, spelar en viktig roll för att främja PNS förnyelse genom att dedifferentiating till en regenerativ cell fenotyp efter skada. Dedifferentierade tillståndet för betydande betydande betydande information är dock en utmaning att upprätthålla genom den tidsperiod som krävs för regenerering och påverkas av förändringar i den omgivande extracellulära matrisen (ECM). Därför är det viktigt att fastställa det komplexa samspelet mellan de rådgivande centralföretag och olika ECM för att tillhandahålla signaler om regenerativ potential hos de centralföretagare som är avgörande. För att ta itu med detta skapades en strategi där olika ECM-proteiner adsorbelades på ett avstämt polydimetylsiloxansubstrat (PDMS) som gav en plattform där styvhet och proteinsammansättning kan moduleras. SCs seeds på den oförstämda substrat och kritiska cellulära funktioner som representerar dynamiken i SC fenotyp mättes. För att illustrera samspelet mellan SC protein uttryck och cellulära morfologi, olika sådd tätheter av SCs utöver enskilda microcontact tryckta cellulära mönster utnyttjades och kännetecknas av immunofluorescens färgning och västra blot. Resultaten visade att celler med en mindre spridning område och högre utsträckning av cellulära töjning främjas högre nivåer av SC regenerativ fenotypiska markörer. Denna metod börjar inte bara att reda ut det betydande förhållandet mellan ECM och cellulära funktion avCS, men ger också riktlinjer för framtida optimering av biomaterial i perifera nerv reparation.

Introduction

Skador på perifera nervsystemet (PNS) är fortfarande en stor klinisk utmaning inom hälso- och sjukvården genom att äventyra livskvaliteten för patienterna och skapa en betydande inverkan genom en mängd socioekonomiska faktorer^1,2. Schwann celler (SC), som de viktigaste gliaceller i PNS, ge nödvändiga molekylära och fysiska ledtrådar för att inducera PNS förnyelse och stöd i funktionella återvinningar i korta gap skador. Detta beror på den anmärkningsvärda förmågan hos SCs att dedifferentiera till en “reparation” cell fenotyp från en myelinating eller Remak fenotyp³. Reparationen SC är en distinkt cell fenotyp på flera sätt. Efter skada, SCs öka sin spridning genom att åter komma in i cellcykeln och börja uttryck för flera transkriptionella faktorer för att underlätta reinnervation. Dessa faktorer, såsom c-Jun och p75 NTR, är uppreglerade medan myelinating SC markörer, såsom myelin grundläggande protein (MBP), är downregulated^4,5. Dessutom ändrar SCs morfologi för att bli långsträckt och i linje med varandra för att bilda Büngner band över skadeområdet⁶. Detta ger en fysisk vägledningsmekanism för axoner att utvidgas till rätt distala mål⁷. Men trots förmågan att SCs har att främja nerv regenerering i korta gap skador, resultatet av funktionell återhämtning är fortfarande dålig i svåra skador. Detta beror delvis på en förlust av extracellulär matris (ECM) vägledning ledtrådar, liksom oförmågacs att upprätthålla regenerativ fenotyp under långa tidsperioder⁸.

Nervregenerering och återhämtningsprocessen är intimt knutna till tillståndet i den basala lamina efter skada. Den basala lamina är ett lager av ECM runt nerven som underlättar vägledning och ger ECM-bundna ledtrådar för axoner och SCs i de fall där det förblir intakt efter skada⁹. Tillståndet för ECM och dess förmåga att leverera matris bundna ledtrådar till celler är mycket viktigt och har tidigare undersökts i en mängd olika sammanhang^{10,11,12,13,14}. Det har till exempel visats att styvheten i ECM kan styra cellfunktioner som spridning och differentiering^11,15,16. Sammansättningen av ECM kan också leda till ett distinkt cellulärt svar och reglera cellbeteenden som migration och differentiering genom intracellulära signalvägar^17,18. Dessutom spelar cellmorfologi, inklusive spridningsområde och cellulär töjning, en viktig roll i regleringen av funktionen och kan styras av ECM-bundna signaler^19,20. Många tidigare studier har fokuserat på stamceller som skiljer sig till definierade härstamningar, men SCs har en liknande förmåga att ändra fenotyp från en homeostatisk, vuxen SC inom en frisk nerv, till en reparation SC kan utsöndra proteiner och tillväxtfaktorer medan remodeling ECM efter nervskada^5,21. Därför är det särskilt viktigt att identifiera mekanismer som ligger till grund för förhållandet mellan den medfödda SC regenerativ kapacitet och ECM bundna ledtrådar för insikten att i slutändan utnyttja denna kapacitet för nervregenerering.

För att åtgärda detta har vi utvecklat en detaljerad metod för att ta fram ett cellodlingssubstrat där mekanisk styvhet och ligandtyp enkelt kan justeras i fysiologiskt relevanta områden. Polydi metylsiloxan (PDMS) valdes som substrat på grund av dess mycket avstämbara mekanik jämfört med polyakrylamidgel, där den maximala Youngs modul är cirka 12 kPa kontrasterad till PDMS på omkring 1000 kPa^22,23,24. Detta är fördelaktigt för det arbete som finns, eftersom nyligen genomförda studier har visat att Youngs modulus av en kanin ischiasnerven kan överstiga 50 kPa under utveckling, vilket tyder på att utbudet av stelhet av nerver inom PNS är bredare än tidigare undersökts. Olika proteiner kan adsorption på PDMS substrat för att analysera kombinatorisk reglering av mekanik och ligander på SC beteende. Detta gör det möjligt för undersökning av flera mikromiljö signaler som finns i PNS regenereringsprocessen och jämförelse av en hög grad av tunability till arbetet fokuserar enbart på styvhet av substratet²⁵. Vidare är dessa konstruerade cellodlingssubstrat kompatibla med en mängd kvantitativa analysmetoder som immunohistokemi, västra blot och kvantitativ polymeraskedjereaktion (q-PCR).

Denna konstruerade cellodlingsplattform är mycket lämplig för att analysera mekanistiska vägar på grund av den höga individuella tunabilityen hos varje ECM-bunden signal. Dessutom kan populära metoder för cellmikromönster, inklusive mikrokontakter, uppnås på substraten för att möjliggöra kontrollerad cellvidhäftning för att analysera cellform i förhållande till andra ECM bundna signaler²⁴. Detta är avgörande eftersom linjemönstrade substrat, som främjar töjning i cellpopulationer, ger ett verktyg för att efterlikna och studera långsträckta och regenerativa SCs inom Büngner band under nervregenerering. Vidare, cellulär morfologi är en potent regulator av flera cellfunktioner och kan potentiellt införa förvirrande experimentella resultat om inte kontrolleras^26,27. Betydande uppmärksamhet ägnas nu åt de mekanismer som styr SC regenerativ fenotyp som regleras av ECM cues^28,29,30. Detta är viktigt för att ge insikt i utformningen av biomaterial som kan tillämpas som nerv vägledning ledningar för stöd i PNS nerv regenerering. Dessa detaljerade protokoll kan i slutändan tillämpas som ett potentiellt verktyg för att dechiffrera mekanismerna för SC och andra celltyp funktion som regleras av ECM bundna ledtrådar.

Protocol

1. Sunable cellodling substrat förberedelse och karakterisering Substratberedning Blanda PDMS bas elastomer och härdningsmedel med hjälp av en pipett spets kraftigt i ett förhållande mellan 10:1 och 60:1 tills bubblor är homogent spridda i blandningen. Ta bort bubblor med vakuum uttorkning tills bubblor skingras.OBS: Under PDMS polymerisation, härdningsmedel tvärbindningar med basen elastomer för att ge slutliga polymer önskade mekaniska egenskaper. Tvärlänksförhålla…

Representative Results

För att analysera och kvantifiera samspelet mellan substratstyvhet och proteinsammansättning på SC-fenotyp utvecklades ett avstämt PDMS-cellodlingssubstrat (figur 1A). Kompressionstestning av polymeren vid olika bas: härdningsmedelsförhållanden användes för att kvantifiera Youngs modulus (E) av substratet (figur 1B). Det resulterande intervallet av modulvärden representerar fysiologiskt relevanta substratförhållanden. Efter beredning av substrat, var…

Discussion

SCs kan främja nerv regenerering på grund av deras fenotypiska omvandling och regenerativ potential efter nerv skada. Men hur ECM signaler reglerar denna regenerativa kapacitet är fortfarande mestadels oklart, potentiellt hindrar inte bara utvecklingen av biomaterial som syftar till att främja nervregenerering men också förståelsen av de mekanismer som är involverade i nervregenerering. För att börja undersöka detta samspel, cellkultur substrat skapades där ECM ledtrådar såsom styvhet, protein beläggning, …

Materials

Albumin from Bovine Serum (BSA), Texas Red conjugate	Thermo Fisher Scientific	A23017	BSA staining to show micropatterns
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signaling Technology	7076S	Antibody used for western blot analysis
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signaling Technology	7074S	Antibody used for western blot analysis
BrdU	Thermo Fisher Scientific	B23151	Reagent used to measure cell proliferation
BrdU primary antibody conjugated with Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	B35130	Used to visualize BrdU in cell proliferation assays
Collagen I	Thermo Fisher Scientific	A10483-01	Protein used to coat coverslips
Compression force test machine	TestResources		Instrument to quantify mechanical properties of polymers
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Thermo Fisher Scientific	11965092	Cell culture medium
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	16000044	Cell culture medium supplemental
Fibronectin	Thermo Fisher Scientific	33010-018	Protein used to coat coverslips
Fluorescence microscope	Nikon	Eclipse Ti2	Fluorescence microscope
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)	Thermo Fisher Scientific	78440	Protease and Phosphatase Inhibitor
Laminin	Thermo Fisher Scientific	23017015	Protein used to coat coverslips
Mounting medium with DAPI	Thermo Fisher Scientific	P36971	Coverslip mountant and nuclei staining
Mouse c-Jun primary antibody	Thermo Fisher Scientific	711202	Primary antibody to visualize c-Jun protein
Mouse β-Actin primary antibody	Cell Signaling Technology	3700S	Loading control for western blot experiments
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122	Cell culture medium supplemental
Photoresist SU 2010	KAYAKU	SU8-2010	Photoresist
Pluronic F-127	Sigma Aldrich	P-2443	Block non-specific protein binding
Rabbit c-Jun primary antibody	Cell Signaling Technology	9165S	Primary antibody for visualization of c-Jun protein
Rabbit myelin basic protein primary antibody	Abcam	ab40390	Primary antibody for visualization of MBP
Rabbit p75NTR primary antibody	Cell Signaling Technology	8238S	Primary antibody for visualization of p75NTR
Rhodamine phalloidin	Thermo Fisher Scientific	R415	Visualization of cell cytoskeleton
RIPA buffer	Abcam	ab156034	Cell lysis buffer
RT4-D6P2T Schwann cell line	ATCC	CRL-2768	Cell line used in experiments
SYLGARD 184 PDMS base and curing agent	Sigma Aldrich	761036	Tunable polymer used to coat coverslips
Trypsin	Thermo Fisher Scientific	15090-046	Cell dissociation reagent
UV-Ozone cleaner	Novascan		Increase hydrophicility of PDMS
Versene (1x)	Thermo Fisher Scientific	15040066	Cell dissociation reagent