Summary
Nous présentons un protocole détaillé pour générer un modèle de xénogreffe murine de malformation veineuse. Ce modèle est basé sur l’injection sous-cutanée de cellules endothéliales dérivées du patient contenant des mutations du gène TIE2 hyper-activantes et/ou PIK3CA. Les lésions de Xenograft récapitulent étroitement les dispositifs histopathologiques du tissu patient de VM.
Abstract
La malformation veineuse (VM) est une anomalie vasculaire qui résulte d’une altération du développement du réseau veineux entraînant des veines dilatées et souvent dysfonctionnelles. Le but de cet article est de décrire soigneusement l’établissement d’un modèle de xénogreffe murine qui imite VM humaine et est capable de refléter l’hétérogénéité du patient. Les mutations TEK (TIE2) non héréditaires (somatiques) et PIK3CA dans les cellules endothéliales (EC) ont été identifiées comme les principaux moteurs de l’élargissement pathologique des vaisseaux dans la VM. Le protocole suivant décrit l’isolement, la purification et l’expansion des EC d’origine du patient exprimant le mutant TIE2 et/ou PIK3CA. Ces EC sont injectées sous-cutanéement dans le dos des souris athymiques immunodéficientes pour générer des canaux vasculaires ectatiques. Les lésions générées avec TIE2 ou PIK3CA-mutant EC sont visiblement vascularisées dans les 7\u20129 jours suivant l’injection et récapitulent les caractéristiques histopathologiques du tissu patient de VM. Ce modèle VM xenograft fournit une plate-forme fiable pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires conduisant la formation et l’expansion de VM. En outre, ce modèle sera instrumental pour des études translationnelles testant l’efficacité des nouveaux candidats de drogue dans la prévention de l’agrandissement anormal de navire vu dans VM humain.
Introduction
Les défauts dans le développement de la vascularisation sont la cause sous-jacente de nombreuses maladies, y compris la malformation veineuse (VM). VM est une maladie congénitale caractérisée par la morphogenèse anormale et l’expansion des veines1. Des études importantes sur les tissus VM et les cellules endothéliales (EC) ont identifié des mutations de gain de fonction dans deux gènes : TEK, qui code le récepteur de la tyrosine kinase TIE2, et PIK3CA, qui code l’isoforme p110α (sous-unité catalytique) de PI3-kinase (PI3K)2,3,4,5. Ces mutations somatiques entraînent une hyperactivation ligand-indépendante des voies de signalisation angiogéniques/de croissance clés, y compris PI3K/AKT, ce qui entraîne des veines ecstatiques dilatées3. Malgré ces découvertes génétiques importantes, les mécanismes cellulaires et moléculaires suivants déclenchant l’angiogenèse anormale et la formation de canaux vasculaires agrandis ne sont toujours pas entièrement compris.
Pendant l’angiogenèse normale et pathologique, de nouveaux vaisseaux germent d’un réseau vasculaire préexistant et EC subissent une séquence de processus cellulaires importants comprenant la prolifération, la migration, le remodelage de matrice extracellulaire (ECM) et la formation de lumen6. Les cultures in vitro bidimensionnelles (2D/3D) d’EC sont des outils importants pour étudier chacune de ces propriétés cellulaires individuellement. Néanmoins, il existe une demande claire pour un modèle de souris récapitulant l’élargissement pathologique des vaisseaux dans le microenvironnement hôte tout en fournissant une plate-forme efficace pour l’évaluation préclinique des médicaments ciblés pour la recherche translationnelle.
À ce jour, un modèle murin transgénique de VM associé aux mutations de gain de fonction tie2 n’a pas été rapporté. Les modèles transgéniques actuels de souris VM s’appuient sur l’expression omniprésente ou restreinte de tissu de la mutation activante PIK3CA p.H1047R3,5. Ces animaux transgéniques fournissent un aperçu significatif des effets spécifiques au corps entier ou aux tissus de cette mutation PIK3CA de point chaud. La limitation de ces modèles est la formation d’un réseau vasculaire hautement pathologique ayant pour résultat la létalité tôt. Ainsi, ces modèles de souris ne reflètent pas entièrement l’occurrence sporadique des événements mutationnels et de la nature localisée de la pathologie de VM.
Au contraire, les modèles de xénogreffe dérivés par le patient sont basés sur la transplantation ou l’injection de tissus pathologiques ou de cellules dérivées de patients sur des souris immunodéficientes7. Les modèles Xénogreffe sont un outil puissant pour élargir les connaissances sur le développement des maladies et la découverte de nouveaux agents thérapeutiques8. En outre, l’utilisation de cellules dérivées du patient permet aux scientifiques de récapituler l’hétérogénéité de mutation pour étudier le spectre des phénotypes de patients.
Ici, nous décrivons un protocole où les VM EC dérivés du patient qui expriment une forme mutante constitutivement active de TIE2 et/ou PIK3CA sont injectés sous-cutanéement dans le dos de souris nues athymiques. Les cellules vasculaires injectées sont suspendues dans un cadre ecm afin de promouvoir l’angiogenèse comme décrit dans les modèles xénogreffe vasculaires précédentes9,10,11. Ces EC de VM subissent la morphogenèse significative et génèrent des vaisseaux pathologiques agrandis et perfusés en l’absence de cellules de soutien. Le modèle de xénogreffe décrit de VM fournit une plate-forme efficace pour l’évaluation préclinique des drogues ciblées pour leur capacité à inhiber l’expansion incontrôlée de lumen.
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Protocol
Des échantillons de tissus de patients ont été obtenus auprès des participants après le consentement éclairé de la collection et du dépôt d’échantillons de tissus et de données de patients atteints de tumeurs et d’anomalies vasculaires dans le cadre d’un Comité d’examen institutionnel (CISR) approuvé par les politiques institutionnelles du Cincinnati Children’s Hospital Medical Center (CCHMC), du Cancer and Blood Disease Institute et avec l’approbation du Comité d’enquête clinique. Toutes les procédures animales décrites ci-dessous ont été examinées et approuvées par le Comité des soins et de l’utilisation des animaux institutionnels du CCHMC.
1. Préparation de matériaux et de solutions de stock
- Préparation d’un milieu complet de croissance des cellules endothéliales (EGM)
- Supplément de milieu basal endothélial (EBM) avec les facteurs de croissance suivants présents dans le kit (voir tableau des matériaux): facteur de croissance du fibroblaste humain-bêta (hFGF-β), facteur de croissance endothéliale vasculaire (VEGF), Facteur de croissance semblable à l’insuline Arg3 Long- I (R3-IGF-I), acide ascorbique, facteur de croissance épidermique (EGF), sulfate de gentamycine et amphotericine-B, et l’héparine. Ajouter 1% de pénicilline/streptomycine/L-Glutamine (PSG) et 20% de sérum bovin fœtal (FBS).
REMARQUE : Nous ne recommandons pas d’ajouter de l’hydrocortisone. - Filtrer stérilement la solution sous un capot d’écoulement laminaire à travers un filtre de 0,2 μm de dessus de bouteille dans une bouteille en verre autoclavé et un support aliquot dans des tubes coniques de 50 mL et stocker à 4 °C jusqu’à une semaine ou à -20 °C pendant jusqu’à un an.
- Supplément de milieu basal endothélial (EBM) avec les facteurs de croissance suivants présents dans le kit (voir tableau des matériaux): facteur de croissance du fibroblaste humain-bêta (hFGF-β), facteur de croissance endothéliale vasculaire (VEGF), Facteur de croissance semblable à l’insuline Arg3 Long- I (R3-IGF-I), acide ascorbique, facteur de croissance épidermique (EGF), sulfate de gentamycine et amphotericine-B, et l’héparine. Ajouter 1% de pénicilline/streptomycine/L-Glutamine (PSG) et 20% de sérum bovin fœtal (FBS).
- Préparer la collagène Une solution de stock
- Préparer 50 mg/mL collagènease Une solution de stock en 1x phosphate tampon saline (PBS).
- Filtrer stérilement la solution sous un capot d’écoulement laminaire avec filtre et seringue de 0,2 μm, et stocker 100 aliquots μL à -20 °C.
- Préparer le milieu de collecte des tissus (Tampon A)
- Préparer une solution de stock Ca2+/Mg2+ en ajoutant 0,927 g de dihydrate de chlorure de calcium (CaCl2.2H2O) et 1 g d’héptahydrate de sulfate de magnésium (MgSO4.7H2O) à 500 mL d’eau distillée. Filtrer stérilement la solution à travers un filtre de 0,2 μm de dessus de bouteille dans une bouteille en verre autoclavée et stocker à température ambiante (RT).
- Supplémentez le milieu aigle modifié de Dulbecco (DMEM) avec 10 % de solution Ca2+/Mg2+ et 2 % de FBS.
- Filtrer stérilement la solution sous un capot d’écoulement laminaire avec filtre et seringue de 0,2 μm et stocker les aliquots de 5 mL à -20 °C.
- Revêtement fibronectine des plaques de culture tissulaire
- Préparer le tampon de revêtement (tampon B) en dissolvant 5,3 g de carbonate de sodium (Na2CO3; 0,1 M) dans 500 mL d’eau déionisée. Ajuster le pH du tampon à 9,4 à l’aide d’acide chlorhydrique de 1 M (HCl). Filtrer sous un capot d’écoulement laminaire à travers un filtre de 0,2 μm de dessus de bouteille dans une bouteille en verre autoclaved et stocker à RT.
- Pour le revêtement, la pipette 2 mL/5 mL/10 mL de tampon B par plaque de culture tissulaire de 60 mm/100 mm/145 mm, respectivement. Ajouter 1 μg/cm2 de solution de protéines purifiées à plasma humain et répartir délicatement le liquide sur la plaque.
- Incuber la plaque à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 20 min.
- Aspirate Buffer B et laver la plaque avec pbs avant de cultiver les cellules.
2. Isolement des cellules endothéliales du tissu patient VM
- Isolement des EC des tissus VM solides
REMARQUE : Le tissu de VM est réséqué par la chirurgie de débulking12,13 en vertu d’un protocole approuvé par la CISR.- Laver le tissu VM (le poids de l’échantillon de tissu varie généralement entre 0,5 g et 1,5 g) dans 5% PSG dans PBS.
- Transférer le tissu dans un plat de culture cellulaire de 100 mm, hacher l’échantillon de tissu en petits morceaux à l’aide d’outils de dissection chirurgicaux stériles, et transférer dans un tube conique de 50 mL.
- Ajouter 100 μL de collagènease Une solution de bouillon à 5 mL de tampon A pour une concentration finale de 1 mg/mL, puis ajoutez-le au tissu et digère le tissu haché à 37 °C pendant 30 min tout en secouant le contenu toutes les 5 minutes.
- Broyer soigneusement le tissu digéré à RT à l’aide d’un broyeur de pilons de surface lisse de 6 mm dans le tube conique de 50 mL.
- Continuer à moudre soigneusement les tissus digérés à l’aide d’un pilon tout en ajoutant 5 mL de PBS froid complété par 0,5% d’albumine de sérum bovin (BSA) et 2% PSG. Répétez cette étape quatre fois.
- Filtrer la solution à travers une passoire cellulaire de 100 μm dans un tube conique de 50 ml pour enlever les fragments de tissu.
- Suspension de cellules de centrifugeuse pendant 5 min à 400 x g à RT. Procéder à l’étape 2.3.
- Isolement de VM EC du sang lésionnel obtenu à partir de la sclérothérapie du patient
- Obtenir le sang lésionnel humain de VM de sclérothérapie en vertu d’un protocole approuvé par la CISR.
- Le sang lésionnel dilué (le volume d’échantillon varie généralement entre 0,5 mL et 5 mL) dans pbs à un volume final de 40 mL.
- Suspension de cellules de centrifugeuse pendant 5 min à 200 x g à RT.
- Placage initial de cellules
- Jeter le supernatant et resuspender le granulé unicellulaire dans 1 mL d’EGM.
- Ajouter 9 mL d’EGM complet sur des plaques de 100 mm et des graines de 1 mL de suspension cellulaire.
- Incuber les cellules à 37 °C dans une atmosphère humidifiée de 5 % de CO2.
- Tous les deux jours, retirez 2 mL de support et ajoutez 2 mL de FBS filtré stérile.
- Une fois que les cultures cellulaires atteignent une confluence de 40\u201250% changer le milieu pour terminer EGM. Il faut généralement entre 2\u20123 semaines pour que les cellules atteignent cette confluence.
- Observez tous les jours pour l’apparition des colonies de l’EC. Ils peuvent être reconnus par leur morphologie typique de type « pavé » (figure 1A). Entre 3\u20125, des colonies EC apparaissent dans chaque échantillon.
- Changez le milieu tous les deux jours pendant 5/u20127 jours jusqu’à ce que les colonies communautaires commencent à se toucher.
- Isolement manuel des différentes colonies communautaires
- Pour récolter les colonies d’EC, laver la plaque avec 5 mL de PBS et l’asphyxie manuelle avec une pipette sérologique.
- Prenez la plaque au microscope et encerclez les emplacements de plusieurs colonies ec à l’aide d’un stylo de marquage à la fois sur le couvercle et le fond avant de la retourner à la hotte d’écoulement laminaire.
- Détacher les colonies de CE en canalisant 50 μL de solution trypsin-EDTA à 0,05 % sur les zones marquées.
- À l’aide d’un petit grattoir à cellules ou d’une pointe de pipette, gratter délicatement les cellules de la plaque.
- Inclinez la plaque sur le bord le plus proche, et rincez avec 1 mL d’EGM par zone marquée et de recueillir les cellules.
- Comptez le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur cellulaire automatisé.
- Plaquez les colonies ec recueillies à une densité de 1 x 104 cellules/cm2 sur des plats de culture cellulaire recouverts de fibronectine (1 μg/cm²) contenant des EGM frais. Le lendemain, changez de support pour compléter EGM.
- Modifier le milieu pour compléter EGM tous les deux jours pendant 2\u20123 semaines jusqu’à ce que les cellules atteignent 80% de confluence.
- Trypsinize EC avec 2 mL de trypsin-EDTA préchauffé à 0,05% par plat de 100 mm à 37 °C pendant 2 min et neutraliser la trypsie en ajoutant 4 mL d’EGM.
- Recueillir la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 mL et la centrifugeuse à 400 x g à RT pendant 5 min. Remplacer les cellules supernatantes et resuspend dans 2 mL d’EGM.
- Comptez le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur cellulaire automatisé. Les nombres cellulaires typiques obtenus sont 1 x10 6 cellules par plaque de culture cellulaire de 60 mm ou 2 x 106 cellules par plaque de culture tissulaire de 100 mm.
- Pelleter les cellules par centrifugation à 400 x g à RT pendant 5 min et aspirate le supernatant. Passez à l’étape 3.2.1.
3. Sélection et expansion des cellules endothéliales
- Préparation de perles magnétiques conjuguées anti-CD31
- Vortex le flacon contenant les perles magnétiques anti-CD31 conjuguées pendant 30 s. Le nombre de perles requises est de 8 x 106 perles/2 x 106 cellules.
- Laver la quantité désirée de perles magnétiques conjuguées anti-CD31 avec 1 ml de solution de lavage contenant 0,1% de BSA dans PBS dans un tube de microcentrifuge de 1,5 mL.
- Placez le tube de microcentrifuge dans un aimant d’isolement cellulaire pendant 1 min.
- Remplacer le supernatant et répéter l’étape de lavage.
- Purification et placage des cellules endothéliales
- Resuspend de granulé de cellules obtenu dans 2.4.12 dans 500 μL de solution de lavage contenant 0.1% BSA dans PBS.
- Ajoutez une solution cellulaire au tube de microcentrifuge contenant des perles magnétiques et resuspendez complètement.
- Incuber pendant 20 min à 4 °C avec inclinaison douce.
- Ajouter 500 μL de 0,1 % de BSA dans pbs et bien mélanger.
- Placez le tube sur un aimant d’isolement cellulaire pendant 1 min.
- Apirate doucement tout le liquide, qui contient la fraction CD31-négatif des cellules sans toucher les perles.
- Laver le granulé de perle contenant la fraction cellulaire CD31-positive avec 1 mL de 0,1% BSA dans PBS et répéter la séparation magnétique.
- Répétez l’étape de lavage et de séparation magnétique pour un minimum de 3 fois pour purifier la fraction cellulaire CD31-positive.
- Resuspend les cellules endothéliales purifiées dans un tube conique de 15 mL et tournez vers le bas pendant 5 min à 400 x g à RT.
- Retirer le surnatant et resuspend le granulé de cellule dans 1 mL d’EGM.
- Ajouter 9 mL d’EGM complet sur des plaques de 100 mm et des graines de 1 mL de suspension cellulaire. Notez que certaines perles magnétiques sont encore attachées aux cellules dans cette étape initiale d’ensemencement. La plupart des perles se lavent pendant l’expansion cellulaire, mais un petit nombre de perles peut persister dans les premiers passages.
- Incuber les cellules à 37 °C dans une atmosphère humidifiée de 5 % de CO2.
- Modifier le milieu tous les deux jours jusqu’à ce que les cellules atteignent 80 % de confluence (figure 1B).
- Expansion des cellules endothéliales
- Une fois que les cellules atteignent 80 % de confluence, détachez-la avec 2 mL de 0,05 % de trypsine-EDTA par plat de 100 mm à 37 °C pendant 2 min.
- Neutraliser la trypsine en ajoutant 4 ml d’EGM et recueillir des cellules dans un tube conique de 15 mL.
- Centrifugeuse à 400 x g à RT pendant 5 min.
- Remplacer les cellules supernatantes, resuspender dans 2 mL d’EGM, et compter le nombre de cellules avec un hémocytomètre ou par comptage automatisé des cellules.
- Cellules de graines à une densité de 1 x 104 cellules/cm² dans des plaques de culture tissulaire recouvertes de fibronectine de 145 mm (1 μg/cm²).
- Continuer à passer les cellules jusqu’à ce que le numéro de cellule souhaité ait été atteint. Considérez qu’une plaque de culture tissulaire confluente de 145 mm contient environ 8\u20129 x 106 cellules et le nombre de cellules nécessaires est de 2,5 x 106 cellules par injection. Seules les cellules entre le passage 3 et 8 doivent être considérées pour la xénogreffe.
4. Protocole de xénogreffe VM dérivé du patient
NOTE: Dans ce protocole, nous utilisons 5\u20126 semaine, immunodéficient masculin, athymique nue Foxn1souris nu.
Toutes les procédures animales doivent être approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC).
- Préparation des matériaux la veille de l’injection
- Pré-réfrigérer les seringues, les aiguilles et les pointes de pipet dans le congélateur de -20 °C pendant la nuit.
- Décongeler lentement la matrice extracellulaire de la membrane du sous-sol (BMEM) pendant la nuit sur un seau à glace placé à 4 °C pour éviter une visibilité accrue du gel.
- Préparation de la suspension cellulaire pour injection
- Trypsinize EC avec 5 mL de préchauffé 0,05% trypsin-EDTA par plat de 145 mm à 37 °C pendant 2 min.
- Neutraliser la trypsine en ajoutant 5 ml d’EGM et recueillir des cellules dans un tube conique de 15 mL.
- Centrifugeuse à 400 x g à RT pendant 5 min.
- Remplacer les cellules supernatantes et résuspender dans 3 mL d’EGM, et compter le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur cellulaire automatisé.
- Déterminez le nombre total de cellules nécessaires pour toutes les injections planifiées.
REMARQUE : Le nombre recommandé de cellules est de 2,5 x 106 cellules par injection. Un total de 2 injections sont généralement effectuées dans chaque souris pour des doublons techniques. Il est nécessaire de calculer un excédent de 10% du numéro de cellule pour tenir compte de la perte lors du transfert dans la seringue. - Transférer le volume contenant le numéro de cellule calculé dans un nouveau tube conique de 50 mL et cellules de granulés par centrifugation à 400 x g à RT pendant 5 min.
- Remplacer le supernatant, en laissant un petit volume (environ 50\u201270 μL) pour desserrer le granulé.
- Préparation des seringues
- Calculer un volume excédentaire de 20 μL/injection pour tenir compte de la perte lors du transfert à la seringue. Resuspendez le granulé cellulaire avec 220 μL de BMEM par injection sur la glace. Le volume injecté de suspension cellulaire sera de 200 μL par lésion.
- Mélanger la suspension cellulaire à fond sur la glace pour obtenir une suspension homogène des cellules et éviter de créer des bulles.
- À l’aide d’un pipet de 1 mL et d’une seringue de 1 mL, le mélange BMEM-cell de pipet simultanément dans l’ouverture de la seringue par la force d’aspiration tout en tirant le piston de la seringue.
- Luer verrouille une aiguille stérile de 26 G x 5/8 pouces à la seringue et garde les seringues préparées à plat sur la glace avant l’injection.
- Injection sous-cutanée dans la souris
- Anesthésiez les souris avec un mélange isoflurane/oxygène de 5 % à un débit de 1 L/min à l’aide d’un vaporisateur isoflurane. Assurer une sédation adéquate des animaux (p. ex., manque de réaction aux pincements aux orteils). Maintenir l’anesthésie par l’administration continue de 1,5% isoflurane / oxygène livré par cône de nez.
- Placez les souris sur leur estomac, en exposant la région arrière où la greffe se produira et désinfecter la région d’injection avec 70% d’éthanol.
- Roulez doucement la seringue préparée pour réutiliser les cellules réglées. Faites glisser les bulles à l’extrémité de l’aiguille de la seringue et expulsez un petit volume de la suspension cellulaire pour assurer l’élimination de toutes les bulles.
REMARQUE : Deux injections peuvent être effectuées pour chaque souris – sur le côté gauche et le côté droit du dos de la souris. - Pincez et créez une structure « en forme de tente » à l’aide de votre pouce et de l’index et insérez l’aiguille sous-cutanéement juste sous la peau. Assurez-vous que l’aiguille n’est profonde que la peau en libérant la peau pincée pour empêcher l’injection dans le tissu musculaire.
- L’aiguille de maintien à angle de 45° injecte soigneusement 200 μL de la suspension cellulaire pour créer une petite masse sphérique (figure 1C).
- Enregistrez le poids de la souris avec une balance, identifiez la souris par l’oreille et retournez en cage.
- Surveiller les souris après la sédation pour s’assurer qu’elles retournent à l’activité normale.
- Surveillance de la croissance des lésions
- À l’aide d’un étrier, mesurer la longueur et la largeur de chaque prise (figure 1D).
- Mesures de document tous les deux jours jusqu’à la collecte des lésions.
5. Collecte et traitement des tissus
- Euthanasier les souris 9 jours après l’implantation dans une chambre de CO2 et vérifier les signes vitaux pour confirmer la mort. Effectuer une dislocation cervicale sur les souris comme une méthode secondaire pour euthanasier la souris.
- Récoltez la lésion/bouchon de xénogreffe du flanc de la souris par dissection à l’aide de forceps chirurgicaux et de ciseaux.
REMARQUE : Afin d’éviter la rupture des vaisseaux remplis de sang à l’intérieur de la prise, il est important d’éviter de toucher la prise de lésion avec des outils de dissection et de laisser les tissus environnants excessifs tels que la peau attachée à la prise. - Plongez la lésion réséquée dans pbs pour laver.
- Installez une scène de caméra avec une caméra. Aligner les bouchons sur une planche à découper avec une règle. Prenez une image de tous les bouchons pour enregistrer la vascularité brute des lésions (Figure 1E).
- Fixez les bouchons en submergeant 10% de formaline pendant la nuit à RT.
- Lavez les bouchons dans PBS le lendemain et déplacez-les dans 70 % d’éthanol.
- Bouchons de lésion de processus pour l’incorporation de paraffine (noyau de pathologie).
6. Sectionment des lésions
- Utilisez un microtome pour couper 5 sections de μm des lésions murines recueillies sur des lames chargées positivement.
REMARQUE : Pour l’analyse subséquente, les sections au centre de la prise (environ 50\u201270 μm dans le tissu) sont importantes. - Faire fondre la paraffine à 60 °C pendant 1 h avant la coloration.
- Dé-paraffiniser et réhydrater les tissus séquentiellement sous une hotte chimique d’écoulement de fumée. Par conséquent, incuber la diapositive dans le xylène pendant 10 min, 100% éthanol (EtOH) pendant 5 min, 90% EtOH pendant 3 min, et 80% EtOH pendant 3 min.
- Rincer la diapositive dans l’eau déionisée pendant 5 min.
7. Hématoxyline et Éosine (H&E)
- Incuber des sections dans l’hématoxyline pendant 2 min.
- Placez les diapositives dans un bocal à taches et rincez-les dans un évier par un jet régulier d’eau du robinet jusqu’à ce que l’eau soit claire.
- Déhydrater les lames en incuber les tissus séquentiellement en 70% EtOH pendant 1 min, 80% EtOH pour 1 min, 90% EtOH pour 1 min, 100% EtOH pour 1 min, et frais 100% EtOH pour 1 min.
- Sections de tache dans Eosin Y pour 30 s.
- Rincer à 100% etoh frais jusqu’à ce que la solution soit claire.
- Incuber la diapositive dans les xylènes pendant 2 min. Laisser sécher les diapositives pendant 5\u201210 min sous le capot de fumée.
- Distribuez une goutte de support de montage permanent et non aqueux sur les sections xénogreffes et placez le couvercle sur le dessus.
- Laissez sécher les lames toute la nuit avant l’imagerie.
8. Immunohistorichimie
- Préparer le tampon de récupération d’antigènes (Tris-EDTA) en pesant 0,6 g de tris-base et 1 mL de 0,5 M EDTA à 500 mL d’eau déionisée. Ajuster le pH à 9,0 à l’aide de 1 M HCl. Ajouter 250 μL de Tween-20.
- Incuber des lames de tissu dé-paraffinisées (obtenues à l’étape 6.2\u20126.3) dans un bécher avec tampon de récupération d’antigène, en remuant sur un bloc de chauffage, pendant 20 min à 95 °C.
- Retirer le bécher du bloc de chauffage, laisser refroidir à 35 °C, puis laver en PBS pendant 3 min.
- Bloquer les sections de tissu dans le sérum normal de cheval de 5% dans PBS pendant 30 min à RT.
- Préparer une solution de travail biotinylée Ulex europaeus agglutinine-I (UEA-I) en diluant 20 μg/mL d’UEA-I biotinylée dans 5% de sérum cheval normal en PBS.
- Pipet 50\u2012100 μL de solution de travail UEA-I par section et incuber pendant 1 h à RT dans une chambre humidifiante.
- Laver les diapositives deux fois dans PBS pendant 3 min.
- Quench sections de diapositives dans 3% peroxyde d’hydrogène pendant 5 min à RT.
- Laver les diapositives deux fois dans PBS pendant 3 min.
- Préparer 5 μg/mL de peroxydadé de raifort Streptavidin conjugué dans le sérum normal de cheval de 5% dans pbs.
- Pipet 50\u2012100 μL sur chaque lame de tissu et incuber pendant 1 h à RT dans une chambre humidifiante.
- Laver les diapositives deux fois dans PBS pendant 3 min.
- Préparer la solution 3,3'Diaminobenzidine (DAB) selon les instructions du fabricant et ajouter 50\u2012100 μL par section.
- Incuber les sections pour 10\u201215 min, vérifier et surveiller le développement des taches toutes les 2\u20125 min.
- Laver les diapositives trois fois dans PBS pendant 3 min.
- Ajouter une goutte d’hématoxyline et incuber pendant 3 min.
- Placez les diapositives dans un bocal à taches et rincez-les dans un évier par un jet régulier d’eau du robinet jusqu’à ce que l’eau soit claire.
- Incuber séquentiellement la diapositive dans 80% EtOH pendant 1 min, 90% EtOH pendant 1 min, 100% EtOH pendant 1 min, et xylène pendant 2 min.
- Laisser sécher les diapositives pendant 5\u201210 min sous le capot de fumée.
- Distribuez une goutte de support de montage permanent et non aqueux sur les sections xénogreffes et placez le couvercle sur le dessus.
- Laissez sécher les lames toute la nuit avant l’imagerie.
9. Analyse des canaux vasculaires d’origine humaine
NOTE : La vascularité des lésions de VM est quantifiée en mesurant la zone vasculaire et la densité vasculaire. Seuls les canaux vasculaires positifs d’UEA-I sont considérés pour la quantification.
- Prenez quatre à cinq images par section de lésion avec un microscope de champ lumineux à un grossissement de 20x (champs de haute puissance [HPF]). Prenez des images HPF dans un modèle x-plane dans la section de lésion pour éviter le chevauchement (Figure 1F-H). Inclure une barre d’échelle sur les images prises.
- Ouvrez les images HPF dans Image J (Fichier > Ouvrir). Calibrer les pixels de la barre d’échelle comme suit. Utilisez l’outil en ligne droite et passez au-dessus de la barre d’échelle. Pour convertir les pixels mesurés en mm, cliquez sur Analyser > Définir l’échelle.
- Cliquez sur Analyser > Définir les mesures et sélectionner Zone et Ajouter à la superposition.
- Mesurer la zone de champ totale d’un HPF à l’aide d’Analyse > Mesurer. Enregistrez cette mesure pour la quantification à l’étape 9.8.
- À l’aide de l’outil de sélection à main levée, décrivez manuellement les canaux vasculaires UEA-I+.
REMARQUE : Un canal vasculaire est défini comme n’importe quelle zone qui est doublée d’UEA-I+ - EC qui peut contenir des cellules sanguines. - Cliquez sur Analyser > Mesurez pour quantifier la zone vasculaire définie de l’UEA-I+ (mm2/HPF).
- Répétez cette mesure pour les cinq HPF prises dans une seule prise.
- Moyenne de la superficie vasculaire totale des cinq HPF. La superficie vasculaire obtenue par HPF est ensuite divisée par la zone de champ HPF (en mm2, étape 9,5) et exprimée en pourcentage (%).
- Pour la quantification de la densité vasculaire, comptez le nombre de canaux vasculaires UEA-I+ de chaque HPF pris. La densité vasculaire est le nombre moyen de canaux vasculaires UEA-I+ comptés par zone HPF (vaisseaux/mm2).
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Representative Results
Ce protocole décrit le processus de génération d’un modèle de xénogreffe murine de VM basé sur l’injection sous-cutanée de l’EC patient-dérivé dans le dos des souris nues immunodéficientes. Les colonies de cellules endothéliales peuvent être récoltées dans les 4 semaines suivant l’isolement initial des cellules du tissu VM ou du sang lésionnel (figure 1A,B). Le lendemain de l’injection, le bouchon de lésion xénogreffe couvre une surface d’environ 80\u2012100 mm2. Dans nos mains, les bouchons de lésions avec TIE2/PIK3CA-mutant EC sont visiblement vascularisés et perfusés dans les 7\u20129 jours de l’injection 14,15 (Figure 1C-E). Cependant, l’étendue de la croissance de lésion est variable et réfléchit sur l’hétérogénéité de patient et d’échantillon.
Les bouchons de lésion récapitulent étroitement les caractéristiques histopathologiques du tissu VM humain : canaux vasculaires agrandis doublés d’une fine couche de cellules endothéliales (Figure 1F\u2012H). Ces structures vasculaires contiennent généralement des érythrocytes, confirmant les anastomoses fonctionnelles avec la vascularisation de souris hôte (Figure 1F\u2012H). La coloration immunohistochimique utilisant la lectine spécifique à l’homme UEA-I peut confirmer que les cellules qui tapissent les lésions vasculaires sont dérivées de cellules implantées humaines plutôt que de vasculature de souris (Figure 1H). Un schéma résumant les étapes de l’isolement VM-EC à la dissection du bouchon de lésion est présenté à la figure 2.
Figure 1 : Résultats représentatifs.
(A) Image représentative de la culture cellulaire mixte primaire trois semaines après l’isolement du tissu VM avant la sélection d’EC. Colonie de cellules endothéliales typiques (EC) et fibroblaste contaminante (FB). (B) Image d’une culture endothéliale purifiée (sélection de perles CD31) à partir de tissus dérivés du patient VM. Barre d’échelle = 200 μm. (C) La lésion formera une structure sphérique. La vascularisation est visible en raison de la couleur bleuâtre à travers la peau des souris nues. (D) Les lignes pointillées montrent comment la taille des lésions est recodée en mesurant la longueur (L) et la largeur (W) à l’aide d’un étrier. (E) Photo de visiblement vascularisé, explant de lésion de xénogreffe au jour 9. Barre d’échelle = 1 cm. (F) Image représentative d’une section de bouchon de lésion. Le modèle x-plane dans lequel cinq images de champ de haute puissance sont prises pour la quantification sont indiqués par des boîtes en pointillés blancs. Barre d’échelle = 1000 μm. (G\u2012H) Images représentatives des sections de prise de lésion VM. (G) Coloration d’hématoxyline et d’éosine et (H) immunohistorichemistry de lectin uea-I spécifique à l’homme. Barre d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Schéma du flux de travail pour générer une xénogreffe de VM dérivée par le patient.
(A)Les cellules endothéliales isolées du tissu solide de lésion de VM patient ou du sang lésionnel sont plaquées et, quand 80% de confluence est atteinte, sont choisies par des perles immunomagnétiques anti CD31-conjuguées et étendues. (B) Pour l’injection sous-cutanée d’EC, le jour 0, la peau sur le dos de la souris est pincée à l’aide de l’index et du pouce pour créer une structure en forme de tente. Les lésions sont mesurées au jour 1, puis tous les deux jours (flèches rouges) à l’aide d’un étrier à travers le jour expérimental 9. Les lésions sont disséquées et traitées pour l’analyse histologique. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Ici, nous décrivons une méthode pour générer un modèle xénogreffe de VM dérivé du patient. Ce modèle murin présente un excellent système qui permet aux chercheurs d’acquérir une compréhension plus profonde de l’élargissement pathologique des lumens et jouera un rôle déterminant dans le développement de thérapies plus efficaces et ciblées pour le traitement de la VM. Ceci peut être facilement adapté pour étudier d’autres types d’anomalies vasculaires telles que la malformation veineuse lymphatique capillaire16. Il y a plusieurs étapes qui sont cruciales pour la génération réussie des lésions vasculaires reproductibles. Tout d’abord, les cellules endothéliales dérivées du patient doivent être pures (sans la présence d’autres types de cellules) et croître de façon exponentielle au moment de l’injection. La contamination du fibroblaste ou d’autres non-EC mésenchymal peuvent être facilement reconnues par une morphologie allongée. En de rares occasions, il est possible que même après purification à l’aide de perles magnétiques conjuguées aux anticorps anti-CD31, un petit nombre de non-EC restent dans la culture. Ces cultures nécessitent une purification supplémentaire avec des marqueurs de surface cellulaire spécifiques à l’endothéliale. Comme approche alternative, l’expansion clonale à cellule unique des cellules endothéliales est possible. Cela permettrait de rassurer l’homogénéité des mutants-EC car toutes les cellules d’une même culture dériveraient d’une seule cellule. Toutefois, cette approche n’est pas recommandée pour les EC dérivées de la VM, car les cellules ont tendance à dépasser leurs capacités de prolifération et à se convertir en phénotype sénescent après 9 passages de 201210. Il est essentiel d’utiliser des cellules entre les passages 3\u20128 pour les expériences de xénogreffe et de ne pas passer les cellules la veille de l’injection.
Le modèle de xénogreffe peut être modifié pour étudier d’autres anomalies vasculaires portant différentes mutations d’activation. En outre, comme les échantillons de tissus patients sont difficiles d’accès pour certains laboratoires, le modèle de xénogreffe peut être adapté en utilisant EC, tels que les cellules endothéliales du sang de cordon ombilical humain (HUVEC), génétiquement modifiés pour exprimer la mutation /s connu pour causer la croissance vasculaire dysfonctionnelle15,17.
Le nombre de cellules recommandées pour l’injection dans la xénogreffe est de 2,5 x10 6 cellules/200 μL de BMEM. Toutefois, si le nombre de cellules est insuffisant, il est possible soit de réduire le nombre d’injections par animal à un seul, soit de réduire le volume d’injection à un minimum de 100 μL. Pour ce dernier, il est toutefois important de maintenir le rapport de densité cellulaire par exemple, 1,25 x 106 cellules/100 μL BMEM. Lorsque vous travaillez avec BMEM, toutes les étapes doivent être effectuées sur la glace pour éviter la solidification de la suspension cellulaire avant l’injection. Pendant l’injection, il est important et que l’aiguille est insérée à un angle de 45° directement sous la peau et loin du tissu musculaire, car l’injection dans le muscle empêche la reproductibilité des lésions et rend la dissection de lésion difficile. Un total de deux injections peuvent être effectuées sur chaque souris, l’une à droite et l’autre sur le côté gauche de chaque animal. La deuxième injection dans la même souris peut servir de réplique technique. Plus d’injections sur le dos ne sont pas recommandés que les lésions se développent au fil du temps et pourrait interférer les uns avec les autres. Pour l’analyse statistique dans les études précliniques comparant les bouchons de xénogreffe des souris traitées par rapport aux souris traitées (uniquement au véhicule), nous recommandons l’utilisation d’un minimum de 5 animaux (10 bouchons de xénogreffe) par groupe d’étude. Si elle est disponible, la deuxième injection pourrait également être utilisée comme « ontrôl interne » à l’aide d’EC non mutants. Nous avons utilisé les EC primaires non mutantes, comme HUVEC, comme un contrôle et avons montré que ces cellules ont formé un nombre négligeable de petits canaux14,15. En outre, dans ces bouchons de lésion de commande de HUVEC, nous avons remarqué l’infiltration des canaux vasculaires murine-dérivés dans le plug après jour 9. Si la conception expérimentale nécessite des temps d’incubation plus longs, ces canaux d’infiltration peuvent être facilement exclus de l’analyse en tachant pour un marqueur spécifique à l’homme comme l’anticorps CD31 spécifique à l’homme ou l’agglutinine I d’Ulex europaeus I (UEA-I) qui ne se croise pas avec la souris.
Pour s’assurer que la lésion ne devient pas un fardeau pour la santé animale et le bien-être, il est important d’observer la taille des lésions, d’enregistrer le poids de la souris quotidiennement, et de prêter attention à toutes les complications latérales telles que les saignements et les ecchymoses. Si le volume de lésion dépasse 500 mm3,l’expérience doit être terminée.
Lorsque les lésions vasculaires sont agrandies et perfusées, une attention extrême doit être accordée pendant la dissection pour éviter la rupture de la lésion. Il est important d’éviter de toucher la prise de lésion avec des outils de dissection et de laisser les tissus environnants excessifs (comme la peau) attachés à la prise. Ceci empêche l’effondrement des structures vasculaires dans la prise de xénogreffe qui interférerait avec l’analyse précise.
Enfin, pour maintenir la cohérence, il est important que l’analyse histologique initiale commence au centre de la prise (environ 50\u201270 μm dans le tissu) plutôt que les régions frontalières où la vascularisation de souris aastomosing pourrait être présent. Il est fortement recommandé de tacher les sections tissulaires d’un marqueur EC spécifique à l’homme, comme l’UEA-I ou un anticorps alternatif spécifique à l’homme qui ne réagira pas avec la souris, afin de confirmer que les structures vasculaires sont formées par des EC d’origine humaine plutôt que par une souris EC envahissante.
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Disclosures
Les auteurs n’ont pas de conflits d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier Nora Lakes pour la relecture. La recherche rapportée dans ce manuscrit a été soutenue par le National Heart, Lung, and Blood Institute, sous le numéro de prix R01 HL117952 (E.B.), qui fait partie des National Institutes of Health. Le contenu est uniquement de la responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles des National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Athymic nude mice, (Foxn1-nu); 5-6 weeks, males | Envigo | 069(nu)/070(nu/+) | Subcutaneous injection |
| Biotinylated Ulex europeaus Agglutinin-I (UEA-I) | Vector Laboratories | B-1065 | Histological anlaysis |
| Bottle top filter (500 ml; 0.2 µM) | Thermo Fisher | 974106 | Cell culture |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | BSA | A7906-50MG | Cell culture; Histological analysis |
| Calcium cloride dihydrate (CaCl2.2H2O) | Sigma | C7902-500G | Cell culture |
| Caliper | Electron Microscopy Sciences | 50996491 | Lesion plug measurment |
| CD31-conjugated magnetic beads (Dynabeads) | Life Technologies | 11155D | EC separation |
| Cell strainer (100 μM) | Greiner | 542000 | Cell culture |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | Cell culture |
| Conical Tube; polypropylene (15 mL) | Greiner | 07 000 241 | Cell culture |
| Conical Tube; polypropylene (50 mL) | Greiner | 07 000 239 | Cell culture |
| Coplin staining jar | Ted Pella | 21029 | Histological anlaysis |
| Coverglass (50 X 22 mm) | Fisher Scientific | 12545E | Histological anlaysis |
| DAB: 3,3'Diaminobenzidine Reagent (ImmPACT DAB) | Vector Laboratories | SK-4105 | Histological anlaysis |
| Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) | Corning | 10-027-CV | Cell culture |
| DynaMag-2 | Life Technologies | 12321D | EC separation |
| Ear punch | VWR | 10806-286 | Subcutaneous injection |
| EDTA (0.5M, pH 8.0) | Life Technologies | 15575-020 | Histological anlaysis |
| Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM2) Bulletkit (basal medium and supplements) | Lonza | CC-3162 | Cell culture |
| Eosin Y (alcohol-based) | Thermo Scientific | 71211 | Histological anlaysis |
| Ethanol | Decon Labs | 2716 | Histological anlaysis |
| Fetal Bovine Serum (FBS) , HyClone | GE Healthcare | SH30910.03 | Cell culture |
| Filter tip 1,250 μL | MidSci | AV1250-H | Multiple steps |
| Filter tip 20 μL | VWR | 10017-064 | Multiple steps |
| Filter tip 200 μL | VWR | 10017-068 | Multiple steps |
| Formalin buffered solution (10%) | Sigma | F04586 | Lesion plug dissection |
| Hemacytometer (INCYTO; Disposable) | SKC FILMS | DHCN015 | Cell culture |
| Hematoxylin | Vector Hematoxylin | H-3401 | Histological anlaysis |
| Human plasma fibronectin purified protein (1mg/mL) | Sigma | FC010-10MG | Cell culture |
| Hydrogen Peroxide solution (30% w/w) | Sigma | H1009 | Histological anlaysis |
| ImageJ Software | Analysis | ||
| Isoflurane, USP | Akorn Animal Health | 59399-106-01 | Subcutaneous injection |
| magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma | M1880-500G | Cell culture |
| Basement Membrane Matrix (Phenol Red-Free; LDEV-free) | Corning | 356237 | Subcutaneous injection |
| Microcentrifuge tube (1.5 mL) | VWR | 87003-294 | EC separation |
| Microscope Slide Superfrost (75mm X 25mm) | Fisher Scientific | 1255015-CS | Histological anlaysis |
| Needles, 26G x 5/8 inch Sub-Q sterile needles | Becton Dickinson (BD) | BD305115 | Subcutaneous injection |
| Normal horse serum | Vector Laboratories | S-2000 | Histological anlaysis |
| Penicillin-Streptomycin-L-Glutamine (100X) | Corning | 30-009-CI | Cell culture |
| Permanent mounting medium (VectaMount) | Vector Laboratories | H-5000 | Histological anlaysis |
| Pestle Size C, Plain | Thomas Scientific | 3431F55 | EC isolation |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3994 | Cell culture |
| Scale | VWR | 65500-202 | Subcutaneous injection |
| Serological pipettes (10 ml) | VWR | 89130-898 | Cell culture |
| Serological pipettes (5ml) | VWR | 89130-896 | Cell culture |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma | 223530 | Cell culture |
| Streptavidin, Horseradish Peroxidase, Concentrate, for IHC | Vector Laboratories | SA-5004 | Cell culture |
| Syringe (60ml) | BD Biosciences | 309653 | Cel culture |
| SYRINGE FILTER (0.2 µM) | Corning | 431219 | Cell culture |
| Syringes (1 mL with Luer Lock) | Becton Dickinson (BD) | BD-309628 | Subcutaneous injection |
| Tissue culture-treated plate (100 X 20 mm) | Greiner | 664160 | Cell culture |
| Tissue culture-treated plate (145X20 mm) | Greiner | 639160 | Cell culture |
| Tissue culture-treated plates (60 X 15) mm | Eppendorf | 30701119 | Cell culture |
| Tris-base (Trizma base) | Sigma | T6066 | Histological anlaysis |
| Trypan Blue Solution (0.4 %) | Life Technologies | 15250061 | Cell culture |
| Trypsin EDTA, 1X (0.05% Trypsin/0.53mM EDTA) | Corning | 25-052-Cl | Cell culture |
| Tween-20 | Biorad | 170-6531 | Histological anlaysis |
| Wheaton bottle | VWR | 16159-798 | Cell culture |
| Xylenes | Fisher Scientific | X3P-1GAL | Histological anlaysis |
References
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