Summary
Apresentamos um protocolo detalhado para gerar um modelo de xenoenxerto murine de malformação venosa. Este modelo é baseado na injeção subcutânea de células endoteliais derivadas do paciente contendo mutações genéticas TIE2 e/ou PIK3CA hiperativantes. As lesões de xenoenxerto recapitulam de perto as características histopatológicas do tecido do paciente VM.
Abstract
A malformação venosa (VM) é uma anomalia vascular que surge do desenvolvimento prejudicado da rede venosa resultando em veias dilatadas e muitas vezes disfuncionais. O objetivo deste artigo é descrever cuidadosamente o estabelecimento de um modelo de xenoenxerto murina que imita vm humano e é capaz de refletir a heterogeneidade do paciente. Mutações não herdadas (somáticas) TEK (TIE2) e PIK3CA hiperativas em células endoteliais (CE) foram identificadas como os principais condutores do alargamento de vasos patológicos em VM. O protocolo a seguir descreve o isolamento, purificação e expansão da CE derivada do paciente expressando tie2 mutante e/ou PIK3CA. Estes CE são injetados subcutâneamente na parte de trás de camundongos atímicos imunodeficientes para gerar canais vasculares ectáticos. As lesões geradas com TIE2 ou PIK3CA-mutante EC são visivelmente vascularizadas dentro de 7\u20129 dias após a injeção e recapitulam características histopatológicas do tecido do paciente VM. Este modelo de xenergrafto VM fornece uma plataforma confiável para investigar os mecanismos celulares e moleculares que impulsionam a formação e expansão de VM. Além disso, este modelo será fundamental para estudos translacionais que testam a eficácia de novos candidatos a medicamentos na prevenção do alargamento anormal de vasos vistos em VM humano.
Introduction
Defeitos no desenvolvimento da vasculatura são a causa básica de muitas doenças, incluindo a malformação venosa (VM). VM é uma doença congênita caracterizada por morfogênese anormal e expansão das veias1. Estudos importantes sobre tecido VM e células endoteliais (CE) identificaram mutações de ganho de função em dois genes: TEK, que codifica o receptor de quinase tiesina TIE2, e PIK3CA, que codifica o isóforme p110α (subunidade catalítica) de PI3-kinase (PI3K)2,3,,4,5. Essas mutações somáticas resultam em hiperativação independente de ligante das principais vias de sinalização angiogênica/de crescimento, incluindo PI3K/AKT, resultando assim em veias ectáticas dilatadas3. Apesar dessas importantes descobertas genéticas, os mecanismos celulares e moleculares subsequentes que desencadeiam angiogênese anormal e a formação de canais vasculares ampliados ainda não são totalmente compreendidos.
Durante a angiogênese normal e patológica, novos vasos brotam de uma rede vascular pré-existente e a CE passa por uma sequência de processos celulares importantes, incluindo proliferação, migração, remodelação de matriz extracelular (ECM) e formação de lúmen6. Culturas in vitro in vitro de duas e tridimensionais (2D/3D) da CE são ferramentas importantes para investigar cada uma dessas propriedades celulares individualmente. No entanto, há uma clara demanda por um modelo de mouse recapitulando o alargamento de vasos patológicos dentro do microambiente hospedeiro, ao mesmo tempo em que fornece uma plataforma eficiente para avaliação pré-clínica de medicamentos direcionados para pesquisa translacional.
Até o momento, não foi relatado um modelo de murina transgênica de VM associado às mutações de ganho de função TIE2. Os modelos atuais de camundongos VM transgênicos dependem da expressão onipresente ou restrita ao tecido da mutação ativante PIK3CA p.H1047R3,5. Esses animais transgênicos fornecem uma visão significativa sobre efeitos específicos do corpo inteiro ou tecido desta mutação PIK3CA hotspot. A limitação desses modelos é a formação de uma rede vascular altamente patológica resultando em letalidade precoce. Assim, esses modelos de camundongos não refletem totalmente a ocorrência esporádica de eventos mutacionais e a natureza localizada da patologia VM.
Pelo contrário, os modelos de xenoenxerto derivados do paciente baseiam-se no transplante ou injeção de tecido patológico ou células derivadas de pacientes em camundongos imunodeficientes7. Os modelos de xenoenxerto são uma poderosa ferramenta para ampliar o conhecimento sobre o desenvolvimento de doenças e a descoberta de novos agentes terapêuticos8. Além disso, o uso de células derivadas do paciente permite que os cientistas recapitulem a heterogeneidade da mutação para estudar o espectro de fenótipos do paciente.
Aqui, descrevemos um protocolo onde vm ec derivados do paciente que expressam uma forma mutante constitutivamente ativa de TIE2 e/ou PIK3CA são injetados subcutâneamente na parte de trás de ratos nus atímicos. As células vasculares injetadas estão suspensas em uma estrutura de ECM, a fim de promover a angiogênese, conforme descrito nos modelos anteriores de xenoenxerto vascular9,,10,,11. Estes VM EC sofrem morfogênese significativa e geram vasos patológicos ampliados e perfundidos na ausência de células de suporte. O modelo de xenoenxerto descrito de VM fornece uma plataforma eficiente para avaliação pré-clínica de medicamentos direcionados para sua capacidade de inibir a expansão de lúmen descontrolada.
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Protocol
Amostras de tecido de pacientes foram obtidas dos participantes após o consentimento informado do Collection and Repositório de Amostras de Tecidos e Dados de Pacientes com Tumores e Anomalias Vasculares sob um Conselho de Revisão Institucional (IRB) aprovado por políticas institucionais no Centro Médico hospitalar infantil de Cincinnati (CCHMC), Instituto de Câncer e Doenças sanguíneas e com aprovação do Comitê de Investigação Clínica. Todos os procedimentos animais descritos abaixo foram revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da CCHMC.
1. Preparação de materiais e soluções de estoque
- Preparação do meio completo de crescimento celular endotelial (EGM)
- Suplemento endotelial meio basal (EBM) com os seguintes fatores de crescimento presentes no kit (ver Tabela de Materiais): Fator de Crescimento fibroblasto humano-Beta (hFGF-β), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), Fator de Crescimento Semelhante à Insulina Arg3- I (R3-IGF-I), ácido ascorico, fator de crescimento epidérmico (EGF), sulfato de gentamicina e anfotericina-B, e heparina. Adicione 1% penicilina/estreptomicina/L-glutamina (PSG) solução e 20% de soro bovino fetal (FBS).
NOTA: Não recomendamos a adição de hidrocortisona. - Filtro estéril a solução sob um capô de fluxo laminar através de um filtro superior de garrafa de 0,2 μm em uma garrafa de vidro autoclaved e mídia aliquot em tubos cônicos de 50 mL e armazenar a 4 °C até uma semana ou a -20 °C por até um ano.
- Suplemento endotelial meio basal (EBM) com os seguintes fatores de crescimento presentes no kit (ver Tabela de Materiais): Fator de Crescimento fibroblasto humano-Beta (hFGF-β), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), Fator de Crescimento Semelhante à Insulina Arg3- I (R3-IGF-I), ácido ascorico, fator de crescimento epidérmico (EGF), sulfato de gentamicina e anfotericina-B, e heparina. Adicione 1% penicilina/estreptomicina/L-glutamina (PSG) solução e 20% de soro bovino fetal (FBS).
- Prepare a solução de ações colagenase A
- Prepare 50 mg/mL de colagenase Uma solução de estoque em 1x de soro fisco tampão de fosfato (PBS).
- Filtro estéril a solução sob uma capa de fluxo laminar com filtro e seringa de 0,2 μm e armazene 100 alíquotas de μL a -20 °C.
- Preparar o meio de coleta de tecido (Buffer A)
- Prepare uma solução de estoque Ca2+/Mg2+ adicionando 0,927 g de dihidrato de cloreto de cálcio (CaCl2.2H2O) e 1 g de heptahydrate de sulfato de magnésio (MgSO4.7H2O) a 500 mL de água destilada. Filtrar a solução através de um filtro superior de garrafa de 0,2 μm em uma garrafa de vidro autoclaved e armazenar à temperatura ambiente (RT).
- Complemente o DMEM (Modified Eagle Medium, meio águia modificada) da Dulbecco com solução Ca2+/Mg2+ e 2% FBS.
- Filtro estéril a solução sob uma capa de fluxo laminar com filtro e seringa de 0,2 μm e armazenar alíquotas de 5 mL a -20 °C.
- Revestimento de fibronectina de placas de cultura tecidual
- Prepare o tampão de revestimento (Buffer B) dissolvendo 5,3 g de carbonato de sódio (Na2CO3; 0,1 M) em 500 mL de água desionizada. Ajuste o pH do tampão para 9,4 usando ácido clorídrico de 1 M (HCl). Filtre sob um capô de fluxo laminar através de um filtro de tampa de garrafa de 0,2 μm em uma garrafa de vidro autoclaved e armazene na RT.
- Para revestimento, pipeta 2 mL/5 mL/10 mL de tampão B por placa de cultura de tecido de 60 mm/100 mm/145 mm, respectivamente. Adicione 1 μg/cm2 da solução de proteína purificada de fibronectina plasmática humana e distribua suavemente o líquido na placa.
- Incubar placa a 37 °C, 5% DE CO2 por 20 min.
- Aspire buffer B e lave a placa com PBS antes de esculpir células.
2. Isolamento das células endoteliais do tecido do paciente VM
- Isolamento do CE do tecido VM sólido
NOTA: O tecido VM é ressecado pela cirurgia de desesculação12,13 sob um protocolo aprovado pelo IRB.- Lavar tecido VM (peso amostral de tecido tipicamente varia entre 0,5 g e 1,5 g) em 5% PSG em PBS.
- Transfira tecido para um prato de cultura celular de 100 mm, amostra de tecido picado em pequenos pedaços usando ferramentas de dissecção cirúrgica estéril, e transfira para um tubo cônico de 50 mL.
- Adicione 100 μL de colagenase Uma solução de estoque a 5 mL de Buffer A para uma concentração final de 1 mg/mL, em seguida, adicione isso ao tecido e digerir o tecido picado a 37 °C por 30 minutos enquanto agita o conteúdo a cada 5 minutos.
- Triture cuidadosamente o tecido digerido em RT usando um moedor de pilão de 6 mm e superfície lisa dentro do tubo cônico de 50 mL.
- Continue a moer cuidadosamente o tecido digerido usando um pilão enquanto adiciona 5 mL de PBS frio suplementado com 0,5% de albumina de soro bovino (BSA) e 2% PSG. Repita este passo quatro vezes.
- Filtre a solução através de um coador de células de 100 μm em um tubo cônico de 50 mL para remover fragmentos de tecido.
- Suspensão celular centrífuga por 5 min a 400 x g em RT. Proceda à etapa 2.3.
- Isolamento de VM CE do sangue lesado obtido da escleroterapia do paciente
- Obtenha sangue lesão VM humano da escleroterapia sob um protocolo aprovado pelo IRB.
- Sangue lesão diluído (volume amostral tipicamente varia entre 0,5 mL e 5 mL) em PBS a um volume final de 40 mL.
- Suspensão celular centrífuga por 5 min a 200 x g em RT.
- Revestimento de células iniciais
- Descarte o supernaspetivo e resuspenque a pelota de célula única em 1 mL de EGM.
- Adicione 9 mL de EGM completo nas placas revestidas de fibronectina (1 μg/cm²) e sementes de 1 mL de suspensão celular.
- Incubar células a 37 °C em uma atmosfera umidificada de 5% de CO2.
- A cada dois dias remova 2 mL de mídia e adicione 2 mL de FBS filtrados estéreis.
- Uma vez que as culturas celulares atingem uma confluência de 40\u201250% alteram o meio para completar o EGM. Normalmente leva entre 2\u20123 semanas para as células atingirem essa confluência.
- Observe diariamente para o aparecimento de colônias CE. Eles podem ser reconhecidos por sua típica morfologia "semelhante a paralelepípedos"(Figura 1A). Entre 3\u20125 Colônias ce aparecem em cada amostra.
- Troque o meio a cada dois dias por mais 5\u20127 dias até que colônias cadais da CE comecem a se tocar.
- Isolamento manual de colônias ce individuais
- Para colher colônias CE, lave a placa com 5 mL de PBS e aspire manualmente com uma pipeta sorológica.
- Leve a placa para um microscópio e circule os locais de várias colônias ce usando uma caneta de marcação tanto na tampa quanto no fundo antes de devolvê-la ao capô de fluxo laminar.
- Despeque colônias ce por pipetação de 50 μL de solução trypsin-EDTA de 0,05% nas áreas marcadas.
- Usando um raspador de células pequena ou uma ponta de pipeta, raspe suavemente as células da placa.
- Incline a placa até a borda mais próxima e enxágue com 1 mL de EGM por área marcada e colete células.
- Conte o número de células usando um hemótmetro ou contador de células automatizado.
- Placa as colônias de EC coletadas a uma densidade de 1 x 104 células/cm2 em pratos de cultura celular revestidos de fibronectina (1 μg/cm²) contendo EGM fresco. No dia seguinte, mude de média para completar O EGM.
- Mude o EGM médio para completo a cada dois dias durante 2\u20123 semanas até que as células atinjam 80% de confluência.
- Trypsinize EC com 2 mL de pré-aquecido 0,05% trypsin-EDTA por prato de 100 mm a 37 °C por 2 min e neutralizar trippsina adicionando 4 mL de EGM.
- Colete a suspensão celular em um tubo cônico de 15 mL e centrífuga a 400 x g em RT por 5 min. Aspire as células supernascidas e resuspend em 2 mL de EGM.
- Conte o número de células usando um hemótmetro ou contador de células automatizado. Os números típicos de células obtidos são 1 x 106 células por placa de cultura celular de 60 mm ou 2 x 106 células por placa de cultura tecidual de 100 mm.
- Pelota as células por centrifugação a 400 x g em RT por 5 min e aspire o supernasce. Prossiga para a etapa 3.2.1.
3. Seleção e expansão de células endoteliais
- Preparação de contas magnéticas anti-CD31
- Vórtice o frasco contendo as contas magnéticas anti-CD31 conjugadas para 30 s. O número de contas necessárias é 8 x 106 contas/2 x 106 células.
- Lave a quantidade desejada de contas magnéticas anti-CD31 conjugadas com 1 mL de solução de lavagem contendo 0,1% de BSA em PBS em um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL.
- Coloque o tubo de microcentrifuge em um ímã de isolamento celular por 1 min.
- Aspire o supernaspe e repita a etapa de lavagem.
- Purificação e revestimento de células endoteliais
- Pelota de célula resuspenda obtida em 2,4,12 em 500 μL de solução de lavagem contendo 0,1% de BSA em PBS.
- Adicione a solução celular ao tubo de microcentrifuagem contendo contas magnéticas e resuspende completamente.
- Incubar por 20 min a 4 °C com inclinação suave.
- Adicione 500 μL de 0,1% BSA no PBS e misture bem.
- Coloque o tubo em um ímã de isolamento celular por 1 min.
- Aspire suavemente todo o líquido, que contém a fração CD31-negativa das células sem tocar nas contas.
- Lave a pelota contendo a fração celular CD31 positiva com 1 mL de 0,1% de BSA no PBS e repita a separação magnética.
- Repita a lavagem e a etapa de separação magnética por um mínimo de 3 vezes para purificar a fração celular CD31 positiva.
- Resuspend células endoteliais purificadas em um tubo cônico de 15 mL e gire para baixo por 5 min a 400 x g em RT.
- Remova a supernasce e a pelota de célula resuspendida em 1 mL de EGM.
- Adicione 9 mL de EGM completo nas placas revestidas de fibronectina (1 μg/cm²) e sementes de 1 mL de suspensão celular. Observe que algumas contas magnéticas ainda estão ligadas às células nesta etapa inicial de semeadura. A maioria das contas lavam durante a expansão celular, mas um pequeno número de contas pode persistir em passagens iniciais.
- Incubar células a 37 °C em uma atmosfera umidificada de 5% de CO2.
- Troque o meio a cada dois dias até que as células atinjam 80 % de confluência(Figura 1B).
- Expansão celular endotelial
- Uma vez que as células atinjam 80 % de confluência, desprende com 2 mL de 0,05% trypsin-EDTA por prato de 100 mm a 37 °C por 2 min.
- Neutralizar a trippsina adicionando 4 mL de EGM e coletar células em um tubo cônico de 15 mL.
- Centrifugar a 400 x g em RT por 5 min.
- Aspire as células supernascidas, resuspend em 2 mL de EGM, e conte o número de células com um hemócito ou por contagem automatizada de células.
- Células de sementes a uma densidade de 1 x 104 células/cm² em placas de cultura tecidual revestidas de fibronectina de 145 mm (1 μg/cm²).
- Continue a passar células até que o número de celular desejado seja atendido. Considere que uma placa de cultura de tecido confluente de 145 mm contém cerca de 8\u20129 x 106 células e o número de células necessárias é de 2,5 x 106 células por injeção. Somente células entre a passagem 3 e 8 devem ser consideradas para o xenoenxerto.
4. Protocolo de xenoenxerto derivado do paciente VM
NOTA: Neste protocolo usamos 5\u20126 semana de idade, imunodeficient masculino, ratos nus atrímicos Foxn1nus.
Todos os procedimentos em animais devem ser aprovados pelo Comitê Institucional de Uso e Uso de Animais (IACUC).
- Preparação de materiais no dia anterior à injeção
- Seringas pré-refrigerar, agulhas e pontas de tubulação no congelador de -20 °C durante a noite.
- Descongele lentamente a membrana extracelular do porão (BMEM) durante a noite no balde de gelo colocado a 4 °C para evitar o aumento da viscosidade do gel.
- Preparação de suspensão celular para injeção
- Trypsinize EC com 5 mL de pré-aquecido 0,05% trypsin-EDTA por prato de 145 mm a 37 °C por 2 min.
- Neutralizar a trippsina adicionando 5 mL de EGM e coletar células em um tubo cônico de 15 mL.
- Centrifugar a 400 x g em RT por 5 min.
- Aspire as células supernascidas, resuspend em 3 mL de EGM, e conte o número de células usando um hemocitómetro ou contador de células automatizada.
- Determine o número total de células necessárias para todas as injeções planejadas.
NOTA: O número recomendado de células é de 2,5 x 106 células por injeção. Um total de 2 injeções são tipicamente realizadas em cada mouse para duplicatas técnicas. É necessário calcular um excesso de 10% do número da célula para contabilizar a perda durante a transferência para a seringa. - Transfira o volume contendo o número de célula calculado para um novo tubo cônico de 50 mL e células de pelotização por centrifugação a 400 x g em RT por 5 min.
- Aspire o supernasce, deixando um pequeno volume (cerca de 50\u201270 μL) para soltar a pelota.
- Preparação da seringa
- Calcule um volume excedente de 20 μL/injeção para contabilizar a perda durante a transferência para a seringa. Resuspend a pelota celular com 220 μL de BMEM por injeção no gelo. O volume injetado de suspensão celular será de 200 μL por lesão.
- Misture bem a suspensão celular no gelo para obter uma suspensão celular homogênea e evite criar bolhas.
- Utilizando uma tubulação de 1 mL e uma seringa de 1 mL, simultaneamente pipet mistura de células BMEM na abertura da seringa por força de sucção enquanto puxa o êmbolo da seringa.
- Luer trava uma agulha estéril de 26G x 5/8 polegadas na seringa e mantenha as seringas preparadas planas no gelo antes da injeção.
- Injeção subcutânea em rato
- Anestesiar os camundongos com 5% de mistura de isoflurano/oxigênio a uma taxa de fluxo de 1 L/min usando um vaporizador de isoflurane. Certifique-se de sedação adequada dos animais (por exemplo, sem resposta para pinças do dedo do dedo). Manter a anestesia através da administração contínua de 1,5% de isoflurano/oxigênio fornecido via cone de nariz.
- Coloque os camundongos em seu estômago, expondo a região traseira onde ocorrerá enxerto e desinfete a região de injeção com 70% de etanol.
- Role suavemente a seringa preparada para resususpensar quaisquer células assentadas. Flick bolhas para a extremidade da agulha da seringa e expulse um pequeno volume da suspensão celular para garantir a remoção de todas as bolhas.
NOTA: Duas injeções podem ser realizadas para cada mouse – no lado esquerdo e direito do mouse para trás. - Aperte e crie uma estrutura "parecida com uma tenda" usando o polegar e o dedo indicador e insira a agulha subcutânea sob a pele. Certifique-se de que a agulha é apenas profunda da pele liberando a pele beliscada para evitar a injeção no tecido muscular.
- Segurar a agulha no ângulo de 45° injete cuidadosamente 200 μL da suspensão celular para criar uma pequena massa esférica(Figura 1C).
- Grave o peso do mouse com uma balança, marque a orelha do mouse e volte para a gaiola.
- Monitore os ratos após a sedação para garantir que eles retornem à atividade normal.
- Monitoramento do crescimento de lesões
- Usando uma pinça, meça o comprimento e a largura de cada plugue(Figura 1D).
- Medições de documentos a cada dois dias até a coleta de lesões.
5. Coleta e processamento de tecidos
- Eutanize camundongos 9 dias após a implantação em uma câmara de CO2 e verifique sinais vitais para confirmar a morte. Realize a luxação cervical nos camundongos como um método secundário para eutanásia do camundongo.
- Retire a lesão/plugue de xenoenxerto do flanco do camundongo por dissecção usando fórceps cirúrgicos e tesouras.
NOTA: Para evitar a ruptura dos vasos cheios de sangue dentro do plugue, é importante evitar tocar o plugue da lesão com ferramentas de dissecção e deixar tecido circundante excessivo, como a pele presa ao plugue. - Mergulhe a lesão resseccionada na PBS para lavar.
- Montar um palco de câmera com uma câmera. Alinhe os plugues em uma placa de corte com uma régua. Tire uma imagem de todos os plugues para registrar a vascularidade bruta das lesões(Figura 1E).
- Fixar os plugues submergindo em 10% de formalina durante a noite na RT.
- Lave os plugues no PBS no dia seguinte e mova-os para 70% de etanol.
- Os plugues de lesão do processo para incorporação de parafina (núcleo patológico).
6. Secção de lesões
- Use um microtome para cortar seções de 5 μm das lesões murinas coletadas em lâminas carregadas positivamente.
NOTA: Para a análise subsequente, as seções no centro do plugue (cerca de 50\u201270 μm no tecido) são importantes. - Derreta a parafina a 60 °C por 1h antes da coloração.
- Desinfinar e re-hidratar o tecido sequencialmente sob uma coifa química. Portanto, incubar slide em xileno por 10 min, 100% etanol (EtOH) por 5 min, 90% EtOH por 3 min e 80% EtOH por 3 min.
- Enxágüe deslize em água desionizada por 5 minutos.
7. Hematoxilina e Eosina (H&E)
- Incubar seções em Hematoxilina por 2 min.
- Coloque slides em um frasco de coloração e enxágue em uma pia por um fluxo constante de água da torneira até que a água esteja limpa.
- Desidratar slides incubando tecido sequencialmente em 70% EtOH por 1 min, 80% EtOH por 1 min, 90% EtOH por 1 min, 100% EtOH por 1 min, e fresco 100% EtOH por 1 min.
- Seções de manchas em Eosin Y para 30 s.
- Enxágüe em EtOH fresco 100% até que a solução esteja clara.
- Incubar slide em xileno por 2 minutos. Deixe os slides secarem por 5\u201210 min sob o capô da fumaça.
- Dispense uma gota de meio de montagem permanente e não aquoso sobre seções de xenoenxertos e coloque o deslizamento de cobertura em cima.
- Deixe os slides secarem durante a noite antes da imagem.
8. Imunohistoquímica
- Prepare o tampão de recuperação de antígeno (Tris-EDTA) pesando 0,6 g de Tris-base e 1 mL de 0,5 M EDTA a 500 mL de água desionizada. Ajuste o pH para 9.0 usando 1 M HCl. Adicione 250 μL de Tween-20.
- Incubar lâminas de tecido desofinalizadas (como obtido na etapa 6.2\u20126.3) em um béquer com tampão de recuperação de antígeno, mexendo em um bloco de aquecimento, por 20 min a 95 °C.
- Retire o béquer do bloco de aquecimento, deixe a solução esfriar a 35 °C e depois lave em PBS por 3 minutos.
- Bloqueie seções de tecido em soro de cavalo normal de 5% na PBS por 30 minutos na RT.
- Prepare uma solução de trabalho biotinilada Ulex europaeus agglutinin-I (UEA-I) diluindo 20 μg/mL de UEA-I biotinína em 5% de soro de cavalo normal na PBS.
- Pipet 50\u2012100 μL de solução de trabalho UEA-I por seção e incubar por 1h em RT em uma câmara umidificante.
- Lave lâminas duas vezes em PBS por 3 minutos.
- Sacie seções de slides em peróxido de hidrogênio de 3% por 5 min no RT.
- Lave lâminas duas vezes em PBS por 3 minutos.
- Prepare 5 μg/mL de streptavidin rabanete peroxidase conjugado em 5% de soro de cavalo normal na PBS.
- Pipet 50\u2012100 μL em cada lâmina de tecido e incubar por 1h em RT em uma câmara umidificante.
- Lave lâminas duas vezes em PBS por 3 minutos.
- Prepare a solução de 3,3'Diaminobenzidina (DAB) de acordo com as instruções do fabricante e adicione 50\u2012100 μL por seção.
- Incubar seções para 10\u201215 min, verificando e monitorando para desenvolvimento de manchas a cada 2\u20125 min.
- Lave lâminas três vezes em PBS por 3 minutos.
- Adicione uma gota de Hematoxilina e incubar por 3 minutos.
- Coloque slides em um frasco de coloração e enxágue em uma pia por um fluxo constante de água da torneira até que a água esteja limpa.
- Incubar sequencialmente slide em 80% EtOH por 1 min, 90% EtOH por 1 min, 100% EtOH por 1 min e xileno por 2 min.
- Deixe os slides secarem por 5\u201210 min sob o capô da fumaça.
- Dispense uma gota de meio de montagem permanente e não aquoso sobre seções de xenoenxertos e coloque o deslizamento de cobertura em cima.
- Deixe os slides secarem durante a noite antes da imagem.
9. Análise dos Canais Vasculares Derivados do Homem
NOTA: A vascularidade das lesões VM é quantificada pela medição da área vascular e da densidade vascular. Apenas os canais vasculares positivos e derivados do ser humano da UEA-I são considerados para quantificação.
- Tire de quatro a cinco imagens por seção de lesão com um microscópio de campo brilhante em uma ampliação de 20x (campos de alta potência [HPF]). Leve as imagens do HPF em um padrão x-plano dentro da seção de lesão para evitar sobreposição(Figura 1F-H). Inclua uma barra de escala nas imagens tiradas.
- Abra as imagens do HPF na Imagem J (Arquivo > Aberto). Calibrar os pixels da barra de escala da seguinte forma. Use a ferramenta de linha reta e ultrapasse a barra de escala. Para converter os pixels medidos em mm clique em Analyze > Set scale.
- Clique em Analisar > Definir medidas e selecionar Área e Adicionar à sobreposição.
- Meça a área total de campo em um HPF utilizando Analyze > Measure. Guarde esta medida para quantificação na etapa 9.8.
- Usando a ferramenta seleções à mão livre, delineie manualmente os canais vasculares UEA-I+.
NOTA: Um canal vascular é definido como qualquer área que esteja forrada com UEA-I+ - CE que possa conter células sanguíneas. - Clique em Analisar > Medir para quantificar a área vascular UEA-I+ (mm2/HPF).
- Repita esta medição para todos os cinco HPF tomados dentro de um plugue.
- Em média, a área vascular total de todos os cinco HPF. A área vascular obtida por HPF é posteriormente dividida pela área de campo hpf (em mm2, passo 9,5) e expressa em por cento (%).
- Para quantificação da densidade vascular, conte o número de canais vasculares UEA-I+ de cada HPF tomados. A densidade vascular é o número médio de canais vasculares UEA-I+ contados por área de HPF (vasos/mm2).
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Representative Results
Este protocolo descreve o processo de geração de um modelo de xenoenxerto de murina de VM baseado na injeção subcutânea de CE derivada do paciente na parte de trás de camundongos nus imunodeficientes. Colônias de células endoteliais podem ser colhidas dentro de 4 semanas após o isolamento celular inicial do tecido VM ou sangue lesão(Figura 1A,B). No dia seguinte à injeção, o plugue da lesão de xenoenxerto cobre uma área de superfície de aproximadamente 80\u2012100 mm2. Em nossas mãos, os plugues de lesão com TIE2/PIK3CA-mutante EC são visivelmente vascularizados e perfundidos dentro de 7\u20129 dias a partir da injeção 14,15 (Figura 1C-E). No entanto, a extensão do crescimento da lesão é variável e reflete na heterogeneidade do paciente e da amostra.
Os plugues de lesão recapitulam de perto as características histopatológicas do tecido VM humano: canais vasculares ampliados alinhados por uma fina camada de células endoteliais(Figura 1F\u2012H). Essas estruturas vasculares normalmente contêm eritrócitos, confirmando anastomoses funcionais com a vasculatura do rato hospedeiro (Figura 1F\u2012H). A coloração imunohistoquímica utilizando a lectina específica humana UEA-I pode confirmar que as células que revestem lesões vasculares são derivadas de células implantadas humanas em vez da vasculatura do rato(Figura 1H). Um esquema resumindo os passos do isolamento VM-CE à dissecção do plugue de lesão é apresentado na Figura 2.
Figura 1: Resultados representativos.
(A) Imagem representativa da cultura celular mista primária três semanas após o isolamento do tecido VM antes da seleção ce. Colônia celular endotelial típica (CE) e fibroblasto contaminante (FB). (B) Imagem de uma cultura celular endotelial purificada (cd31) do tecido derivado do paciente VM. Barra de escala = 200 μm. (C) A lesão formará uma estrutura esférica. A vascularização é visível devido à cor azulada através da pele de ratos nus. (D) As linhas tracejadas mostram como o tamanho da lesão é recodificado medindo o comprimento (L) e a largura (W) usando uma pinça. (E) Foto de lesão de xenoenxerto visivelmente vascularizada no dia 9. Barra de escala = 1 cm. (F) Imagem representativa de uma seção de tampão de lesão. O padrão x-plane no qual cinco imagens de campo de alta potência são tiradas para quantificação são indicados por caixas brancas tracejadas. Barra de escala = 1000 μm. (G\u2012H) Imagens representativas das seções de plugue de lesão VM. (G) Mancha de hematoxilina e eosina e(H) imunohistoquímica da lectina específica humana UEA-I. Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Esquema do fluxo de trabalho para gerar um xenoenxerto derivado do paciente de VM.
(A) As células endoteliais isoladas do tecido sólido da lesão VM do paciente ou do sangue lesão são emplacados e, quando 80% de confluência é atingida, são selecionadas por contas imunomagnéticas anti CD31 e expandidas. (B) Para injeção subcutânea de CE, no dia 0, a pele na parte traseira do mouse é beliscada usando dedo indicador e polegar para criar uma estrutura semelhante a uma tenda. As lesões são medidas no dia 1 e, em seguida, a cada dois dias (setas vermelhas) usando uma pinça durante o dia 9 experimental. As lesões são dissecadas e processadas para análise histológica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aqui, descrevemos um método para gerar um modelo de xenoenxerto derivado do paciente de VM. Este modelo murino apresenta um excelente sistema que permite aos pesquisadores obter uma compreensão mais profunda do alargamento patológico do lúmen e será fundamental no desenvolvimento de terapias mais eficazes e direcionadas para o tratamento de VM. Isso pode ser facilmente adaptado para investigar outros tipos de anomalias vasculares, como a malformação venosa linfática capilar16. Existem várias etapas que são cruciais para a geração bem sucedida de lesões vasculares reprodutíveis. Em primeiro lugar, as células endoteliais derivadas do paciente devem ser puras (sem a presença de outros tipos celulares) e crescendo exponencialmente no momento da injeção. Contaminar o fibroblasto ou outro não-CE mesenquimal pode ser facilmente reconhecido pela morfologia alongada. Em raras ocasiões, é possível que mesmo após a purificação usando contas magnéticas conjugadas de anticorpos anti-CD31, um pequeno número de não-CE permaneça na cultura. Essas culturas requerem mais purificação com marcadores de superfície celular específicos endoteliais. Como abordagem alternativa, a expansão clonal de células únicas das células endoteliais é possível. Isso reinsseguraria a homogeneidade dos mutantes-CE, pois todas as células dentro de uma cultura derivariam de uma única célula. No entanto, essa abordagem não é recomendada para o CE derivado do VM, pois as células tendem a superar suas capacidades de proliferação e se converter em um fenótipo senescente após as passagens de 9\u201210. É fundamental usar células entre as passagens 3\u20128 para experimentos de xenoenxerto e não passar células no dia anterior à injeção.
O modelo de xenoenxerto pode ser modificado para investigar outras anomalias vasculares que carregam diferentes mutações ativantes. Além disso, como as amostras de tecido do paciente são de difícil acesso para alguns laboratórios, o modelo de xenoenxerto pode ser adaptado usando CE, como células endoteliais do cordão umbilical humano (HUVEC), geneticamente modificadas para expressar a mutação/s conhecidas por causar crescimento vascular disfuncional15,,17.
O número de células recomendadas para a injeção no xenoenxerto é de 2,5 x 106 células/200 μL de BMEM. No entanto, se o número de células for insuficiente, é possível reduzir o número de injeções por animal para um ou reduzir o volume de injeção para um mínimo de 100 μL. Para este último, no entanto, é importante manter a razão de densidade celular, por exemplo, 1,25 x 106 células/100 μL BMEM. Ao trabalhar com BMEM, todas as etapas devem ser realizadas no gelo para evitar a solidificação da suspensão celular antes da injeção. Durante a injeção, é importante e que a agulha seja inserida em um ângulo de 45° diretamente sob a pele e longe do tecido muscular, pois injetar no músculo impede a reprodutibilidade da lesão e dificulta a dissecção da lesão. Um total de duas injeções podem ser realizadas em cada rato — uma à direita e outra no lado esquerdo de cada animal. A segunda injeção no mesmo mouse pode servir como uma replicação técnica. Mais injeções nas costas não são recomendadas à medida que as lesões crescem ao longo do tempo e podem interferir umas nas outras. Para análise estatística em estudos pré-clínicos comparando tampões de xenoenxerto de camundongos tratados versus não tratados (somente veículo), recomendamos o uso de um mínimo de 5 animais (10 tampões de xenoenxerto) por grupo de estudo. Se disponível, a segunda injeção poderia ser usada como um "controle interno" usando ce não mutante. Usamos o EC primário não mutante, como o HUVEC, como controle e mostramos que essas células formaram um número insignificante de pequenos canais14,,15. Além disso, nestes plugues de lesão de controle HUVEC, notamos infiltração de canais vasculares derivados de murina no plugue após o dia 9. Se o design experimental requer tempos mais longos de incubação, esses canais de infiltração podem ser facilmente excluídos da análise por coloração para um marcador específico do homem, como anticorpo CD31 específico para humanos ou ulex europaeus agglutinina I (UEA-I) que não reagem cruzadamente com o mouse.
Para garantir que a lesão não se torne um fardo para a saúde e o bem-estar animal, é importante observar o tamanho da lesão, registrar o peso do rato diariamente e prestar atenção a quaisquer complicações laterais, como sangramento e hematomas. Se o volume da lesão exceder 500 mm3,o experimento deve ser encerrado.
Quando as lesões vasculares são aumentadas e perfundidas, deve-se prestar extrema atenção durante a dissecção para evitar a ruptura da lesão. É importante evitar tocar no plugue da lesão com ferramentas de dissecção e deixar o tecido circundante excessivo (como a pele) preso ao plugue. Isso evita o colapso das estruturas vasculares dentro do plugue de xenoenxerto que interferiria com uma análise precisa.
Finalmente, para manter a consistência, é importante que a análise histológica inicial comece no centro do plugue (cerca de 50\u201270 μm no tecido) em vez das regiões fronteiriças onde a vasculatura do rato anastomos pode estar presente. É altamente recomendável manchar as seções teciduais com um marcador CE específico do homem, como a UEA-I ou um anticorpo alternativo específico do homem que não reagirá com o rato, a fim de confirmar que as estruturas vasculares são formadas por CE derivado do homem em vez de invadir o mouse EC.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesses para divulgar.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer a Nora Lakes pela revisão. A pesquisa relatada neste manuscrito foi apoiada pelo National Heart, Lung, and Blood Institute, sob o Prêmio Número R01 HL117952 (E.B.), parte dos Institutos Nacionais de Saúde. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Athymic nude mice, (Foxn1-nu); 5-6 weeks, males | Envigo | 069(nu)/070(nu/+) | Subcutaneous injection |
| Biotinylated Ulex europeaus Agglutinin-I (UEA-I) | Vector Laboratories | B-1065 | Histological anlaysis |
| Bottle top filter (500 ml; 0.2 µM) | Thermo Fisher | 974106 | Cell culture |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | BSA | A7906-50MG | Cell culture; Histological analysis |
| Calcium cloride dihydrate (CaCl2.2H2O) | Sigma | C7902-500G | Cell culture |
| Caliper | Electron Microscopy Sciences | 50996491 | Lesion plug measurment |
| CD31-conjugated magnetic beads (Dynabeads) | Life Technologies | 11155D | EC separation |
| Cell strainer (100 μM) | Greiner | 542000 | Cell culture |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | Cell culture |
| Conical Tube; polypropylene (15 mL) | Greiner | 07 000 241 | Cell culture |
| Conical Tube; polypropylene (50 mL) | Greiner | 07 000 239 | Cell culture |
| Coplin staining jar | Ted Pella | 21029 | Histological anlaysis |
| Coverglass (50 X 22 mm) | Fisher Scientific | 12545E | Histological anlaysis |
| DAB: 3,3'Diaminobenzidine Reagent (ImmPACT DAB) | Vector Laboratories | SK-4105 | Histological anlaysis |
| Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) | Corning | 10-027-CV | Cell culture |
| DynaMag-2 | Life Technologies | 12321D | EC separation |
| Ear punch | VWR | 10806-286 | Subcutaneous injection |
| EDTA (0.5M, pH 8.0) | Life Technologies | 15575-020 | Histological anlaysis |
| Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM2) Bulletkit (basal medium and supplements) | Lonza | CC-3162 | Cell culture |
| Eosin Y (alcohol-based) | Thermo Scientific | 71211 | Histological anlaysis |
| Ethanol | Decon Labs | 2716 | Histological anlaysis |
| Fetal Bovine Serum (FBS) , HyClone | GE Healthcare | SH30910.03 | Cell culture |
| Filter tip 1,250 μL | MidSci | AV1250-H | Multiple steps |
| Filter tip 20 μL | VWR | 10017-064 | Multiple steps |
| Filter tip 200 μL | VWR | 10017-068 | Multiple steps |
| Formalin buffered solution (10%) | Sigma | F04586 | Lesion plug dissection |
| Hemacytometer (INCYTO; Disposable) | SKC FILMS | DHCN015 | Cell culture |
| Hematoxylin | Vector Hematoxylin | H-3401 | Histological anlaysis |
| Human plasma fibronectin purified protein (1mg/mL) | Sigma | FC010-10MG | Cell culture |
| Hydrogen Peroxide solution (30% w/w) | Sigma | H1009 | Histological anlaysis |
| ImageJ Software | Analysis | ||
| Isoflurane, USP | Akorn Animal Health | 59399-106-01 | Subcutaneous injection |
| magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma | M1880-500G | Cell culture |
| Basement Membrane Matrix (Phenol Red-Free; LDEV-free) | Corning | 356237 | Subcutaneous injection |
| Microcentrifuge tube (1.5 mL) | VWR | 87003-294 | EC separation |
| Microscope Slide Superfrost (75mm X 25mm) | Fisher Scientific | 1255015-CS | Histological anlaysis |
| Needles, 26G x 5/8 inch Sub-Q sterile needles | Becton Dickinson (BD) | BD305115 | Subcutaneous injection |
| Normal horse serum | Vector Laboratories | S-2000 | Histological anlaysis |
| Penicillin-Streptomycin-L-Glutamine (100X) | Corning | 30-009-CI | Cell culture |
| Permanent mounting medium (VectaMount) | Vector Laboratories | H-5000 | Histological anlaysis |
| Pestle Size C, Plain | Thomas Scientific | 3431F55 | EC isolation |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3994 | Cell culture |
| Scale | VWR | 65500-202 | Subcutaneous injection |
| Serological pipettes (10 ml) | VWR | 89130-898 | Cell culture |
| Serological pipettes (5ml) | VWR | 89130-896 | Cell culture |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma | 223530 | Cell culture |
| Streptavidin, Horseradish Peroxidase, Concentrate, for IHC | Vector Laboratories | SA-5004 | Cell culture |
| Syringe (60ml) | BD Biosciences | 309653 | Cel culture |
| SYRINGE FILTER (0.2 µM) | Corning | 431219 | Cell culture |
| Syringes (1 mL with Luer Lock) | Becton Dickinson (BD) | BD-309628 | Subcutaneous injection |
| Tissue culture-treated plate (100 X 20 mm) | Greiner | 664160 | Cell culture |
| Tissue culture-treated plate (145X20 mm) | Greiner | 639160 | Cell culture |
| Tissue culture-treated plates (60 X 15) mm | Eppendorf | 30701119 | Cell culture |
| Tris-base (Trizma base) | Sigma | T6066 | Histological anlaysis |
| Trypan Blue Solution (0.4 %) | Life Technologies | 15250061 | Cell culture |
| Trypsin EDTA, 1X (0.05% Trypsin/0.53mM EDTA) | Corning | 25-052-Cl | Cell culture |
| Tween-20 | Biorad | 170-6531 | Histological anlaysis |
| Wheaton bottle | VWR | 16159-798 | Cell culture |
| Xylenes | Fisher Scientific | X3P-1GAL | Histological anlaysis |
References
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