En protokoll presenteres som gjør det mulig å visualisere intakt Drosophila melanogaster når som helst i utviklingen ved hjelp av mikrocomputert tomografi.
Biomedisinske bildeverktøy tillater undersøkelse av molekylære mekanismer på tvers av romlige skalaer, fra gener til organismer. Drosophila melanogaster, en godt karakterisert modellorganisme, har hatt nytte av bruk av lys og elektronmikroskopi for å forstå genfunksjonen på nivå med celler og vev. Anvendelsen av bildeplattformer som muliggjør forståelse av genfunksjon på nivået av hele den intakte organismen, vil ytterligere forbedre vår kunnskap om genetiske mekanismer. Her presenteres en hel dyreavbildningsmetode som skisserer trinnene som trengs for å visualisere Drosophila på et hvilket som helst utviklingsstadium ved hjelp av mikrocomputert tomografi (μ-CT). Fordelene med μ-CT inkluderer kommersielt tilgjengelig instrumentering og minimal praktisk tid til å produsere nøyaktig 3D-informasjon ved mikronnivåoppløsning uten behov for vevsavhandling eller ryddingsmetoder. Sammen med programvare som akselererer bildeanalyse og 3D-gjengivelse, kan detaljert morfometrisk analyse av ethvert vev eller organsystem utføres for å bedre forstå mekanismer for utvikling, fysiologi og anatomi for både beskrivende og hypotesetestingsstudier. Ved å bruke en bildearbeidsflyt som omfatter bruk av elektronmikroskopi, lysmikroskopi og μ-CT, kan det utføres en grundig evaluering av genfunksjonen, og dermed øke nytten av denne kraftige modellorganismen.
Imaging metoder som tillater detaljert undersøkelse av indre strukturer av et objekt uten å ødelegge sin generelle 3D-arkitektur har vist seg å være allment gunstig for en rekke forskjellige disipliner, inkludert fysikk, engineering, materialvitenskap, arkeologi, paleontologi, geologi og biologi1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Blant disse ikke-ødeleggende avbildningsmetodene er røntgenbaserte plattformer spesielt nyttige på grunn av røntgenstrålenes evne til å trenge inn i mange forskjellige prøvetyper og materialer med minimal spredning sammenlignet med synlige lysbølger. Beregnet tomografi (CT), mikrocomputert tomografi (μ-CT), nanocomputert tomografi (Nano-CT) og Synkrotronmikrotomografi har derfor dukket opp som den primære teknologien for røntgenbasert bildebehandling av prøver fra meter til mikron, med millimeter til submikronoppløsningsfunksjoner10,11,12,13,14.
Selv om disse plattformene er forskjellige i design, røntgengeometri og komponenter for å balansere prøvestørrelse og oppløsning, er de alle avhengige av det samme grunnleggende prinsippet for bildeopptak: en kilde til røntgenstråler som beveger seg gjennom objektet og fanges opp av en detektor. Differensial demping av røntgenstrålen når den passerer gjennom varierende tettheter i objektet genererer bildekontrast. 3D-data oppnås ved å rotere enten prøven eller detektoren, og samler inn en serie 2D-projeksjonsbilder som deretter rekonstrueres ved hjelp av algoritmer til tomogrammer som inneholder 3D-informasjon hvis oppløsning er isotropisk i x,y,z15. For mange benktop-μ-CT-skannere som bruker en røntgengeometri med kjeglestråle for å projisere røntgenbilder på objektet som blir avbildet, brukes Feldkamp-algoritmen til å rekonstruere objektet nøyaktig med minimale feil16.
Oppløsningen til en gitt plattform bestemmes hovedsakelig av systemparametere som størrelsen på røntgenstrålen (spotstørrelse), skannergeometri (avstand fra objekt til røntgenkilde), størrelsen på pikslene på detektoren og rekonstruksjonsalgoritmen som brukes. Andre faktorer, for eksempel skannervibrasjoner, røntgenstrålesvingninger, prøvebevegelse og materialtype eller kjemisk flekk som brukes til å visualisere objektet, kan også påvirke romlig oppløsning betydelig under virkelige bildebehandlingskondidasjoner15.
For biomedisinske anvendelser har CT og μ-CT spilt en nøkkelrolle i å fremme vår forståelse av anatomi, fysiologi, utvikling og sykdomsmekanismer, som fungerer som et verktøy for både menneskelige pasientdiagnoser og som en preklinisk bildeplattform for modellorganismer17,18. For eksempel bruker Mouse International Phenotyping Consortium, hvis mål er å identifisere funksjonen til hvert gen i musegenomet, μ-CT som en del av deres fenotyping rørledning19. Resultatene deres har vært avgjørende for å forstå gener involvert i utvikling og sykdomsprosesser, samtidig som de fungerer som et atlas for museanatomi og utvikling20. Andre modellorganismer, som sebrafisk og rotter, har også fullt ut omfavnet bruken av μ-CT for å utføre hele dyr fenotyping av en rekke genmutanter17,21,22,23.
Fordelen med å kombinere hele dyreavbildning med modellorganismer er at en mekanistisk forståelse av genfunksjon for en gitt biologisk prosess kan utforskes fullt ut. Dette er mulig på grunn av de godt karakteriserte genomene og mange genetiske verktøy som er tilgjengelige i modellorganismer som muliggjør presis manipulering av genfunksjon ved distinkte utviklingstidspunkter, spesifikke vev, individuelle celler og til og med subcellulære organeller. Disse inkluderer binære uttrykkssystemer som UAS / GAL4-systemet (og dets mange derivater), CRISPR / Cas9 og RNAi24,25,26. Når disse genetiske verktøyene brukes sammen med en kraftig bilderørledning bestående av elektronmikroskopi, lysmikroskopi (fluorescerende og ikke-fluorescerende), og hele dyreavbildninger som μ-CT, kan en grundig evaluering av molekyler, celler, vev, organer og hele organismen oppnås, noe som gir en mye dypere forståelse av genfunksjonen.
Denne protokollen fokuserer på bruk av μ-CT i den ikke-pattedyrmodellorganismen Drosophila melanogaster, hvis utallige genetiske verktøy har bidratt til å belyse mange molekylæremekanismer 26,27. Det ble vedtatt fra tidligere protokoller i ikke-modellinsekter1,28,29,30,31,32, og bygger av tidligere μ-CT-studier i Drosophila for å etablere en standardisert protokoll for bruk i dette dyret33,34,35,36,37,38,39 ,40,41. Trinnene for vellykket prøvepreparering, avbildning og analyse av fly μ-CT-datasett ved hjelp av kommersielt tilgjengelige skannere er skissert. Med denne protokollen kan alle utviklingsstadier av fluen visualiseres med høy oppløsning for både beskrivende og hypotesetestingsstudier, inkludert taksonomi, anatomi, utvikling, fysiologi og sykdom27. Denne protokollen vil også være nyttig for avbildning nesten alle insekt og til og med ikke-levende materialer som krever kjemisk farging for bildekontrast for å forbedre visualiseringen ved å μ-CT.
Visualisering av intakt Drosophila melanogaster i alle utviklingsstadier har forblitt en utfordring, hovedsakelig på grunn av inkompatibiliteten til lysmikroskopi med den tykke, pigmenterte kutiklen som finnes i dette dyret. Mens andre avbildningsmetoder for hele dyr, for eksempel Magnetic Resonance Imaging (MRI), Optical Coherence Tomography (OCT) og ultramikroskopi kombinert med vevsrydding, har blitt brukt med suksess i fluer50,51,52,53,54, μ-CT presenterer en rekke fordeler som gjør den ideell for hele dyreavbildning av denne organismen13,15,30 . Røntgenstråler trenger lett inn i den pigmenterte kutiklen, og deres lille bølgelengde gir mulighet for submikronavbildning. Merking krever minimal investering i allment tilgjengelige kjemikalier og ingen spesialiserte benkferdigheter13. μ-CT-skannere er også kommersielt tilgjengelige, og kostnadene kan sammenlignes med lette mikroskopiplattformer, samtidig som de er mer attraktive for et bredere spekter av disipliner (geologi, paleontologi, ingeniørfag, etc.) som også kan dra nytte av tilgjengeligheten ved en institusjon. Synchrotron røntgenkilder kan også brukes til høyoppløselig μ-CT-avbildning av faste og levende insekter31,55,56, men er mindre tilgjengelige enn kommersielle benkeplateskannere.
Denne protokollen gir en effektiv måte å skaffe μ-CT-bilder av flue voksne, pupa, larve og cellulære embryoer. Legg merke til at for mange av trinnene som er beskrevet ovenfor, kan alternative metoder også brukes til å forberede prøver for avbildning. Andre studier har gitt en detaljert sammenligning av forskjellige fikserings-, merkings- og tørketrinn for bruk i insekter, og de som er interessert i å vedta denne teknikken, oppfordres til å evaluere fordelene ved hver tilnærming1,4,13,29,30,57. Selv om denne protokollen er relativt grei, presenteres noen nyttige forslag.
For det første bør det tas hensyn til når du forstyrrer kutikol av intakte prøver slik at underliggende bløtvev ikke blir betydelig forstyrret. Det er viktig å la larval og tidlige puppestadier gjennomgå fiksering i 2 timer i Bouins løsning før du stikker. Dette vil stivne vevet og begrense mengden hemolymfe som vil ooze ut av kutikalhullene, noe som kan endre organarkitekturen. Individuelle kroppssegmenter (hode, thorax og mage) av voksen kan skilles hvis strukturen (e) av interesse ligger der. Det anbefales å bruke en skalpell for å skjære rent gjennom disse segmentene i stedet for å trekke dem fra hverandre med tang, noe som kan forstyrre 3D-arkitekturen i tarmen eller sentralnervesystemet, for eksempel. Når det gjelder timing, trenger voksne generelt bare 16 timer. for fullstendig fiksering, mens larve- og puppetrinnene trenger 24 timer. Også, hvis jod eller PTA-farging virker ujevn, kan prøven plasseres tilbake i løsning for å inkubere lenger til jevn farging oppnås. Til slutt bør hydrerte prøver ikke plasseres ved 4 °C, da dette ser ut til å indusere dannelsen av luftbobler i kroppshulen etter oppvarming til romtemperatur.
For det andre vil prøvemontering variere etter instrument, scenetype og om prøven må forbli hydrert eller har vært kritisk punkttørket. Hvis den er hydrert, må du forsikre deg om at prøven ikke lekker og muligens ødelegger skanneren. Når du monterer prøven inne i en pipettespiss, må du skyve forsiktig med en kjedelig gjenstand til prøvene støter på liten motstand og ikke kan bevege seg. Å presse for hardt kan føre til kutikuladeformasjon og underliggende strukturelle feil. Pass også på at prøven er justert i holderen så nær rotasjonsaksen som mulig. Enhver wobble vil øke skannetidene på grunn av det større synsfeltet og redusere oppløsningen til det endelige tomogrammet etter rekonstruksjon.
For det tredje vil skannerinnstillingene for henting av projeksjonsbilder også variere fra instrument til instrument. For å maksimere oppløsningsmulighetene til skanneren, bør spotstørrelsen for røntgenstrålen være så liten som mulig (5-10 μm). Dette kan oppnås ved å balansere røntgenspenning og strøminnstillinger slik at den totale effekten er 3-4 W. Med disse innstillingene og riktig eksponeringstid på kameraet kan riktig røntgenstråledemping av prøven og optimal bildekontrast oppnås. Bruken av aluminiums- eller kobberfiltre mellom objektet og røntgenkilden kan brukes til å finjustere de optimale røntgenenergiinnstillingene for best mulig bildekontrast eller dempe strålen tilstrekkelig til at høyere drevne kilder kan brukes. Når det gjelder bildeoppløsning, vil dette avhenge av mange forskjellige variabler, inkludert flekktype, antall projeksjonsbilder, bildepikselstørrelse, kameraposisjon, prøvebevegelse, skannervibrasjoner og rekonstruksjonsparametere. Et fantom for stolpemønster (QRM GmbH) som inneholder kjente størrelsesmarkører, kan bidra til å evaluere romlig oppløsning for en gitt skanner- og kamerainnstilling.
Det er også verdt å evaluere fordelene ved å avbilde kritiske punkter tørket eller hydrert prøver. Sombke et al. utførte en komparativ vurdering av de to metodene og fant kritisk punkttørking å være overlegen for μ-CT-applikasjoner som involverer leddyr30. Fordelene med hydrerte prøver er imidlertid at dyr utsettes for mindre kjemisk og mekanisk eksponering som kan føre til både kvantitative og morfologiske artefakter. Dette har også en tendens til å bevare delikat vev bedre enn CPD. Imidlertid har hydrerte prøver en mye kortere holdbarhet og bør avbildes senest en måned etter fiksering siden vevsforringelse og redusert bildekvalitet blir åpenbar på det tidspunktet. Også oppløsningen av hydrerte prøver vil være litt mindre enn en kritisk punkttørket prøve, fordi røntgenstråler også må trenge gjennom både en plastpipettespiss og den omkringliggende væsken (vann eller buffer). Kritisk punkt Tørkede prøver kan bevares i mye lengre perioder, spesielt når de holdes på Drierite. De kan også plasseres direkte i røntgenstrålebanen ved ganske enkelt å lime vingene eller bena til en insektpinne og plassere den i scenechucken, noe som forenkler monteringsprosessen. Imidlertid kan den omfattende etanoldehydreringen av disse prøvene føre til vevskrymping og tap av delikat vevsarkitektur, og derfor er det viktig å utføre en rekke økende EtOH-konsentrasjoner for å minimere disse effektene. Likevel bør det bemerkes at alle former for kjemisk behandling, inkludert paraformaldehydfiksering og til og med jodfarging, kan forårsake vevskrymping58,59. Selv om ingen av metodene vil gi målinger av ‘faktisk organstørrelse’ i en levende flue, er morfometriske målinger fortsatt gyldige når man sammenligner mutant- og wildtype-dyr så lenge fikserings-, fargings- og tørketrinnene utføres identisk for begge settene med prøver – helst parallelt.
Avslutningsvis gir μ-CT et nyttig verktøy for hele dyreavbildning for Drosophila33,34,35,36,37,38,39,40,41. Mange andre studier har vist kraften i denne teknologien for å forstå ulike aspekter av insekt taksonomi, økologi, fysiologi, utvikling og anatomi som kan bidra til å informere fremtidige studier i fluer1,28,30,31,32,55,56,57 . Kombinert med de genetiske og lette mikroskopiverktøyene som allerede er mye brukt i denne organismen, kan μ-CT posisjonere seg i en eksperimentell rørledning som gir en dypere forståelse mellom genotype og fenotype.
The authors have nothing to disclose.
Ingenting av dette ville vært mulig uten støtte fra Nasser Rusan. Jeg vil takke H. Doug Morris, Danielle Donahue og Brenda Klaunberg fra NIH Mouse Imaging Facility og Ben Ache fra Micro Photonics for trening og nyttig diskusjon. Jeg takker også Mansoureh Norouzi Rad fra Zeiss for skanning av mageprøver på Xradia 520 Versa. Lauren Smith, Samantha Smith og Rachel Ng hjalp også til med skanning. Mike Marsh fra Object Research Systems ga Dragonfly teknisk støtte. Jeg er også takknemlig for støtten fra National Heart, Lung, and Blood Institute (1K22HL137902-01) og Start Up Funds fra University of Wyoming. Jeg takker også de anonyme anmelderne for deres nyttige forslag og kommentarer.
100% Ethanol | For critical point drying | ||
Bouin's Solution | Sigma-Aldrich | HT10132 | For animal fixation |
Critical Point Dryer | Dries samples using the critical point method; multiple options available (Balzers CPD 020 or Leica EMCPD300) | ||
Dragonfly Software | Object Research Systems | For visualization and segmentation of micro-CT datasets; https://www.theobjects.com/dragonfly/index.html | |
Heat Block | For microfuge tubes | ||
Image Analysis Workstation | Should contain sufficient RAM and quality graphics card for 3D rendering | ||
Iodine Solution (I2KI) | Fisher Scientific | SI86-1 | For staining |
Microcomputed Tomography Scanner | Bruker | Skyscan 1172 | Cone-beam X-Ray geometry; detector is a Hamamatsu 10 MP camera with 11.54 µm pixel size. |
Microcomputed Tomography Scanner Software | Bruker | For controling the scanner itself (e.g., performing flat field corrections, X-ray tube power, camera expsoure times, acquisition, etc.) | |
Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-15 | For poking hole in cuticle |
NRecon Image Reconstruction Software | Bruker | Used to reconstruct cross-section images from 2D projection images taken with cone-beam X-Ray geometry | |
P10 pipet tips | Genesee Scientific | 24-120 | Sample mounting |
Phosphate Buffered Saline | Resarch Products International | P32060-4000.0 | Dilute to 1X with water before use |
Phosphotungstic Acid Hydrate | Sigma-Aldrich | 79690-25g | For staining |
Pin Holder | Fine Science Tools | 26018-17 | For Minutien Pins |
Triton X-100 | Research Products International | 111036 | To remove waxy coating from adult flies (as 0.5% PBST) |
X-Ray Microscope | Zeiss | Xradia 520 Versa | Cone-beam X-Ray geometry featuring Fresnel zone plate objective lenses for Resoluton at a Distance (RaaD™) |