Summary
マイクロコンピュータ断層撮影を用いた開発のあらゆる段階で、無傷の ショウジョウジョウバエメラノガスター の可視化を可能にするプロトコルが提示される。
Abstract
生物医学イメージングツールは、遺伝子から生物まで、空間的なスケールを越えた分子メカニズムの研究を可能にします。 ショウジョウバエメラノガスターは、 細胞や組織のレベルで遺伝子機能を理解するために光と電子顕微鏡を使用することから恩恵を受けています。無傷の生物全体のレベルで遺伝子機能を理解できるイメージングプラットフォームの応用は、遺伝的メカニズムに関する我々の知識をさらに高めるだろう。ここでは、微小コンピュータ断層撮影(μ-CT)を用いて任意の発達段階で ショウジョウバエ を可視化するために必要なステップを概説する全動物イメージング法を提示する。μ-CTの利点は、組織解剖やクリア方法を必要とせずにミクロンレベルの解像度で正確な3D情報を生成するための市販の計装と最小限のハンズオン時間を含みます。画像解析や3Dレンダリングを加速するソフトウェアと組み合わせることで、組織や臓器系の詳細な形態学的解析を行い、記述的および仮説的試験研究のための発達、生理学、解剖学のメカニズムをよりよく理解することができます。電子顕微鏡、光顕微鏡、μ-CTを利用したイメージングワークフローを活用することで、遺伝子機能の徹底的な評価が可能となり、この強力なモデル生物の有用性を高めることができます。
Introduction
3Dアーキテクチャ全体を破壊することなく、物体の内部構造を詳細に調査できるイメージング法は、物理学、工学、材料科学、考古学、古生物学、地質学、生物学1、2、3、4、5、6、7、8、8、9のさまざまな分野に広く有益であることが証明されています。 .これらの非破壊イメージング法の中でも、X線ベースのプラットフォームは、可視光波に比べて散乱を最小限に抑え、多くの異なる種類のサンプルや材料に高エネルギーX線が浸透する能力のために特に有用である。コンピュータ断層撮影(CT)、微小断層撮影(μ-CT)、ナノコンピュータ断層撮影(Nano-CT)、シンクロトロン微小トモグラフィーは、メートルからミクロンまでのサンプルのX線イメージングの主要技術として浮上し、ミリメートルからサブミクロン分解能10、11、12、13、14に至る。
これらのプラットフォームは、サンプルサイズと解像度のバランスをとるために設計、X線ジオメトリ、コンポーネントが異なりますが、すべて同じ基本原理に依存して画像キャプチャを行います: オブジェクトを通過し、検出器によってキャプチャされるX線のソース。X線ビームがオブジェクト内の様々な密度を通過する際の差動減衰は、画像のコントラストを生成します。3Dデータは、試料または検出器のいずれかを回転させて取得し、アルゴリズムを用いて再構成される一連の2D投影画像を、X、y、z15において等方性の分解能を持つ3D情報を含むトモグラムに再構成する。イメージ対象の物体にX線を投影するためにコーンビームX線幾何学を利用する多くのベンチトップμ-CTスキャナでは、Feldkampアルゴリズムは、最小誤差16でオブジェクトを正確に再構築するために使用される。
所定のプラットフォームの解像度は、主にX線ビームのサイズ(スポットサイズ)、スキャナジオメトリ(物体からX線源までの距離)、検出器上のピクセルのサイズ、および使用される再構成アルゴリズムなどのシステムパラメータによって決定されます。また、スキャナ振動、X線ビームの揺らぎ、サンプルの動き、物体の可視化に使用される材料タイプまたは化学染色などの追加要因も、実世界のイメージング・コンディション15の下で空間分解能に大きく影響を与える可能性がある。
生物医学の応用のために、CTおよびμ-CTは解剖学、生理学、発達および病気のメカニズムについての理解を進める上で重要な役割を果たし、ヒト患者の診断のためのツールとして、そしてモデル生物17、18のための前臨床画像化プラットフォームとして役立つ。例えば、マウス・インターナショナル・フェノタイピング・コンソーシアムは、マウスゲノム中のすべての遺伝子の機能を同定することを目的とし、μ-CTをその表現型パイプライン19の一部として利用する。彼らの結果は、開発および疾患プロセスに関与する遺伝子を理解するために重要であり、マウス解剖学および開発20のアトラスとしても機能している。ゼブラフィッシュやラットなどの他のモデル生物も、多数の遺伝子変異体17、21、22、23の全動物の表現型を行うためのμ-CTの使用を完全に受け入れてきた。
動物イメージング全体とモデル生物を組み合わせることの利点は、特定の生物学的プロセスに対する遺伝子機能の機械的理解を十分に探求できることである。これは、明確な発達時点、特定の組織、個々の細胞、さらには細胞内小器官で遺伝子機能を正確に操作することを可能にするモデル生物で利用可能なゲノムと多くの遺伝的ツールのために可能です。これらには、UAS/GAL4 システム (およびその多くの誘導体)、CRISPR/Cas9、RNAi24、25、26などのバイナリ式システムが含まれます。これらの遺伝子ツールを電子顕微鏡、光顕微鏡(蛍光法、非蛍光)、μ-CTなどの動物イメージング全体と組み合わせて使用すると、分子、細胞、組織、臓器、生物全体の徹底的な評価が可能になり、遺伝子機能の理解が深まる。
このプロトコルは、非哺乳類モデル生物ショウジョウバエメラノガスターにおけるμ-CTの使用に焦点を当てており、その無数の遺伝的ツールは、多くの分子機構26、27を解明するのに役立った。これは、非モデル昆虫1、28、29、30、31、32の以前のプロトコルから採用され、この動物33、34、35、36、37、38、39での使用のための標準化されたプロトコルを確立するためにショウジョウバエの以前のμ-CT研究を構築します 、40,41.市販のスキャナーを使用したフライμ-CTデータセットのサンプル調製、イメージング、分析を成功させるための手順を概説します。このプロトコルを使用すると、ハエのすべての発達段階は、分類、解剖学、発達、生理学、疾患27を含む記述的および仮説試験研究の両方の高解像度で視覚化することができる。このプロトコルは、μ-CTによる可視化を強化するために、画像コントラストに化学的染色を必要とする昆虫や非生きた物質を事実上撮影するのにも有用です。
Protocol
1. サンプルの選択とキューティクルの準備
- イメージングに適した発達のタイムポイント(胚、幼虫、子犬、または成人)を選択します。
- 胚性の段階では、酵母ペーストで塗られたブドウジュース寒天プレートのケージメスは、30〜60分ごとに卵を収集します。適切な段階に達するまで、これらの胚を25°Cで発達させる。
- 幼虫段階では、時を取った胚採取実験から第1および第2の星を採取する。非混雑状態の下で食品バイアルの側面から3番目 の星を直接選びます。
- 子犬のタイミングについては、白いプレパエ(逆尖乳)を収集し、キューティクルが茶色になり始める時間をメモします。動物はキューティクル褐変後の定義された時点で15段階のプパル開発を進め、それに応じて42を収集することができる。
- エクロイオンに続く処女として大人を収集し、必要な時間(例えば、完全な腸の発達のために5日間)の食品バイアルで老化することができます。
- 5~50匹の動物を、1xリン酸緩衝塩水(0.5%PBST)で0.5%トリトンX-100の1mLを含む1.5mLマイクロ遠心分離チューブに移します。ベンチトップでチューブを定期的にタップしながら、室温(RT)で5分間インキュベートして疎水性コーティングの除去を支援し、動物が完全に水没できるようにします。
- 胚、幼虫、およびプパル段階の場合、チューブを100°Cに設定したヒートブロックに20sセットし、RTで5分間冷却して、さらに発達を阻止する。
注:動物はまた、液体窒素37でフラッシュ冷凍することができます。
- 胚、幼虫、およびプパル段階の場合、チューブを100°Cに設定したヒートブロックに20sセットし、RTで5分間冷却して、さらに発達を阻止する。
2. 固定と染色
- 0.5% PBST を取り出し、ブインの溶液を 1 mL 追加します。チューブをタップして、動物が完全に水没していることを確認します。
注意:ブインの溶液はホルムアルデヒドが含まれています。こぼれると皮膚や目に急性毒性を引き起こし、飲み込むと致命的になる可能性があります。取り扱い時には手袋、安全眼鏡、ラボコートを着用してください。
注: エタノールの使用など、追加の固定技術を使用することもできます。他の固定剤のメリットについては、ref.1,30で詳しく説明します。- 胚および成体サンプルの場合、RTで16〜20時間ベンチトップにインキュベートする。
- 幼虫とパパルのサンプルの場合は、RTで2時間動物を固定し、ブインの溶液を捨て、1x PBSで5分間洗浄します。1x PBSを含むマルチウェル解剖皿に移し、ホルダーに取り付けられた小さなミヌティエンピンを使用して、下の軟部組織を破壊しないように注意して前部と後部キューティクルに穴を開けます。
- 幼虫とパパルのサンプルをマイクロフュージチューブに戻し、新鮮なブインの溶液を1 mL加えます。RTで24時間ベンチトップにインキュベート。
- ブインの溶液を取り除き、μ-CTウォッシュバッファー(0.1 M Na2HPO 4、1.8%スクロース)または1x PBS 3thriceの1 mLで30分間サンプルを洗浄します。
- 適切な染色液を1 mL加え、ベンチトップに2~7日間インキュベートします。
注:ステインの選択は多くの要因に依存しますが、一般的には浸透、インキュベーション時間、解像度のバランスです。一般に、ホスホタングジン酸(PTA)は、軟組織の優れたコントラストと分解能を提供しますが、キューティクルの機械的破壊と長いインキュベーション時間が必要です。異なる染色タイプのメリットについては、ref.1で詳しく説明します。- ヨウ素染色には、0.1 N I2KI(ルゴール溶液)の1mLを使用してください。2日間インキュベートします。大人のキューティクルのこれ以上の破壊は必要ありません。
- ホスホタンスチン酸(PTA)染色の場合は、水で希釈した0.5%(w/v)溶液の1mLを使用してください。ホルダーに取り付けられた小さなミヌティエンピンで口の部分を取り除くか、胸郭または腹部キューティクルの穴を突くことによって、大人のキューティクルを破壊します。5〜7日間インキュベート、または組織染色が不均一に見える場合は長い。
- 1 mLの超純水または1x PBSで30分間洗浄します。洗浄工程を繰り返します。RTで動物を超純水または1x PBSで最大1ヶ月間保管してください。
- 動物が水分補給中にスキャンされる場合は、セクション4に直接進みます。サンプルの保存時間を長くする必要がある場合は、プロトコルのセクション 3 に進みます。
3. 臨界点乾燥(オプション)
- エタノール(EtOH)脱水シリーズをサンプル上で行う:10%、25%、50%、75%、100%、100%。EtOH溶液を1 mL添加し、記載された順番で各濃度に対して1時間ベンチトップにインキュベートします。
- 最後の100%EtOHが浸漬した後、新鮮な100%EtOHに交換し、サンプルを一晩ベンチトップにインキュベートさせます。
- メーカーの指示に従ってサンプルの臨界点乾燥を行います。
注:電子顕微鏡機能には、一般に、EtOH脱水後のサンプルの乾燥を行う重要な点乾燥機( 材料表を参照)があります。
4. サンプル取り付け
- 重篤な点で乾燥したサンプルの場合、ホットグルーサンプルは、回転段階のチャック内に収まるように設計された昆虫ピンまたは他のホルダーに、プラスチックまたはガラスキャピラリーチューブ(〜1.0〜1.25mm内径)に入れるように設計されています。
- 水和サンプルの場合、P10ピペットチップに水を充填し、漏れを防ぐためにヒートシールまたはパラフィンフィルムのいずれかで狭い端を固定します。
注意: 水がスキャナーに漏れて損傷を引き起こさないように、接続をしっかりとラップしてください。- 鉗子を使用して、1つの標本をピペットチップに移します。鈍い20G針や別のピペットチップなどの長くて細い物体を使用して、パイプチップの壁に接触して所定の位置に保持するまで、サンプルを慎重にチップに押し下げます。
- ピペットチップの開口部をパラフィンフィルムで覆い、長時間のスキャン中に水が蒸発するのを防ぎます。
- 回転ステージのチャック内に収まるように設計されたホルダーを使用してP10ピペットを取り付けます(図1A-C)。
5. スキャン
- その日のイメージング前に機械の必要なキャリブレーションを実行します。
注: これらは製造元によって異なりますので、適切な手順を決定するためにアプリケーションの専門家に相談することをお勧めします。このプロトコルで使用されるセットアップおよびソフトウェアに関する具体的な情報については、 資料表 を参照してください。一般に、回転ステージに対して軸外にチャックに関連する「ぐらつき」を取り除き、カメラ上で均一な背景ピクセル強度を確保するためにフラットフィールド補正を実行するステージ軸の位置合わせなどのキャリブレーションは、複数のスキャンで同等の解像度とデータセットに最適なイメージング条件を提供します。 - ソフトウェアの左上隅にある [ドアを開く] アイコンをクリックして、回転するステージのチャックにアクセスするためにスキャナーのドアを開きます。サンプルホルダーのベースの周りに襟を締めてサンプルを取り付けます。
メモ:スキャナーの位置合わせを維持するために、サンプルを回転チャックに取り付ける際に穏やかな圧力を使用してください。 - 最適な解像度とコントラストを得るためのスキャナーの制御をソフトウェアでスキャンパラメータに設定します。
注:これらは、X線源、カメラ/検出器、および各スキャナの形状がメーカーによって異なるため、経験的に決定する必要があります。最適なパラメータを選択するための追加情報は、製造元のアプリケーションスペシャリストだけでなく、ここでも43を見つけることができます。- X-Ray 電源制御を開きます (オプション|X線源。スライダーバーを使用してX線電圧を30-40 kVに、電流を100-110 μAに設定して、3-4Wのパワーを備えたX線ビームと、解像度を高める小さなスポットサイズを生成します。
- [取得モード]ダイアログボックス(オプション|を使用する取得モード) をクリックして、カメラの露出時間を 500 ~800 ミリ秒に設定します。
- ソフトウェア下部にある虫眼鏡アイコンの横にあるスライダーバーを使用して、カメラの設定と位置に応じて、目的の画像ピクセルサイズ(〜700 nm〜4 μm)を設定します。これにより、スキャン中に取得される投影画像の数が決定され、より多くのプロジェクションが解像度を高めるが、スキャン時間が長くなります( 代表的な結果を参照)。
- ソフトウェアの下部にある回転矢印の横にあるスライダーバーをクリックしてドラッグし、サンプルを 360° 回転パスに沿って移動します。サンプルが視野の中に残っていることを確認します。
- ソフトウェアの上部にある [取得開始] アイコン (青丸の矢印アイコン) をクリックします。追加のスキャン パラメータを設定できるダイアログ ボックスが表示され、スキャンを保存して名前を付けるファイルと出力フォルダが表示されます。
- ランダムな動きを10と平均4-6フレームに設定します。回転ステップは、使用するカメラの設定に応じて自動的に計算されます。
- [取得] ダイアログ ボックスで[OK] をクリックしてスキャンを開始します。スキャン時間を示す 2 番目の進行状況バー ダイアログが表示されます。スキャナーは、回転経路に沿って標本の一連の投影画像(図1D)を取得し、監視する必要はありません。
6. 復興
- 図を生成するには、投影画像を用いて画像再構成を行う。
メモ:コーンビーム幾何スキャナからの画像のほとんどすべての再構成はFeldkampアルゴリズム16に依存していますが、個々のパラメータはソフトウェアの実装によって異なり、経験的に決定する必要があります。以下の設定は、市販のソフトウェアに固有の( 資料表を参照)をガイドとして使用することができる。不整列補正、リングアーチファクトリダクション、ビーム硬化補正(ほとんどのフライサンプルでは0%)などのパラメータを反復的に実行し、最終的な再構築に最適な値を選択します。再構築プロセスをより詳細に制御したい上級ユーザーは、MATLAB インターフェイスを参照してください44. - 参照スキャンに基づくシフト補正アルゴリズムを利用して初期画像配置を行う45 (アクション |X/Y の位置合わせと参照スキャン)。
- 各再構成パラメータを微調整する (開始|微調整)。 これにより、[パラメータ微調整]ダイアログ ボックスがアクティブになります。
- [次へ] を [ 配置後 ] をクリックして、配置を微調整します。反復回数を 5 に設定し、パラメータ ステップを 1.0 に設定します。[スタート]ボタンをクリックして、一連のプレビューを生成します。正しく配置されているイメージを選択します。
注:適切に整列した画像はぼやけたり、そうでなければ連続した構造(キューティクルなど)が分割されている場合に「せん断」アーチファクトを表示しません。 - リングアーティファクトの減少を微調整するには、その隣をクリックします。反復回数を 5 に設定し、パラメータ ステップを 1.0 に設定します。[ スタート ]ボタンをクリックして、一連のプレビューを生成します。リングの数が最も少ないイメージを選択します。
- [次へ] を [ 配置後 ] をクリックして、配置を微調整します。反復回数を 5 に設定し、パラメータ ステップを 1.0 に設定します。[スタート]ボタンをクリックして、一連のプレビューを生成します。正しく配置されているイメージを選択します。
- 上記のパラメータが最適な画像を提供するように最適化されたら、選択した値が[設定]タブ([設定])で正しく表示されていることを確認します。
- ヒストグラムを用いて任意の最終的な明るさとコントラスト値を調整し、ビット深度およびタイプなどのファイルパラメータを、対象とする領域(ROI)を利用して、対象の構造のみを包含する(例えば、全体のフライまたはヘッドのみ)計算時間を短縮する(出力)。
- 再構築を開始する(|を開始する開始)。 複数の再構成が必要な場合は、現在のイメージをバッチ マネージャーに追加します (開始|バッチに追加)、 残りの画像に対して手順 6.2 ~ 6.5 を繰り返します。
7. 画像解析
- 2次元と3次元のトモグラムを視覚化し、フリーウェアまたは商用ソフトウェアでさらなるモルフォメトリクス分析を行います。
注: このプロトコルで使用されるソフトウェアの詳細については、 資料一覧を参照してください。μ-CT データセットを評価できる他のソフトウェア パッケージには、フィジー46、Seg3D (www.seg3D.org)47、ITK-SNAP48、商用ソフトウェア (AMIRA など) などのフリーウェア オプションが含まれます。セグメンテーション プロセスを半自動化するために機械学習ベースのアルゴリズムを使用する他のアプリケーションは、ワークフローを高速化し、人間のバイアスを減らすのに役立ちます (例: Biomedisa49)。 - ソフトウェアにトモグラムファイルをインポートします (ファイル|イメージ ファイルのインポートファイルに関連付けられたメタデータは、自動的にウィンドウに読み込まれますが、イメージのプロパティに合わせて手動で設定することもできます。
- 目的の構造を分割するには、画面の左側にある [セグメント] タブをクリックします。新しい対象地域の作成 (ROI) (基本|新しい)に名前を付け、適切な色を選択します。
- 対象の構造を包含するしきい値範囲を定義する (範囲| スライダー バーを使用して範囲を定義します。
- 適切な 2D または 3D ROI ペインタツールモード(ROI ペインタ|ペイントブラシオプション)。
- しきい値で定義された領域をペイントします。Ctrl キーを 押しながらマウスの左キーを押します。領域を削除するには 、Shift キー を押しながらマウスの左キーを押したままにします。
メモ:円形または正方形のペイントブラシのサイズを変更するには、Ctrl キーまたは Shift キーを押しながらマウスホイールをスクロールするだけです。 - Zボリューム全体を通して、目的の構造を描き続けます。
- ROI をメッシュに変換する (エクスポート|メッシュ|へ通常)。
- 右上隅にある [データ プロパティ と 設定] パネルでメッシュ オーバーレイをクリックして、メッシュ オーバーレイをハイライト表示します。
- 適切な数の反復を使用してメッシュをスムーズにする(スムーズ メッシュ|イテレーション)。
注: 比較するすべてのイメージに同じメッシュ スムージング反復値を使用します。 - 基本的なモルフォメトリクス解析のために、画面右側の情報パネルにメッシュ ROI(表面積、体積、フェレット径)の測定値が表示されていることを確認します。追加の分析は、オブジェクト分析モジュールを使用して実行できます。
- メッシュ オブジェクトと、すべてのトモグラム イメージをレンダリングし、3D で視覚化します。組み込みのムービー メーカーを使用してオブジェクトのビデオを生成する (マウスの右ボタンをクリック|ビューアの 個別のフレームを使用してムービーメーカーを表示する([キーを追加])。
注: いくつかの視覚機能は、特定の機能などを強調するために、右側のパネルの視覚効果タブを使用してムービーに適用することができます。 - ムービー メーカーの [アニメーションのエクスポート ] ボタンを使用して、ビデオをエクスポートして表示します。
Representative Results
図2 は、胚、3番目 のインスター幼虫、ファレート成体期の子犬(P7)、およびヨウ素で染色され、市販のベンチトップスキャナーを使用して水中で水和画像化された成人雌のハエの画像を示しています。繊細な組織の保存と染色さえも明らかであり、すべての主要な器官を容易に同定し、形態測定解析および3D視覚化に使用することを可能にする。
通常、標本の投影画像を少なくするスキャンは、より多くの投影画像を取得するスキャンよりも低い解像度を提供し、トレードオフはスキャンに費やす時間です。スキャン時間は計測器やその他のスキャンパラメータによって異なりますが、数百の投影(約3μm画像ピクセルサイズ)を取得するスキャンは、標本あたり約30分かかりますが、数千の投影画像(700 nm-1.25 μm画像ピクセルサイズ)からなるスキャンは8〜16時間かかることがあります。「低速」(何千ものプロジェクション)と「高速」(何百ものプロジェクション)スキャンモードで撮影された同じ成人フライヘッドケースの比較を図3に示します。重要なのは、形態測定解析は「低速」と「高速」スキャン(図3C)40の間で異ならない。したがって、当社のイメージングパイプラインは、高速スキャンを利用して形態測定解析に十分に大きなサンプルサイズを生成し、より高い解像度で形態学的または解剖学的欠陥を視覚化するための低速スキャンを行います。ソフトウェアを使用して(ステップ7)、目的の任意の組織または器官系をセグメント化し、形態測定解析に使用し、ムービーメーカーを使用して3Dで可視化することができます(Movie 1)。
図4 は、X線顕微鏡( 材料表)上でPTAと画像水和(水)または以下の臨界点乾燥(CPD)で染色されたフライ腹部の例を示す。PTAとこのプラットフォームの機能の組み合わせによって与えられる詳細は、これらの画像で容易に明らかであり、精巣内の中腸および精子束の個々の上皮細胞は容易に解決される。CPD画像は、水和サンプルに比べてわずかに増加した解像度を示しているが、繊細な組織(キューティクル付近の脂肪細胞など)の超構造のより良い保存は、水和サンプル(Movie 2)で達成される。
図1:μ-CTのスキャナー設計とサンプル取り付けの概要(A) 商用ベンチトップμ-CTスキャナー。(B) スキャナー内のビュー。X線源(右)は、回転ステージ(黄色の矢印)にあるサンプルを通過するX線を放出します。これらのX線の減衰は、サンプルを通過して検出器に向かって画像コントラストを生成し、X線を光子に変換するシンチレーションスクリーンと標準CCDカメラ(左)で構成されています。(C) 水中での水和画像撮影用に成体フルーツフライを取り付ける。ピペットチップと真鍮ホルダーの間の接続ポイントは、漏れやスキャナーへの潜在的な損傷を防ぐためにパラフィンフィルムで包まれています。ステージチャックもハイライト表示されます。ピペットチップは軸外にわずかに配置され、最終的な再構築においてスキャン時間が長くなり、解像度が低下することに注意してください。(D) 大人の雌のハエの単一の2D投影画像。これらの投影の数百から数千は、回転軸に沿ったスキャン中に取得され、等方性の解像度と正確な3D情報を含む断線図を生成するために再構築に使用されます。スケールバー(C)= 2 mm. P,後部;V、腹側。この図は、ショボーグら40. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ショウジョウバエメラノガスターのライフサイクル段階は、μ-CTで画像化された。ヨウ素で染色されたサンプルを水で水和した画像化。1 つの 2D スライスを示します。(A ) 胃の初期段階を完了した胚(アスタリスク)。(B) 第3のインスター幼虫。(C)変態中のP7は成人に咽頭をする。(D) 成人女性。様々な臓器が強調表示されている:BWM、体壁の筋肉;Br, 脳;Cd、カルディア;Cr, 作物;Dレム、後頭筋;DVM, 側頭腹筋;E-AD、アイアンテナディスク;エム、胚;FB、脂肪体。Fbcs、脂肪体細胞;H, 心臓;Hg、後腸;ラ、ラミネナ;L, 脚;Mg, ミッドグット;OL、 脳光学ローブ;Ov, オビポジター;PC、プパルキューティクル;SG, 唾液腺;VNC、腹側神経コード;W,翼;WD、ウィングディスクスケールバー(A)= 100 μm;(B)-(D) = 500 μm. D, D, ドーサル;A, 前者;L、左。スキャンパラメータ:サンプル距離(mm):(A、D)36.5、(B)48.8、(C)40.3。カメラ距離(mm):(A、D)350、(B、C)285。カメラピクセルサイズ(μm):(A-D) 11.6.画像ピクセルサイズ(μm):(A、D)1.2、(B)1.9、(C)1.7。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: スキャン パラメータと画像解像度は、形態測定解析を変更しません。大人の頭は、(A、A')の「高速」スキャナ設定(数百のプロジェクション)と(B、B)の「遅い」スキャナ設定(数千のプロジェクション)の両方を使用してスキャンしました。脳は黄色で輪郭が描かされています。(C)低速および高速スキャンからの脳の容積測定。強調表示された構造: AL;アンテナローブ;CB, 中央脳;FB、ファン形のボディ;FC、脂肪細胞;ラ、ラミネナ;ロー、ロブラ;LoP、ロブラプレート;私、メデュラ;再、レティナ。 n = 5、 ウェルチのt検定。 ns = 重要ではありません。 スケールバー= 100 μmスキャンパラメータ:サンプル距離(mm):(A)44.4、(B)36.5。カメラ距離(mm):(A)348(B)350。カメラピクセルサイズ(μm): (A-B) 11.6.画像ピクセルサイズ(μm):(A)2.95、(B)1.2。この図は、ショボーグら40. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:X線顕微鏡で撮影したショウジョウバエメラノガスター腹部。腹部は、0.5%PTAで染色され、水和(水)または臨界点乾燥(CPD)に従って画像化された。(A)YZの視点と(A')XZの視点から示される、重篤な点乾燥腹部。(B) YZの視点と(B')XZの観点から示される、水分補給された腹部。様々な器官が強調されている:FC、脂肪細胞;Hg、後腸;Mg, ミドガット;SP、 精子ポンプ;テ、精巣。スケールバー(A)=250 μm. D,ドーサル;A, 前者;L、左。スキャンパラメータ: ソースからサンプル距離 (mm): (A) 6.7, (B) 7.ソースからカメラ距離(mm):(A) 28 (B) 29.5.目的: (A-B) 4X. 画像ピクセルサイズ (μm): (A-B) 0.65.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
映画1:トンボのムービーメーカーを使用して3Dでレンダリングされた3番目のインスター幼虫。 強調表示された器官には、脳(黄色)、アイアンテナル想像力ディスク(赤)、脂肪体(青)、体壁の筋肉(緑色)が含まれます。 この映画をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
動画2:水中で撮影したサンプルの比較、または臨界点乾燥に従うサンプル。0.5%PTAで染色された腹部が示されている。両腹部は同一の画像ピクセルサイズ設定(0.65 μm)でスキャンした。一連の2Dスライスは、後側の表面から始まり、腹部の腹側で終わる「Zスタック」フォーマット(YZ)で示されています。強調表示された臓器: FC, 脂肪細胞;Mg, ミドガット;SP、 精子ポンプ;テ、精巣。スキャンパラメータ:ソースからサンプル距離 (mm): (A) 6.7, (B) 7.ソースからカメラ距離(mm):(A) 28 (B) 29.5.目的: (A-B) 4X. 画像ピクセルサイズ (μm): (A-B) 0.65.この映画をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Discussion
すべての発達段階で無傷のショウジョウバエメラノガスターを視覚化することは、主にこの動物に見られる厚い色素性キューティクルと光顕微鏡の不適合のために、挑戦のままです。磁気共鳴画像法(MRI)、光コヘレンス断層撮影(OCT)、組織クリアリングと組み合わせた超顕微鏡検査などの他の動物イメージング法は、ハエ50、51、52、53、54、μ-CTで成功を収めていますが、この生物の動物イメージング全体に最適な利点が数多くあります。.X線は、色素性キューティクルに容易に浸透し、その小さい波長は、サブミクロンイメージングを可能にする。ラベリングは、広く利用可能な化学物質への最小限の投資を必要とし、専門のベンチスキル13.μ-CTスキャナーも市販されており、コストは光顕微鏡プラットフォームに匹敵する一方で、より幅広い分野(地質学、古生物学、エンジニアリングなど)にとっても魅力的であり、機関での入手可能性からも恩恵を受けることができます。シンクロトロンX線源は、固定および生きている昆虫31、55、56の高解像度μ-CTイメージングにも使用できますが、商用ベンチトップスキャナよりもアクセスが少ないです。
このプロトコルは、フライ成人、子犬、幼虫および細胞化胚のμ-CT画像を得るための効率的な方法を提供する。なお、上記の多くの手順では、イメージング用のサンプルを準備するために代替方法を適用することもできます。他の研究は、昆虫に使用するための異なる固定、標識、および乾燥ステップの詳細な比較を提供しており、この技術を採用することに興味がある人は、各アプローチ1、4、13、29、30、57のメリットを評価することが奨励されている。このプロトコルは比較的簡単ですが、いくつかの役に立つ提案が提示されています。
まず、基礎となる軟部組織が著しく破壊されないような無傷の標本のキューティクルを破壊する場合には注意が必要です。幼虫と初期のプパル段階は、突く前にブインの溶液中で2時間固定を受けることが重要です。これは、組織を硬化させ、器官のアーキテクチャを変更することができるキューティクルの穴からにじみ出るヘモリンパの量を制限します。目的の構造が存在する場合、成人の個々の身体セグメント(頭、胸部および腹部)を分離することができます。例えば、鉗子でそれらを引き離すのではなく、これらのセグメントをきれいにスライスするためにメスを使用することをお勧めします。タイミングに関しては、大人は一般的に16時間しか必要としないです。完全な固定のために、幼虫およびパパル段階は24時間を必要とする。また、ヨウ素またはPTA染色が不均一に見える場合、試料を溶液中に戻して、染色が達成されるまでより長くインキュベートすることができる。最後に、水和サンプルは、室温に温めた後に体腔内の気泡の形成を誘導するように見えるので、4°Cに置かれるべきではありません。
第2に、サンプル取り付けは、機器、ステージタイプ、およびサンプルが水分補給を維持する必要があるか、または臨界点乾燥されているのかによって異なります。水分が補給された場合は、サンプルが漏れないようにし、スキャナーを破壊する可能性があることを確認してください。ピペットチップ内にサンプルを取り付ける場合は、試料がわずかな抵抗に遭遇して動かなくなるまで、鈍い物体で軽く押し込みます。強く押しすぎると、キューティクルの変形や下層構造の欠陥につながる可能性があります。また、サンプルが可能な限り回転軸に近いホルダーに揃えられていることを確認します。任意のウォブルは、視野の大きさのためにスキャン時間を増加させ、再構築後の最終的な断食率の分解能を低下させます。
3つ目は、投影画像を取得するためのスキャナ設定も計測器によって異なります。スキャナーの分解能を最大限に高めるには、X線ビームスポットサイズを可能な限り小さくする必要があります(5~10 μm)。これは、X線の電圧と電流の設定のバランスをとることで、総電力が3〜4Wになるように実現できます。これらの設定とカメラの適切な露光時間により、サンプルによる適切なX線ビーム減衰と最適な画像コントラストを実現できます。物体とX線源の間にアルミニウムまたは銅フィルターを使用することで、最適なX線エネルギー設定を微調整して、画像コントラストを最適に調整したり、高出力源を使用するためにビームを十分に減衰させることができます。画像解像度に関しては、染色タイプ、投影画像の数、画像ピクセルサイズ、カメラ位置、サンプルの動き、スキャナの振動、再構成パラメータなど、さまざまな変数に依存します。既知のサイズマーカーを含むバーパターンファントム(QRM GmbH)は、特定のスキャナとカメラ設定の空間解像度を評価するのに役立ちます。
また、イメージングクリティカルポイントが乾燥または水和サンプルをイメージングするメリットを評価する価値があります。Sombkeら. 2つの方法の比較評価を行い、節足動物30を含むμ-CT用途に対して臨界点乾燥が優れていることがわかった。しかし、水和サンプルの利点は、動物が定量的および形態学的アーティファクトの両方につながる可能性のある化学的および機械的暴露が少なくて済むということです。これはまた、CPDよりも繊細な組織を保存する傾向があります。しかし、水和サンプルは貯蔵寿命がはるかに短く、組織の劣化と画質の低下がその時点で明らかになるため、固定後1ヶ月で画像化する必要があります。また、X線はプラスチックピペットチップと周囲の液体(水または緩衝液)の両方を貫通しなければならないので、水和サンプルの分解能は、重要な点乾燥サンプルよりもわずかに少なくなります。クリティカルポイント乾燥サンプルは、特にグリエールに保管する場合、はるかに長い期間保存することができます。また、翼や脚を昆虫ピンに接着してステージチャックに入れるだけで、X線ビームパスに直接配置できるため、取り付けプロセスが簡素化されます。しかし、これらのサンプルの広範なエタノール脱水は、組織の収縮および繊細な組織アーキテクチャの損失につながる可能性があり、これらの効果を最小限に抑えるためにEtOH濃度を増加させる範囲を実行することが重要である。それにもかかわらず、パラホルムアルデヒド固定およびヨウ素染色を含むあらゆる形態の化学的処理が組織収縮58,59を引き起こす可能性があることを留意すべきである。どちらの方法も生きているハエの「実際の器官サイズ」の測定を提供しませんが、固定、染色、乾燥のステップが両方のサンプルセットで同じように行われている限り、突然変異型動物と野生動物型動物を比較する場合、モルフォメトリック測定は有効です。
結論として、μ-CTはショウジョウバエ33、34、35、36、37、38、39、40、41のための有用な全体の動物イメージングツールを提供する。他の多くの研究は、ハエ1、28、30、31、32、55、56、57の将来の研究を知らせるのに役立つ昆虫分類、生態学、生理学、開発、解剖学の様々な側面を理解するために、この技術の力を示しています.この生物で既に広く使用されている遺伝および光顕微鏡ツールと組み合わせることで、μ-CTは、遺伝子型と表現型の間のより深い理解を可能にする実験パイプライン内に位置付けることができます。
Disclosures
著者は、競合する利益や財政的利益を宣言しません。
Acknowledgments
ナセル・ルサンの支援がなければ、これは不可能でした。H・ダグ・モリス、ダニエル・ドナヒュー、NIHマウスイメージング施設のブレンダ・クランバーグ、マイクロフォトニクスのベン・アッシュに、トレーニングと有益な議論に感謝したいと思います。私はまた、Xradia 520 Versaで腹部サンプルをスキャンしてくれたマンソレ・ノロウジ・ラッド・オブ・ツァイスに感謝します。ローレン・スミス、サマンサ・スミス、レイチェル・ンもスキャンを手伝った。オブジェクトリサーチシステムのマイクマーシュは、トンボの技術サポートを提供しました。また、国立心臓・肺・血液研究所(1K2HL137902-01)とワイオミング大学のスタートアップ・ファンドの支援にも感謝しています。私はまた、彼らの役に立つ提案やコメントのために匿名のレビュー担当者に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% Ethanol | For critical point drying | ||
| Bouin's Solution | Sigma-Aldrich | HT10132 | For animal fixation |
| Critical Point Dryer | Dries samples using the critical point method; multiple options available (Balzers CPD 020 or Leica EMCPD300) | ||
| Dragonfly Software | Object Research Systems | For visualization and segmentation of micro-CT datasets; https://www.theobjects.com/dragonfly/index.html | |
| Heat Block | For microfuge tubes | ||
| Image Analysis Workstation | Should contain sufficient RAM and quality graphics card for 3D rendering | ||
| Iodine Solution (I2KI) | Fisher Scientific | SI86-1 | For staining |
| Microcomputed Tomography Scanner | Bruker | Skyscan 1172 | Cone-beam X-Ray geometry; detector is a Hamamatsu 10 MP camera with 11.54 µm pixel size. |
| Microcomputed Tomography Scanner Software | Bruker | For controling the scanner itself (e.g., performing flat field corrections, X-ray tube power, camera expsoure times, acquisition, etc.) | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-15 | For poking hole in cuticle |
| NRecon Image Reconstruction Software | Bruker | Used to reconstruct cross-section images from 2D projection images taken with cone-beam X-Ray geometry | |
| P10 pipet tips | Genesee Scientific | 24-120 | Sample mounting |
| Phosphate Buffered Saline | Resarch Products International | P32060-4000.0 | Dilute to 1X with water before use |
| Phosphotungstic Acid Hydrate | Sigma-Aldrich | 79690-25g | For staining |
| Pin Holder | Fine Science Tools | 26018-17 | For Minutien Pins |
| Triton X-100 | Research Products International | 111036 | To remove waxy coating from adult flies (as 0.5% PBST) |
| X-Ray Microscope | Zeiss | Xradia 520 Versa | Cone-beam X-Ray geometry featuring Fresnel zone plate objective lenses for Resoluton at a Distance (RaaD™) |
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