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Developmental Biology

使用微计算断层扫描的 果蝇黑色素加斯特 全动物成像

Published: September 2, 2020 doi: 10.3791/61515
Automatic Translation
1
1Department of Molecular Biology, University of Wyoming

Summary

提出了一个协议，允许使用微计算断层扫描在任何发展阶段对完整的 果蝇黑色素加斯特 进行可视化。

Abstract

生物医学成像工具允许在空间尺度上研究分子机制，从基因到生物体。 嗜血杆菌黑色素加斯特是 一种功能良好的模型生物体，它受益于利用光和电子显微镜来了解细胞和组织水平下的基因功能。成像平台的应用，使了解基因功能的水平，在整个完整的生物体将进一步提高我们对遗传机制的知识。在这里，提出了一个完整的动物成像方法，概述了使用微计算断层扫描（μ-CT）在任何发育阶段可视化 果蝇 所需的步骤。μ CT 的优势包括商用仪器和最短的动手时间，无需组织解剖或清除方法即可以微米级分辨率生成准确的 3D 信息。与加速图像分析和三维渲染的软件配对，可以对任何组织或器官系统进行详细的形态分析，以便更好地了解描述性和假设性测试研究的发展机制、生理学和解剖学。通过利用电子显微镜、光显微镜和μ-CT的成像工作流程，可以对基因功能进行彻底的评估，从而进一步促进这种强大的模型生物体的效用。

Introduction

成像方法，允许详细调查物体的内部结构，而不破坏其整体的3D结构已证明广泛有利于许多不同的学科，包括物理，工程，材料科学，考古学，古生物学，地质学，和生物学1，2，3，4，5，6，7，8，9.在这些无损成像方法中，基于 X 射线的平台特别有用，因为与可见光波相比，高能 X 射线能够穿透许多不同的样品类型和材料，且散射最小。因此，计算机断层扫描（CT）、微计算断层扫描（μ-CT）、纳米计算断层扫描（Nano-CT）和同步质显微造已成为X射线成像样品的主要技术，从米到微米不等，毫米到亚微米分辨率能力为10、11、12、13、14。

虽然这些平台的设计、X 射线几何和组件不同，以平衡样本大小和分辨率，但它们都依赖于相同的图像捕获基本原则：通过物体传播并被探测器捕获的 X 射线源。X 射线束穿过物体内不同密度时，差分衰减会生成图像对比度。3D 数据是通过旋转样品或探测器获得的，收集一系列 2D 投影图像，然后使用算法重建成包含分辨率在 x，y，z15中的同位素的 3D 信息的图光。对于许多使用锥形光束 X 射线几何形状投影被成像对象的台式μ-CT 扫描仪，Feldkamp 算法用于以最小的错误16准确重建对象。

给定平台的分辨率主要由系统参数决定，如 X 射线束的大小（点大小）、扫描仪几何形状（从物体到 X 射线源的距离）、探测器上的像素大小以及使用的重建算法。其他因素，如扫描仪振动，X射线束波动，样品运动，材料类型或化学污渍用于可视化对象也可以显著影响空间分辨率下的实际世界成像调理15。

在生物医学应用方面，CT和μ-CT在促进我们对解剖学、生理学、发育和疾病机制的理解方面发挥了关键作用，成为人类患者诊断的工具，也是模型生物体17、18的临床前成像平台。例如，小鼠国际表型联盟，其目标是确定小鼠基因组中每个基因的功能，利用μ-CT作为其表型管道19的一部分。他们的研究结果对于了解参与发育和疾病过程的基因至关重要，同时也作为小鼠解剖和发育的地图集。其他模型生物，如斑马鱼和大鼠，也完全接受使用μ-CT对一些基因突变体17，21，22，23进行整个动物表型。

将整个动物成像与模型生物体相结合的优点是可以充分探索对特定生物过程基因功能的机械理解。这是可能的，因为模型生物体中具有良好的特征基因组和许多遗传工具，能够在不同的发育时间点、特定组织、单个细胞，甚至亚细胞细胞器精确操作基因功能。这些包括二进制表达系统，如UAS/GAL4系统（及其许多衍生物）、CRISPR/Cas9和RNAi 24、25、26。当这些遗传工具与由电子显微镜、光显微镜（荧光和非荧光）以及整个动物成像（如μ-CT）组成的强大成像管道配合使用时，可以彻底评估分子、细胞、组织、器官和整个生物体，从而更深入地了解基因功能。

本协议侧重于在非哺乳动物模型生物中使用μ-CT，其无数的遗传工具帮助阐明了许多分子机制26，27。它采用了以前在非模型昆虫1，28，29，30，31，32的协议，并建立在德罗索菲拉以前的μ-CT研究的基础上，建立一个标准化的协议，用于这种动物33，34，35，36，37，38，39 ，40，41.概述了使用商用扫描仪成功制备苍蝇μ CT 数据集的样品准备、成像和分析的步骤。有了这个协议，飞行的所有发育阶段都可以高分辨率地用于描述性和假设性测试研究，包括分类学、解剖学、发育、生理学和疾病27。该协议也将可用于成像几乎任何昆虫，甚至非活材料，需要化学染色图像对比，以提高可视化μ-CT。

Protocol

1. 样品选择和甲骨文制备

  1. 选择适当的发育时间点（胚胎、幼虫、幼崽或成人）进行成像。
    1. 对于胚胎阶段，葡萄汁阿加板上的笼雌性涂上酵母膏，每30-60分钟收集一次卵子。让这些胚胎在25°C下发育，直到达到适当的阶段。
    2. 对于幼虫阶段，从时间胚胎采集实验中收集第一和第二星。在非拥挤条件下，直接从食物小瓶的一侧挑选游荡的第三 星。
    3. 对于幼虫的计时，收集白色预吐物（倒置螺旋骨），并记录角质层开始变棕色的时间。动物将在甲骨文变黄后，在规定的时间点进行15个阶段的幼崽发育，并可以相应地收集42个。
    4. 在闭合后收集成人作为处女，并允许在食物小瓶中老化一定的时间（例如，5 天完全肠道发育）。
  2. 将 5-50 只动物转移到 1.5 mL 微中心管中，该管内含 1 mL 0.5% 的 Triton X-100，含 1x 磷酸盐缓冲盐水（0.5% PBST）。在台面上定期敲击管子时，在室温下孵育5分钟（RT），以帮助去除疏水涂层，使动物完全被淹没。
    1. 对于胚胎、幼虫和幼崽阶段，将管子放置在 20 年代设置为 100 °C 的热块中，然后在 RT 冷却 5 分钟，从而阻止进一步发育。
      注：动物也可以在液氮37中闪冻。

2. 固定和染色

  1. 去除 0.5% PBST 并添加 1 mL 的 Bouin 解决方案。水龙头管，以确保动物完全淹没。
    警告：布恩的解决方案含有甲醛。如果溢出，可能会对皮肤和眼睛造成急性毒性，如果吞咽，可能会致命。处理时戴手套、安全眼镜和实验室外套。
    注意：还可以使用其他固定技术，例如使用乙醇。其他固定剂的优点在参考1，30中详细描述。
    1. 对于胚胎和成人样本，在 RT 的台面上孵育 16-20 小时。
    2. 对于幼虫和幼虫样本， 在 Rt. 丢弃 Bouin 的溶液时将动物固定 2 小时， 用 1x Pbs 洗 5 分钟三次。转移到包含 1x PBS 的多孔解剖盘中，并使用连接到支架上的一个小细枝末节针戳前肢和后角质层中的一个孔，小心不要破坏任何底层软组织。
    3. 将幼虫和幼虫样品移回微灌注管，并加入 1 mL 的新鲜 Bouin 溶液。在 Rt 的台面上孵育 24 小时。
  2. 取出 Bouin 的解决方案，用 1 mL 的μ CT 洗涤缓冲器（0.1 M Na2HPO4，1.8% 蔗糖）或 1x PBS 三次清洗样品 30 分钟。
  3. 加入1 mL的适当染色溶液，在台面上孵育2-7天。
    注：污渍选择将取决于许多因素，但通常是渗透、孵化时间和分辨率之间的平衡。一般来说，磷磷酸 （PTA） 提供软组织的优越对比度和分辨率，但需要角质层的机械破坏和更长的孵化时间。不同污渍类型的优点在参考1中详细描述。
    1. 对于碘污渍，请使用 1 mL 的 0.1 N I2KI（卢戈尔溶液）。孵化2天。成人甲骨文无需进一步中断。
    2. 对于磷酸 （PTA） 染色，请使用 0.5% （w/v） 溶液中的 1 mL 稀释在水中。通过取出口腔部分或在胸腔或腹部角质层上戳孔，将小细枝末节固定在支架上，从而扰乱成人角质层。如果组织染色出现非同质性，则孵育5-7天或更长时间。
  4. 用 1 mL 超纯水或 1x PBS 清洗 30 分钟。重复洗涤步骤。将动物存放在 RT 的超纯水中或 1x PBS 中长达一个月。
  5. 如果动物在水合时要进行扫描，请直接进入第 4 节。如果需要更长的样品保存时间，则继续执行协议第 3 节。

3. 临界点干燥（可选）

  1. 对样品执行乙醇 （EtOH） 脱水系列：10%、25%、50%、75%、100%、100%。添加 1 mL 的 EtOH 溶液，并在台面上孵育 1 小时，以达到所述顺序中的每浓度。
  2. 最后 100% EtOH 浸泡后，用新鲜的 100% EtOH 代替，让样品在台面上孵育过夜。
  3. 按照制造商的指示对样品进行临界点干燥。
    注：电子显微镜设备通常有一个临界点干燥机（见 材料表），将在EtOH脱水后对样品进行干燥。

4. 样品安装

  1. 对于关键点干燥的样品，热胶样品到昆虫针或其他支架设计，以适应旋转阶段的夹头或将其放置在塑料或玻璃毛细管（+1.0-1.25毫米内径）。
  2. 对于水合样品，将 P10 移液器尖端装满水，并通过热密封或石蜡薄膜固定狭窄端，以防止泄漏。
    注意：请务必将任何连接紧密包裹，以免水泄漏到扫描仪中并造成损坏。
    1. 使用钳子将单个标本转移到移液器尖端。使用长而细长的物体，如沉闷的20G针或其他移液器尖端，小心地将标本向下推，直到它接触管道尖的墙壁，将其保持到位。
    2. 用石蜡薄膜盖住移液器尖端的开口，以防止长时间扫描时水蒸发。
    3. 使用支架安装P10移液器，设计用于安装在旋转舞台的夹头内（图1A-C）。

5. 扫描

  1. 在当天成像之前对机器进行任何必要的校准。
    注：这些将因制造商而异，建议咨询应用专家以确定适当的步骤。有关本协议中使用的设置和软件的具体信息，请参阅 材料表 。通常，校准（如舞台轴对齐）以消除与夹头相对于旋转阶段的离轴相关的任何"摆动"，并执行平场校正，以确保相机上均匀的背景像素强度，为跨多个扫描中可比的最佳分辨率和数据集提供最佳成像条件。
  2. 通过单击软件左上角的"打开门"图标，打开扫描仪门，进入旋转舞台夹头。通过拧紧样品支架底部周围的衣领来连接样品。
    注意：将样品连接到旋转夹头时，使用轻柔的压力来保持扫描仪的对齐。
  3. 在控制扫描仪的软件中设置扫描参数，以获得最佳分辨率和对比度。
    注：这些需要经验确定，因为每个扫描仪的 X 射线源、相机/探测器和几何形状因制造商而异。选择最佳参数的其他信息也可在此处找到43，以及制造商的应用专家。
    1. 打开 X 射线源电源控制 （选项|X射线源）。使用滑块条将 X 射线电压设置为 30-40 kV，电流设置为 100-110 μA，以产生具有 3-4W 功率和小点尺寸的 X 射线束，以增强分辨率。
    2. 使用获取模式对话（选项|采集模式） 将相机曝光时间设置为 500-800 ms。
    3. 使用位于软件底部放大镜图标旁边的滑块条，根据相机设置和位置设置所需的图像像素大小（+700 nm 至 4 μm）。这将确定扫描期间获得的投影图像数量，通过更多的投影，可增强分辨率，但扫描时间更长（见 代表结果）。
    4. 单击并拖动位于软件底部旋转箭头旁边的滑块条，以沿其 360° 旋转路径移动示例。确保样品保持在视野内。
  4. 单击软件顶部的"开始获取"图标（蓝色圆箭头图标）。对话框显示允许设置额外的扫描参数，以及保存扫描的文件和输出文件夹以命名。
    1. 将随机运动设置为 10，平均 4-6 帧。根据使用的摄像机设置自动计算旋转步骤。
  5. 通过单击"获取对话框"上的"确定"开始扫描。显示扫描时间的第二个进度条对话。扫描仪现在将沿旋转路径获取一系列标本的投影图像（图1D），无需进行监控。

6. 重建

  1. 要生成图光，使用投影图像执行图像重建。
    注：虽然几乎所有来自圆锥束几何扫描仪的图像重建都依赖于Feldkamp算法16，但各个参数会因软件实现而异，应根据经验来确定。以下设置，具体用于商业可用的软件（参见材料表），可用作指南。参数，如错位补偿、环形器件还原和光束硬化校正（大多数飞行样品为 0%）以迭代方式执行，以选择最终重建的最佳值。对于希望对重建过程进行更多控制的高级用户，请参阅 MATLAB 界面44。
  2. 使用基于参考扫描45 的换档校正算法（操作|，执行初始图像对齐X/Y 与参考扫描对齐）。
  3. 微调每个重建参数（开始|微调）。 这将激活"参数微调"对话框。
    1. 通过单击"下一步"到"调整后对齐"来微调对齐。将迭代数设置为 5，将参数步骤设置为 1.0。单击"开始"按钮以生成一系列预览。选择正确对齐的图像。
      注：如果出现连续结构（如比质层），则正确对齐的图像不会模糊或显示"剪切"工件。
    2. 点击它旁边，微调环子工件的减少。将迭代数设置为 5，将参数步骤设置为 1.0。单击 "开始" 按钮以生成一系列预览。选择包含最少环数的图像。
  4. 优化上述参数以提供最佳图像后，确保选定的值在"设置"选项卡（"设置"）中正确表示。
  5. 使用直方图调整任何最终亮度和对比值，文件参数（如位深度和类型），并利用仅包含兴趣结构（例如仅限整个苍蝇或头部）的兴趣区域 （ROI） 来减少计算时间 （输出）。
  6. 开始重建（开始|开始）。 如果需要多次重建，将当前图像添加到批次管理器（开始|添加到批次） 和重复步骤 6.2-6.5 的剩余图像。

7. 图像分析

  1. 可视化两个和三个维度的影像，并利用免费软件或商业软件进行进一步的形态分析。
    注：本协议中使用的软件的详细信息可在材料表中找到。其他能够评估μ CT 数据集的软件包包括免费软件选项，如 FIJI 46、Seg3D（www.seg3D.org）47 和 ITK-SNAP48，以及商业软件（例如 AMIRA）。其他应用使用基于机器学习的算法来半自动化细分过程，可以帮助加快工作流程并减少人为偏见（例如 Biomedisa49）。
  2. 将图单文件导入软件（文件|导入图像文件） 。与文件相关的元数据应自动加载到窗口中，但也可以手动设置以匹配图像属性。
  3. 要分割兴趣结构，请单击屏幕左侧的细分选项卡。创建新的兴趣区域 （ROI） （基本|新），给它一个名字，并选择一个合适的颜色。
  4. 定义包含兴趣结构的阈值范围（范围| 使用滑块条定义范围） 。
  5. 选择合适的 2D 或 3D ROI 画家工具模式（ROI 画家|画笔选项）。
  6. 绘制阈值定义的区域;按住 Ctrl 键，同时按住左鼠标键。要移除区域，请按住 移位 键，同时按住左鼠标键。
    注：要更改圆形或方形画笔的大小，只需滚动鼠标轮，同时握住 Ctrl 或 Shift 键。
  7. 在整个 Z 卷中继续绘制兴趣结构。
  8. 将投资回报率转换为网格（出口|到网状|正常）。
  9. 在右上角 的数据属性 和 设置 面板中单击网格覆盖物，突出显示网格覆盖。
  10. 使用适当数量的迭代（平滑网格|迭代）。
    注：对于要比较的所有图像，使用相同的网格平滑迭代值。
  11. 确保网状 ROI（表面积、 体积 和 费雷特直径）的测量显示在屏幕右侧 的信息 面板中，以便进行基本形态分析。其他分析可以使用 对象分析模块执行。
  12. 渲染网状物体和整个图像，并可视化为 3D。使用内置电影制作人生成对象的视频（右鼠标单击|显示电影制作人） 使用观众的单独帧（添加键）。
    注：还可以通过右侧面板中的视觉效果选项卡对电影应用多种视觉增强功能，以突出某些功能等。
  13. 使用电影制作人中的 "出口动画 "按钮导出视频观看。

Representative Results

图2 显示了胚胎、第3 只星内幼虫、在相形虫成人阶段（P7）的幼虫，以及一只成年雌性苍蝇使用商业台式扫描仪在水中沾染碘和水分的图像。精细组织的出色保存甚至染色是显而易见的，使所有主要器官都能够轻易地识别并用于形态分析和三维可视化。

通常，获得标本投影图像较少的扫描比获得更多投影图像的扫描分辨率更低，而权衡是花费在扫描上的时间。虽然扫描时间会因仪器和其他扫描参数而异，但获取几百个投影（+3 μm 图像像素大小）的扫描每个标本大约需要 30 分钟，而由数千张投影图像（700 nm-1.25 μm 图像像素大小）组成的扫描可能需要 8-16 小时。图3显示，在"慢"（数千个投影）和"快速"（数百个投影）扫描模式下拍摄的同一个成人苍蝇头壳的比较。重要的是，形态分析在"慢"和"快"扫描（图3C）40之间没有区别。因此，我们的成像管道利用快速扫描生成足够大的样本量进行形态分析，并缓慢扫描以更高的分辨率可视化任何形态或解剖缺陷。使用该软件（第7步），任何感兴趣的组织或器官系统都可以被分割，并用于形态分析和可视化的3D使用电影制作人（电影1）。

图4 显示了在X射线显微镜（ 材料表）上沾染PTA和成像水合物（水）或跟随临界点干燥（CPD）的苍蝇腹部的例子。PTA 和此平台功能的组合所提供的细节在这些图像中显而易见，因此，睾炎中腹腔和精子束的个体绰号细胞很容易得到解决。虽然CPD图像显示与水合样品相比分辨率略有提高，但通过水合样品（电影2），可以更好地保存细腻组织的超结构（如角质层附近的脂肪细胞）。

Figure 1
图1：μ-CT扫描仪设计及样品安装概述。（A） 商业台式μ-CT扫描仪。（B） 查看扫描仪内部。X 射线源（右）发射 X 射线，穿过位于旋转阶段的样本（黄色箭头）。这些 X 射线的衰减在通过样品并进入探测器时生成图像对比度，探测器包括将 X 射线转换为光子的闪烁屏幕和标准 CCD 相机（左图）。（C） 在水中安装成人果蝇进行水合成像。移液器尖端和黄铜支架之间的连接点用石蜡薄膜包裹，以防止泄漏和扫描仪的潜在损坏。舞台夹头也突出显示。请注意，移液器尖端的位置稍微偏离轴，这导致扫描时间更长，最终重建的分辨率降低。（D） 成年雌蝇的单个二维投影图像：在沿旋转轴进行扫描时，会获得数百到数千个这些投影，用于重建，以生成包含同位素分辨率和准确 3D 信息的图光。秤杆 （C） = 2 毫米 P， 后部;五、文特尔这个数字已经从肖博格等人修改了40。请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图2：所有 果蝇黑色素加斯特 生命周期阶段，由μ-CT成像。样品沾有碘，在水中被水化。显示的是单个 2D 切片。（A） 完成胃造气早期阶段的胚胎（星号）。（B） 第三个星内幼虫。（C） 变质过程中的 P7 相形见成。（D） 成年女性。各种器官突出：BWM，身体壁肌：布尔，大脑;Cd， 卡迪亚;Cr， 作物;DLM，多面体纵向肌肉;DVM，腹腔肌肉;电子广告，眼天间盘;埃姆，胚胎;FB，脂肪体;FBC，脂肪体细胞;H，心脏;Hg， 后古特;拉，拉米纳;L， 腿;毫克，中古特;OL，大脑视叶;Ov， 卵巢;电脑，双层甲骨文;SG，唾液腺;VNC，心室神经线;W， 机翼;Wd， 翼盘。 秤条 （A） = 100μm;（B） -（D） = 500 μm. D. 多萨尔;A、 前：L， 左。扫描参数：源到样本距离（毫米）：（A、D） 36.5、（B） 48.8、（C） 40.3。相机距离来源（毫米）：（A、D） 350、（B、C） 285。相机像素尺寸 （μm）： （A-D） 11.6.像素大小 （μm）： （A， D） 1.2， （B） 1.9， （C） 1.7. 请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图3：扫描参数和图像分辨率不会改变形态分析。使用（A，A）"快速"扫描仪设置（数百个投影）和（B、B）"慢"扫描仪设置（数千个投影）扫描成人头部。大脑用黄色勾勒。（C） 缓慢而快速的扫描所测得的大脑体积。突出结构：AL;天线叶;CB，中央大脑;FB，风扇形状的身体;FCs，脂肪细胞;拉，拉米纳;洛，洛布拉;洛普， 洛布拉板;我，梅杜拉;再，视网膜。n = 5， 韦尔奇的 t 测试。ns = 不重要。秤杆 = 100 μm。扫描参数：样本距离（毫米）：（A） 44.4，（B） 36.5。相机距离来源 （mm）： （A） 348 （B） 350。相机像素尺寸 （μm）： （A-B） 11.6.像素大小 （μm）： （A） 2.95， （B） 1.2.这个数字已经从肖博格等人修改了40。请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 4
图4：由X射线显微镜成像的果 蝇黑色素加斯特 腹部。腹部沾染了 0.5% PTA 和成像水合物（水）或临界点干燥 （CPD）。（A） 临界点干腹部，从 YZ 视角和 （A'） XZ 视角显示。（B） 水合腹部，从 YZ 视角和 （B'） XZ 视角显示。各种器官突出：FC，脂肪细胞：Hg， 后古特;毫克， 米古特;SP，精子泵;泰， 泰斯比例条 （A） = 250 μm. D. 多萨尔;A、 前：L， 左。扫描参数：源到样品距离（毫米）：（A） 6.7，（B） 7。相机距离来源 （mm）： （A） 28 （B） 29.5.目标： （A-B） 4 倍。 图像像素大小 （μm）： （A-B） 0.65。 请单击此处查看此图的较大版本。

电影1：第三个星内幼虫，使用《龙飞》中的电影制作人以3D呈现。 突出的器官包括大脑（黄色）、眼部想象盘（红色）、脂肪体（蓝色）和身体壁部肌肉（绿色）。 请点击这里下载这部电影。

电影2：比较水中成像的样品或跟随临界点干燥。显示沾有 0.5% PTA 的腹部。两个腹部都用相同的图像像素大小设置（0.65 μm）进行扫描。一系列 2D 切片以"Z 堆栈"格式 （YZ） 显示，从腹腔表面开始，到腹部腹腔表面结束。器官突出：FC，脂肪细胞：毫克， 米古特;SP，精子泵;泰， 泰斯扫描参数：源到样品距离（毫米）：（A） 6.7，（B） 7。相机距离来源 （mm）： （A） 28 （B） 29.5.目标： （A-B） 4 倍。 图像像素大小 （μm）： （A-B） 0.65。请点击这里下载这部电影。

Discussion

在所有发育阶段，对完整的果蝇黑色素加斯特进行可视化仍然是一项挑战，这主要是因为光显微镜与这种动物中发现的厚重的色素角质层不相容。而其他完整的动物成像方法，如磁共振成像（MRI）、光学相干断层扫描（OCT）和超显微镜结合组织清除，在苍蝇50、51、52、53、54、μ-CT中得到了成功应用，具有许多优点，使其成为整个动物成像的理想选择.X 射线很容易穿透色素的甲骨文，其小波长允许亚微米成像。标签需要对广泛可用的化学品进行最低限度的投资，并且没有专门的板凳技能。μ-CT扫描仪也市售，其成本可与光显微镜平台相媲美，同时对更广泛的学科（地质学、古生物学、工程学等）更具吸引力，这些学科也可以从该机构的可用性中获益。同步加速器X射线源也可用于固定昆虫和活昆虫31、55、56的高分辨率μ-CT成像，但比商用台式扫描仪更难以获得。

该协议为获取苍蝇成人、幼虫、幼虫和细胞化胚胎的μ-CT图像提供了一种有效的方法。请注意，对于上述许多步骤，还可应用替代方法为成像样品准备样品。其他研究已提供昆虫使用的不同固定、标记和干燥步骤的详细比较，并鼓励有兴趣采用这种技术的人评估每种方法的优点1、4、13、29、30、57。虽然此协议相对简单，但提出了一些有用的建议。

首先，在破坏完整标本的甲状层时应小心谨慎，这样基础软组织就不会受到显著干扰。重要的是，让幼虫和早期幼崽阶段在Bouin的溶液中经过2个小时的固定，然后再戳。这将加强组织，并限制淋巴的数量，将渗出的甲骨文孔，这可以改变器官结构。如果感兴趣的结构位于此处，则成人的个体身体部分（头部、胸部和腹部）可以分开。建议使用手术刀干净地切开这些片段，而不是用钳子将其拉开，这可能会破坏肠道或中枢神经系统的 3D 结构，例如。至于时间安排，成年人一般只需要16小时。完全固定， 而幼虫和幼虫阶段需要 24 小时。此外，如果碘或 PTA 染色看起来不均匀，则样品可以放回溶液中，以孵育更长的时间，直到实现染色。最后，水合样品不应放置在4°C，因为这似乎会在室温升高后诱发体腔内的气泡。

其次，样品安装会因仪器、阶段类型以及样品是否需要保持水分或已干点而异。如果水合，请确保样品不会泄漏，并可能破坏扫描仪。将样品安装在移液器尖端内时，请务必用钝器轻轻推动，直到标本遇到轻微阻力且无法移动。推力过大会导致甲状层变形和潜在的结构缺陷。此外，请确保样品在支架中尽可能靠近旋转轴。任何摆动都会增加扫描时间，因为视野较大，并且会降低重建后最终图光检查的分辨率。

第三，用于获取投影图像的扫描仪设置也会因仪器而异。为了最大限度地提高扫描仪的分辨率，X 射线束点尺寸应尽可能小（5-10 μm）。这可以通过平衡 X 射线电压和电流设置来实现，从而使总功率为 3-4 W。通过这些设置和相机上的适当曝光时间，样品可以实现适当的 X 射线束衰减和最佳图像对比度。物体和 X 射线源之间使用铝或铜滤光片可用于微调最佳 X 射线能量设置，以实现最佳图像对比度，或使光束衰减到足以使用更高功率的源。至于图像分辨率，这将取决于许多不同的变量，包括污渍类型、投影图像数量、图像像素大小、相机位置、示例移动、扫描仪振动和重建参数。包含已知尺寸标记的条形模式幻象 （QRM GmbH） 可以帮助评估给定扫描仪和相机设置的空间分辨率。

也值得评估成像临界点干燥或水合样品的优点。Sombke等人对两种方法进行了比较评估，发现关键点干燥在涉及节肢动物30的μ CT应用方面具有优越性。然而，水合样品的好处是，动物受到较少的化学和机械暴露，这可能导致定量和形态文物。这也往往比CPD更好地保存细腻的组织。然而，水合样品的保质期要短得多，并且应在固定后不迟于一个月进行成像，因为此时组织退化和图像质量下降变得明显。此外，水合样品的分辨率将略低于临界点干燥样品，因为 X 射线还必须穿透塑料移液器尖端和周围的液体（水或缓冲器）。临界点干燥样品可以保存更长的时间，尤其是当保存在干燥石上时。它们也可以直接放置在X射线束路径，只需将翅膀或腿粘在昆虫针上，并将其放置在舞台夹头中，简化安装过程。然而，这些样品的广泛乙醇脱水会导致组织收缩和微妙的组织结构的损失，这就是为什么执行一系列增加的EtOH浓度，以尽量减少这些影响是很重要的。然而，应该指出，所有形式的化学处理，包括副甲醛固定，甚至碘染色都可能导致组织收缩58，59。虽然这两种方法都不会提供活飞中"实际器官大小"的测量，但形态测量在比较突变动物和野生类型动物时仍然有效，只要两组样品的固定、染色和干燥步骤相同，最好是平行进行的。

最后，μ-CT为德罗索菲拉33、34、35、36、37、38、39、40、41提供了有用的全动物成像工具。许多其他研究已经展示了这项技术的力量，了解昆虫分类学，生态学，生理学，发育和解剖学的各个方面，可以帮助通知未来的研究苍蝇1，28，30，31，32，55，56，57 .结合已经广泛应用于这种生物体的遗传和光显微镜工具，μ-CT可以将自己定位在实验管道中，从而在基因型和表型之间有更深入的理解。

Disclosures

提交人声明没有竞争或经济利益。

Acknowledgments

没有纳赛尔·鲁桑的支持，这一切都是不可能的。我要感谢美国国家卫生研究院鼠标成像设施的道格·莫里斯、丹妮尔·多纳休和布伦达·克伦伯格以及微光子的本·阿奇的培训和有益的讨论。我还感谢蔡司的曼苏雷 ·诺鲁齐 · 拉德扫描了 Xradia 520 Versa 上的腹部样本。劳伦·史密斯、萨曼莎·史密斯和瑞秋·吴也帮助扫描。物体研究系统的迈克·马什为萤火把提供了技术支持。我还感谢来自国家心肺和血液研究所（1K22HL137902-01）和怀俄明大学的启动基金的支持。我还要感谢匿名评论者提出的有益建议和意见。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100% Ethanol For critical point drying
Bouin's Solution Sigma-Aldrich HT10132 For animal fixation
Critical Point Dryer Dries samples using the critical point method; multiple options available (Balzers CPD 020 or Leica EMCPD300)
Dragonfly Software Object Research Systems For visualization and segmentation of micro-CT datasets; https://www.theobjects.com/dragonfly/index.html
Heat Block For microfuge tubes
Image Analysis Workstation Should contain sufficient RAM and quality graphics card for 3D rendering
Iodine Solution (I2KI) Fisher Scientific SI86-1 For staining
Microcomputed Tomography Scanner Bruker Skyscan 1172 Cone-beam X-Ray geometry; detector is a Hamamatsu 10 MP camera with 11.54 µm pixel size.
Microcomputed Tomography Scanner Software Bruker For controling the scanner itself (e.g., performing flat field corrections, X-ray tube power, camera expsoure times, acquisition, etc.)
Minutien Pins Fine Science Tools 26002-15 For poking hole in cuticle
NRecon Image Reconstruction Software Bruker Used to reconstruct cross-section images from 2D projection images taken with cone-beam X-Ray geometry
P10 pipet tips Genesee Scientific 24-120 Sample mounting
Phosphate Buffered Saline Resarch Products International P32060-4000.0 Dilute to 1X with water before use
Phosphotungstic Acid Hydrate Sigma-Aldrich 79690-25g For staining
Pin Holder Fine Science Tools 26018-17 For Minutien Pins
Triton X-100 Research Products International 111036 To remove waxy coating from adult flies (as 0.5% PBST)
X-Ray Microscope Zeiss Xradia 520 Versa Cone-beam X-Ray geometry featuring Fresnel zone plate objective lenses for Resoluton at a Distance (RaaD™)

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发育生物学，第163期， 果蝇黑色素瘤，微计算断层扫描，临床前成像，图像分析，人类疾病建模，表型
使用微计算断层扫描的 <em>果蝇黑色素加斯特</em> 全动物成像
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Schoborg, T. A. Whole Animal Imaging … More

Schoborg, T. A. Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography. J. Vis. Exp. (163), e61515, doi:10.3791/61515 (2020).

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