Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

التصوير الحيواني كله من الميلانوغاستر Drosophila باستخدام التصوير المقطعي microcomputed

Published: September 2, 2020 doi: 10.3791/61515
Automatic Translation
1
1Department of Molecular Biology, University of Wyoming

Summary

يتم تقديم بروتوكول يسمح بتصور Drosophila melanogaster سليمة في أي مرحلة من مراحل التطوير باستخدام التصوير المقطعي microcomputed.

Abstract

تسمح أدوات التصوير الطبي الحيوي بالتحقيق في الآليات الجزيئية عبر المقاييس المكانية ، من الجينات إلى الكائنات الحية. وقد استفادت Drosophila melanogaster ، وهو كائن نموذجي يتميز بشكل جيد ، من استخدام المجهر الضوئي والإلكترون لفهم وظيفة الجينات على مستوى الخلايا والأنسجة. إن تطبيق منصات التصوير التي تسمح بفهم وظيفة الجينات على مستوى الكائن الحي السليم بأكمله من شأنه أن يزيد من تعزيز معرفتنا بالآليات الجينية. هنا يتم تقديم طريقة تصوير حيواني كاملة توضح الخطوات اللازمة لتصور Drosophila في أي مرحلة تنموية باستخدام التصوير المقطعي المجهري (μ CT). وتشمل مزايا μ-CT الأجهزة المتاحة تجاريا والحد الأدنى من الوقت العملي لإنتاج معلومات دقيقة ثلاثية الأبعاد بدقة على مستوى ميكرون دون الحاجة إلى طرق تشريح الأنسجة أو تطهيرها. يمكن إقرانها مع البرامج التي تسرع تحليل الصور وتقديم 3D ، وتحليل مورفوميتري مفصلة من أي نظام الأنسجة أو الجهاز لفهم أفضل لآليات التنمية وعلم وظائف الأعضاء ، والتشريح لكل من الوصفية والفرضية اختبار الدراسات. من خلال استخدام سير عمل التصوير الذي يتضمن استخدام المجهر الإلكتروني ، المجهر الخفيف ، μ CT ، يمكن إجراء تقييم شامل لوظيفة الجينات ، وبالتالي تعزيز فائدة هذا الكائن الحي النموذجي القوي.

Introduction

أثبتت طرق التصوير التي تسمح بإجراء تحقيق مفصل في الهياكل الداخلية للجسم دون تدمير هندسته المعمارية ثلاثية الأبعاد بشكل عام أنها مفيدة على نطاق واسع لعدد من التخصصات المختلفة ، بما في ذلك الفيزياء والهندسة وعلوم المواد وعلم الآثار وعلم الحفريات والجيولوجيا والبيولوجيا1و2و 3 و4و5و6و7و9 . من بين طرق التصوير غير التدميرية هذه ، تعد المنصات القائمة على الأشعة السينية مفيدة بشكل خاص نظرا لقدرة الأشعة السينية عالية الطاقة على اختراق العديد من أنواع العينات والمواد المختلفة مع الحد الأدنى من التشتت مقارنة بموجات الضوء المرئية. التصوير المقطعي المحوسب (CT) ، والتصوير المقطعي microcomputed (μ CT) ، والتصوير المقطعي النانوي (نانو CT) ، والتصوير الدقيق السنكروترون ، لذلك ، ظهرت كتقنيات أساسية للتصوير بالأشعة السينية على أساس عينات تتراوح من متر إلى ميكرون ، مع قدرات دقة ملليمتر إلى دون ميكرون10،11،12،13،14.

في حين تختلف هذه المنصات في تصميمها وهندسة الأشعة السينية والمكونات من أجل تحقيق التوازن بين حجم العينة والدقة ، إلا أنها تعتمد جميعا على نفس المبدأ الأساسي لالتقاط الصور: مصدر للأشعة السينية التي تنتقل عبر الجسم ويتم التقاطها بواسطة كاشف. التوهين التفاضلي لشعاع الأشعة السينية أثناء مروره عبر كثافات مختلفة داخل الجسم يولد تباين الصورة. يتم الحصول على البيانات ثلاثية الأبعاد عن طريق تدوير العينة أو الكاشف ، وجمع سلسلة من صور الإسقاط 2D التي يتم إعادة بنائها بعد ذلك باستخدام الخوارزميات في مخططات تحتوي على معلومات ثلاثية الأبعاد تكون دقتها متساوية في x،y،z15. بالنسبة للعديد من الماسحات الضوئية μ CT التي تستخدم هندسة الأشعة السينية ذات الحزمة المخروطية لإسقاط الأشعة السينية في الكائن الذي يتم تصويره ، يتم استخدام خوارزمية Feldkamp لإعادة بناء الكائن بدقة مع الحد الأدنى من الأخطاء16.

يتم تحديد دقة منصة معينة في المقام الأول من خلال معلمات النظام مثل حجم شعاع الأشعة السينية (حجم البقعة) ، وهندسة الماسح الضوئي (المسافة من الكائن إلى مصدر الأشعة السينية) ، وحجم البكسل على الكاشف ، وخوارزميات إعادة البناء المستخدمة. عوامل إضافية، مثل اهتزازات الماسح الضوئي، وتقلبات شعاع الأشعة السينية، وحركة العينة، ونوع المادة أو وصمة عار الكيميائية المستخدمة لتصور الكائن يمكن أن تؤثر أيضا بشكل كبير على القرار المكاني تحت condidtions التصوير في العالم الحقيقي15.

بالنسبة للتطبيقات الطبية الحيوية ، لعبت CT و μ CT دورا رئيسيا في تعزيز فهمنا لآليات التشريح وعلم وظائف الأعضاء والتنمية والمرض ، حيث كانت بمثابة أداة لتشخيص المريض البشري كمنصة تصوير ما قبل السريرية للكائنات الحية النموذجية17،18. على سبيل المثال ، فإن اتحاد ماوس الدولي للفينوتيبينج ، الذي يهدف إلى تحديد وظيفة كل جين في جينوم الماوس ، يستخدم μ CT كجزء من خط أنابيب phenotyping19. وكانت نتائجها حاسمة لفهم الجينات المشاركة في عمليات التنمية والمرض، في حين تعمل أيضا كأطلس لتشريح الفئران والتنمية20. الكائنات الحية نموذج آخر، مثل حمار وحشي والجرذان، كما احتضنت تماما استخدام μ CT لأداء phenotyping الحيوان كله من عدد من المسوخ الجينات17،21،22،23.

ميزة الجمع بين التصوير الحيواني كله مع الكائنات الحية النموذجية هو أن الفهم الآلي لوظيفة الجينات لعملية بيولوجية معينة يمكن استكشافها بالكامل. وهذا ممكن بسبب الجينوم المميز والعديد من الأدوات الجينية المتاحة في الكائنات الحية النموذجية التي تسمح بالتلاعب الدقيق بوظيفة الجينات في نقاط زمنية تنموية متميزة، وأنسجة محددة، وخلايا فردية، وحتى العضيات دون الخلوية. وتشمل هذه أنظمة التعبير الثنائي مثل نظام UAS /GAL4 (ومشتقاته العديدة) ، CRISPR / Cas9 ، وRNAi24،25،26. عندما يتم استخدام هذه الأدوات الوراثية جنبا إلى جنب مع خط أنابيب التصوير قوية تتكون من المجهر الإلكتروني، المجهر الخفيف (الفلورسنت وغير الفلورية)، والتصوير الحيواني كله مثل μ CT، يمكن تحقيق تقييم شامل للجزيئات والخلايا والأنسجة والأعضاء، والكائن الحي بأكمله، مما يسمح لفهم أعمق بكثير من وظيفة الجينات.

هذا البروتوكول يركز على استخدام μ CT في الكائن الحي نموذج غير الثدييات Drosophila melanogaster، الذي ساعد عدد لا يحصى من الأدوات الوراثية توضيح العديد من الآليات الجزيئية26،27. تم تبنيه من البروتوكولات السابقة في الحشرات غير النموذجية1،28،29،30،31،32، ويبني من دراسات μ CT السابقة في Drosophila لوضع بروتوكول موحد لاستخدامه في هذا الحيوان33،34،35،36،37،38،39 ,40,41. وترد الخطوط العريضة للخطوات اللازمة لنجاح إعداد العينات وتصويرها وتحليلها لمجموعات بيانات μ-CT التي تستخدم الماسحات الضوئية المتاحة تجاريا. مع هذا البروتوكول ، يمكن تصور جميع مراحل النمو من ذبابة في قرار عالية لكل من الوصفية والفرضية اختبار الدراسات ، بما في ذلك التصنيف والتشريح والتنمية وعلم وظائف الأعضاء ، والمرض27. سيكون هذا البروتوكول مفيدا أيضا لتصوير أي حشرة تقريبا وحتى المواد غير الحية التي تتطلب تلطيخا كيميائيا لتباين الصورة لتعزيز التصور من خلال μ CT.

Protocol

1. اختيار عينة وإعداد لطيف

  1. اختر نقطة زمنية مناسبة للنمو (الجنين أو اليرقة أو الجراء أو البالغين) للتصوير.
    1. بالنسبة للمراحل الجنينية ، تلطخ الإناث القفصيات على لوحات أجار عصير العنب مع معجون الخميرة وجمع البيض كل 30-60 دقيقة. اترك هذه الأجنة لتتطور عند 25 درجة مئوية حتى يتم الوصول إلى المرحلة المناسبة.
    2. بالنسبة لمراحل اليرقات، اجمع النجوم الأولى والثانية من تجارب جمع الأجنة المي توقيتها. اختيار تجول مباشرة 3نجوم rd من جانب قارورة الطعام في ظل ظروف غير الازدحام.
    3. لتوقيت pupal، وجمع الأبيض قبل pupae (spiracles مقلوب) وتدوين علما من الوقت عندما يبدأ البشرة إلى اللون البني. سوف تتقدم الحيوانات من خلال 15 مرحلة من مراحل تطور الجرو في نقاط زمنية محددة بعد براوننج البشرة ويمكن جمعها وفقا لذلك42.
    4. جمع البالغين والعذارى بعد eclosion والسماح للشيخوخة في قارورة الطعام لفترة زمنية مطلوبة (على سبيل المثال، 5 أيام لتطوير القناة الهضمية كاملة).
  2. نقل 5-50 الحيوانات إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق 1.5 مل تحتوي على 1 مل من 0.5٪ تريتون X-100 في 1x فوسفات عازلة المالحة (0.5٪ PBST). أثناء النقر على الأنبوب بشكل دوري على سطح المقعد ، احتضن لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT) للمساعدة في إزالة الطلاء الكاره للماء والسماح للحيوانات بأن تصبح مغمورة بالكامل.
    1. بالنسبة للمراحل الجنينية واليرقات والجراء ، قم بضبط المزيد من التطوير عن طريق وضع الأنبوب في كتلة حرارية تم تعيينها إلى 100 درجة مئوية لمدة 20 درجة مئوية تليها التبريد في RT لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: يمكن أيضا أن تكون الحيوانات فلاش المجمدة في النيتروجين السائل37.

2. التثبيت وتلطيخ

  1. إزالة 0.5٪ PBST وإضافة 1 مل من الحل بوين. أنبوب الصنبور لضمان غمر الحيوانات بالكامل.
    تنبيه: يحتوي حل بوين على الفورمالديهايد. قد يسبب سمية حادة للبشرة والعينين إذا انسكب ويمكن أن يكون قاتلا إذا ابتلع. ارتداء قفازات ونظارات السلامة ومعطف المختبر عند التعامل معها.
    ملاحظة: يمكن أيضا استخدام تقنيات تثبيت إضافية، مثل استخدام الإيثانول. ويرد وصف مزايا المثبتات الأخرى بالتفصيل في المرجع1،30.
    1. لعينات الأجنة والبالغين، احتضان على مقاعد البدلاء لمدة 16-20 ساعة في RT.
    2. لعينات اليرقات والجراء، قم بإصلاح الحيوانات لمدة 2 ساعة في محلول RT. Discard Bouin واغسلها باستخدام برنامج تلفزيوني 1x لمدة 5 دقائق ثلاث مرات. نقل إلى طبق تشريح متعددة الآبار التي تحتوي على برنامج تلفزيوني 1x واستخدام دبوس minutien صغيرة تعلق على حامل لكزة حفرة في الجلد الأمامي والخلفي الحرص على عدم تعطيل أي الأنسجة الرخوة الكامنة.
    3. نقل عينات اليرقات والجراء مرة أخرى إلى أنبوب الميكروفون وإضافة 1 مل من محلول بوين الطازج. احتضان على مقاعد البدلاء لمدة 24 ساعة في RT.
  2. إزالة الحل بوين وغسل عينة لمدة 30 دقيقة مع 1 مل من μ CT غسل العازلة (0.1 M Na2HPO4، 1.8٪ السكروز) أو 1x PBS ثلاث مرات.
  3. إضافة 1 مل من محلول تلطيخ المناسبة واحتضان على benchtop لمدة 2-7 أيام.
    ملاحظة: يعتمد اختيار البقعة على عوامل كثيرة، ولكنه عموما توازن بين الاختراق ووقت الحضانة والدقة. بشكل عام ، يوفر حمض فوسفوتونغستيك (PTA) تباينا فائقا وحلا للأنسجة الرخوة ولكنه يتطلب اضطرابا ميكانيكيا في السفاح وأوقات حضانة أطول. ويرد وصف مزايا أنواع البقع المختلفة بالتفصيل في المرجع1.
    1. لتلطيخ اليود، استخدم 1 مل من 0.1 N I2KI (محلول Lugol). حضانة لمدة 2 أيام. لا مزيد من تعطيل كندل الكبار ضروري.
    2. لتلطيخ حمض فوسفوتونجستيك (PTA)، استخدم 1 مل من محلول 0.5٪ (ث/v) المخفف في الماء. تعطيل كتل الكبار، إما عن طريق إزالة أفواه أو بدس ثقوب في الصدر أو كتل البطن مع دبوس minutien صغيرة تعلق على حامل. احتضان لمدة 5-7 أيام، أو أطول إذا تلطيخ الأنسجة يبدو غير متجانسة.
  4. اغسله 1 مل من الماء فائق النبور أو 1x PBS لمدة 30 دقيقة. كرر خطوة الغسيل. تخزين الحيوانات في RT في المياه فائقة الشراء أو برنامج تلفزيوني 1x لمدة تصل إلى شهر واحد.
  5. إذا كان للحيوانات أن تفحص وهي رطبة، انتقل مباشرة إلى القسم 4. إذا لزم الحفاظ على العينة لفترة أطول، انتقل إلى القسم 3 من البروتوكول.

3. تجفيف نقطة حرجة (اختياري)

  1. إجراء سلسلة الجفاف الإيثانول (EtOH) على العينة: 10٪، 25٪، 50٪، 75٪، 100٪، 100٪. إضافة 1 مل من محلول EtOH واحتضان على benchtop لمدة 1 ساعة لكل تركيز في الترتيب المذكور.
  2. بعد النهائي 100٪ EtOH نقع، واستبدال مع EtOH 100٪ جديدة والسماح عينة حضانة على مقاعد البدلاء بين عشية وضحاها.
  3. إجراء تجفيف نقطة حرجة من العينات وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    ملاحظة: مرافق المجهر الإلكتروني عموما آلة تجفيف نقطة حرجة (انظر جدول المواد) منشأنها أن تؤدي تجفيف العينة بعد الجفاف EtOH.

4. تركيب عينة

  1. لعينات المجففة نقطة حرجة، عينات الغراء الساخن لدبوس الحشرات أو غيرها من حامل مصممة لتناسب داخل تشاك من المرحلة الدوارة أو وضعه في أنبوب شعري من البلاستيك أو الزجاج (~ 1.0-1.25 مم القطر الداخلي).
  2. للحصول على عينات رطبة، قم بملء طرف ماصة P10 بالماء وتأمين النهاية الضيقة إما عن طريق ختم الحرارة أو فيلم البارافين لمنع التسرب.
    تنبيه: تأكد من التفاف أي اتصالات بإحكام بحيث لا يتسرب الماء إلى الماسح الضوئي ويسبب تلفا.
    1. نقل عينة واحدة إلى طرف ماصة باستخدام ملقط. باستخدام كائن طويل ونحيل ، مثل إبرة 20 G مملة أو طرف ماصة آخر ، ادفع العينة بعناية إلى أسفل الطرف حتى تتصل فقط بجدار طرف الماصة لعقده في مكانه.
    2. تغطية افتتاح تلميح ماصة مع فيلم البارافين لمنع تبخر الماء خلال عمليات المسح الطويل.
    3. جبل ماصة P10 باستخدام حامل مصممة لتناسب داخل تشاك من المرحلة الدورية (الشكل 1A-C).

5. المسح الضوئي

  1. إجراء أي معايرة ضرورية للجهاز قبل التصوير لهذا اليوم.
    ملاحظة: هذه تختلف حسب الشركة المصنعة ومن المستحسن استشارة أخصائي تطبيق لتحديد الخطوات المناسبة. يرجى الاطلاع على جدول المواد للحصول على معلومات محددة حول الإعداد والبرامج المستخدمة في هذا البروتوكول. بشكل عام، توفر المعايرة مثل محاذاة محور المرحلة لإزالة أي "تمايل" مرتبط بتشاك خارج المحور بالنسبة للمرحلة الدوارة وإجراء تصحيحات في الحقل المسطح لضمان أن كثافة بكسل الخلفية الموحدة على الكاميرا توفر ظروف تصوير مثالية للحصول على أفضل دقة ومجموعات بيانات قابلة للمقارنة عبر عمليات مسح متعددة.
  2. فتح باب الماسح الضوئي للوصول إلى تشاك المرحلة الدورية عن طريق النقر على'الباب المفتوح'أيقونة في الزاوية اليسرى العليا من البرنامج. إرفاق العينة عن طريق تشديد طوق حول قاعدة حامل العينة.
    ملاحظة: استخدم الضغط اللطيف عند إرفاق العينة بتشاك الدوار للحفاظ على محاذاة الماسح الضوئي.
  3. تعيين معلمات المسح الضوئي في البرنامج الذي يتحكم في الماسح الضوئي للحصول على الدقة المثلى والتباين.
    ملاحظة: هذه سوف تحتاج إلى تحديد تجريبيا كمصدر الأشعة السينية، وكاميرا / كاشف، والهندسة من كل ماسح ضوئي سوف تختلف حسب الشركة المصنعة. ويمكن أيضا الحصول على معلومات إضافية لاختيار أفضل المعلمات هنا43، وكذلك من المتخصص في تطبيق الشركة المصنعة.
    1. فتح التحكم في مصدر الأشعة السينية (خيارات | مصدر الأشعة السينية). استخدم أشرطة شريط التمرير لضبط الجهد بالأشعة السينية إلى 30-40 كيلو فولت والتيارات إلى 100-110 ميكرومتر لإنتاج شعاع الأشعة السينية مع 3-4W من الطاقة وحجم بقعة صغيرة لتعزيز القرار.
    2. استخدام مربع الحوار أوضاع الاستحواذ (خيارات | أوضاع الاستحواذ) لتعيين وقت التعرض للكاميرا إلى 500-800 مللي ثانية.
    3. استخدم شريط شريط التمرير الموجود بجوار أيقونة العدسة المكبرة في الجزء السفلي من البرنامج لتعيين حجم بكسل الصورة المطلوب (~ 700 نانومتر إلى 4 ميكرومتر)، اعتمادا على إعدادات الكاميرا وموضعها. وهذا يحدد عدد صور الإسقاط التي يتم الحصول عليها أثناء المسح الضوئي، مع المزيد من التوقعات التي تؤدي إلى الدقة المحسنة ولكن مرات المسح الأطول (انظر النتائج التمثيلية).
    4. انقر واسحب شريط التمرير الموجود بجوار السهم الدوار في الجزء السفلي من البرنامج لتحريك العينة على طول مسار الدوران 360 درجة. تأكد من بقاء العينة في حقل العرض.
  4. انقر على رمز'بدء اكتساب'(رمز سهم الدائرة الزرقاء) في الجزء العلوي من البرنامج. يظهر مربع حوار يسمح بتعيين معلمات مسح ضوئي إضافية، والمجلد الملف والمخرجات حيث سيتم حفظ المسح الضوئي ليتم تسميته.
    1. تعيين حركة عشوائية إلى 10 ومتوسط 4-6 الإطارات. يتم حساب خطوة الدوران تلقائيا وفقا لإعدادات الكاميرا المستخدمة.
  5. ابدأ المسح الضوئي بالنقر فوق 'موافق' في مربع الحوار Acquisition . يظهر مربع حوار شريط التقدم الثاني الذي يظهر وقت المسح الضوئي. الماسح الضوئي الآن الحصول على سلسلة من الصور الإسقاط(الشكل 1D)للعينة على طول مسار التناوب وليس من الضروري رصدها.

6. إعادة الإعمار

  1. لإنشاء مخططات الكائنات المبرمجة، قم بإجراء إعادة بناء الصورة باستخدام صور الإسقاط.
    ملاحظة: في حين أن جميع تقريبا إعادة بناء الصور من الماسحات الضوئية مخروط شعاع الهندسة تعتمد على خوارزمية Feldkamp16، المعلمات الفردية سوف تختلف تبعا لتنفيذ البرنامج وينبغي أن تحدد تجريبيا. يمكن استخدام الإعدادات التالية، المحددة لبرنامج متاح تجاريا (انظر جدول المواد)كدليل. معلمات مثل تعويض اختلال، والحد من القطع الأثرية حلقة، وتصحيح تصلب شعاع (0٪ بالنسبة لمعظم عينات ذبابة) يتم تنفيذها بطريقة متكررة لاختيار أفضل القيم لإعادة الإعمار النهائي. للمستخدمين المتقدمين الذين يرغبون في مزيد من السيطرة على عملية إعادة الإعمار، انظر واجهة MATLAB هنا44.
  2. تنفيذ محاذاة الصورة الأولية باستخدام خوارزمية تصحيح التحول استنادا إلى مسح المرجع45 (الإجراءات | محاذاة X/Y مع مسح مرجعي).
  3. ضبط كل معلمة إعادة الإعمار (بدء | ضبط دقيق). يؤدي هذا إلى تنشيط مربع حوار "ضبط المعلمة".
    1. ضبط المحاذاة بالنقر فوق 'التالي' إلى 'بعد المحاذاة'. تعيين عدد التكرارات إلى خمسة و خطوة المعلمة إلى 1.0. انقر فوق الزر ابدأ لإنشاء سلسلة من المعاينات. حدد الصورة التي تمت محاذاتها بشكل صحيح.
      ملاحظة: لن تكون الصورة المتوائمة بشكل صحيح ضبابية أو تعرض قطعا أثرية "قص" تظهر فيها بنية مستمرة (مثل القطع) منقسمة.
    2. ضبط الحد من القطع الأثرية حلقة عن طريق النقر بجانبه. تعيين عدد التكرارات إلى خمسة و خطوة المعلمة إلى 1.0. انقر فوق الزر ابدأ لإنشاء سلسلة من المعاينات. حدد الصورة التي تحتوي على أقل عدد من الحلقات.
  4. بمجرد تحسين المعلمات أعلاه لإعطاء أفضل صورة، تأكد من تمثيل القيم المحددة بشكل صحيح في علامة التبويب إعدادات(إعدادات).
  5. ضبط أي سطوع النهائي وقيم التباين باستخدام المدرج التكراري، والمعلمات ملف مثل عمق بت ونوع، والاستفادة من منطقة الاهتمام (ROI) التي تشمل فقط هياكل الفائدة (على سبيل المثال، يطير كله أو الرأس فقط) للحد من الوقت الحسابي(الإخراج).
  6. بدء إعادة الإعمار (بدء | ابدأ). إذا كانت هناك حاجة إلى عمليات إعادة بناء متعددة، أضف الصورة الحالية إلى مدير الدفعة (ابدأ | إضافة إلى الدفعة) وكرر الخطوات 6.2-6.5 للصور المتبقية.

7. تحليل الصور

  1. تصور tomograms في اثنين وثلاثة أبعاد وإجراء مزيد من التحليل morphometric مع مجانية أو البرمجيات التجارية.
    ملاحظة: تفاصيل البرنامج المستخدم في هذا البروتوكول متوفرة في جدول المواد. حزم البرامج الأخرى القادرة على تقييم مجموعات البيانات μ CT تشمل خيارات مجانية مثل فيجي46، Seg3D (www.seg3D.org)47، و ITK-SNAP48، بالإضافة إلى البرامج التجارية (على سبيل المثال ، AMIRA). التطبيقات الأخرى التي تستخدم الخوارزميات القائمة على التعلم الآلي لشبه أتمتة عملية التقسيم يمكن أن تساعد في تسريع سير العمل والحد من التحيز البشري (على سبيل المثال، Biomedisa49).
  2. استيراد ملف مخطط الكائنات المبرمجة إلى البرنامج (ملف | استيراد ملفات الصور). يجب تحميل بيانات التعريف المقترنة بالملف تلقائيا في الإطار ولكن يمكن أيضا تعيينها يدويا لمطابقة خصائص الصورة.
  3. لتقسيم بنية ذات أهمية، انقر على علامة التبويب الجزء على الجانب الأيسر من الشاشة. إنشاء منطقة اهتمام جديدة (ROI) (| الأساسية جديد)، وإعطائها اسما وتحديد اللون المناسب.
  4. تحديد نطاق العتبة الذي يشمل بنية الاهتمام (النطاق | تحديد النطاق) باستخدام شريط التمرير.
  5. حدد وضع أداة رسام عائد الاستثمار 2D أو 3D المناسب (ROI Painter | خيار فرشاة الطلاء).
  6. لرسم منطقة محددة من خلال العتبة؛ اضغط مع الاستمرار على مفتاح Ctrl أثناء الضغط على مفتاح الماوس الأيسر. لإزالة منطقة، اضغط مع الاستمرار على مفتاح Shift أثناء الضغط على مفتاح الماوس الأيسر.
    ملاحظة: لتغيير حجم فرشاة الطلاء الدائرية أو المربعة، ما عليك سوى تمرير عجلة الماوس أثناء الضغط على مفاتيح Ctrl أو Shift.
  7. الاستمرار في رسم هيكل الفائدة في جميع أنحاء كامل Z-حجم.
  8. تحويل عائد الاستثمار إلى شبكة(تصدير | إلى | شبكة عادي).
  9. قم بتمييز تراكب الشبكة بالنقر عليه في لوحة خصائص البيانات والإعدادات في الزاوية العلوية اليمنى.
  10. تجانس الشبكة باستخدام عدد مناسب من التكرارات (شبكة متجانسة | التكرارات).
    ملاحظة: استخدم نفس شبكة تنعيم قيمة التكرار لكافة الصور التي سيتم مقارنتها.
  11. تأكد من عرض قياسات عائد الاستثمار الشبكي(المساحة السطحية والحجم وقطر فيريت)في لوحة المعلومات على الجانب الأيمن من الشاشة للتحليل المورفوميتري الأساسي. يمكن إجراء تحليل إضافي باستخدام الوحدة النمطية لتحليل الكائنات.
  12. تقديم كائن شبكة وصورة مخطط كامل وتصور في 3D. استخدام صانع الفيلم المدمج في لتوليد فيديو للكائن (الماوس الأيمن انقر فوق | إظهار Movie Maker) باستخدام إطارات فردية من العارض (إضافة مفتاح).
    ملاحظة: يمكن أيضا تطبيق العديد من التحسينات البصرية على الفيلم باستخدام علامة التبويب تأثيرات بصرية في اللوحة اليمنى لتسليط الضوء على بعض الميزات، إلخ.
  13. تصدير الفيديو للعرض باستخدام الزر تصدير الحركة في Movie Maker.

Representative Results

ويبين الشكل 2 صورا لجنين، و3 يرقاتنجمية، وجراء في مرحلة البلوغ الفراتية (P7)، وذبابة أنثى بالغة ملطخة باليود ومصورة رطبة في الماء باستخدام ماسح ضوئي تجاري على سطح المقعد. الحفاظ الممتاز وحتى تلطيخ الأنسجة الحساسة واضحة ، مما يسمح بتحديد جميع الأعضاء الرئيسية بسهولة واستخدامها للتحليل المورفومتري والتصور ثلاثي الأبعاد.

عادة، توفر عمليات المسح التي تكتسب صورا إسقاط أقل للعينة دقة أقل من عمليات المسح التي تكتسب المزيد من صور الإسقاط، مع المفاضلة التي تقضيها في المسح الضوئي. على الرغم من أن أوقات المسح الضوئي ستختلف حسب الأداة ومعلمات المسح الضوئي الأخرى ، إلا أن عمليات المسح التي تكتسب بضع مئات من الإسقاطات (~ 3 ميكرومتر حجم بكسل الصورة) تستغرق حوالي 30 دقيقة لكل عينة ، في حين أن المسح الضوئي الذي يتكون من آلاف صور الإسقاط (700 نانومتر - 1.25 ميكرومتر حجم بكسل الصورة) يمكن أن يستغرق 8-16 ساعة. تظهر مقارنة من نفس الرأس يطير الكبار التي اتخذت في كل من 'بطيئة' (الآلاف من التوقعات) و 'سريع' (مئات من التوقعات) وضع المسح الضوئي في الشكل 3. الأهم من ذلك ، لا تختلف التحليلات المورفومترية بين المسح "البطيء" و "السريع" (الشكل 3C)40. لذلك، يستخدم خط أنابيب التصوير لدينا مسحا سريعا لتوليد حجم عينة كبير بما يكفي للتحليل المورفوميتري، وفحوصات بطيئة لتصور أي عيوب مورفولوجية أو تشريحية بدقة أعلى. باستخدام البرنامج (الخطوة 7) ، يمكن تقسيم أي نظام الأنسجة أو الجهاز من الفائدة واستخدامها لتحليل morphometric وتصور في 3D باستخدام صانع الفيلم(فيلم 1).

يظهر الشكل 4 مثالا على بطن الذبابة الملطخة ب PTA والمطبطبة المصورة (الماء) أو بعد تجفيف النقطة الحرجة (CPD) على مجهر الأشعة السينية (جدول المواد). التفاصيل التي يوفرها مزيج من منطقة التجارة التفضيلية وقدرات هذه المنصة واضحة بسهولة في هذه الصور ، بحيث يتم حل خلايا الظهارة الفردية لحزم midgut والحيوانات المنوية داخل الخصيتين بسهولة. في حين أن صورة CPD تظهر زيادة طفيفة في الدقة مقارنة بالعينة المائية ، يتم تحقيق الحفاظ بشكل أفضل على البنية الفائقة للأنسجة الحساسة (مثل الخلايا الدهنية بالقرب من البشرة) مع عينات رطبة(Movie 2).

Figure 1
الشكل 1: نظرة عامة على تصميم الماسح الضوئي وتركيب العينة μ CT. (أ) ماسح ضوئي تجاري μ-CT. (ب) عرض داخل الماسح الضوئي. يصدر مصدر الأشعة السينية (إلى اليمين) أشعة سينية تمر عبر العينة الموجودة على مرحلة دوارة (سهم أصفر). إن توهين هذه الأشعة السينية يولد تباينا في الصورة أثناء مرورها عبر العينة وعلى الكاشف، الذي يتكون من شاشة تلألؤ تحول الأشعة السينية إلى فوتونات وكاميرا CCD قياسية (يسار). (ج) تركيب ذبابة فاكهة الكبار للتصوير رطب في الماء. يتم لف نقاط الاتصال بين طرف ماصة وحامل النحاس في فيلم البارافين لمنع التسرب والأضرار المحتملة للماسح الضوئي. يتم تسليط الضوء أيضا على تشاك المرحلة. لاحظ أن طرف ماصة تم وضعه قليلا خارج المحور، مما أدى إلى وقت أطول المسح الضوئي وانخفاض القرار في إعادة الإعمار النهائي. (D) صورة إسقاط 2D واحدة من ذبابة أنثى بالغة؛ يتم الحصول على مئات إلى آلاف من هذه التوقعات أثناء المسح الضوئي على طول محور الدوران وتستخدم لإعادة الإعمار لتوليد توموجرامات تحتوي على دقة متساوية الخواص ومعلومات ثلاثية الأبعاد دقيقة. أشرطة المقياس (C) = 2 مم P، الخلفية؛ V، فينترال. وقد تم تعديل هذا الرقم من شوبورغوآخرون. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: جميع مراحل دورة حياة دروسوفيليا ميلانوغاستر، التي تم تصويرها بواسطة μ-CT. عينات ملطخة باليود وصور رطبة في الماء. يظهر هو شريحة واحدة 2D. أ)جنين أكمل المراحل المبكرة من الاختراق (النجمة). (ب) يرقة نجمة ثالثة. (ج)A P7 فارات الكبار أثناء التحول. (د)أنثى بالغة. ويسلط الضوء على مختلف الأجهزة: BWM, عضلات جدار الجسم; Br, الدماغ; القرص المضغوط، كارديا؛ Cr, محصول; DLMs, العضلات الطولية الظهرية; DVM, عضلات البطن الظهري; E-AD، قرص هوائي العين؛ إم, جنين; FB, أجسام الدهون; FBCs, خلايا الجسم الدهنية; H, قلب; HG, هندغوت; لا، لامينا؛ L, ساق; مغ, ميدغوت; OL, الفص البصري الدماغ; أوف، أوفيبوستور؛ PC، كتل الجراء؛ SG, الغدد اللعابية; VNC, سلك العصب البطني; W, جناح; WD، قرص الجناح. أشرطة المقياس (A) = 100 ميكرومتر؛ (B)-(D) = 500 ميكرومتر. A, الأمامي; L، إلى اليسار. معلمات المسح الضوئي: مصدر إلى عينة المسافة (مم): (A، D) 36.5، (B) 48.8، (C) 40.3. مصدر إلى مسافة الكاميرا (مم): (A، D) 350، (B، C) 285. حجم بكسل الكاميرا (μm): (A-D) 11.6. حجم بيكسل الصورة (μm): (A، D) 1.2، (B) 1.9، (C) 1.7. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: لا تغير معلمات المسح الضوئي ودقة الصورة التحليلات المورفومترية. يتم مسح رأس شخص بالغ باستخدام إعدادات الماسح الضوئي(A و A)و (مئات الإسقاطات) و(B، B') إعدادات الماسح الضوئي "البطيئة" (آلاف الإسقاطات). الدماغ مبين باللون الأصفر. (ج) قياسات حجم الدماغ من المسح البطيء والسريع. أبرز الهياكل: AL; فص هوائي؛ CB, الدماغ المركزي; FB, مروحة على شكل الجسم; FCs, الخلايا الدهنية; لا، لامينا؛ لو، لوبولا؛ لوب، لوحة لوبولا. لي، medulla؛ إعادة، شبكية العين. ن = 5 ، ويلش تي الاختبار. ns = غير هام. أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر. معلمات المسح الضوئي: مصدر إلى عينة المسافة (مم): (أ) 44.4، (ب) 36.5. المصدر إلى مسافة الكاميرا (مم): (أ) 348 (ب) 350. حجم بكسل الكاميرا (μm): (A-B) 11.6. حجم بيكسل الصورة (μm): (A) 2.95، (B) 1.2. وقد تم تعديل هذا الرقم من شوبورغوآخرون. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: Drosophila الميلانوغاستر البطن المصورة بواسطة المجهر بالأشعة السينية. كانت البطن ملطخة بنسبة 0.5٪ من PTA وصورت رطبة (ماء) أو بعد تجفيف النقاط الحرجة (CPD). (أ) نقطة حرجة المجففة البطن، هو مبين من منظور YZ و (A') XZ المنظور. (ب) البطن رطب، يظهر من منظور YZ و (B') XZ المنظور. يتم تسليط الضوء على مختلف الأجهزة: FC, الخلايا الدهنية; HG, هندغوت; مغ, ميدجوت; SP, مضخة الحيوانات المنوية; تي، الخصيتين. أشرطة المقياس (A) = 250 ميكرومتر D، دورسال؛ A, الأمامي; L، إلى اليسار. معلمات المسح الضوئي: مصدر إلى عينة المسافة (مم): (أ) 6.7، (ب) 7. المصدر إلى مسافة الكاميرا (مم): (أ) 28 (ب) 29.5. الهدف: (A-B) 4X. حجم بكسل الصورة (μm): (A-B) 0.65. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

فيلم 1: يرقة نجمة ثالثة ، قدمت في 3D باستخدام صانع الفيلم في اليعسوب. وتشمل الأجهزة البارزة الدماغ (الأصفر) وأقراص العين الهوائية التصويرية (الأحمر) والجسم الدهني (الأزرق) وعضلات جدار الجسم (الخضراء). الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيلم.

الفيلم 2: مقارنة العينات المصورة في الماء أو اتبع التجفيف نقطة حرجة. تظهر البطن ملطخة 0.5٪ PTA. تم مسح كلا البطنين بإعدادات حجم بكسل صورة متطابقة (0.65 ميكرومتر). تظهر سلسلة من الشرائح ثنائية الأبعاد في شكل "Z-stack" (YZ) بدءا من السطح الظهري وانتهاء على السطح البطني للبطن. أبرز الأجهزة: FC, الخلايا الدهنية; مغ, ميدجوت; SP, مضخة الحيوانات المنوية; تي، الخصيتين. معلمات المسح الضوئي: مصدر إلى عينة المسافة (مم): (أ) 6.7، (ب) 7. المصدر إلى مسافة الكاميرا (مم): (أ) 28 (ب) 29.5. الهدف: (A-B) 4X. حجم بكسل الصورة (μm): (A-B) 0.65. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيلم.

Discussion

ظل تصور Drosophila melanogaster سليما في جميع مراحل النمو تحديا ، ويرجع ذلك في المقام الأول إلى عدم توافق المجهر الخفيف مع بشرة سميكة مصطبغة موجودة في هذا الحيوان. في حين أن طرق التصوير الحيوانية الكاملة الأخرى ، مثل التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) ، والتصوير المقطعي للتماسك البصري (OCT) ، والتنظير الفائق إلى جانب تطهير الأنسجة قد استخدمت بنجاح في الذباب50،51،52،53،54، μ CT يقدم عددا من المزايا التي تجعله مثاليا للتصوير الحيواني الكامل لهذا الكائن الحي13،15،30 . تخترق الأشعة السينية البشرة المصطبغة بسهولة ويسمح طول موجتها الصغير بالتصوير دون الميكرون. وضع العلامات يتطلب الحد الأدنى من الاستثمار في المواد الكيميائية المتاحة على نطاق واسع وليس المهارات مقاعد البدلاء المتخصصة13. كما تتوفر الماسحات الضوئية μ-CT تجاريا، والتكاليف مماثلة لمنصات المجهر الخفيف، في حين أنها أكثر جاذبية لمجموعة أوسع من التخصصات (الجيولوجيا وعلم الحفريات والهندسة، وما إلى ذلك) التي يمكن أن تستفيد أيضا من توافرها في مؤسسة ما. يمكن أيضا استخدام مصادر Synchrotron X-Ray للتصوير عالي الدقة μ CT للحشرات الثابتة والحية31و55و56، ولكنها أقل سهولة من الماسحات الضوئية التجارية على سطح المقعد.

يوفر هذا البروتوكول طريقة فعالة للحصول على صور μ CT للبالغين الذباب والجراء واليرقات والأجنة الخلوية. لاحظ أنه بالنسبة للعديد من الخطوات الموضحة أعلاه، يمكن أيضا تطبيق طرق بديلة لإعداد عينات للتصوير. وقد قدمت دراسات أخرى مقارنة مفصلة لمختلف التثبيت، ووضع العلامات، وتجفيف الخطوات لاستخدامها في الحشرات ويتم تشجيع المهتمين في اعتماد هذه التقنية لتقييم مزايا كل نهج1،4،13،29،30،57. وفي حين أن هذا البروتوكول بسيط نسبيا، فإن بعض الاقتراحات المفيدة تقدم.

أولا، ينبغي توخي الحذر عند تعطيل كندل العينات سليمة بحيث لا تتعطل الأنسجة الرخوة الكامنة بشكل كبير. من المهم السماح لليرقات والمراحل المبكرة من الجراء بالخضوع للتثبيت لمدة ساعتين في محلول بوين قبل الوخز. وهذا سوف تصلب الأنسجة والحد من كمية الهيموليم التي سوف تتسرب من ثقوب كتيكل، والتي يمكن أن تغير بنية الجهاز. يمكن فصل أجزاء الجسم الفردية (الرأس والصدر والبطن) للبالغين إذا كان الهيكل (الهياكل) ذات الاهتمام موجودا هناك. من المستحسن استخدام مشرط لشريحة نظيفة من خلال هذه الشرائح بدلا من سحبها بعيدا مع ملقط، والتي يمكن أن تعطل العمارة 3D من القناة الهضمية أو الجهاز العصبي المركزي، على سبيل المثال. أما بالنسبة للتوقيت، يحتاج البالغون عادة إلى 16 ساعة فقط. لتثبيت كامل، في حين أن مراحل اليرقات والجراء تحتاج إلى 24 ساعة. أيضا، إذا اليود أو تلطيخ PTA يبدو متفاوتا، يمكن وضع العينة مرة أخرى في الحل لاحتضان لفترة أطول حتى يتم تحقيق تلطيخ حتى. وأخيرا، لا ينبغي وضع عينات رطبة في 4 درجة مئوية، لأن هذا يبدو للحث على تشكيل فقاعات الهواء داخل تجويف الجسم بعد الاحترار لدرجة حرارة الغرفة.

ثانيا، سوف تختلف العينة المتصاعدة حسب الأداة ونوع المرحلة وما إذا كانت العينة تحتاج إلى البقاء رطبة أو تم تجفيفها في نقطة حرجة. إذا كان رطبا، تأكد من عدم تسرب العينة وربما تدمير الماسح الضوئي. عند تركيب العينة داخل طرف ماصة، تأكد من دفع بلطف مع كائن مملة حتى العينات يواجه مقاومة طفيفة ولا يمكن أن تتحرك. دفع من الصعب جدا يمكن أن يؤدي إلى تشوه لطيف والعيوب الهيكلية الكامنة. تأكد أيضا من محاذاة العينة في الحامل أقرب ما يمكن إلى محور الدوران. أي تمايل سيزيد من أوقات المسح الضوئي بسبب مجال الرؤية الأكبر ويقلل من دقة مخطط الكائنات المبرمج النهائي بعد إعادة الإعمار.

ثالثا، ستختلف إعدادات الماسح الضوئي للحصول على صور الإسقاط أيضا حسب الأداة. ولزيادة قدرات دقة الماسح الضوئي إلى أقصى حد، ينبغي أن يكون حجم بقعة شعاع الأشعة السينية صغيرا قدر الإمكان (5-10 ميكرومتر). ويمكن تحقيق ذلك من خلال تحقيق التوازن بين الجهد الأشعة السينية والإعدادات الحالية بحيث أن مجموع الطاقة هو 3-4 واط. مع هذه الإعدادات ووقت التعرض المناسب على الكاميرا ، يمكن تحقيق التوهين المناسب لأشعة X-ray بواسطة العينة والتباين الأمثل للصورة. يمكن استخدام مرشحات الألومنيوم أو النحاس بين الجسم ومصدر الأشعة السينية لضبط إعدادات الطاقة بالأشعة السينية المثلى للحصول على أفضل تباين للصورة أو توهين الشعاع بما يكفي لاستخدام المصادر التي تعمل بالطاقة العالية. أما بالنسبة لدقة الصورة، فإن هذا يعتمد على العديد من المتغيرات المختلفة، بما في ذلك نوع البقعة، وعدد صور الإسقاط، وحجم بيكسل الصورة، وموضع الكاميرا، وحركة العينة، واهتزازات الماسح الضوئي، ومعلمات إعادة البناء. يمكن أن يساعد شبح نمط الشريط (QRM GmbH) الذي يحتوي على علامات الحجم المعروفة في تقييم الدقة المكانية لإعداد ماسح ضوئي وكاميرا معينين.

ومن الجدير أيضا تقييم مزايا التصوير نقطة حرجة المجففة أو عينات رطب. قام Sombke وآخرون بتقييم مقارن للم طريقتين ووجدوا أن تجفيف النقاط الحرجة متفوق لتطبيقات μ CT التي تنطوي على المفصليات30. ومع ذلك، فإن فوائد العينات المائية هي أن الحيوانات تتعرض لتعرض أقل للمواد الكيميائية والميكانكية التي يمكن أن تؤدي إلى كل من التحف الكمية والمورفولوجية. هذا يميل أيضا إلى الحفاظ على الأنسجة الحساسة أفضل من CPD. ومع ذلك ، فإن العينات المائية لها عمر صلاحية أقصر بكثير ويجب تصويرها في موعد لا يتجاوز شهرا واحدا بعد التثبيت نظرا لأن تدهور الأنسجة وانخفاض جودة الصورة يصبحان واضحين في تلك المرحلة. أيضا، فإن القرار من عينات رطب يكون أقل قليلا من عينة المجففة نقطة حرجة، لأن الأشعة السينية يجب أن تخترق أيضا من خلال كل من طرف ماصة بلاستيكية والسائل المحيط بها (الماء أو العازلة). يمكن الحفاظ على عينات النقطة الحرجة المجففة لفترات أطول بكثير من الزمن ، خاصة عندما تبقى على Drierite. كما يمكن وضعها مباشرة في مسار شعاع الأشعة السينية ببساطة عن طريق لصق الأجنحة أو الساقين إلى دبوس حشرة ووضعه في مرحلة تشاك ، وتبسيط عملية التركيب. ومع ذلك ، فإن جفاف الإيثانول الواسع النطاق لهذه العينات يمكن أن يؤدي إلى انكماش الأنسجة وفقدان بنية الأنسجة الحساسة ، وهذا هو السبب في أنه من المهم إجراء مجموعة من تركيزات EtOH المتزايدة لتقليل هذه الآثار. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن جميع أشكال العلاج الكيميائي ، بما في ذلك تثبيت البارافورمالديهايد وحتى تلطيخ اليود يمكن أن يسبب انكماش الأنسجة58،59. في حين أن أيا من الأسلوبين لن توفر قياسات "حجم الجهاز الفعلي" في ذبابة حية ، فإن القياسات المورفومترية لا تزال صالحة عند مقارنة الحيوانات المتحولة والحيوانات البرية طالما يتم تنفيذ خطوات التثبيت والتلطيخ والتجفيف بشكل مماثل لكلا المجموعتين من العينات - ويفضل أن يكون ذلك بالتوازي.

في الختام، يوفر μ-CT أداة تصوير حيوانية كاملة مفيدة ل Drosophila33،34،35،36،37،38،39،40،41. وقد عرضت العديد من الدراسات الأخرى قوة هذه التكنولوجيا لفهم جوانب مختلفة من تصنيف الحشرات، والبيئة، وعلم وظائف الأعضاء، والتنمية، والتشريح التي يمكن أن تساعد في إثراء الدراسات المستقبلية في الذباب1،28،30،31،32،55،56،57 . جنبا إلى جنب مع الأدوات المجهرية الوراثية والخفيفة المستخدمة بالفعل على نطاق واسع في هذا الكائن الحي، يمكن μ CT وضع نفسها داخل خط أنابيب تجريبي يسمح بفهم أعمق بين النمط الجيني والنمط الظاهري.

Disclosures

ولا يعلن صاحب البلاغ عن أي مصالح منافسة أو مالية.

Acknowledgments

لم يكن أي من هذا ممكنا لولا دعم ناصر روسان. وأود أن أشكر H. دوغ موريس، دانييل دوناهو، وبريندا كلاونبرغ من مرفق التصوير الماوس NIH وبن أش من الضوئيات الصغيرة للتدريب والمناقشة المفيدة. كما أشكر منصورة نوروزي راد من زايس على مسح عينات البطن على زرادية 520 فيرسا. لورين سميث، سامانثا سميث، وراشيل نغ ساعدت أيضا في المسح الضوئي. مايك مارش من أنظمة أبحاث الأجسام قدم الدعم التقني اليعسوب. كما أنني ممتن للدعم المقدم من المعهد الوطني للقلب والرئة والدم (1K22HL137902-01) وصناديق البدء من جامعة وايومنغ. كما أشكر المراجعين المجهولين على اقتراحاتهم وتعليقاتهم المفيدة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100% Ethanol For critical point drying
Bouin's Solution Sigma-Aldrich HT10132 For animal fixation
Critical Point Dryer Dries samples using the critical point method; multiple options available (Balzers CPD 020 or Leica EMCPD300)
Dragonfly Software Object Research Systems For visualization and segmentation of micro-CT datasets; https://www.theobjects.com/dragonfly/index.html
Heat Block For microfuge tubes
Image Analysis Workstation Should contain sufficient RAM and quality graphics card for 3D rendering
Iodine Solution (I2KI) Fisher Scientific SI86-1 For staining
Microcomputed Tomography Scanner Bruker Skyscan 1172 Cone-beam X-Ray geometry; detector is a Hamamatsu 10 MP camera with 11.54 µm pixel size.
Microcomputed Tomography Scanner Software Bruker For controling the scanner itself (e.g., performing flat field corrections, X-ray tube power, camera expsoure times, acquisition, etc.)
Minutien Pins Fine Science Tools 26002-15 For poking hole in cuticle
NRecon Image Reconstruction Software Bruker Used to reconstruct cross-section images from 2D projection images taken with cone-beam X-Ray geometry
P10 pipet tips Genesee Scientific 24-120 Sample mounting
Phosphate Buffered Saline Resarch Products International P32060-4000.0 Dilute to 1X with water before use
Phosphotungstic Acid Hydrate Sigma-Aldrich 79690-25g For staining
Pin Holder Fine Science Tools 26018-17 For Minutien Pins
Triton X-100 Research Products International 111036 To remove waxy coating from adult flies (as 0.5% PBST)
X-Ray Microscope Zeiss Xradia 520 Versa Cone-beam X-Ray geometry featuring Fresnel zone plate objective lenses for Resoluton at a Distance (RaaD™)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiology. 9, 11 (2009).
  2. Rahman, I. A., Smith, S. Y. Virtual paleontology: computer-aided analysis of fossil form and function. Journal of Paleontology. 88 (04), 633-635 (2014).
  3. Carlson, W. D. Three-dimensional imaging of earth and planetary materials. Earth and Planetary Science Letters. 249 (3-4), 133-147 (2006).
  4. Gutiérrez, Y., Ott, D., Töpperwien, M., Salditt, T., Scherber, C. X-ray computed tomography and its potential in ecological research: A review of studies and optimization of specimen preparation. Ecology and Evolution. 8 (15), 7717-7732 (2018).
  5. Abel, R. L., et al. Digital preservation and dissemination of ancient lithic technology with modern micro-CT. Computers & Graphics. 35 (4), 878-884 (2011).
  6. Kastengren, A., Powell, C. F. Synchrotron X-ray techniques for fluid dynamics. Experiments in Fluids. 55 (3), 1686 (2014).
  7. Boerckel, J. D., Mason, D. E., McDermott, A. M., Alsberg, E. Microcomputed tomography: approaches and applications in bioengineering. Stem Cell Research & Therapy. 5 (6), 144 (2014).
  8. Du Plessis, A., Yadroitsev, I., Yadroitsava, I., Le Roux, S. G. X-Ray Microcomputed Tomography in Additive Manufacturing: A Review of the Current Technology and Applications. 3D Printing and Additive Manufacturing. 5 (3), 227-247 (2018).
  9. Cnudde, V., Boone, M. N. High-resolution X-ray computed tomography in geosciences: A review of the current technology and applications. Earth-Science Reviews. 123, 1-17 (2013).
  10. Zhu, Y., Zhang, J., Li, A., Zhang, Y., Fan, C. Synchrotron-based X-ray microscopy for sub-100nm resolution cell imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 39, 11-16 (2017).
  11. Kampschulte, M., et al. Nano-Computed Tomography: Technique and Applications. RoFo: Fortschritte Auf Dem Gebiete der Rontgenstrahlen und der Nuklearmedizin. 188 (2), (2016).
  12. Seeram, E. Computed tomography: A technical review. Radiologic Technology. 89 (3), 279-302 (2018).
  13. Rawson, S. D., Maksimcuka, J., Withers, P. J., Cartmell, S. H. X-ray computed tomography in life sciences. BMC Biology. 18 (1), 21 (2020).
  14. Morton, E. J., Webb, S., Bateman, J. E., Clarke, L. J., Shelton, C. G. Three-dimensional x-ray microtomography for medical and biological applications. Physics in Medicine and Biology. 35 (7), 805-820 (1990).
  15. Lin, A. S. P., Stock, S. R., Guldberg, R. E. Microcomputed Tomography. Springer Handbook of Microscopy. , Springer. 2 (2019).
  16. Feldkamp, L. A., Davis, L. C., Kress, J. W. Practical cone-beam algorithm. Journal of the Optical Society of America A. 1 (6), 612 (1984).
  17. Clark, D. P., Badea, C. T. Micro-CT of rodents: state-of-the-art and future perspectives. Physica Medica: PM: An International Journal Devoted to the Applications of Physics to Medicine and Biology: Official Journal of the Italian Association of Biomedical Physics (AIFB). 30 (6), 619-634 (2014).
  18. Schambach, S. J., Bag, S., Schilling, L., Groden, C., Brockmann, M. A. Application of micro-CT in small animal imaging. Methods. 50 (1), 2-13 (2010).
  19. Collins, F. S., Rossant, J., Wurst, W. A mouse for all reasons. Cell. 128 (1), International Mouse Knockout Consortium 9-13 (2007).
  20. Wong, M. D., Dorr, A. E., Walls, J. R., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. A novel 3D mouse embryo atlas based on micro-CT. Development. 139 (17), 3248-3256 (2012).
  21. Dyer, E. L., et al. Quantifying Mesoscale Neuroanatomy Using X-Ray Microtomography. eNeuro. 4 (5), (2017).
  22. Weinhardt, V., et al. Quantitative morphometric analysis of adult teleost fish by X-ray computed tomography. Scientific Reports. 8 (1), 16531 (2018).
  23. Ding, Y., et al. Computational 3D histological phenotyping of whole zebrafish by X-ray histotomography. eLife. 8, 44898 (2019).
  24. Ahmadzadeh, E., et al. A collection of genetic mouse lines and related tools for inducible and reversible intersectional mis-expression. Development. 147 (10), (2020).
  25. Koster, R., Sassen, W. A. A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish. Advances in Genomics and Genetics. 2015, 151-163 (2015).
  26. Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: A primer on the Drosophila model system. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
  27. Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Disease Models & Mechanisms. 9 (3), 235-244 (2016).
  28. Smith, D. B., et al. Exploring miniature insect brains using micro-CT scanning techniques. Scientific Reports. 6, 21768 (2016).
  29. Swart, P., Wicklein, M., Sykes, D., Ahmed, F., Krapp, H. G. A quantitative comparison of micro-CT preparations in Dipteran flies. Scientific Reports. 6, 39380 (2016).
  30. Sombke, A., Lipke, E., Michalik, P., Uhl, G., Harzsch, S. Potential and limitations of X-Ray micro-computed tomography in arthropod neuroanatomy: a methodological and comparative survey. The Journal of Comparative Neurology. 523 (8), 1281-1295 (2015).
  31. Betz, O., et al. Imaging applications of synchrotron X-ray phase-contrast microtomography in biological morphology and biomaterials science. I. General aspects of the technique and its advantages in the analysis of millimetre-sized arthropod structure. Journal of Microscopy. 227, Pt 1 51-71 (2007).
  32. Wipfler, B., Pohl, H., Yavorskaya, M. I., Beutel, R. G. A review of methods for analysing insect structures - the role of morphology in the age of phylogenomics. Current Opinion in Insect Science. 18, 60-68 (2016).
  33. Chen, W. C., et al. Toward a new insight of calcium oxalate stones in Drosophila by micro-computerized tomography. Urolithiasis. 46 (2), 149-155 (2017).
  34. Fabian, B., Schneeberg, K., Beutel, R. G. Comparative thoracic anatomy of the wild type and wingless (wg1cn1) mutant of Drosophila melanogaster (Diptera). Arthropod Structure & Development. 45 (6), 611-636 (2016).
  35. Harrison, J. F., et al. Developmental plasticity and stability in the tracheal networks supplying Drosophila flight muscle in response to rearing oxygen level. Journal of Insect Physiology. , (2017).
  36. Klok, C. J., Kaiser, A., Socha, J. J., Lee, W. K., Harrison, J. F. Multigenerational effects of rearing atmospheric oxygen level on the tracheal dimensions and diffusing capacities of pupal and adult Drosophila melanogaster. Advances in Experimental Medicine and Biology. 903, (2016).
  37. Mattei, A. L., Riccio, M. L., Avila, F. W., Wolfner, M. F. Integrated 3D view of postmating responses by the Drosophila melanogaster female reproductive tract, obtained by micro-computed tomography scanning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8475-8480 (2015).
  38. Mizutani, R., Saiga, R., Takeuchi, A., Uesugi, K., Suzuki, Y. Three-dimensional network of Drosophila brain hemisphere. Journal of Structural Biology. 184 (2), 271-279 (2013).
  39. Mizutani, R., Takeuchi, A., Akamatsu, G., Uesugi, K., Suzuki, Y. Element-specific microtomographic imaging of Drosophila brain stained with high-Z probes. Journal of Synchrotron Radiation. 15, Pt 4 374-377 (2008).
  40. Schoborg, T. A., Smith, S. L., Smith, L. N., Morris, H. D., Rusan, N. M. Micro-computed tomography as a platform for exploring Drosophila development. Development. 146 (23), (2019).
  41. Chaturvedi, D., Prabhakar, S., Aggarwal, A., Atreya, K. B., VijayRaghavan, K. Adult Drosophila muscle morphometry through microCT reveals dynamics during ageing. Open Biology. 9 (6), 190087 (2019).
  42. Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 66, 57-80 (1981).
  43. Withers, P. J. X-ray nanotomography. Materials Today. 10 (12), 26-34 (2007).
  44. Bleichrodt, F., et al. Easy implementation of advanced tomography algorithms using the ASTRA toolbox with Spot operators. Numerical Algorithms. 71 (3), 673-697 (2016).
  45. Salmon, P. L., Liu, X., Sasov, A. A post-scan method for correcting artefacts of slow geometry changes during micro-tomographic scans. Journal of X-ray Science and Technology. 17 (2), 161-174 (2009).
  46. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  47. CIBC Seg3D: Volumetric Image Segmentation and Visualization. Scientific Computing and Imaging Institute (SCI). , Available from: http://www.seg3d.org (2016).
  48. Yushkevich, P. A., et al. User-guided 3D active contour segmentation of anatomical structures: significantly improved efficiency and reliability. Neuroimage. 31 (3), 1116-1128 (2006).
  49. Lösel, P., Heuveline, V. Enhancing a diffusion algorithm for 4D image segmentation using local information. Medical Imaging 2016: Image Processing. 9784, (2016).
  50. Null, B., Liu, C. W., Hedehus, M., Conolly, S., Davis, R. W. High-resolution, in vivo magnetic resonance imaging of Drosophila at 18.8 Tesla. Plos One. 3 (7), 2817 (2008).
  51. Holmes, J. In vivo real-time optical coherence tomography imaging of Drosophila for cardiovascular research. Nature Methods. 6 (10), 5557 (2009).
  52. Men, J., et al. Optical coherence tomography for brain imaging and developmental biology. IEEE journal of selected topics in quantum electronics: a publication of the IEEE Lasers and Electro-optics Society. 22 (4), 6083213 (2016).
  53. Jährling, N., Becker, K., Schönbauer, C., Schnorrer, F., Dodt, H. U. Three-dimensional reconstruction and segmentation of intact Drosophila by ultramicroscopy. Frontiers in Systems Neuroscience. 4, 1 (2010).
  54. Pende, M., et al. High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster. Nature Communications. 9 (1), 4731 (2018).
  55. Socha, J. J., Westneat, M. W., Harrison, J. F., Waters, J. S., Lee, W. K. Real-time phase-contrast x-ray imaging: a new technique for the study of animal form and function. BMC Biology. 5, 6 (2007).
  56. Westneat, M. W., et al. Tracheal respiration in insects visualized with synchrotron x-ray imaging. Science. 299 (5606), 558-560 (2003).
  57. Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: a versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
  58. Stowell, R. E. Effect on tissue volume of various methods of fixation, dehydration, and embedding. Stain Technology. 16 (2), 67-83 (1941).
  59. Vickerton, P., Jarvis, J., Jeffery, N. Concentration-dependent specimen shrinkage in iodine-enhanced microCT. Journal of Anatomy. 223 (2), 185-193 (2013).

Tags

علم الأحياء التنموي، العدد 163، Drosophila melanogaster، التصوير المقطعي المجهري، التصوير قبل السريري، تحليل الصور، نمذجة الأمراض البشرية، الفينوتيبينج
التصوير الحيواني كله من <em>الميلانوغاستر Drosophila</em> باستخدام التصوير المقطعي microcomputed
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schoborg, T. A. Whole Animal Imaging … More

Schoborg, T. A. Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography. J. Vis. Exp. (163), e61515, doi:10.3791/61515 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter