Summary
यह आलेख वर्णन करता है कि एक्सोलॉटल अंग पुनर्जनन के दौरान घाव एपिडर्मिस गठन को रोकने के लिए एक सर्जिकल विधि को तुरंत विच्छेदन विमान पर पूर्ण मोटाई वाली त्वचा को टांका लगाकर कैसे किया जाए। यह विधि शोधकर्ताओं को अंग पुनर्जनन के शुरुआती चरणों के दौरान घाव एपिडर्मिस की कार्यात्मक भूमिकाओं की जांच करने की अनुमति देती है।
Abstract
पिछली शताब्दी में समन्दर पुनर्योजी जीव विज्ञान में शास्त्रीय प्रयोगों ने लंबे समय से स्थापित किया है कि घाव एपिडर्मिस एक महत्वपूर्ण सिग्नलिंग संरचना है जो तेजी से विच्छेदन के बाद बनती है और अंग उत्थान के लिए आवश्यक है। हालांकि, पिछले दशकों में आणविक स्तर पर इसके सटीक कार्य का अध्ययन करने के तरीके सटीक कार्यात्मक तकनीकों और समन्दर मॉडल प्रणालियों में उपलब्ध जीनोमिक जानकारी की कमी के कारण सीमित हैं। रोमांचक रूप से, विभिन्न समन्दर जीनोम की रिहाई और CRISPR सहित कार्यात्मक आनुवंशिक परीक्षण विधियों के आगमन के साथ युग्मित अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों की हाल की अधिकता, अभूतपूर्व आणविक संकल्प पर इन मूलभूत प्रयोगों को फिर से देखना संभव बनाती है। यहां, मैं वर्णन करता हूं कि विच्छेदन के तुरंत बाद घाव एपिडर्मिस गठन को बाधित करने के लिए वयस्क एक्सोलोटल में शास्त्रीय रूप से विकसित पूर्ण त्वचा फ्लैप (एफएसएफ) सर्जरी कैसे करें। घाव एपिडर्मिस आमतौर पर बाहरी वातावरण से घाव को सील करने के लिए विच्छेदन विमान के समीपस्थ त्वचा में उपकला कोशिकाओं के डिस्टल माइग्रेशन के माध्यम से बनता है। सर्जरी में उपकला सेल माइग्रेशन और अंतर्निहित क्षतिग्रस्त मेसेनकाइमल ऊतकों के साथ संपर्क में बाधा डालने के लिए विच्छेदन विमान पर तुरंत पूर्ण मोटाई वाली त्वचा (जिसमें एपिडर्मल और त्वचीय परतें दोनों शामिल हैं) को शामिल किया जाता है। सफल सर्जरी के परिणामस्वरूप ब्लास्टेमा गठन और अंग पुनर्जनन का निषेध होता है। समकालीन डाउनस्ट्रीम आणविक और कार्यात्मक विश्लेषण के साथ इस सर्जरी विधि के संयोजन से, शोधकर्ता अंग पुनर्जनन के दौरान घाव एपिडर्मिस फ़ंक्शन और जीव विज्ञान के आणविक आधार को उजागर करना शुरू कर सकते हैं।
Introduction
चूंकि 17681 में Lazzaro Spallanzani ने इसकी सूचना दी थी, इसलिए सैलामैंडर अंग पुनर्जनन सबसे अच्छी तरह से अध्ययन की गई प्राकृतिक पुनर्योजी घटनाओं में से एक रहा है जिसमें सदियों से जीवविज्ञानियों को मोहक किया गया है। सफल अंग पुनर्जनन एक अविभाजित सेलुलर संरचना के गठन, वृद्धि और बाद के पैटर्निंग पर निर्भर करता है जिसे ब्लास्टेमा के रूप में जाना जाता है। शोधकर्ताओं ने ब्लास्टेमा की सेलुलर संरचना को समझने में महत्वपूर्ण प्रगति की है और साथ ही इसके गठन के लिए कौन से सहायक ऊतक और सेल प्रकार आवश्यक हैं2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 . फिर भी, विभिन्न ऊतकों और सेल प्रकारों के बीच समन्वित सिग्नलिंग तंत्र जो ब्लास्टेमा गठन की शुरुआत का कारण बनते हैं, खराब रूप से समझे जाते हैं।
सफल ब्लास्टेमा गठन और पुनर्जनन के लिए एक प्रमुख आवश्यकता घाव एपिडर्मिस है, जो एक क्षणिक और विशेष उपकला है जो 12 घंटे के भीतर विच्छेदन विमान को कवर करती है। विच्छेदन के बाद, चोट के लिए अक्षुण्ण त्वचा से उपकला कोशिकाएं तेजी से विच्छेदन विमान पर एक पतली घाव उपकला 14 बनाने के लिए स्थानांतरित होती हैं। जैसा कि ब्लास्टेमा अगले हफ्तों में बनता है, प्रारंभिक घाव एपिडर्मिस एक मोटी उपकला सिग्नलिंग संरचना में विकसित होता है जिसे एपिकल एपिथेलियल कैप (एईसी) 15 कहा जाता है। जबकि सामान्य पूर्ण मोटाई वाली त्वचा में बेसल लामिना द्वारा अलग एक उपकला और त्वचीय परत दोनों होती हैं, घाव एपिडर्मिस / एईसी में केवल एक उपकला परत होती है और इसमें बेसल लैमिना 16,17 की कमी होती है। बेसल लामिना और डर्मिस की अनुपस्थिति घाव उपकला कोशिकाओं और अंतर्निहित ऊतकों के बीच सीधे संपर्क की अनुमति देती है, जो दो डिब्बों के बीच द्वि-दिशात्मक सिग्नलिंग की सुविधा प्रदान करती है जो ब्लास्टेमा गठन और रखरखाव दोनों के लिए महत्वपूर्ण है17,18।
शास्त्रीय प्रयोगात्मक अध्ययनों ने घाव एपिडर्मिस / एईसी फ़ंक्शन और इसके गठन को रोकने के माध्यम से आवश्यकता की जांच करने के लिए विभिन्न अभिनव सर्जिकल तरीकों को तैयार किया। इन तरीकों में विच्छेदन विमान पर पूर्ण मोटाई skin20,21 को suturing या ग्राफ्टिंग शामिल है, तुरंत शरीर गुहा 22 में कटा हुआ अंग suturing, और लगातार दैनिक हटाने या प्रारंभिक घाव epidermis और AEC23,24 के विकिरण. कुल मिलाकर, इन प्रयोगों ने न केवल घाव एपिडर्मिस / एईसी के महत्व को स्थापित किया, बल्कि शुरुआती ऊतक हिस्टोलिसिस में अपनी भूमिकाओं को भी निर्धारित किया, साथ ही साथ पूरे पुनर्जनन के दौरान पूर्वज सेल प्रसार और ब्लास्टेमल आउटग्रोथ 13 को बनाए रखा।
हालांकि, ये पिछले अध्ययन काफी हद तक हिस्टोलॉजिकल स्टेनिंग के साथ-साथ कोशिका प्रसार को ट्रैक करने के लिए ट्राइटिएटेड थाइमिडिन दालों तक सीमित थे। वास्तव में, सैलामैंडर में आधुनिक अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों और कार्यात्मक तकनीकों के साथ इन शास्त्रीय प्रयोगों को फिर से देखना हाल ही में किया गया है और पुनर्जनन के शुरुआती चरणों के दौरान सूजन और ईसीएम गिरावट / जमाव को संशोधित करने में घाव एपिडर्मिस के लिए अतिरिक्त भूमिकाओं की खोज के लिए नेतृत्व किया गया है25। विभिन्न समन्दर जीनोम और ट्रांसक्रिप्टोम अनुक्रमों की रिहाई के साथ26,27,28,29,30,31,32,33,34, साथ ही साथ समन्दर प्रजातियों में उपलब्ध कार्यात्मक तरीकों की बढ़ती संख्या11,35,36,37,38 , शोधकर्ताओं को अब अच्छी तरह से घाव epidermis गठन, समारोह, और एईसी विकास ड्राइविंग आणविक तंत्र को सुलझाने के लिए शुरू करने के लिए तैनात कर रहे हैं।
दुर्भाग्य से, घाव एपिडर्मिस गठन को बाधित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले इन शास्त्रीय तरीकों में से कई तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण हैं, जो एक ही प्रयोग में जैविक प्रतिकृतियों के बीच पुनरुत्पादन के लिए कठिनाइयों को प्रस्तुत करते हैं। उदाहरण के लिए, त्वचा ग्राफ्ट को बनाए रखना चुनौतीपूर्ण हो सकता है क्योंकि ग्राफ्ट अंततः मेजबान अंग से गिर सकते हैं और अंतर्निहित ऊतकों को नुकसान पहुंचाए बिना दैनिक घाव एपिडर्मिस / एईसी को हटाना मुश्किल है। इसके अलावा, शरीर गुहा में कटे हुए अंग को टांका लगाना चुनौतीपूर्ण है और सम्मिलन की साइट पर अतिरिक्त चोट की भी आवश्यकता होती है। दूसरी ओर, विच्छेदन विमान पर तुरंत पूर्ण मोटाई की त्वचा को सुसुना अपेक्षाकृत सरल, तकनीकी रूप से पुन: प्रस्तुत करने योग्य है, और न्यूनतम ऊतक क्षति का परिचय देता है। यह पूर्ण त्वचा फ्लैप (एफएसएफ) सर्जिकल विधि पहले एंथोनी मेशर द्वारा 1976 में वयस्क न्यूट्स (Notophthalmus viridiscens) में विकसित की गई थी। उन्होंने प्रदर्शित किया कि एफएसएफ सर्जरी ने घाव एपिडर्मिस गठन को रोक दिया और दोनों उपकला कोशिकाओं को विच्छेदन विमान पर उपकला सेल माइग्रेशन और उपकला कोशिकाओं और अंतर्निहित ऊतकों के बीच सीधे संपर्क पर प्रतिबंध लगा दिया।
यहां, इस सर्जिकल प्रक्रिया को एक्सोलॉटल अंग का उपयोग करके चरण-दर-चरण दिखाया गया है। आधुनिक दिन आणविक और अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों के साथ युग्मित, यह तकनीक शोधकर्ताओं के लिए घाव एपिडर्मिस / एईसी गठन और अंग उत्थान के दौरान कार्य की हमारी समझ को गहरा करने के लिए बहुत उपयोगी साबित हो सकती है।
Protocol
सभी पशु प्रयोगों को IACUC (प्रोटोकॉल #: 11-32) और हार्वर्ड विश्वविद्यालय में AAALAC दिशानिर्देशों के अनुसार किया गया था।
1. संज्ञाहरण और वसूली के लिए समाधान और सेटअप तैयार करना
- संज्ञाहरण के लिए ताजा 0.1% ट्राइकेन समाधान और वसूली के लिए 0.5% सल्फामेराज़िन सोडियम नमक समाधान तैयार करें। प्रासंगिक अनुसंधान संस्थान में अनुमोदित IACUC प्रोटोकॉल के अनुसार axolotl husbandry37 के लिए उपयुक्त पानी का उपयोग करके समाधान बनाएं (उदाहरण के लिए, संशोधित Holtfreter का समाधान)। सुनिश्चित करें कि समाधान अच्छी तरह से मिश्रित हैं और पूरे एक्सोलॉटल को डुबोने के लिए पर्याप्त मात्रा तैयार की जाती है।
- 0.1% ट्राइकेन समाधान तैयार करने के लिए, 1 लीटर पानी के साथ 1 ग्राम ट्राइकेन और 1 ग्राम सोडियम बाइकार्बोनेट मिलाएं। समाधान को इस नुस्खा के अनुसार बढ़ाया जा सकता है।
- 0.5% sulfamerazine सोडियम नमक समाधान तैयार करने के लिए, 1 लीटर पानी के साथ 5 ग्राम sulfamerazine सोडियम नमक मिलाएं। समाधान को इस नुस्खा के अनुसार बढ़ाया जा सकता है। Sulfamerazine समाधान एक एंटी-बायोटिक है जो सर्जिकल वसूली के दौरान जीवाणु संक्रमण को रोक देगा।
- सर्जिकल क्षेत्र को क्लिडॉक्स-एस या 70% इथेनॉल के साथ छिड़काव करके सैनिटाइज करें। सर्जिकल उपकरण (संदंश, विच्छेदन कैंची, वसंत कैंची) autoclaving द्वारा निष्फल. यदि कई सर्जरी कर रहे हैं, तो जानवरों के बीच गर्म मनका स्टरलाइज़र के साथ सर्जिकल उपकरणों को निष्फल करना सुनिश्चित करें।
- रिकवरी क्षेत्र स्थापित करने के लिए, एक 15 सेमी पेट्री डिश या कोई भी कंटेनर रखें जो गीली बर्फ से भरी बाल्टी के शीर्ष पर एक्सोलोटल को फिट करेगा। पेट्री डिश को 0.5% सल्फामेराज़िन सोडियम नमक समाधान के निम्न स्तर के साथ भरें, पर्याप्त है जैसे कि एक्सोलोटल पूरी तरह से जलमग्न नहीं होगा। सर्जरी के बाद बर्फ पर वसूली जानवर के आंदोलन को धीमा कर देगी, जबकि यह संज्ञाहरण से जागती है, जिससे टांके वाले क्षेत्र को अपेक्षाकृत अबाधित चंगा करने की अनुमति मिलती है।
नोट: इस सेटअप को शोधकर्ताओं द्वारा अनुकूलित किया जा सकता है जो इस बात पर निर्भर करता है कि उनके पास कौन सी सामग्री उपलब्ध है।
2. पूर्ण त्वचा प्रालंब शल्य चिकित्सा प्रक्रिया प्रदर्शन
- 0.1% ट्राइकेन समाधान के कंटेनर में इसे submersing द्वारा axolotl anesthetize. इसमें लगभग 15-20 मिनट लगेंगे। सुनिश्चित करें कि axolotl वास्तव में एक पूंछ चुटकी प्रदर्शन करके पूरी तरह से anesthetized है। यदि एक्सोलॉटल से कोई प्रतिक्रिया नहीं है, तो सर्जरी के साथ आगे बढ़ें।
नोट: इस सर्जरी के लिए पुराने, बड़े एक्सोलोटल का उपयोग करें (आकार में कम से कम 15 सेमी)। सुनिश्चित करें कि एक्सोलोटल एक प्लास्टिक पिपेट का उपयोग करके एक्सोलॉटल सिस्टम के पानी के साथ समय-समय पर त्वचा को गीला करके सर्जरी के दौरान अच्छी तरह से हाइड्रेटेड रहता है। सर्जरी से पहले बाँझ पीबीएस के साथ क्षेत्र की सिंचाई करके शल्य चिकित्सा साइट को तैयार करना सुनिश्चित करें। जानवर को प्रक्रिया के लिए बाँझ सर्जिकल ड्रेप पर भी रखा जाना चाहिए। - विच्छेदन कैंची का उपयोग करके zeugopodial कंकाल तत्वों के दूरस्थ छोर पर एक अंग विच्छेदन प्रदर्शन (चित्र 1.1).
- वसंत कैंची का उपयोग करते हुए, त्वचा के वेंट्रल हिस्से पर एक छोटा चीरा (लगभग 2 मिमी) बनाएं (चित्र 1.2)।
- संदंश का उपयोग करते हुए, ध्यान से त्वचा को ज़ेउगोपोडियाल कंकाल तत्वों की लगभग मध्य रेखा पर छील लें, अंतर्निहित अंग ऊतकों (मांसपेशियों, हड्डी, आदि) को उजागर करें। (चित्र 1.3)। सुनिश्चित करें कि त्वचा को नुकसान न पहुंचे। चरण 2.8 के बाद नोट देखें।
- सर्जिकल कैंची का उपयोग करके zeugopod की मध्य रेखा पर उजागर अंतर्निहित अंग ऊतकों को काट दें (चित्र 1.4)।
- सर्जिकल कैंची के साथ मांसपेशियों के ऊतकों को वापस पुश करें और उजागर हड्डी को ट्रिम करें।
नोट: यह बेहतर उपचार सुनिश्चित करने के लिए और सर्जरी की सफलता को बढ़ाने के लिए भी आवश्यक है क्योंकि उभरी हुई हड्डी को टांके वाले फ्लैप के खिलाफ झुकाया जा सकता है और बाद में एक बरकरार त्वचा फ्लैप की अखंडता को बाधित किया जा सकता है। - संदंश का उपयोग करते हुए, वेंट्रल पूर्ण मोटाई त्वचा (चित्रा 1.5) के साथ जुड़कर उजागर अंतर्निहित ऊतकों और सीवन को कवर करने के लिए विच्छेदन विमान पर अतिरिक्त पूर्ण मोटाई वाली त्वचा को सावधानीपूर्वक खींचें।
- त्वचा के शेष दाएं और बाएं किनारों को बरकरार त्वचा के अंतर्निहित वेंट्रल भागों में फ्लैप सीवन करें। यह या तो फ्लैप के किनारों को "क्रिस-क्रॉस" तरीके से (अनुशंसित) (अनुशंसित) (चित्रा 1.6-1.9) में टांका लगाकर किया जा सकता है, या बस सीधे वेंट्रल त्वचा में टांके लगाकर किया जा सकता है। suturing के लिए संदंश और घुमावदार वसंत कैंची का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि कोई उजागर अंतर्निहित ऊतकों को नहीं देखा जा सकता है और टांके तंग बंधे हुए हैं (कम से कम तीन बार गांठदार)।
नोट:: यह महत्वपूर्ण है कि अक्षत त्वचा चरण 2.4, 2.7-2.8 में क्षतिग्रस्त नहीं है। हमने पाया है कि पूर्ण मोटाई वाली त्वचा को नुकसान असफल सर्जरी के साथ सहसंबद्ध किया गया है, क्योंकि क्षति के क्षेत्र अभी भी एक छोटे से घाव एपिडर्मिस बना सकते हैं। यदि संभव हो, तो पूर्ण मोटाई वाली त्वचा फ्लैप को सौंपते समय संदंश की एक सुस्त जोड़ी का उपयोग करने का प्रयास करें। - contralateral अंग (वैकल्पिक आंतरिक पशु नियंत्रण) पर एक विच्छेदन यह सर्जिकल कैंची के साथ मध्य zeugopod स्तर पर विच्छेदन द्वारा प्रदर्शन करते हैं. सर्जिकल कैंची के साथ मांसपेशियों के ऊतकों को वापस पुश करें और उजागर हड्डी को ट्रिम करें।
नोट: एक आंतरिक contralateral अंग नियंत्रण बेहतर एक ही जानवर में चरण 4 के दौरान सर्जरी की सफलता का आकलन करने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, एक अलग जानवर में एक ही अंग के विच्छेदन का उपयोग नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए भी किया जा सकता है।
3. पोस्ट-ऑपरेटिव वसूली और देखभाल
- एक बार सर्जरी पूरी हो जाने के बाद, इसे गीला करने के लिए कंटेनर या पेट्री डिश के नीचे एक किमवाइफ या बाँझ पेपर तौलिया रखें। जानवर को गीली बर्फ पर कंटेनर में रखें और धीरे-धीरे जानवर के शीर्ष के चारों ओर किमवाइफ या पेपर तौलिया के उजागर सिरों को लपेटें ताकि इसे सल्फामेराज़िन समाधान के साथ अच्छी तरह से हाइड्रेटेड रखा जा सके। संज्ञाहरण से वसूली के दौरान न्यूनतम आंदोलन सुनिश्चित करने के लिए 30 मिनट से 1 घंटे के लिए गीली बर्फ पर छोड़ दें।
- जानवर को 0.5% sulfamerazine समाधान के साथ एक स्थिर आवास कंटेनर में रखें। संक्रमण को रोकने के लिए पहले 24 घंटों के लिए एक्सोलॉटल को इस समाधान में रहना चाहिए।
- Axolotl को सामान्य सिस्टम के पानी में रखें और दैनिक स्वास्थ्य की निगरानी करें। सुनिश्चित करें कि कोई टांके हर दिन बाहर गिरते हैं क्योंकि इसके परिणामस्वरूप एक छोटा घाव एपिडर्मिस बन सकता है जो परिणामों को भ्रमित करेगा।
नोट: सुनिश्चित करें कि आवास कंटेनर axolotl के लिए पर्याप्त जगह है चारों ओर ले जाने के लिए और संभावना है कि axolotl पर टांका अंग कंटेनर के किनारों के साथ संपर्क में आ सकते हैं कम से कम है। यह सुनिश्चित करने में मदद करेगा कि टांके जगह में रहें, खासकर सर्जरी के बाद पहले सप्ताह के दौरान।
4. एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत सर्जरी की सफलता का आकलन
नोट: हम सप्ताह में कम से कम एक बार स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत जानवरों की जांच करने की सलाह देते हैं ताकि पूर्ण त्वचा फ्लैप की अखंडता और सर्जरी की सफलता का आकलन किया जा सके।
- चरण 2.1 के रूप में 0.1% ट्राइकेन में axolotl anesthetize. सुनिश्चित करें कि एक्सोलॉटल को चारों ओर ले जाने के लिए कंटेनर में पर्याप्त जगह है।
- यदि सर्जरी के बाद पहले दो हफ्तों के दौरान निरीक्षण किया जाता है, तो यह सुनिश्चित करने के लिए एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग करके टांके वाले अंग का निरीक्षण करें कि कोई टांके बाहर नहीं निकले हैं और यह कि एक स्पष्ट पतला घाव एपिडर्मिस कहीं भी दिखाई नहीं दे रहा है। यदि सर्जरी के बाद या बाद में तीसरे सप्ताह का निरीक्षण किया जाता है, तो सुनिश्चित करें कि एक ब्लास्टेमा का गठन नहीं हुआ है और इस बात की तुलना करें कि सामान्य नियंत्रण कटा हुआ अंग (या तो एक ही जानवर या एक अलग जानवर से) ने पुनर्जनन के दौरान प्रगति की है (यानी, क्या एक ब्लास्टेमा का गठन हुआ है)।
- जब किया जाता है, तो एक्सोलोटल को सामान्य सिस्टम पानी और पशुपालन की स्थिति में वापस कर दें।
Representative Results
यह सर्जिकल प्रोटोकॉल घाव एपिडर्मिस गठन (चित्रा 1) और अंततः, अंग पुनर्जनन के पूर्ण निषेध के लिए अनुमति देगा। एक सफल सर्जरी के परिणामस्वरूप जानवर के आकार के आधार पर लगभग 2-3 सप्ताह में कोई ब्लास्टेमा गठन नहीं होता है, जबकि नियंत्रण पुनर्जन्म अंगों को सामान्य रूप से एक ब्लास्टेमा बनाना चाहिए।
शोधकर्ताओं को हर 2-3 दिनों में नग्न आंखों से टांके वाले अंग का निरीक्षण करना चाहिए ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि टांके बाहर नहीं निकले हैं और एक ब्लास्टेमा नहीं बन रहा है। यदि एक या अधिक टांके बाहर निकलते हैं, तो एक घाव एपिडर्मिस अभी भी बन सकता है जिसके परिणामस्वरूप या तो एक छोटा या बड़ा ब्लास्टेमा और एक असफल सर्जरी हो सकती है (चित्रा 2)। इसके अतिरिक्त, शोधकर्ताओं को यह सुनिश्चित करने के लिए कि एक पतली घाव एपिडर्मिस विच्छेदन सतह पर कहीं भी स्पष्ट नहीं है, यह सुनिश्चित करने के लिए हर हफ्ते कम से कम एक बार टांका हुआ अंग का निरीक्षण करना चाहिए। तुलना के लिए, शोधकर्ताओं को नियंत्रण पुनरुत्पादन अंग की भी जांच करनी चाहिए जिसमें विच्छेदन विमान पर घाव एपिडर्मिस होना चाहिए और 2-3 सप्ताह में एक ब्लास्टेमा बनाना चाहिए। घाव एपिडर्मिस पतली और स्पष्ट दिखाई देगा, जबकि सामान्य त्वचा क्रमशः अधिक अपारदर्शी और पीली गुलाबी (लगभग सफेद), हल्के पीले, या गहरे हरे रंग की ल्यूसिस्टिक, अल्बिनो, या वाइल्डटाइप एक्सोलॉटल में दिखाई देगी।
यदि शोधकर्ता 2-3 सप्ताह में ब्लास्टेमा गठन चरणों से पहले ऊतक एकत्र करना चाहते हैं, तो उन्हें यह सुनिश्चित करने के लिए नमूना संग्रह से पहले टांके वाले अंगों का निरीक्षण करना चाहिए कि टांके जगह में बने रहे और एक छोटा घाव एपिडर्मिस नहीं बना। इसके अतिरिक्त, टांकेदार अंग ऊतक के माध्यम से सैजिटल रूप से विभाजित करना और किसी भी समय हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण करना भी पूरे विच्छेदन विमान को घेरने वाले पूर्ण त्वचा फ्लैप से डर्मिस की उपस्थिति और घाव एपिडर्मिस की अनुपस्थिति को सत्यापित कर सकता है (चित्रा 3)।
चित्रा 1: पूर्ण त्वचा फ्लैप सर्जरी के चरणों की योजनाबद्ध।
प्रोटोकॉल के चरणों को यहां क्रमांकित और आरेखित किया गया है। बिंदीदार रेखाएं प्रोटोकॉल के चरण 1 और 3 पर विच्छेदन के विमानों को निरूपित करती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: सफल और असफल पूर्ण त्वचा फ्लैप सर्जरी के उदाहरण।
एक अंग की प्रतिनिधि ब्राइटफील्ड छवि जो एक सफल सर्जरी (बाएं), एक असफल सर्जरी (दाएं), और 25 दिनों के बाद विच्छेदन (डीपीए) पर एक नियंत्रण पुनर्जन्म अंग (कोई सर्जरी नहीं) से गुजरी है। सफल सर्जरी में एक फ्लैट विच्छेदन विमान होता है जहां पूरी त्वचा फ्लैप को टांका जाता था, जबकि असफल सर्जरी में एक छोटा ब्लास्टेमा विकसित होता है। एरोहेड्स विच्छेदन विमान को निरूपित करते हैं और सफेद बिंदीदार रेखाएं सफल सर्जरी में ब्लास्टेमा की अनुपस्थिति के विज़ुअलाइज़ेशन और असफल सर्जरी में ब्लास्टेमा की उपस्थिति और नियंत्रण के लिए हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: सामान्य regenerating और FSF टांकेदार अंगों के हिस्टोलॉजिकल धुंधला.
(A-B') पिक्रो-मैलोरी दाग वर्गों के प्रतिनिधि brightfield छवियों regenerating (ए-ए') और टांका axolotl अंगों (बी-बी') से 7 dpa पर. A और B में इनसेट क्रमशः A' और B' में दिखाए गए हैं। कोलेजन-भारी त्वचीय परत लाइनों और टांकेदार अंगों में पूरे विच्छेदन विमान को कवर करता है। विच्छेदन विमान को ए-बी में एरोहेड्स द्वारा दर्शाया जाता है। स्केल बार 500 μm का प्रतिनिधित्व करते हैं। इस आंकड़े को त्साई एट अल.25 से अनुकूलित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
Discussion
यह आलेख घाव एपिडर्मिस गठन को बाधित करने के लिए एक्सोलॉटल अंगों में पूर्ण त्वचा फ्लैप सर्जरी करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। जबकि यह सर्जरी घाव एपिडर्मिस गठन को बाधित करने के अन्य तरीकों की तुलना में अपेक्षाकृत सरल और तकनीकी रूप से पुन: प्रस्तुत करने योग्य है, कई महत्वपूर्ण कदम हैं जो सर्जरी की सफलता को प्रभावित कर सकते हैं। सबसे पहले, उजागर अंतर्निहित ऊतकों पर बरकरार पूर्ण त्वचा फ्लैप खींचते समय, यह सर्वोपरि है कि पूर्ण मोटाई वाली त्वचा किसी भी तरह से क्षतिग्रस्त नहीं होती है। त्वचा के फ्लैप को नुकसान अभी भी एक छोटे से घाव एपिडर्मिस के गठन का कारण बन सकता है, जिसके परिणामस्वरूप एक छोटे से ब्लास्टेमा जैसी वृद्धि हो सकती है। दूसरा, सुनिश्चित करें कि पोस्ट-ऑपरेटिव देखभाल के दौरान टांके बाहर न गिरें क्योंकि इससे एक छोटे से घाव एपिडर्मिस का गठन भी हो सकता है। इस बिंदु पर, टांके वाले अंग और किसी भी सतहों के बीच संभावित संपर्क को कम करना महत्वपूर्ण है, खासकर सर्जरी के बाद के पहले सप्ताह के दौरान। इसे रोकने के कई तरीके आवास और एक बड़े पर्याप्त कंटेनर में एक्सोलेटल को एनेस्थेटाइज़ करने के लिए शामिल हैं जैसे कि एक्सोलॉटल में सर्जरी के बाद के चारों ओर जाने के लिए बहुत सारे कमरे हैं।
इस सर्जरी की भी कई सीमाएं हैं। शायद सबसे उल्लेखनीय यह है कि सर्जरी की सफलता का मूल्यांकन केवल दो तरीकों से किया जा सकता है: सर्जरी के पहले दो हफ्तों के दौरान विच्छेदन के दायरे का उपयोग करके घाव एपिडर्मिस की अनुपस्थिति की खोज करने के लिए और / या यह जांचने के लिए कि क्या एक ब्लास्टेमा 3 सप्ताह के भीतर बनता है। जबकि ये तरीके प्रभावी हैं, वे अपेक्षाकृत कम थ्रूपुट हैं। घाव एपिडर्मिस-विशिष्ट मार्करों के लिए भविष्य के ट्रांसजेनिक रिपोर्टर एक्सोलॉटल का विकास सफल बनाम असफल सर्जरी के लिए त्वरित स्क्रीनिंग में सहायता कर सकता है। इसके अलावा, यह सर्जरी युवा जानवरों पर प्रदर्शन करना अधिक कठिन है क्योंकि बरकरार त्वचा अधिक नाजुक है। उप-वयस्क या वयस्क एक्सोलोटल का उपयोग करना इस प्रकार अनुशंसित है।
जबकि यह सर्जरी मूल रूप से एन viridiscens19 में विकसित की गई थी, इसे आसानी से एक्सोलॉटल्स 25,39 के लिए अनुकूलित किया गया है और संभवतः अन्य समन्दर प्रजातियों पर भी लागू किया जा सकता है। संक्षेप में, भविष्य के अंग पुनर्योजी अध्ययनों के लिए इस तकनीक को लागू करने से शोधकर्ताओं को घाव एपिडर्मिस जीव विज्ञान को संबोधित करने के लिए अधिक उपकरण विकसित करने और ब्लास्टेमा गठन शुरू करने में अपने कार्य को चलाने वाले अंतर्निहित तंत्र की पहचान करने के लिए सशक्त बनाया जाएगा।
Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
लेखक अपने निरंतर प्रोत्साहन और अटूट समर्थन के लिए डौग को धन्यवाद देता है, साथ ही साथ पांडुलिपि पर उनकी सहायक प्रतिक्रिया और टिप्पणियों के लिए मेल्टन लैब के सदस्यों को भी धन्यवाद देता है। लेखक हार्वर्ड ऑफिस ऑफ एनिमल रिसोर्सेज (ओएआर) को उनके समर्पित पशु देखभाल के लिए भी धन्यवाद देना चाहते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Curved spring scissors | Fine Scientific Tools | 15009-08 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | |
| Forceps | Fine Scientific Tools | 11252-40 | Need two pairs |
| Nylon monofilament sutures (9-0) | Roboz | SUT-1000-21 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Stereo microscope | Leica | MZ6 | |
| Sulfamerazine sodium salt | Sigma-Aldrich | 127-58-2 | |
| Surgical scissors | Fine Scientific Tools | 14002-14 |
References
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