Vi presenterer en kostnadseffektiv metode for ripemigrasjonsanalysen som gir en ny tilnærming for å bestemme cellemigrasjon uten bruk av utstyrsintensive metoder. Mens fibroblaster ble brukt i denne protokollen, kan den tilpasses og brukes til å studere flere celletyper og påvirkninger på cellemigrasjon.
Cellemigrasjon er en viktig komponent i både fysiologiske og patologiske hendelser. Normal cellemigrasjon er nødvendig for viktige funksjoner som utvikling og montering av immunrespons. Når en defekt eller endring oppstår med cellemigrasjonsprosessen, kan det ha skadelige resultater (det vil si kreftmetastase, sårheling og arrdannelse). På grunn av viktigheten av cellemigrasjon, er det nødvendig å ha tilgang til en cellemigrasjonsanalyse som er rimelig, tilpasningsdyktig og repeterbar. Ved hjelp av den vanlige ripemigrasjonsanalysen har vi utviklet en ny tilnærming til å analysere cellemigrasjon som bruker generelt laboratorieutstyr. Metoden som er beskrevet, bruker visuelle markører som gjør det mulig å gjenerobre bestemte interesseområder uten bruk av time-lapse mikroskopi. I tillegg gir det fleksibilitet i eksperimentell design, alt fra å endre migrasjonsmatrisesubstratet til tilsetning av farmakologiske modifikatorer. Videre skisserer denne protokollen en måte å ta hensyn til celleoverføringsområdet, som ikke vurderes av flere metoder ved undersøkelse av cellemigrasjon. Denne nye tilnærmingen gir en ripemigrasjonsanalyse til et større publikum og vil gi forskerne større mulighet til å undersøke den fysiologiske og patofysiologiske virkningen av cellemigrasjon.
Cellemigrasjon er avgjørende for mange fysiologiske så vel som patologiske hendelser. Det er nødvendig under utvikling, for å montere en immunrespons, og for riktig sårheling1,2,3. Mange av disse cellemigrasjonshendelsene kan utløses av fysiske eller kjemiske signaler. For eksempel, under en immunrespons, vil leukocytter migrere mot et skadested som svar på et kjemoattractant2. I tillegg vil leukocytter også frigjøre cytokiner for å indusere migrering av flere immunceller, samt andre celletyper, for eksempel fibroblaster, som er involvert i sårhelingsprosessen, og dermed initiere en flercellet respons4. Cellenes evne til å migrere er avgjørende for riktig fysiologisk funksjon; Men når cellemigrasjon går ukontrollert, kan det ha en negativ respons og bidra til patologiske hendelser, for eksempel kronisk betennelse, vaskulær sykdom, kreftmetastase og nedsatt sårheling2,3,4,5,6,7. Nedsatt sårheling er en vanlig lidelse av diabetikere på grunn av defekter i cellemigrasjon, og hvis disse feilene ikke er adressert, kan det føre til ytterligere komplikasjoner (f.eks.amputasjon 8,9). Denne studien, så vel som andre, har indikert behovet for å ytterligere forstå prosessen der cellemigrasjon oppstår, enten under normale fysiologiske eller patologiske forhold, og det er viktig for å fremme dette forskningsfeltet. For å oppnå dette må det være migrasjonsanalyser tilgjengelig som er både tilgjengelige og rimelige for de forskerne, som kanskje ikke har utstyret som trengs for å gjennomføre disse analysene.
For øyeblikket finnes det en rekke overføringsanalyser tilgjengelig for å undersøke et bredt spekter av emner angående cellemigrasjon. Både 2D- og 3D-migreringsmodeller er utviklet, hver rettet mot bestemte områder som påvirker cellemigrasjon. 3D migrasjon modeller er vanligvis forbundet med celle invasjon studier og vurdere virkningen av ekstracellulær matrise på celle migrasjon10,11,12,mens 2D migrasjon analyser har et større spekter av søknad og er primært brukt til å studere chemotactic migrasjon, sårheling, og funksjonelle endringer under cellemigrasjon13,14,15,16. Flere av disse analysene krever ekstra utstyr, for eksempel Boyden kamre eller eksklusjonsringer, noe som kan redusere tilgjengeligheten av disse analysene til visse forskere. En av de mer kostnadseffektive analysene er ripeanalysen, som vanligvis brukes til å vurdere sårheling og generelle endringer i cellemigrasjon14,17. Mens de fleste laboratorier er utstyrt for å gjennomføre en ripeanalyse, har utstyret som brukes til å spore cellemigrasjon, en tendens til å enten være utilgjengelig eller for dyrt å kjøpe. Dette inkluderer time-lapse mikroskopi, som krever et omvendt mikroskop og et levende bildesystem. Disse dyre delene av utstyret er ikke allment tilgjengelig for hvert laboratorium. Derfor understreker denne observasjonen behovet for en ny protokoll som gjør det mulig å vurdering av cellemigrasjon med lettere tilgjengelig utstyr.
Protokollen som presenteres her gir en ny og rimelig måte å vurdere cellemigrasjon på. Denne metoden følger samme prosedyre forbundet med ripeanalyser, men varierer i analysen av å undersøke cellemigrasjon ved å bruke utstyr som er mer tilgjengelig i en grunnleggende vitenskapslaboratoriuminnstilling. Denne protokollen ved hjelp av felles utstyr gir en mer nøyaktig bestemmelse av cellemigrasjon uten bruk av time-lapse mikroskopi. I tillegg til å bestemme overføring, står denne metoden også for variable faktorer i kladdeområdet som har blitt notert for å ha stor innvirkning på celleoverføring. Samlet sett gir denne nye protokollen for celleoverføringsanalyse en mulighet for flere laboratorier til å utforske og bidra til cellemigrasjonsområdet.
Denne nye tilnærmingen til scratch migrasjon analyse gir en mer tilgjengelig metode for forskere å undersøke endringer i cellemigrasjon. Selv om denne analysen følger samme prosedyre for å administrere en ripe som ligner på andre ripeanalyser, gir den en ny metode for avbildning og nøyaktig analyse av cellemigrasjon10. I stedet for å bruke utstyrsintensive metoder for tidsforløp mikroskopi og levende celle bildekamre, denne metoden detaljer bruk av allment tilgjengelig lab utstyr. Ved hje…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet støttes av US Army Medical Research Award #81XWH-16-1-0710, University of Mississippi School of Pharmacy og Institutt for biomolekylære vitenskaper.
Adobe All Apps | Adobe | This includes Adobe photoshop which is the imaging software used with this protocol | |
Avant Pipette Tips 200ul Binding non-sterile | MIDSCI | AVR1 | Tips are autoclaved to sterilize |
AxioCam Erc 5s Camera | Zeiss | 426540-9901-000 | |
Coomassie Brilliant Blue R-250 | Fisher Scientific | BP101-25 | |
Costar Flat Bottom Cell Culture Plates 48 Wells | Fisher Scientific | 07-200-86 | |
DMEM with L-Glutamine, 1g/L glucose and sodium pyruvate | Fisher Scientific | MT10014CM | |
Image J | NIH | This is a free software offered by the US government and is the analysis software used with this protocol | |
Paraformaldehyde | Fisher Scientific | AC416785000 | |
Premium US origin fetal bovine serum | Innovative Research | IFBS-HU | |
Primocin | InvivoGEN | ant-pm-2 | This is the anitmicrobial used for with this procotol to culture cardiac fibroblasts |
Zeiss Primovert Microscope | Zeiss | 491206-0002-000 | |
Zen Blue Edition 2.3 software | Zeiss | software comes with camera purchase |