يقدم هذا البروتوكول نهجا لبصمات الأصابع واستكشاف البيانات متعددة الأبعاد التي تم جمعها من خلال كروماتوغرافيا الغاز ثنائي الأبعاد الشاملة إلى جانب قياس الطيف الكتلي. يتم تطبيق خوارزميات التعرف على الأنماط المخصصة (مطابقة القالب) لاستكشاف المعلومات الكيميائية المشفرة في الكسر المتطاير لزيت الزيتون البكر الممتاز (أي volatilome).
وتعد معالجة البيانات وتقييمها خطوات حاسمة في مجال التصوير الكروماتوغرافي الشامل للغاز ثنائي الأبعاد، لا سيما عندما يقترن قياس الطيف الكتلي. قد تكون المعلومات الغنية المشفرة في البيانات ذات قيمة عالية ولكن يصعب الوصول إليها بكفاءة. كثافة البيانات وتعقيدها يمكن أن يؤدي إلى فترات طويلة من التفصيل وتتطلب إجراءات شاقة تعتمد على المحلل. ولذلك، فإن أدوات معالجة البيانات الفعالة التي يمكن الوصول إليها هي المفتاح لتمكين انتشار وقبول هذه التقنية المتقدمة المتعددة الأبعاد في المختبرات للاستخدام اليومي. يستخدم بروتوكول تحليل البيانات المقدم في هذا العمل بصمات الأصابع اللونية ومطابقة القالب لتحقيق هدف التفكيك الآلي للغاية للكروماتوغرافيات المعقدة ثنائية الأبعاد في السمات الكيميائية الفردية للتعرف المتقدم على الأنماط الإعلامية داخل الكروماتوغرافيات الفردية وعبر مجموعات من الكروماتوجرامات. يوفر البروتوكول اتساقا وموثوقية عالية مع تدخل قليل. وفي الوقت نفسه، يمكن الإشراف على المحللين في مجموعة متنوعة من الإعدادات ووظائف القيود التي يمكن تخصيصها لتوفير المرونة والقدرة على التكيف مع الاحتياجات والأهداف المختلفة. يظهر مطابقة القالب هنا ليكون نهجا قويا لاستكشاف زيت الزيتون البكر الممتاز volatilome. يتم تنفيذ المحاذاة المتقاطعة للقمم ليس فقط للأهداف المعروفة ، ولكن أيضا للمركبات غير المستهدفة ، مما يزيد بشكل كبير من قوة التوصيف لمجموعة واسعة من التطبيقات. وتقدم أمثلة على ذلك للدلالة على أداء تصنيف ومقارنة الأنماط اللونية من مجموعات العينات التي تم تحليلها في ظل ظروف مماثلة.
شامل ثنائي الأبعاد الكروماتوغرافيا الغاز جنبا إلى جنب مع الكشف الطيفي كتلة وقت الطيران (GC×GC-TOF MS) هو في الوقت الحاضر النهج التحليلي الأكثر إفادة لتوصيف الكيميائية للعينات المعقدة1،2،3،4،5. في GC×GC، يتم توصيل الأعمدة بشكل متسلسل وربطها بمعامل (على سبيل المثال، واجهة تركيز حرارية أو قائمة على صمام) يحاصر مكونات التملبد من عمود البعد الأول(1D) قبل إعادة حقنها في عمود البعد الثاني(2D). تتم هذه العملية خلال فترة زمنية ثابتة(PM)،تتراوح عموما بين 0.5-8 s. من خلال التشكيل الحراري ، تتضمن العملية محاصرة التبريد والتركيز على نطاق التجويب مع بعض الفوائد لقوة الفصل الشاملة.
على الرغم من GC×GC تقنية فصل ثنائي الأبعاد، تنتج العملية قيم بيانات متسلسلة. يحصل المحول التناظري إلى الرقمي (A/D) على إخراج الإشارات اللونية بتردد معين. ثم يتم تخزين البيانات في أشكال خاصة الملكية التي لا تحتوي فقط على البيانات الرقمية ولكن البيانات الوصفية ذات الصلة (معلومات عن البيانات) كذلك. يساعد المحول A/D المستخدم في أنظمة GC×GC في رسم خرائط لشدة الإشارة اللونية إلى رقم رقمي (DN) كدالة للوقت في البعدين التحليليين. تنتج أجهزة الكشف أحادية القناة (مثل كاشف تأين اللهب (FID) وكاشف التقاط الإلكترونات (ECD) وكاشف الومينومينسيون الكبريتي (SCD) وما إلى ذلك) قيما مفردة لكل وقت لأخذ العينات، في حين تنتج أجهزة الكشف متعددة القنوات (مثل كاشف الطيف الكتلي (MS)) قيما متعددة (عادة، على مدى طيفي) في كل وقت أخذ عينات على طول المدى التحليلي.
لتصور البيانات ثنائيةالأبعاد، يبدأ الإعداد بتنقيط قيم بيانات فترة تعديل واحدة (أو دورة) كأعمدة من وحدات البكسل (عناصر الصورة المقابلة لأحداث الكاشف). على طول تنسيق (المحور ص، من أسفل إلى أعلى) يتم تصور وقت الفصل 2D. تتم معالجة أعمدة البكسل بشكل تسلسلي بحيث تقوم abscissa (المحور X، من اليسار إلى اليمين) بالتقارير عن وقت الفصل 1D. يقدم هذا الترتيب البيانات 2D في نظام تنسيق الديكارتية اليد اليمنى، مع ترتيب الاحتفاظ 1D كفهرس الأول في الصفيف.
تتيح معالجة البيانات للكروماتوجرامات 2D الوصول إلى مستوى أعلى من المعلومات من البيانات الأولية، مما يتيح الكشف عن الذروة 2D، وتحديد الذروة، واستخراج بيانات الاستجابة للتحليل الكمي، والتحليل المقارن.
ويمكن التعامل مع أنماط الذروة 2D كبصمات فريدة للعينة والمركبات المكتشفة كخصائص دقيقة للتحليل الفعال عبر المقارنة. هذا النهج، والمعروفة باسم البصمات المستندة إلى قالب6،7، مستوحاة من بصمات الأصابع البيومترية6. تعتمد أنظمة التحقق التلقائي من بصمات الأصابع البيومترية، في الواقع، على خصائص أطراف أصابع فريدة من نوعها: تشعبات ونهايات التلال، المترجمة والمستخرجة من الانطباعات الموقعة أو الصور التفصيلية. هذه الخصائص، وملامح minutiae اسمه، ثم عبر مطابقة مع القوالب المخزنة المتاحة8،9.
وكما ذكر أعلاه، فإن كل نمط فصل GC×GC يتكون من 2قمم D موزعة بشكل عقلاني على مستوى ثنائي الأبعاد. كل ذروة يتوافق مع تحليل واحد، لديه إمكاناته الإعلامية، ويمكن أن تعامل كميزة واحدة لتحليل نمط المقارنة.
هنا، نقدم نهجا فعالا لأخذ بصمات الأصابع الكيميائية من قبل GC×GC-TOF MS يتميز بالتأين جنبا إلى جنب. والهدف من ذلك هو فهرسة شاملة وكمية الميزات من مجموعة من الكروماتوجرامات.
بالمقارنة مع البرامج التجارية القائمة أو الإجراءات الداخلية10،11 التي تستخدم نهج ذروة الميزات ، تتميز بصمات الأصابع المستندة إلى القالب بخصوصية عالية وكفاءة ووقت حسابي محدود. وبالإضافة إلى ذلك، لديها مرونة جوهرية تمكن من المحاذاة عبر ميزات minutia (أي، 2قمم D) بين الكروماتومات المنحرفة بشدة مثل تلك التي تم الحصول عليها من قبل أجهزة مختلفة أو في دراسات الإطار الزمني الطويل12،13،14.
ويرد وصف موجز للعمليات الأساسية للطريقة المقترحة لتوجيه القارئ إلى فهم جيد لتعقيد النمط 2D وقوة المعلومات. ثم، من خلال استكشاف مصفوفة بيانات إخراج الصك، يتم إجراء تحديد المواد الكيميائية و التحليلية المستهدفة المعروفة الموجودة على الفضاء ثنائي الأبعاد. ثم يتم بناء قالب القمم المستهدفة وتطبيقها على سلسلة من الكروماتوجرامات المكتسبة داخل نفس الدفعة التحليلية. واستخراج البيانات الفوقية المتعلقة بأوقات الاحتفاظ والتوقيعات الطيفية والاستجابات (المطلقة والنسبية) من أنماط إعادة محاذاة القمم المستهدفة واعتمادها للكشف عن الاختلافات التركيبية في مجموعة العينات.
وكخطوة إضافية وفريدة من نوعها في العملية، يتم أيضا أخذ بصمات أصابع مشتركة غير موجهة ومستهدفة (UT) على كروماتوجرامات مستهدفة مسبقا لتوسيع إمكانية أخذ بصمات الأصابع إلى كل من التحليلات المعروفة وغير المعروفة. تنتج العملية قالب UT لتحليل مقارن شامل حقا يمكن أن يكون مؤتمتا إلى حد كبير.
وكخطوة أخيرة، تؤدي الطريقة المحاذاة المتقاطعة للميزات في إشتين متوازيتين للكشف تنتجان طاقات تأين إلكترون عالية ومنخفضة (70 و12 eV).
البروتوكول مرن جدا في دعم التحليلات من الكروماتوغرام واحد أو مجموعة من الكروماتوغرافيا ومع الكروماتوغرافيا المتغيرة و / أو كاشفات متعددة. هنا، يتم عرض البروتوكول مع مجموعة برامج GC×GC متوفرة تجاريا (انظر جدول المواد)مجتمعة إلى مكتبة MS وبرامج البحث (انظر جدول المواد). بعض الأدوات اللازمة متوفرة في برامج أخرى ويمكن تنفيذ أدوات مماثلة بشكل مستقل عن الأوصاف في الأدب من قبل Reichenbach وزملاء العمل15،16،17،18،19. البيانات الأولية للمظاهرة مستمدة من دراسة بحثية عن زيت الزيتون البكر الممتاز (EVO) أجريت في مختبر المؤلفين14. وعلى وجه الخصوص، يتم أخذ عينات من الكسر المتطاير (أي volatilome) من زيوت EVO الإيطالية بواسطة الميكروإكستاتيون المرحلة الصلبة مساحة الرأس (HS-SPME) وتحليلها من قبل GC×GC-TOF MS لالتقاط بصمات التشخيص للجودة والتأهيل الحسي للعينات. وترد تفاصيل عن العينات وظروف أخذ العينات والتهيئة التحليلية في جدول المواد.
تصف الخطوات 1-6 المعالجة المسبقة للكروماتوجرامات. تصف الخطوات 7-9 معالجة وتحليل الكرومات التوضيحية الفردية. تصف الخطوات 10-12 إنشاء القالب ومطابقته، وهما أساس تحليل العينة المشتركة. تصف الخطوات 13-16 تطبيق البروتوكول عبر مجموعة من الكروماتوغرامات، مع الخطوات 14-16 لتحليل UT.
يمثل تصور بيانات GC×GC-TOF MS خطوة أساسية لفهم مناسب للنتائج التي تحققت من خلال عمليات فصل شاملة ثنائية الأبعاد. رسم الصور مع تلوين مخصص يسمح للمحللين لتقدير الاختلافات استجابة كاشف وبالتالي التوزيع التفاضلي لمكونات العينة. هذا النهج البصري يغير تماما وجهة نظر المحللين على تفسير ووضع الكروماتوجرامات. هذه الخطوة الأولى، بمجرد فهمها واستخدامها بثقة من قبل الكروماتوغراف، تفتح منظورا جديدا في المزيد من المعالجة.
10- وثمة جانب أساسي آخر من معالجة البيانات هو إمكانية الوصول إلى مصفوفة البيانات الكاملة (أي البيانات الطيفية للتصلب المتعدد والاستجابات) لجميع نقاط العينة، التي يتوافق كل منها مع حدث كشف واحد. وفي هذا الصدد، يبلغ التكامل بين الأبعاد 2ذروته، بحيث تمثل مجموعة أحداث الكاشف المقابلة للت التحليلي الواحد خطوة حاسمة. في البروتوكول الحالي، يستند الكشف عن قمم 2D على خوارزمية مستجمعات المياه18 مع تضمين بعض التعديلات لتحسين حساسية الكشف في حالة المركبات الجزئية المشتركة. ولجعل هذه العملية أكثر تحديدا، يجب القيام بالانتهاك، واعتماد إجراءات أكثر تطورا. وهذا ممكن عن طريق إجراء الكشف عن ذروة أيون لبيانات مرض التصلب العصبي المتعدد؛ الخوارزمية بمعالجة صفيف البيانات وعزل الاستجابة من التحليلات واحد استنادا إلى التشكيلات الطيفية19،31.
وثمة خطوة هامة ولكنها حاسمة في البروتوكول، وأي عملية لتفسير بيانات GC×GC-MS، تتعلق بتحديد التحليلات. ويجب أن يجري المحلل هذا الإجراء، المقترح في الخطوتين 8 و9، في غياب تحليل تأكيدي مع معايير صحيحة. الإجراءات الآلية متاحة في أي برنامج تجاري؛ وهي تشمل تقييم التشابه في التوقيع الطيفي MS مقابل الأطياف المرجعية المجمعة (أي المكتبات الطيفية) وتقييم النسب المميزة بين الأيونات المؤهلة/الكمية. ومع ذلك، هناك حاجة إلى معايير تأكيد إضافية لدحض تحديد الأيزومرات. ويقترح البروتوكول اعتماد فهارس استبقاء خطية لتحديد أولويات قائمة المرشحين؛ الحد هنا يتعلق بتوفر بيانات الاستبقاء واتساقها.
السمة الرئيسية التي تجعل هذا النهج فريدة من نوعها هو قالب مطابقة12،13،15،29. تمكن مطابقة القالب من التعرف على نمط 2D بطريقة فعالة ومحددة وبديهية للغاية. ويمكن تعيينها، من حيث الحساسية وخصوصية، من خلال تطبيق قيم عتبة مخصصة و / أو وظائف القيد في حين يمكن للمحلل الإشراف على الإجراء من خلال التفاعل بنشاط مع معلمات وظيفة التحويل. وتعتمد خصوصية هذه العملية على إمكانية التوفيق بين معلومات القمم المستهدفة وغير المستهدفة بين عينات من دفعة موحدة ولكن أيضا بين العينات المكتسبة بنفس الشروط الاسمية على الرغم من الاختلال المتوسط إلى الشديد. وتتعلق مزايا هذه العملية بإمكانية الحفاظ على جميع عمليات تحديد الهوية التحليلية المستهدفة، وهي مهمة تستغرق وقتا طويلا بالنسبة للمحلل، وجميع البيانات الوصفية المحفوظة للقمم المستهدفة وغير المستهدفة من جلسات الإعداد السابقة.
مطابقة القالب هو أيضا فعالة جدا من حيث الوقت الحسابية. تتكون ملفات بيانات MS منخفضة الدقة من حوالي 1-2 غيغابايت من البيانات المعبأة بينما قد تصل تحليلات MS عالية الدقة إلى 10-15 غيغابايت لكل شوط تحليلي واحد. مطابقة القالب لا يعالج مصفوفة البيانات الكاملة في كل مرة ولكن، في البداية، ينفذ المحاذاة وقت الاستبقاء بين الكروماتوغرام باستخدام قمم القالب ثم، يعالج قمم المرشح داخل إطار البحث عن تطابق تشابهها مع المرجع في القالب. في حالة الاختلال الشديد ، وهو الوضع الأكثر تحديا ، كان أداء التحويلات العالمية متعددة الحدود من الدرجة الثانية أفضل من الأساليب المحلية مع تقليل الوقت الحسابي13.
10 – لكي تنتشر تقنية GC×GC على نطاق واسع خارج الأوساط الأكاديمية ومختبرات البحوث، يتعين على أدوات معالجة البيانات أن تيسر العمليات الأساسية للتصور وفحص الرسوم اللونية؛ تحديد التحليلات ينبغي أن توفر إمكانية اعتماد خوارزميات موحدة والإجراءات (على سبيل المثال، خوارزمية البحث NIST والمعايرة IT)؛ وينبغي أن يكون التحليل المقارن بديهيا وفعالا ومدعما بأدوات تفاعلية. النهج المقترح يعالج هذه الاحتياجات مع تقديم خيارات وأدوات متقدمة للتعامل مع الحالات المعقدة مثل التحليلات المشتركة elution ، معايرة التحليلات المتعددة ، تحليل نوع المجموعة ، ومحاذاة الكشف الموازية.
تغطي الأدبيات المشار إليها العديد من السيناريوهات المحتملة حيث يقدم GC×GC ، وبشكل أعم ، الكروماتوغرافيا ثنائية الأبعاد الشاملة ، حلولا فريدة ونتائج موثوقة لا يمكن تحقيقها من خلال 1D-chromatography في تحليل تشغيل واحد. 5،32،33 على الرغم من GC ×GC هو أقوى أداة تزيد من قدرة الانفصال والحساسية ، وهناك دائما قيود على قوة الفصل ، والحساسية ، وغيرها من القدرات النظامية. ومع اقتراب هذه الحدود المنهجية، يصبح تحليل البيانات أكثر صعوبة تدريجيا. ولذلك، يجب أن يستمر البحث والتطوير في تحسين الأدوات التحليلية المتاحة لنا.
The authors have nothing to disclose.
وقد دعم البحث بروغيتو أجير – فوندازيوني في ريتي في لا رايسركا agroalimentare. مشروع اختصار الكمان – تثمين منتجات الزيتون الإيطالية من خلال أدوات تحليلية مبتكرة (https://olivoeolio.progettoager.it/index.php/i-progetti-olio-e-olivo/violin-valorization-of-italian-olive-products-through-innovative-analytical-tools/violin-il-progetto). برنامج GC Image متاح لتجربة مجانية للقراء الذين يرغبون في إثبات البروتوكول واختباره.
1D SolGel-Wax column (100% polyethylene glycol; 30 m × 0.25 mm dc × 0.25 μm df). Carrier gas helium at a constant nominal flow of 1.3 mL/min. | Trajan SGE Analytical Science, Ringwood, Australia | PN 054796 | Carrier gas helium at a constant nominal flow of 1.3 mL/min. Oven temperature programming set as follows: 40°C (2 min) to 240°C (10 min) at 3.5°C/min. |
2D OV1701 column (86% polydimethylsiloxane, 7% phenyl, 7% cyanopropyl; 1 m × 0.1 mm dc × 0.10 μm df) from . | Mega, Legnano, Milan, Italy | PN MEGA-1701 | |
Automated system for sample preparation: SPR Autosampler for GC | SepSolve-Analytical, Llantrisant, UK | ||
Extra Virgin Olive oils: Sicily and Tuscany, Italy | Project VIOLIN (Ager – Fondazioni in rete per la ricerca agroalimentare) | Samples (n=10) were collected during the production year 2018 within the "Violin" project sampling campaign. Oils were submitted to HS-SPME to sample volatiles according to a reference protocol validated in a previous study of Stilo et al.14 | |
Gas chromatograph: Model 7890B GC | Agilent Technologies Wilmington DE, USA | ||
GC Image GC×GC edition V 2.9 | GC Image LLC, Lincoln, Nebraska | https://www.gcimage.com/gcxgc/trial.html | |
Image processing software | GC Image LLC, Lincoln, Nebraska | https://www.gcimage.com/gcxgc/trial.html | |
Mass spectrometer: BenchTOF-Select | Markes International Llantrisant, UK | ||
Methyl-2-octynoate (CAS 111-12-6) | Merck-Millipore/Supelco | PN: 68982 | |
Modulator controller: Optimode v2.0 | SRA Intruments, Cernusco sul Naviglio, Milan, Italy | ||
Modulator: KT 2004 loop type | Zoex Corporation Houston, TX, USA | ||
MS library and search software: NIST Library V 2017, Software V 2.3 | National Institute of Standards and Technology (NIST), Gaithersburg MD | https://www.nist.gov/srd/nist-standard-reference-database-1a-v17 | |
n-alkanes C8-C40 for retention indexing | Merck-Millipore/Supelco | PN: 40147-U | |
n-hexane (CAS 110-54-3) gas chromatography MS SupraSolv | Merck-Millipore/Supelco | PN: 100795 | |
Solid Phase Microextraction fiber | Merck-Millipore/Supelco | PN 57914-U | |
α- /β-thujone (CAS 546-80-5) | Merck-Millipore/Sigma Aldrich | PN: 04314 |