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Immunology and Infection

इम्युनोग्लोबुलिन ए नेफ्रोपैथिक चूहों के गुर्दे में माइक्रोआरएनए अभिव्यक्ति का पता लगाना

Published: July 8, 2020 doi: 10.3791/61535
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2, 1, 1, 1, 3, 1
1Division of Nephrology, First Department of Integrated Medicine, Saitama Medical Center, Jichi Medical University, 2Division of Intensive Care Unit, First Department of Integrated Medicine, Saitama Medical Center, Jichi Medical University, 3Department of Medical Physiology, Meiji Pharmaceutical University

Summary

माइक्रोआरएनए आईजीए नेफ्रोपैथी के रोगजनन में शामिल हैं। हमने एक आईजीए नेफ्रोपैथी माउस मॉडल (एचआईजीए चूहों) के गुर्दे में माइक्रोआरएनए अभिव्यक्ति के स्तर का पता लगाने के लिए एक विश्वसनीय विधि विकसित की है। यह नई विधि आईजीए नेफ्रोपैथी में एमआईआरएनए की भागीदारी की जांच करने की सुविधा प्रदान करेगी।

Abstract

इम्युनोग्लोबुलिन ए (आईजीए) नेफ्रोपैथी एक प्रकार का प्राथमिक ग्लोमेरुलोनेफ्राइटिस है जो आईजीए के असामान्य जमाव की विशेषता है, जिससे अंत-चरण गुर्दे की विफलता होती है। हाल के वर्षों में, आईजीए नेफ्रोपैथी के रोगजनन में माइक्रोआरएनए (एमआईआरएनए) की भागीदारी की सूचना मिली है। हालांकि, छोटे पशु मॉडल का उपयोग करके आईजीए नेफ्रोपैथी में एमआईआरएनए की प्रोफाइलिंग के लिए कोई स्थापित विधि नहीं है। इसलिए, हमने एक आईजीए माउस मॉडल (एचआईजीए माउस) के गुर्दे में एमआरएनए का विश्लेषण करने के लिए एक विश्वसनीय विधि विकसित की है। इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य नियंत्रित चूहों के गुर्दे में स्तरों की तुलना में एचआईजीए चूहों के गुर्दे में एमआईआरएनए के परिवर्तित अभिव्यक्ति स्तर का पता लगाना है। संक्षेप में, इस विधि में चार चरण होते हैं: 1) एचआईजीए चूहों से गुर्दे के नमूने प्राप्त करना; 2) गुर्दे के नमूनों से कुल आरएनए को शुद्ध करना; 3) कुल आरएनए से पूरक डीएनए को संश्लेषित करना; और 4) एमआईआरएनए के मात्रात्मक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (क्यूआरटी-पीसीआर)। इस विधि का उपयोग करते हुए, हमने एचआईजीए चूहों के गुर्दे में कई एमआईआरएनए (एमआईआर -155-5 पी, एमआईआर -146 ए -5 पी और एमआईआर -21-5 पी) के अभिव्यक्ति स्तर का सफलतापूर्वक पता लगाया। इस नई विधि को आईजीए नेफ्रोपैथी में एमआईआरएनए की रूपरेखा बनाने वाले अन्य अध्ययनों पर लागू किया जा सकता है।

Introduction

इम्युनोग्लोबुलिन ए (आईजीए) नेफ्रोपैथी एक प्रकार का प्राथमिक ग्लोमेरुलोनेफ्राइटिस है जो गुर्दे के ग्लोमेरुलर मेसांगियलक्षेत्र 1,2 में आईजीए के असामान्य जमाव की विशेषता है। यह प्राथमिक ग्लोमेरुलोनेफ्राइटिस में सबसे आम है और 20% -40% रोगियों में अंतिम चरण गुर्दे की विफलता की ओर जाता है। कारण अभी भी अज्ञात है लेकिन लगातार म्यूकोसल संक्रमण को 1,3 में फंसाया गया है। कॉर्टिकोस्टेरॉइड्स, इम्यूनोसप्रेसेन्ट्स, और रेनिन-एंजियोटेंसिन सिस्टम इनहिबिटर को चिकित्सीय विधियों1,3 के रूप में प्रस्तावित किया गया है, लेकिन पूरी तरह से स्थापित नहीं किया गयाहै। इसलिए, आईजीए नेफ्रोपैथी के इलाज के एटियलजि और चिकित्सीय तरीकों को स्पष्ट करने के लिए आगे के शोध की आवश्यकता है।

माइक्रोआरएनए (एमआईआरएनए) छोटे, गैर-कोडिंग आरएनए हैं जो जीन अभिव्यक्ति 4,5 को विनियमित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। एमआईआरएनए को विभिन्न बीमारियों के रोगजनन में शामिल होने की सूचना दी गई है, और कुछ को रोग बायोमार्कर और चिकित्सीय एजेंट 4,5 के रूप में पहचाना गया है। हाल के वर्षों में, एमआईआरएनए और आईजीए नेफ्रोपैथी के रोगजनन के बीच एक संबंध भी 2,6,7 बताया गया है। उदाहरण के लिए, एमआईआर -148 बी को आईजीए नेफ्रोपैथी 2,6,7 के रोगियों में आईजीए की संरचनात्मक असामान्यताओं में शामिल दिखाया गया था, जबकि एमआईआर -148 बी और एलईटी -7 बी को आईजीए नेफ्रोपैथी7 का पता लगाने के लिए नए बायोमार्कर के रूप में प्रलेखित किया गया था। हालांकि आईजीए नेफ्रोपैथी पर एमआईआरएनए के प्रभावों को समझने से एटियलजि और उपचार2 को और स्पष्ट करने में मदद मिल सकती है, छोटे पशु मॉडल का उपयोग करके आईजीए नेफ्रोपैथी में एमआईआरएनए की रूपरेखा के लिए मानक तरीके अभीतक स्थापित नहीं किए गए हैं।

हमने यहां एक आईजीए नेफ्रोपैथी माउस मॉडल (एचआईजीए चूहों) के गुर्दे में एमआरएनए अभिव्यक्ति के स्तर को मापने के लिए एक सरल और विश्वसनीय विधि विकसित की है। एचआईजीए माउस एक विशिष्ट डीडीवाई स्ट्रेन है जो विशेष रूप से सीरम आईजीए के उच्च स्तर और किडनी ग्लोमेरुली 8,9,10,11 में आईजीए के असामान्य जमाव को दर्शाता है। इसलिए, एचआईजीए चूहों को आईजीए नेफ्रोपैथी माउस मॉडल 8,9,10,11 के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। हमारी विधि में चार प्रमुख चरण शामिल हैं: सबसे पहले, एचआईजीए चूहों से गुर्दे के नमूने प्राप्त करना; दूसरा, सिलिका झिल्ली-आधारित स्पिन कॉलम का उपयोग करके नमूनों को समरूप बनाना और कुल आरएनए को शुद्ध करना; तीसरा, रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन का उपयोग करके कुल आरएनए से पूरक डीएनए (सीडीएनए) को संश्लेषित करना; और चौथा, मात्रात्मक रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (क्यूआरटी-पीसीआर) द्वारा एमआरएनए के अभिव्यक्ति स्तर का पता लगाना। इस विधि के लिए तर्क और परिणामों की विश्वसनीयता पिछली रिपोर्ट12,13 पर आधारित है। हम दिखाते हैं कि यह एक आईजीए नेफ्रोपैथी माउस मॉडल में एमआरएनए अभिव्यक्ति के स्तर को सटीक रूप से मापने के लिए एक उपयोगी तकनीक है, और इसका उपयोग आईजीए नेफ्रोपैथी में एमआईआरएनए में भविष्य के शोध को सुविधाजनक बनाने के लिए किया जा सकता है।

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Protocol

पशु प्रयोगों को जिची मेडिकल यूनिवर्सिटी की पशु नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था और प्रयोगशाला जानवरों के लिए जिची मेडिकल यूनिवर्सिटी गाइड से प्रायोगिक जानवरों के उपयोग और देखभाल दिशानिर्देशों का पालन किया गया था।

1. एचआईजीए चूहों से गुर्दे के नमूने प्राप्त करना।

नोट: एचआईजीए चूहे 8,9,10,11 वर्ष की आयु के 25 सप्ताह के बाद आईजीए नेफ्रोपैथी का एक स्थिर फेनोटाइप दिखाते हैं। सी चूहों को नियंत्रण समूह 8,9,10,11 के रूप में चुना जाना चाहिए। 25 सप्ताह की मादा एचआईजीए चूहों (एन = 10) और 25 सप्ताह की मादा बाल्ब / सी चूहों (एन = 10) को प्राप्त किया गया था। प्रयोगों के लिए आवश्यक चूहों की संख्या को पहले से निर्धारित करना आवश्यक है। इस चरण में 10 एचआईजीए चूहों और 10 बाल्ब / सी चूहों के नमूने के आकार के लिए लगभग 7-8 घंटे की आवश्यकता होती है।

  1. इन वस्तुओं को तैयार करें: एचआईजीए चूहों (25 सप्ताह का, महिला), बाल्ब / सी चूहों (25 सप्ताह का, महिला), इनहेलेशन एनेस्थीसिया उपकरण, आइसोफ्लुरेन, कॉर्क शीट, पिन, फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस), इंजेक्शन सिरिंज, सुई, सर्जिकल कैंची और फोर्स।
  2. इनहेलेशन एनेस्थीसिया उपकरण के साथ 4% -5% आइसोफ्लुरेन का उपयोग करके एक एचआईजीए माउस को एनेस्थेटाइज करें और इसे पिन का उपयोग करके कॉर्क शीट पर पृष्ठीय स्थिति में माउंट करें। संज्ञाहरण के प्रेरण के बाद रखरखाव खुराक के रूप में आइसोफ्लुरेन की एकाग्रता को 2% -3% तक समायोजित करें।
    नोट: संज्ञाहरण की गहराई को एक स्तर पर बनाए रखा जाता है जिस पर आक्रामक प्रक्रिया से जुड़े दर्द पूरी तरह से समाप्त हो जाते हैं। विशेष रूप से, वक्ष जैसे ऊतकों को बाहर निकालते समय आइसोफ्लुरेन एकाग्रता को 4-5% तक समायोजित किया जाना चाहिए। बालों को हटाना और आंखों का मरहम आवश्यक नहीं है। यदि प्रक्रिया जल्दी से की जा सकती है तो माउस को हीटिंग पैड पर माउंट करना आवश्यक नहीं है।
  3. सर्जिकल कैंची और बल के साथ माउस पेट की दीवार का 3-4 सेमी मध्य रेखा चीरा लगाएं और गुर्दे के दोनों किनारों की सावधानीपूर्वक पहचान करें।
  4. हृदय को उजागर करने के लिए सर्जिकल कैंची और बल के साथ पसलियों और डायाफ्राम को इंजकरें। दाएं आलिंद को इंजेक्ट करने के बाद, पीबीएस को बाएं वेंट्रिकल में इंजेक्ट करें जब तक कि गुर्दे का रंग हल्के पीले रंग में बदल न जाए (इस प्रक्रिया का मतलब है कि माउस का पूरा शरीर पीबीएस से संक्रमित है।
  5. गुर्दे की धमनी, गुर्दे की नस और मूत्रवाहिनी को काट लें, और गुर्दे को हटा दें। अगले चरण में उपयोग के लिए गुर्दे को 30 मिलीग्राम के टुकड़ों में विभाजित करें।
    नोट: आईजीए नेफ्रोपैथी की विकृति में मुख्य रूप से गुर्दे के कॉर्टेक्स (गुर्दे का बाहरी हिस्सा) में ग्लोमेरुलस शामिल है। यद्यपि मैक्रोस्कोपिक रूप से और पूरी तरह से कॉर्टेक्स और मज्जा को अलग करना मुश्किल है, लेकिन मुख्य रूप से गुर्दे के बाहरी हिस्से को इकट्ठा करना वांछनीय है। इन नमूनों को कई महीनों तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

2. गुर्दे के नमूनों से कुल आरएनए को शुद्ध करना

नोट: इस चरण में, कुल आरएनए के निष्कर्षण के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एमआरएनए अलगाव किट का उपयोग किया जाता है। इसके अलावा, बायोपॉलिमर-श्रेडिंग स्पिन कॉलम का उपयोग किया जाता है। अतिरिक्त विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें। माइआरएनए आइसोलेशन किट में सिलिका झिल्ली-आधारित स्पिन कॉलम, फिनोल / गुआनिडाइन-आधारित लाइसिस अभिकर्मकों, गुआनिडाइन/ इथेनॉल वॉश बफर (वॉश बफर 1), इथेनॉल वॉश बफर (वॉश बफर 2), और न्यूक्लियस-मुक्त पानी शामिल हैं। इस चरण में 10 एचआईजीए चूहों और 10 नियंत्रण चूहों के नमूना आकार के लिए लगभग 3 घंटे की आवश्यकता होती है।

  1. निम्नलिखित आइटम तैयार करें: 1.5 या 2.0 एमएल संग्रह ट्यूब, 100% इथेनॉल, क्लोरोफॉर्म, सिलिकॉन होमोजिनाइज़र, माइक्रोपिपेट, पिपेट टिप्स, सेंट्रीफ्यूज, बायोपॉलिमर-श्रेडिंग स्पिन कॉलम, सिलिका झिल्ली-आधारित स्पिन कॉलम, फिनोल / गुआनिडाइन-आधारित लाइसिस अभिकर्मकों, गुआनिडाइन / इथेनॉल वॉश बफर (वॉश बफर 1), इथेनॉल वॉश बफर (वॉश बफर 2), और न्यूक्लियस-मुक्त पानी।
  2. कमरे के तापमान पर सिलिकॉन होमोजिनाइज़र और फिनोल / गुआनिडाइन-आधारित लाइसिस अभिकर्मक के 700 μL का उपयोग करके 30 मिलीग्राम गुर्दे के नमूनों को होमोजिनाइज़ करें।
    नोट: नमूने में एमआईआरएनए तब तक कमजोर होते हैं जब तक कि वे फिनोल / गुआनिडाइन-आधारित लाइसिस अभिकर्मक के संपर्क में नहीं आते हैं, इसलिए इन चरणों को तुरंत किया जाना चाहिए।
  3. लाइसेट को बायोपॉलिमर-श्रेडिंग स्पिन कॉलम में स्थानांतरित करें और इसे कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए 15,000 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  4. छानने में क्लोरोफॉर्म के 140 μL जोड़ें और 15 सेकंड के लिए जोर से मिलाएं। 2-3 मिनट के लिए छोड़ दें, फिर 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 12,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  5. मध्य परत को छूने के बिना स्पष्ट सतह पर तैरनेवाला को धीरे से एक नई संग्रह ट्यूब में स्थानांतरित करें और 100% इथेनॉल की निर्धारित मात्रा (नीचे देखें) जोड़ें। 5 सेकंड के लिए भंवर।
    नोट: प्राप्त सुपरनैटेंट की मात्रा 1.5 x पर 100% इथेनॉल की आवश्यकता होती है।
  6. नमूना (ऊपरी सीमा 700 μL) को सिलिका झिल्ली-आधारित स्पिन कॉलम में स्थानांतरित करें और 8,000 x g पर 15 s के लिए कमरे के तापमान पर नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद छानना छोड़ दें।
  7. सिलिका झिल्ली-आधारित स्पिन कॉलम में वॉश बफर 1 के 700 μL जोड़ें और कॉलम को 8,000 x g पर 15 सेकंड के लिए कमरे के तापमान पर सेंट्रीफ्यूज करें। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद छानना छोड़ दें।
  8. सिलिका झिल्ली-आधारित स्पिन कॉलम में वॉश बफर 2 के 500 μL जोड़ें और इसे 8,000 x g पर 15 सेकंड के लिए कमरे के तापमान पर सेंट्रीफ्यूज करें। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद छानना छोड़ दें।
  9. सिलिका झिल्ली-आधारित स्पिन कॉलम में वॉश बफर 2 के 500 μL जोड़ें और इसे 8,000 x g पर 15 सेकंड के लिए कमरे के तापमान पर सेंट्रीफ्यूज करें। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद छानना छोड़ दें।
  10. कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए 15,000 x g पर किसी भी अतिरिक्त इथेनॉल को हटाने के लिए कुछ भी जोड़े बिना सिलिका झिल्ली-आधारित स्पिन कॉलम को फिर से सेंट्रीफ्यूज करें। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद छानना फेंक दें।
  11. स्पिन कॉलम से जुड़ी ट्यूब को एक नई संग्रह ट्यूब में बदलें।
  12. सिलिका झिल्ली-आधारित स्पिन कॉलम में 30 μL न्यूक्लियस-मुक्त पानी जोड़ें और इसे कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए 8,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
    नोट: परिणामी 30 μL समाधान में कुल आरएनए की उच्च सांद्रता होती है। इस नमूने को कई महीनों के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

3. कुल आरएनए से सीडीएनए का संश्लेषण

नोट: इस चरण में, एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन किट का उपयोग किया जाता है। अतिरिक्त विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें। इस किट में न्यूक्लिक एसिड मिक्स, रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस मिक्स और बफर शामिल हैं। प्रतिक्रिया की प्रगति को रोकने के लिए इस प्रक्रिया को बर्फ पर किया जाना चाहिए। इस चरण में 10 एचआईजीए चूहों और 10 नियंत्रण चूहों के नमूना आकार के लिए लगभग 3 घंटे की आवश्यकता होती है।

  1. निम्नलिखित आइटम तैयार करें: 1.5 एमएल संग्रह ट्यूब, आठ-अच्छी तरह से स्ट्रिप ट्यूब, माइक्रोपिपेट, पिपेट टिप्स, स्पेक्ट्रोफोटोमीटर, न्यूक्लियस-मुक्त पानी, बर्फ, न्यूक्लिक एसिड मिक्स, रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज मिक्स, बफर और थर्मल साइकिलर।
  2. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके कुल आरएनए की एकाग्रता को मापें। फिर, न्यूक्लियस-मुक्त पानी की आवश्यक मात्रा की गणना करें ताकि 12 μL में कुल आरएनए का 1 μg हो।
  3. निम्नलिखित सामग्री के साथ एक मास्टर मिश्रण तैयार करें: न्यूक्लिक एसिड मिश्रण का 2.0 μL, रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस मिश्रण का 2.0 μL, और प्रति नमूना कुल 8.0 μL के लिए बफर का 4.0 μL।
  4. आठ-अच्छी तरह से पट्टी ट्यूबों के प्रत्येक कुएं में मास्टर मिश्रण के 8 μL जोड़ें।
  5. 3.2 में गणना किए गए न्यूक्लियस-मुक्त पानी की मात्रा में कुल आरएनए को पतला करें। फिर, आठ-अच्छी तरह से पट्टी ट्यूबों के प्रत्येक कुएं में कुल आरएनए समाधान (कुल आरएनए का 1 μg युक्त) का 12 μL जोड़ें।
  6. थर्मल साइकलर का उपयोग करके 60 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 8 अच्छी तरह से स्ट्रिप ट्यूबों में नमूने को इनक्यूबेट करें। फिर, थर्मल साइकलर का उपयोग करके 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: इनक्यूबेशन के बाद के समाधान में सीडीएनए की उच्च सांद्रता होती है।
  7. इस घोल को 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें और 200 μL न्यूक्लियस-मुक्त पानी जोड़ें।
    नोट: परिणामी 200 μL समाधान का उपयोग QRT-PCR के लिए टेम्पलेट cDNA के रूप में किया जा सकता है। इस नमूने को लगभग 1 वर्ष के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

4. एमआईआरएनए का क्यूआरटी-पीसीआर

नोट: इस चरण में, एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पीसीआर किट का उपयोग किया जाता है। अतिरिक्त विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें। इस किट में पीसीआर मिक्स, यूनिवर्सल प्राइमर और न्यूक्लियस फ्री पानी है। नमूने डुप्लिकेट में तैयार किया जाना चाहिए, और प्रत्येक मामले में परिणामों की सटीकता पर विचार किया जाना चाहिए। MIRNA के अभिव्यक्ति स्तर को त्रिभुज विधि द्वारा परिमाणित किया जाता है। इस चरण में 10 एचआईजीए चूहों और 10 नियंत्रण चूहों के नमूना आकार के लिए लगभग 4 घंटे की आवश्यकता होती है।

  1. निम्नलिखित आइटम तैयार करें: 1.5 एमएल संग्रह ट्यूब, 96-वेल रिएक्शन प्लेट, 96-वेल रिएक्शन प्लेट के लिए चिपकने वाली फिल्म, माइक्रोपिपेट, पिपेट टिप्स, पीसीआर मिक्स, यूनिवर्सल प्राइमर, न्यूक्लियस-फ्री वॉटर, एमआईआरएनए-विशिष्ट प्राइमर, और एक रियल-टाइम पीसीआर उपकरण।
  2. निम्नलिखित सामग्री के साथ मास्टर मिश्रण तैयार करें: पीसीआर मिश्रण का 12.5 μL, सार्वभौमिक प्राइमर का 2.5 μL, 5 μM miRNA-विशिष्ट प्राइमर का 1.25 μL, और प्रत्येक कुएं के लिए 6.25 μL न्यूक्लियस-मुक्त पानी।
    नोट: इस परख में, एमआईआरएनए [आरएनए, यू 6 स्मॉल न्यूक्लियर 2 (आरएनयू 6-2), एमआईआर -155-5 पी, एमआईआर -146 ए -5 पी, और एमआईआर -21-5 पी] के लिए विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग किया गया था। आरएनयू 6-2 का उपयोग अंतर्जात नियंत्रण14 के रूप में किया गया था।
  3. 96 अच्छी प्रतिक्रिया प्लेट के प्रत्येक कुएं में मास्टर मिश्रण के 22.5 μL जोड़ें।
  4. चरण 3.7 में तैयार सीडीएनए के 2.5 μL को 96 वेल प्लेट के अलग-अलग कुएं में जोड़ें।
  5. आसंजन फिल्म के साथ 96 अच्छी तरह से प्रतिक्रिया प्लेट को कवर करें, फिर 30 सेकंड के लिए 1,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  6. रीयल-टाइम पीसीआर उपकरण चलाएँ। पीसीआर उपकरण को निम्नानुसार प्रोग्राम करें: 15 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर प्रारंभिक सक्रियण, फिर 15 सेकंड के लिए 94 डिग्री सेल्सियस पर विकृतीकरण के 40 चक्र, 30 सेकंड के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर एनीलिंग, और 30 सेकंड के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर विस्तार।
  7. त्रिभुज विधि का उपयोग करके जीन अभिव्यक्ति की मात्रा निर्धारित करें। सापेक्ष अभिव्यक्ति स्तर 2-त्रिभुज के रूप में निर्धारित किए जाते हैं।
    नोट: परिणामों से बहिष्करण के लिए असामान्य पीसीआर प्रवर्धन वक्रों पर विचार किया जाना चाहिए।

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Representative Results

हमने एचआईजीए चूहों (एन = 10) के गुर्दे में एमआईआरएनए के अभिव्यक्ति स्तर की जांच की। यह परिणाम पूरी तरह से वर्णित प्रोटोकॉल के आधार पर प्राप्त किया गया था। सी चूहों के गुर्दे को नियंत्रण (एन = 10) के रूप में चुना गया था। दोनों समूहों में, 25 सप्ताह की आयु का चयन किया गया था। आपूर्तिकर्ता से केवल मादा एचआईजीए चूहे उपलब्ध थे। तीन एमआईआरएनए (एमआईआर -155-5 पी, एमआईआर -146 ए -5 पी, और एमआईआर -21-5 पी) के अभिव्यक्ति स्तर; चित्र 1) पता लगाया गया था, जिसे पहले आईजीए नेफ्रोपैथी15,16 से जुड़ा बताया गया था। दो समूहों के सापेक्ष एमआरएनए अभिव्यक्ति स्तरों की तुलना टी-टेस्ट का उपयोग करके की गई थी, जिसमें पी < 0.05 सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण था। MIR-155-5p को नियंत्रण समूह (P < 0.001) की तुलना में HIGA समूह में 3.3 गुना उच्च स्तर पर व्यक्त किया गया था, जबकि MIR-21-5p को HIGA समूह (P = 0.007) में 1.58 गुना उच्च स्तर पर व्यक्त किया गया था। MIR-146a-5p अभिव्यक्ति दो समूहों के बीच काफी भिन्न नहीं थी।

Figure 1
चित्रा 1: एचआईजीए चूहों के गुर्दे में एमआईआरएनए के अभिव्यक्ति स्तर। QRT-PCR ने HIGA चूहों (n = 10) और Balb/c चूहों (n = 10) में MIR-155-5p, MIR-146a-5p और MIR-21-5p के सापेक्ष अभिव्यक्ति स्तर निर्धारित किए। सापेक्ष अभिव्यक्ति स्तर माध्य मान और मानक त्रुटियों के रूप में दिखाए जाते हैं। (ए) एमआईआर -155-5 पी अभिव्यक्ति एचआईजीए समूह (पी < 0.001) में 3.3 गुना अधिक थी। (बी) एमआईआर -146 ए -5 पी अभिव्यक्ति दो समूहों के बीच महत्वपूर्ण रूप से भिन्न नहीं थी। (सी) एमआईआर -21-5 पी अभिव्यक्ति एचआईजीए समूह (पी = 0.007) में 1.58 गुना अधिक थी। मात्रात्मक वास्तविक समय रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (क्यूआरटी-पीसीआर); माइक्रोआरएनए (एमआईआरएनए); महत्वपूर्ण नहीं (एनएस); *, पी <0.05। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

हम इस नई विधि का उपयोग करके एक आईजीए नेफ्रोपैथी माउस मॉडल (एचआईजीए चूहों) के गुर्दे में एमआईआरएनए के अभिव्यक्ति स्तर को मापने में सक्षम थे। आईजीए नेफ्रोपैथी एक अस्पष्टीकृत बीमारी है जिसे इसके एटियलजि और चिकित्सीय लक्ष्योंको स्पष्ट करने के लिए और शोध की आवश्यकता है। हालांकि, मानव गुर्दे के नमूने प्राप्त करना अत्यधिक आक्रामक है। यह नई तकनीक इस मायने में फायदेमंद है कि यह छोटे जानवरों का उपयोग करके आईजीए नेफ्रोपैथी के अध्ययन की अनुमति देता है और आईजीए नेफ्रोपैथी और एमआईआरएनए में भविष्य के शोध की सुविधा प्रदान करनी चाहिए। भविष्य के एक अध्ययन में, इस विधि को आईजीए नेफ्रोपैथी के उपचार के लिए नए एमआईआरएनए के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है। एचआईजीए चूहों में एमआईआरएनए का कृत्रिम मॉड्यूलेशन आईजीए नेफ्रोपैथी के फेनोटाइप को प्रभावित कर सकता है। उस स्थिति में, यह विधि एमआईआरएनए के परिवर्तनों को सत्यापित करने के लिए उपयोगी हो सकती है। यह विधि सीरम में एमआईआरएनए का विश्लेषण करने के लिए अभिप्रेत नहीं है, लेकिन प्रोटोकॉल को संशोधित करके इसके लिए इसका उपयोग करना संभव हो सकता है।

इस पद्धति का औचित्य पिछली रिपोर्टों पर आधारित है। हमने नमूने में बायोपॉलिमर को बाधित करने के लिए बायोपॉलिमर-श्रेडिंग स्पिन कॉलम का उपयोग किया, जिसे पहले एक प्रभावी तकनीक12 के रूप में दिखाया गया है। पिछली रिपोर्टों ने रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन का उपयोग करके कुल आरएनए से सीडीएनए को संश्लेषित करने और तैयार सीडीएनए को टेम्पलेट13 के रूप में उपयोग करके पीसीआर प्रदर्शन करने की सटीकता का भी प्रदर्शन किया है। इस पद्धति में एक महत्वपूर्ण कदम के रूप में, पीसीआर परिणामों का मूल्यांकन महत्वपूर्ण है। परिणामों से असामान्य प्रवर्धन वक्रों को बाहर करना आवश्यक है। इसके अलावा, अंतर्जात नियंत्रण ों में परिवर्तन पर विचार किया जाना चाहिए यदि स्थिरपरिणाम प्राप्त नहीं होते हैं।

एक बड़ी समस्या जो इस विधि के साथ सामना की जा सकती है वह एमआईआरएनए की असामान्य रूप से कम अभिव्यक्ति है। एमआईआरएनए अत्यधिक डिग्रेडेबल यौगिक हैं इसलिए विधि को जल्दी से किया जाना चाहिए। इसके अतिरिक्त, प्रयोगात्मक वातावरण में राइबोन्यूक्लिज़ (आरएनएस) के प्रभावों को समाप्त करने की आवश्यकता है। शोधकर्ताओं को हमेशा त्वचाऔर बालों में RNase की उपस्थिति के बारे में पता होना चाहिए। प्रयोगों के लिए डिस्पोजेबल दस्ताने, मास्क और हेयर कैप पहनना आवश्यक है। इसके अलावा, प्रयोगशाला उपकरण जैसे माइक्रोपिपेट, पिपेट टिप्स, और संग्रह ट्यूबों को RNase17 की अनुपस्थिति सुनिश्चित करने के लिए साफ किया जाना चाहिए। एक आटोक्लेव का उपयोग करके RNase को निष्क्रियकरना आवश्यक रूप से किया जाना चाहिए। अन्यथा, शोधकर्ताओं को RNase-मुक्त-प्रमाणित आइटम17 का उपयोग करना चाहिए। सभी नमूनों को आरएनएस संदूषण के जोखिम को कम करने के लिए अनुशंसित शर्तों के तहत ठीक से संग्रहीत किया जाना चाहिए।

हमारी विधि की तीन महत्वपूर्ण सीमाएँ हैं। पहला यह है कि हमने यह प्रदर्शित नहीं किया कि क्या इसे अन्य जानवरों और अन्य अंगों पर लागू किया जा सकता है। यह प्रासंगिक है क्योंकि एमआईआरएनए को आईजीए नेफ्रोपैथी 2,6,7 में रक्त कोशिकाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए जाना जाता है, लेकिन हमने जांच नहीं की कि हमारी विधि का उपयोग रक्त कोशिकाओं में किया जा सकता है या नहीं। दूसरा, हमारे प्रयोगों का नमूना आकार छोटा हो सकता है। नमूना आकार अध्ययन डिजाइन, सांख्यिकीय विश्लेषण, आवश्यक समय और आवश्यक लागतों के आधार पर निर्धारित किया जाना चाहिए। इसलिए, प्रत्येक शोधकर्ता को इस प्रयोग को शुरू करने से पहले उचित नमूना आकार निर्धारित करना चाहिए। तीसरा, एचआईजीए चूहों में आईजीए नेफ्रोपैथी की गंभीरता औरफेनोटाइप व्यक्तियों के बीच भिन्न हो सकते हैं। इसके अलावा, सेक्स और उम्र के पूर्वाग्रह की पूरी तरह से जांच नहीं की गई है। यदि आवश्यक हो, तो आईजीए नेफ्रोपैथी की गंभीरता और फेनोटाइप की पुष्टि करने के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री को जोड़ने की सिफारिश की जाती है। इसके अलावा, पीसीआर के अलावा अन्य विधियों, जिसमें माइक्रोएरे, उत्तरी सोख्ता और राइबोन्यूक्लिज़ संरक्षण परख शामिल हैं, को आवश्यकतानुसार प्रदर्शन करने की सिफारिश की जाती है।

निष्कर्ष में, हमने एक आईजीए माउस मॉडल (एचआईजीए चूहों) के गुर्दे में एमआईआरएनए के अभिव्यक्ति स्तर को मापने के लिए एक विश्वसनीय विधि विकसित की।

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Disclosures

लेखक ों ने घोषणा की है कि उनके पास हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम इस पांडुलिपि के मसौदे को संपादित करने के लिए एडांज ग्रुप (www.edanzediting.com) से सारा विलियम्स, पीएचडी को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BALB/cCrSlc (25-week-old, female) Japan SLC, Inc. none Mouse for control
HIGA/NscSlc (25-week-old, female) Japan SLC, Inc. none IgA nephropathy mouse model
MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR Thermo Fisher Scientific 4316813 96-well reaction plate
MicroAmp Optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific 4311971 adhesive film for 96-well reaction plate
miScript II RT kit Qiagen 218161 Experimental kit for synthesis of cDNA
miRNeasy Mini kit Qiagen 217004 Experimental kit fot extraction of total RNA
miScript Primer Assay (RNU6-2) Qiagen MS00033740 miRNA-specific primer
miScript Primer Assay (miR-155-5p) Qiagen MS00001701 miRNA-specific primer
miScript Primer Assay (miR-146a-5p) Qiagen MS00001638 miRNA-specific primer
miScript Primer Assay (miR-21-5p) Qiagen MS00009079 miRNA-specific primer
miScript SYBR Green PCR kit Qiagen 218073 Experimental kit for real-time PCR
QIA shredder Qiagen 79654 biopolymer-shredding spin column
QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system Thermo Fisher Scientific 4472380 real-time PCR instrument
QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. Thermo Fisher Scientific 4472380 real-time PCR instrument software
takara biomasher standard Takara Bio 9790B silicon homogenizer

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References

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इस महीने जोव में अंक 161 माइक्रोआरएनए आईजीए नेफ्रोपैथी एचआईजीए माउस क्यूआरटी-पीसीआर किडनी अभिव्यक्ति।
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Kaneko, S., Yanai, K., Ishii, H., Aomatsu, A., Ito, K., Hirai, K., Ookawara, S., Ishibashi, K., Morishita, Y. Detection of MicroRNA Expression in the Kidneys of Immunoglobulin A Nephropathic Mice. J. Vis. Exp. (161), e61535, doi:10.3791/61535 (2020).

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