Summary
Los microARN están implicados en la patogénesis de la nefropatía por IgA. Hemos desarrollado un método fiable para detectar los niveles de expresión de microARN en los riñones de un modelo de ratón con nefropatía IgA (ratones HIGA). Este nuevo método facilitará la comprobación de la participación de los miRNAs en la nefropatía por IgA.
Abstract
La nefropatía por inmunoglobulina A (IgA) es un tipo de glomerulonefritis primaria caracterizada por el depósito anormal de IgA, que conduce a la insuficiencia renal terminal. En los últimos años, se ha reportado la participación de microRNAs (miRNAs) en la patogénesis de la nefropatía por IgA. Sin embargo, no existe un método establecido para perfilar miRNAs en la nefropatía por IgA utilizando modelos de animales pequeños. Por lo tanto, desarrollamos un método confiable para analizar miRNA en el riñón de un modelo de ratón IgA (ratón HIGA). El objetivo de este protocolo es detectar los niveles de expresión alterados de miRNAs en los riñones de ratones HIGA en comparación con los niveles en riñones de ratones control. En resumen, este método consta de cuatro pasos: 1) obtención de muestras de riñón de ratones HIGA; 2) purificar el ARN total de muestras de riñón; 3) sintetizar ADN complementario a partir de ARN total; y 4) reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa (qRT-PCR) de miRNAs. Usando este método, detectamos con éxito los niveles de expresión de varios miRNAs (miR-155-5p, miR-146a-5p y miR-21-5p) en los riñones de ratones HIGA. Este nuevo método se puede aplicar a otros estudios que perfilan miRNAs en nefropatía por IgA.
Introduction
La nefropatía por inmunoglobulina A (IgA) es un tipo de glomerulonefritis primaria caracterizada por el depósito anormal de IgA en la región mesangial glomerular renal 1,2. Es la más común de las glomerulonefritis primarias y conduce a la insuficiencia renal terminal en 20-40% de los pacientes2. La causa aún se desconoce, pero la infección persistente de la mucosa ha sido implicada 1,3. Los corticosteroides, inmunosupresores e inhibidores del sistema renina-angiotensina han sido propuestos como métodos terapéuticos1,3, pero no han sido completamente establecidos 3. Por lo tanto, se necesita investigación adicional para aclarar la etiología y los métodos terapéuticos para tratar la nefropatía por IgA.
Los microARN (miARN) son pequeños ARN no codificantes que desempeñan un papel importante en la regulación de la expresión génica 4,5. Se informa que los miARN están involucrados en la patogénesis de diversas enfermedades, y algunos han sido identificados como biomarcadores de enfermedades y agentes terapéuticos 4,5. En los últimos años, también se ha descrito una asociación entre los miRNAs y la patogénesis de la nefropatía por IgA 2,6,7. Por ejemplo, se demostró que miR-148b estaba involucrado en anomalías estructurales de IgA en pacientes con nefropatía por IgA 2,6,7, mientras que miR-148b y let-7b se documentaron como nuevos biomarcadores para detectar la nefropatía por IgA7. Aunque comprender los efectos de los miARN sobre la nefropatía por IgA puede ayudar a dilucidar aún más la etiología y el tratamiento 2, aún no se han establecido métodos estándar para perfilar los miARN en la nefropatía por IgA utilizando modelos de animales pequeños2.
Aquí desarrollamos un método simple y confiable para medir los niveles de expresión de miARN en los riñones de un modelo de ratón con nefropatía por IgA (ratones HIGA). El ratón HIGA es una cepa ddY característica que muestra un nivel particularmente alto de IgA sérica y el depósito anormal de IgA en los glomérulos renales 8,9,10,11. Por lo tanto, los ratones HIGA se pueden utilizar como un modelo de ratón de nefropatía por IgA 8,9,10,11. Nuestro método consta de cuatro pasos principales: primero, obtener quirúrgicamente muestras de riñón de ratones HIGA; segundo, homogeneizar muestras y purificar el ARN total utilizando una columna de espín basada en membrana de sílice; tercero, sintetizar ADN complementario (ADNc) a partir de ARN total mediante transcripción inversa; y cuarto, detectar los niveles de expresión de miRNA mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa (qRT-PCR). La justificación de este método y la fiabilidad de los resultados se basan en informes anteriores12,13. Demostramos que esta es una técnica útil para medir con precisión los niveles de expresión de miARN en un modelo de ratón con nefropatía por IgA, y que podría usarse para facilitar futuras investigaciones sobre miARN en la nefropatía por IgA.
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Protocol
Los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad Médica de Jichi y cumplen con las pautas de uso y cuidado de animales experimentales de la Guía para animales de laboratorio de la Universidad Médica de Jichi.
1. Obtención de muestras de riñón de ratones HIGA
NOTA: Los ratones HIGA muestran un fenotipo estable de nefropatía por IgA después de las 25 semanas de edad 8,9,10,11. Los ratones Balb/c deben seleccionarse como grupo control 8,9,10,11. Se obtuvieron ratones HIGA hembra de 25 semanas de edad (n = 10) y ratones Balb/c hembra de 25 semanas de edad (n = 10). Es necesario determinar el número de ratones necesarios para los experimentos de antemano. Este paso requiere aproximadamente 7-8 h para un tamaño de muestra de 10 ratones HIGA y 10 ratones Balb/c.
- Prepare estos artículos: ratones HIGA (hembra de 25 semanas de edad), ratones Balb/c (hembras de 25 semanas de edad), aparatos de anestesia por inhalación, isoflurano, lámina de corcho, alfiler, solución salina tamponada con fosfato (PBS), jeringas para inyección, agujas, tijeras quirúrgicas y fórceps.
- Anestesiar un ratón HIGA usando 4%-5% de isoflurano con aparato de anestesia por inhalación y montarlo en posición dorsal en la lámina de corcho usando alfileres. Ajustar la concentración de isoflurano a 2%-3% como dosis de mantenimiento después de la inducción de la anestesia.
NOTA: La profundidad de la anestesia se mantiene a un nivel en el que el dolor asociado con el procedimiento invasivo se elimina por completo. En particular, la concentración de isoflurano debe ajustarse al 4-5% cuando se extirpan tejidos como el tórax. La depilación y la pomada para los ojos no son esenciales. No es necesario montar el mouse en una almohadilla térmica si el procedimiento se puede realizar rápidamente. - Haga una incisión de 3-4 cm en la línea media de la pared abdominal del ratón con tijeras quirúrgicas y fórceps e identifique cuidadosamente ambos lados del riñón.
- Incise las costillas y el diafragma con tijeras quirúrgicas y fórceps para exponer el corazón. Después de incidir la aurícula derecha, inyecte PBS en el ventrículo izquierdo hasta que el color del riñón cambie a amarillo pálido (este procedimiento significa que todo el cuerpo del ratón se perfunde con PBS).
- Cortar la arteria renal, la vena renal y el uréter, y extirpar el riñón. Divida el riñón en trozos de 30 mg para usar en el siguiente paso.
NOTA: La patología de la nefropatía por IgA afecta principalmente al glomérulo de la corteza renal (parte externa del riñón). Aunque es difícil distinguir macroscópicamente y completamente la corteza y la médula, es deseable recolectar principalmente la parte externa del riñón. Estas muestras pueden almacenarse a –80 °C durante varios meses.
2. Purificación del ARN total de muestras renales
NOTA: En este paso, se utiliza el kit de aislamiento de miARN disponible comercialmente para la extracción de ARN total. Además, se utiliza una columna de centrifugado de biopolímeros. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles adicionales. El kit de aislamiento de miARN contiene una columna de espín a base de membrana de sílice, reactivos de lisis a base de fenol/guanidina, tampón de lavado de guanidina/etanol (tampón de lavado 1), tampón de lavado de etanol (tampón de lavado 2) y agua libre de nucleasas. Este paso requiere aproximadamente 3 h para un tamaño de muestra de 10 ratones HIGA y 10 ratones control.
- Prepare los siguientes elementos: tubos de recolección de 1.5 o 2.0 ml, etanol al 100%, cloroformo, homogeneizador de silicio, micropipetas, puntas de pipeta, centrífuga, columna de centrifugado de biopolímeros, columna de espín a base de membrana de sílice, reactivos de lisis a base de fenol/guanidina, tampón de lavado de guanidina/etanol (tampón de lavado 1), tampón de lavado de etanol (tampón de lavado 2) y agua libre de nucleasa.
- Homogeneizar muestras de riñón de 30 mg utilizando un homogeneizador de silicio y 700 μL del reactivo de lisis a base de fenol/guanidina a temperatura ambiente.
NOTA: Los miRNAs en la muestra son vulnerables hasta que han sido expuestos al reactivo de lisis a base de fenol/guanidina, por lo que estos pasos deben realizarse con prontitud. - Transfiera el lisado a la columna de centrifugado de biopolímero y centrifugarlo a 15.000 x g durante 2 min a temperatura ambiente.
- Añadir 140 μL de cloroformo al filtrado y mezclar vigorosamente durante 15 s. Dejar actuar durante 2-3 min, luego centrifugar a 12.000 x g a 4 °C durante 15 min.
- Transfiera suavemente el sobrenadante transparente sin tocar la capa intermedia a un nuevo tubo de recolección y agregue el volumen determinado (ver más abajo) de etanol al 100%. Vórtice durante 5 s.
NOTA: Se requiere etanol al 100% a 1,5 veces el volumen del sobrenadante obtenido. - Transfiera la muestra (límite superior 700 μL) a una columna de centrifugado a base de membrana de sílice y centrifugar la muestra a temperatura ambiente durante 15 s a 8.000 x g. Deseche el filtrado después de la centrifugación.
- Añadir 700 μL de tampón de lavado 1 a la columna de centrifugado a base de membrana de sílice y centrifugar la columna a temperatura ambiente durante 15 s a 8.000 x g. Deseche el filtrado después de la centrifugación.
- Añadir 500 μL de tampón de lavado 2 a la columna de centrifugado a base de membrana de sílice y centrifugarla a temperatura ambiente durante 15 s a 8.000 x g. Deseche el filtrado después de la centrifugación.
- Añadir 500 μL de tampón de lavado 2 a la columna de centrifugado a base de membrana de sílice y centrifugarla a temperatura ambiente durante 15 s a 8.000 x g. Deseche el filtrado después de la centrifugación.
- Centrifugar de nuevo la columna de centrifugado a base de membrana de sílice sin añadir nada para eliminar el etanol adicional, a 15.000 x g durante 1 minuto a temperatura ambiente. Deseche el filtrado después de la centrifugación.
- Cambie el tubo conectado a la columna de centrifugado por un nuevo tubo de recolección.
- Agregue 30 μL de agua libre de nucleasas a la columna de centrifugado a base de membrana de sílice y centrifugarla a 8,000 x g durante 1 minuto a temperatura ambiente.
NOTA: La solución resultante de 30 μL contiene una alta concentración de ARN total. Esta muestra puede almacenarse a –80 °C durante varios meses.
3. Síntesis de ADNc a partir de ARN total
NOTA: En este paso, se utiliza un kit de transcripción inversa disponible comercialmente. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles adicionales. Este kit contiene mezcla de ácidos nucleicos, mezcla de transcriptasa inversa y tampón. Este procedimiento debe realizarse en hielo para evitar el progreso de la reacción. Este paso requiere aproximadamente 3 h para un tamaño de muestra de 10 ratones HIGA y 10 ratones control.
- Prepare los siguientes elementos: tubos de recolección de 1,5 ml, tubos de tira de ocho pocillos, micropipetas, puntas de pipetas, espectrofotómetro, agua libre de nucleasas, hielo, mezcla de ácidos nucleicos, mezcla de transcriptasa inversa, tampón y termociclador.
- Mida la concentración de ARN total usando un espectrofotómetro. Luego, calcule el volumen requerido de agua libre de nucleasas para que 12 μL contengan 1 μg de ARN total.
- Prepare una mezcla maestra con el siguiente contenido: 2.0 μL de mezcla de ácidos nucleicos, 2.0 μL de mezcla de transcriptasa inversa y 4.0 μL de tampón hasta un total de 8.0 μL por muestra.
- Agregue 8 μL de la mezcla maestra a cada pocillo de tubos de tira de ocho pocillos.
- Diluir el ARN total en el volumen de agua libre de nucleasas calculado en 3.2. Luego, agregue 12 μL de la solución de ARN total (que contiene 1 μg de ARN total) a cada pocillo de tubos de tira de ocho pocillos.
- Incubar la muestra en tubos de 8 pocillos a 37 °C durante 60 min utilizando el termociclador. A continuación, incubar a 95 °C durante 5 min utilizando el termociclador.
NOTA: La solución después de la incubación contiene una alta concentración de ADNc. - Transfiera esta solución a un tubo de 1,5 ml y agregue 200 μL de agua libre de nucleasas.
NOTA: Los 200 μL de solución resultantes se pueden utilizar para qRT-PCR como ADNc plantilla. Esta muestra puede almacenarse a –80 °C durante aproximadamente 1 año.
4. qRT-PCR de miRNA
NOTA: En este paso, se utiliza un kit de PCR disponible comercialmente. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles adicionales. Este kit contiene mezcla de PCR, cebador universal y agua libre de nucleasas. Las muestras deben prepararse por duplicado, y la exactitud de los resultados debe considerarse en cada caso. Los niveles de expresión de miRNA se cuantifican mediante el método ΔΔCT. Este paso requiere aproximadamente 4 h para un tamaño de muestra de 10 ratones HIGA y 10 ratones control.
- Prepare los siguientes elementos: tubo de recolección de 1,5 ml, placa de reacción de 96 pocillos, película adhesiva para la placa de reacción de 96 pocillos, micropipetas, puntas de pipeta, mezcla de PCR, cebador universal, agua libre de nucleasas, cebadores específicos de miARN y un instrumento de PCR en tiempo real.
- Prepare la mezcla maestra con el siguiente contenido: 12,5 μL de mezcla de PCR, 2,5 μL de cebador universal, 1,25 μL de cebador específico de miARN de 5 μM y 6,25 μL de agua libre de nucleasas para cada pozo.
NOTA: En este ensayo, se utilizaron cebadores específicos para miRNAs [ARN, U6 Small Nuclear 2 (RNU6-2), miR-155-5p, miR-146a-5p y miR-21-5p]. RNU6-2 fue utilizado como control endógeno14. - Agregue 22.5 μL de la mezcla maestra a cada pocillo de la placa de reacción de 96 pocillos.
- Añadir 2,5 μL de ADNc preparado en el paso 3.7 al pocillo individual de la placa de 96 pocillos.
- Cubra la placa de reacción de 96 pocillos con una película de adhesión, luego centrifugar a 1.000 x g durante 30 s.
- Ejecute el instrumento de PCR en tiempo real. Programe el instrumento de PCR de la siguiente manera: activación inicial a 95 °C durante 15 min, luego 40 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 15 s, recocido a 55 °C durante 30 s y extensión a 70 °C durante 30 s.
- Cuantificar la expresión génica utilizando el método ΔΔCT. Los niveles de expresión relativos se determinan como 2–ΔΔCT.
NOTA: Las curvas de amplificación por PCR anormales deben considerarse para su exclusión de los resultados.
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Representative Results
Investigamos los niveles de expresión de miRNAs en los riñones de ratones HIGA (n = 10). Este resultado se obtuvo completamente en base al protocolo descrito. Los riñones de ratones Balb/c fueron seleccionados como control (n=10). En ambos grupos, se seleccionaron las 25 semanas de edad. Solo los ratones HIGA hembra estaban disponibles en el proveedor. Los niveles de expresión de tres miRNAs (miR-155-5p, miR-146a-5p y miR-21-5p; Figura 1) fueron detectados, que previamente fueron reportados como asociados a nefropatía por IgA15,16. Los niveles relativos de expresión de miARN de los dos grupos se compararon mediante una prueba t, siendo P < 0,05 estadísticamente significativo. miR-155-5p se expresó en niveles 3,3 veces más altos en el grupo HIGA en comparación con el grupo control (P < 0,001), mientras que miR-21-5p se expresó en niveles 1,58 veces más altos en el grupo HIGA (P = 0,007). La expresión de miR-146a-5p no difirió significativamente entre los dos grupos.
Figura 1: Niveles de expresión de miRNAs en los riñones de ratones HIGA. qRT-PCR determinó los niveles de expresión relativos de miR-155-5p, miR-146a-5p y miR-21-5p en ratones HIGA (n = 10) y ratones Balb/c (n = 10). Los niveles de expresión relativos se muestran como valores medios y errores estándar. (A) La expresión de miR-155-5p fue 3,3 veces mayor en el grupo HIGA (P < 0,001). (B) la expresión de miR-146a-5p no difirió significativamente entre los dos grupos. (C) la expresión de miR-21-5p fue 1,58 veces mayor en el grupo HIGA (P = 0,007). reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR); microARN (miRNAs); no significativo (NS); *, p <0,05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Pudimos medir los niveles de expresión de miRNAs en los riñones de un modelo de ratón con nefropatía IgA (ratones HIGA) utilizando este nuevo método. La nefropatía por IgA es una enfermedad inexplicable que necesita más investigación para aclarar su etiología y dianas terapéuticas 1,3. Sin embargo, la obtención de muestras de riñón humano es altamente invasiva. Esta nueva técnica es ventajosa porque permite el estudio de la nefropatía por IgA utilizando animales pequeños y debería facilitar futuras investigaciones sobre la nefropatía por IgA y los miARN. En un estudio futuro, este método podría aplicarse al estudio de nuevos miRNAs para el tratamiento de la nefropatía por IgA. La modulación artificial de miRNAs en ratones HIGA puede influir en el fenotipo de la nefropatía por IgA. En ese caso, este método puede ser útil para verificar los cambios de los miRNAs. Este método no está destinado a analizar miRNAs en suero, pero puede ser posible utilizarlo para esto modificando el protocolo.
La justificación de este método se basa en informes anteriores. Utilizamos columnas de espín trituradoras de biopolímeros para interrumpir los biopolímeros en la muestra, lo que previamente ha demostrado ser una técnica efectiva12. Informes anteriores también han demostrado la precisión de sintetizar ADNc a partir de ARN total utilizando transcripción inversa y realizar PCR utilizando el ADNc preparado como plantilla13. Como paso crítico en este método, la evaluación de los resultados de la PCR es importante. Es necesario excluir las curvas de amplificación anormales de los resultados. Además, se deben considerar cambios en los controles endógenos si no se obtienen resultados estables14.
Un problema importante que se puede encontrar con este método es la expresión anormalmente baja de miRNAs. Los miRNAs son compuestos altamente degradables, por lo que el método debe realizarse rápidamente. Además, es necesario eliminar los efectos de la ribonucleasa (RNasa) en el entorno experimental. Los investigadores siempre deben ser conscientes de la presencia de RNasa en la piel y el cabello17. Es necesario usar guantes, máscaras y gorros desechables para los experimentos. Además, el equipo de laboratorio como micropipetas, puntas de pipetas y tubos de recolección debe limpiarse para garantizar la ausencia de RNasa17. La desactivación de RNasa utilizando un autoclave debe realizarse según sea necesario17. De lo contrario, los investigadores deben usar ítems certificados libres de RNasa17. Todas las muestras deben almacenarse adecuadamente en las condiciones recomendadas para reducir el riesgo de contaminación por RNasa.
Nuestro método tiene tres limitaciones importantes. La primera es que no demostramos si se puede aplicar a otros animales y otros órganos. Esto es relevante porque se sabe que los miRNAs desempeñan un papel importante en las células sanguíneas en la nefropatía por IgA 2,6,7, pero no investigamos si nuestro método puede usarse en células sanguíneas. En segundo lugar, el tamaño de la muestra de nuestros experimentos puede ser pequeño. El tamaño de la muestra debe determinarse según el diseño del estudio, el análisis estadístico, el tiempo requerido y los costos requeridos. Por lo tanto, cada investigador debe determinar el tamaño de muestra apropiado antes de comenzar este experimento. En tercer lugar, la gravedad y el fenotipo de la nefropatía por IgA en ratones HIGA pueden variar entre individuos9. Además, el sesgo de sexo y edad no se ha investigado completamente. Se recomienda agregar inmunohistoquímica para confirmar la gravedad y el fenotipo de la nefropatía por IgA, si es necesario. Además, se recomienda que los métodos distintos de la PCR, incluidos los ensayos de microarray, northern blotting y protección contra la ribonucleasa, funcionen según sea necesario.
En conclusión, desarrollamos un método fiable para medir los niveles de expresión de miRNAs en los riñones de un modelo de ratón IgA (ratones HIGA).
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.
Acknowledgments
Agradecemos a Sarah Williams, PhD, de Edanz Group (www.edanzediting.com) por editar un borrador de este manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BALB/cCrSlc (25-week-old, female) | Japan SLC, Inc. | none | Mouse for control |
| HIGA/NscSlc (25-week-old, female) | Japan SLC, Inc. | none | IgA nephropathy mouse model |
| MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | adhesive film for 96-well reaction plate |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | Experimental kit for synthesis of cDNA |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Experimental kit fot extraction of total RNA |
| miScript Primer Assay (RNU6-2) | Qiagen | MS00033740 | miRNA-specific primer |
| miScript Primer Assay (miR-155-5p) | Qiagen | MS00001701 | miRNA-specific primer |
| miScript Primer Assay (miR-146a-5p) | Qiagen | MS00001638 | miRNA-specific primer |
| miScript Primer Assay (miR-21-5p) | Qiagen | MS00009079 | miRNA-specific primer |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | Experimental kit for real-time PCR |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | biopolymer-shredding spin column |
| QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument |
| QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument software |
| takara biomasher standard | Takara Bio | 9790B | silicon homogenizer |
References
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