Summary
microRNA参与IgA肾病的发病机制。我们已经开发出一种可靠的方法来检测IgA肾病小鼠模型（HIGA小鼠）肾脏中的microRNA表达水平。这种新方法将有助于检查miRNA是否参与IgA肾病。
Abstract
免疫球蛋白A（IgA）肾病是一种原发性肾小球肾炎，其特征是IgA沉积异常，导致终末期肾衰竭。近年来，在IgA肾病的发病机制中报道了microRNA（miRNA）的参与。然而，没有使用小动物模型分析IgA肾病中miRNA的既定方法。因此，我们开发了一种可靠的方法来分析IgA小鼠模型（HIGA小鼠）肾脏中的miRNA。该协议的目标是检测与对照小鼠肾脏中的水平相比，HIGA小鼠肾脏中miRNA的表达水平改变。简而言之，该方法包括四个步骤：1）从HIGA小鼠获得肾脏样本;2）从肾脏样本中纯化总RNA;3）从总RNA合成互补DNA;4）miRNA的定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）。使用这种方法，我们成功地检测了HIGA小鼠肾脏中几种miRNA（miR-155-5p，miR-146a-5p和miR-21-5p）的表达水平。这种新方法可以应用于其他分析IgA肾病中miRNA的研究。
Introduction
免疫球蛋白A（IgA）肾病是一种原发性肾小球肾炎，其特征是IgA在肾小球系膜区域1,2中的异常沉积。它是最常见的原发性肾小球肾炎，在20%-40%的患者中导致终末期肾衰竭2。病因尚不清楚，但与持续性黏膜感染有关1,3。皮质类固醇、免疫抑制剂和肾素-血管紧张素系统抑制剂已被提出作为治疗方法1,3，但尚未完全确立3。因此，需要进一步研究明确治疗IgA肾病的病因和治疗方法。
microRNA（miRNA）是小的非编码RNA，在调节基因表达中起重要作用4,5。据报道，miRNA参与各种疾病的发病机制，有些已被确定为疾病生物标志物和治疗剂4,5。近年来，miRNA与IgA肾病发病机制之间的关联也有报道2,6,7。例如，miR-148b被证明与IgA肾病2,6,7患者的IgA结构异常有关，而miR-148b和let-7b被记录为检测IgA肾病的新型生物标志物7。尽管了解miRNA对IgA肾病的影响可能有助于进一步阐明病因和治疗2，但尚未建立使用小动物模型分析IgA肾病中miRNA的标准方法2。
我们在此开发了一种简单可靠的方法来测量IgA肾病小鼠模型（HIGA小鼠）肾脏中的miRNA表达水平。HIGA小鼠是一种特征性的ddY菌株，显示血清IgA水平特别高，肾小球8,9,10,11中IgA的异常沉积。因此，HIGA小鼠可用作IgA肾病小鼠模型8,9,10,11。我们的方法包括四个主要步骤：首先，通过手术从HIGA小鼠获得肾脏样本;其次，使用基于硅胶膜的离心柱均质化样品并纯化总RNA;第三，使用逆转录从总RNA合成互补DNA（cDNA）;第四，通过定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）检测miRNA的表达水平。这种方法的基本原理和结果的可靠性基于以前的报告12,13。我们表明，这是一种准确测量IgA肾病小鼠模型中miRNA表达水平的有用技术，并且可用于促进未来对IgA肾病中miRNA的研究。
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Protocol
动物实验经吉智医科大学动物伦理委员会批准，并符合《吉智医科大学实验动物指南》中的实验动物使用和护理指南。
1. 从HIGA小鼠中获取肾脏样本
注意：HIGA小鼠在8,9,10,11岁25周后显示出稳定的IgA肾病表型。应选择Balb/c小鼠作为对照组8、9、10、11。获得25周龄雌性HIGA小鼠（n = 10）和25周龄雌性Balb / c小鼠（n = 10）。有必要提前确定实验所需的小鼠数量。对于10只HIGA小鼠和10只Balb / c小鼠的样本量，此步骤需要约7-8小时。
- 准备这些物品：HIGA小鼠（25周龄，雌性），Balb / c小鼠（25周龄，雌性），吸入麻醉器，异氟醚，软木板，针，磷酸盐缓冲盐水（PBS），注射器，针头，手术剪刀和镊子。
- 使用4%-5%的异氟醚和吸入麻醉装置麻醉HIGA小鼠，并使用销钉将其安装在软木板上的背侧位置。将异氟醚的浓度调节至2%-3%作为诱导麻醉后的维持剂量。
注意：麻醉深度保持在完全消除与侵入性手术相关的疼痛的水平。特别是，在切除胸部等组织时，异氟醚浓度应调节至4-5%。脱毛和眼膏不是必需的。如果可以快速执行该过程，则无需将鼠标安装在加热垫上。 - 用手术剪刀和镊子在小鼠腹壁上做一个3-4厘米的中线切口，并仔细识别肾脏的两侧。
- 用手术剪刀和镊子切开肋骨和横膈膜，露出心脏。切开右心房后，将PBS注射到左心室，直到肾脏颜色变为淡黄色（此过程意味着小鼠的整个身体都注入了PBS。
- 切开肾动脉、肾静脉和输尿管，切除肾脏。将肾脏分成30毫克片，用于下一步。
注意：IgA肾病的病理主要涉及肾皮质（肾脏外部）中的肾小球。虽然很难在肉眼下完全区分皮层和髓质，但希望主要收集肾脏的外部。这些样品可在–80°C下储存数月。
2. 纯化肾脏样本中的总RNA
注意：在此步骤中，市售miRNA分离试剂盒用于提取总RNA。此外，还使用生物聚合物粉碎离心柱。有关更多详细信息，请参阅 材料表 。miRNA 分离试剂盒包含基于硅胶膜的离心柱、基于苯酚/胍的裂解试剂、胍/乙醇洗涤缓冲液（洗涤缓冲液 1）、乙醇洗涤缓冲液（洗涤缓冲液 2）和无核酸酶的水。对于10只HIGA小鼠和10只对照小鼠的样本量，此步骤需要约3小时。
- 准备以下物品：1.5 或 2.0 mL 收集管、100% 乙醇、氯仿、硅均质器、微量移液器、移液器吸头、离心机、生物聚合物粉碎离心柱、硅胶膜离心柱、苯酚/胍基裂解试剂、胍/乙醇洗涤缓冲液（洗涤缓冲液 1）、乙醇洗涤缓冲液（洗涤缓冲液 2）和无核酸酶水。
- 在室温下，使用硅匀浆器和 700 μL 苯酚/胍基裂解试剂匀浆 30 mg 肾脏样品。
注意：样品中的miRNA在暴露于基于苯酚/胍的裂解试剂之前是脆弱的，因此应立即执行这些步骤。 - 将裂解物转移到生物聚合物粉碎离心柱中，并在室温下以15,000× g 离心2分钟。
- 向滤液中加入 140 μL 氯仿并剧烈混合 15 秒。放置2-3分钟，然后在4°C下以12,000 ×g 离心15分钟。
- 轻轻地将透明上清液不接触中间层转移到新的收集管中，并加入测定体积（见下文）的100%乙醇。涡旋5秒。
注意：需要100%乙醇，为获得的上清液体积的1.5倍。 - 将样品（上限 700 μL）转移到基于硅胶膜的离心柱中，并在室温下以 8,000 x g 离心样品 15 秒。离心后弃去滤液。
- 向基于硅胶膜的离心柱中加入 700 μL 洗涤缓冲液 1，并在室温下以 8,000 x g 离心柱 15 秒。离心后弃去滤液。
- 将 500 μL 洗涤缓冲液 2 加入基于硅胶膜的离心柱中，并在室温下以 8,000 x g 离心 15 秒。离心后弃去滤液。
- 将 500 μL 洗涤缓冲液 2 加入基于硅胶膜的离心柱中，并在室温下以 8,000 x g 离心 15 秒。离心后弃去滤液。
- 再次离心基于硅胶膜的离心柱，而不添加任何东西以除去任何额外的乙醇，在室温下以15,000× g 离心1分钟。离心后扔掉滤液。
- 将连接到离心柱的管更换为新的收集管。
- 向基于硅胶膜的离心柱中加入 30 μL 无核酸酶水，并在室温下以 8,000 x g 离心 1 分钟。
注意：所得的 30 μL 溶液含有高浓度的总 RNA。该样品可在–80°C下储存数月。
3. 从总RNA合成cDNA
注意：在此步骤中，使用市售的逆转录试剂盒。有关更多详细信息，请参阅 材料表 。该试剂盒包含核酸混合物、逆转录酶混合物和缓冲液。此过程必须在冰上进行，以防止反应进展。对于10只HIGA小鼠和10只对照小鼠的样本量，此步骤需要约3小时。
- 准备以下物品：1.5 mL 收集管、八孔试管、微量移液器、移液器吸头、分光光度计、无核酸酶水、冰、核酸混合物、逆转录酶混合物、缓冲液和热循环仪。
- 使用分光光度计测量总RNA的浓度。然后，计算所需体积的无核酸酶水，使 12 μL 含有 1 μg 总 RNA。
- 制备含有以下内容的预混液：2.0 μL 核酸混合物、2.0 μL 逆转录酶混合物和 4.0 μL 缓冲液，每个样品总共 8.0 μL。
- 向八孔试管的每个孔中加入 8 μL 预混液。
- 稀释以3.2计算的无核酸酶水体积中的总RNA。然后，向每个八孔试管孔中加入 12 μL 总 RNA 溶液（含有 1 μg 总 RNA）。
- 使用热循环仪将样品在37°C的8孔试管中孵育60分钟。然后，使用热循环仪在95°C孵育5分钟。
注意：孵育后的溶液含有高浓度的cDNA。 - 将该溶液转移到 1.5 mL 管中，加入 200 μL 无核酸酶水。
注意：所得的 200 μL 溶液可用作 qRT-PCR 模板 cDNA。该样品可在–80°C下储存约1年。
4. miRNA 的 qRT-PCR
注意：在此步骤中，使用市售PCR试剂盒。有关更多详细信息，请参阅 材料表 。该试剂盒包含PCR混合物、通用引物和无核酸酶水。样品应一式两份制备，并在每种情况下考虑结果的准确性。miRNA的表达水平通过ΔΔCT方法定量。对于10只HIGA小鼠和10只对照小鼠的样本量，此步骤需要约4小时。
- 准备以下物品：1.5 mL 收集管、96 孔反应板、用于 96 孔反应板的粘合膜、微量移液器、移液器吸头、PCR 混合物、通用引物、无核酸酶水、miRNA 特异性引物和实时荧光定量 PCR 仪器。
- 制备含有以下内容的预混液：每孔 12.5 μL PCR 混合物、2.5 μL 通用引物、1.25 μL 5 μM miRNA 特异性引物和 6.25 μL 无核酸酶水。
注意：在该测定中，使用了对miRNA[RNA，U6小核2（RNU6-2），miR-155-5p，miR-146a-5p和miR-21-5p]特异性引物。RNU6-2用作内源性对照14。 - 向 96 孔反应板的每个孔中加入 22.5 μL 预混液。
- 将步骤 3.7 中制备的 2.5 μL cDNA 加入 96 孔板的各个孔中。
- 用粘附膜覆盖96孔反应板，然后以1,000× g 离心30秒。
- 运行实时荧光定量 PCR 仪器。对PCR仪器进行编程如下：在95°C下初始活化15分钟，然后在94°C下变性40个循环15秒，在55°C下退火30秒，并在70°C下延伸30秒。
- 使用 ΔΔCT 方法定量基因表达。相对表达水平确定为 2–ΔΔCT。
注意：应考虑从结果中排除异常的PCR扩增曲线。
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Representative Results
我们研究了miRNA在HIGA小鼠肾脏中的表达水平（n = 10）。该结果完全基于所描述的协议获得。选择Balb / c小鼠的肾脏作为对照（n = 10）。在两组中，均选择25周龄。供应商仅提供雌性HIGA小鼠。三种miRNA（miR-155-5p、miR-146a-5p和miR-21-5p）的表达水平;图1）被检测到，之前报道与 IgA 肾病有关15,16。采用t检验比较两组相对miRNA表达水平，P<0.05有统计学意义。与对照组相比，HIGA组miR-155-5p的表达水平高3.3倍（P < 0.001），而HIGA组的miR-21-5p表达水平高1.58倍（P = 0.007）。两组miR-146a-5p表达差异无统计学意义。
图1：miRNA在HIGA小鼠肾脏中的表达水平。 qRT-PCR测定了miR-155-5p，miR-146a-5p和miR-21-5p在HIGA小鼠（n = 10）和Balb / c小鼠（n = 10）中的相对表达水平。相对表达水平显示为平均值和标准误差。（A）HIGA组miR-155-5p表达高3.3倍（P <0.001）。（B）两组miR-146a-5p表达无显著差异。（C）HIGA组miR-21-5p表达高1.58倍（P=0.007）。定量实时逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）;微核糖核酸（miRNA）;不显著（NS）;*，第 <0.05 页。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
我们能够使用这种新方法测量IgA肾病小鼠模型（HIGA小鼠）肾脏中miRNA的表达水平。IgA肾病是一种无法解释的疾病，需要进一步研究以阐明其病因和治疗靶点1,3。然而，获取人类肾脏样本是高度侵入性的。这种新技术的优点在于它允许使用小动物研究IgA肾病，并且应该有助于未来对IgA肾病和miRNA的研究。在未来的研究中，该方法可以应用于治疗IgA肾病的新型miRNA的研究。HIGA小鼠中miRNA的人工调节可能会影响IgA肾病的表型。在这种情况下，该方法可能有助于验证miRNA的变化。该方法不用于分析血清中的miRNA，但可以通过修改协议将其用于此目的。
这种方法的理由是根据以前的报告。我们使用生物聚合物粉碎离心柱来破坏样品中的生物聚合物，这在以前已被证明是一种有效的技术12。过去的报告还证明了使用逆转录从总RNA合成cDNA和使用制备的cDNA作为模板进行PCR的准确性13。作为该方法的关键步骤，PCR结果的评估很重要。有必要从结果中排除异常的扩增曲线。此外，如果未获得稳定的结果，应考虑内源性对照的变化14。
这种方法可能遇到的一个主要问题是miRNA的异常低表达。miRNA是高度可降解的化合物，因此应快速执行该方法。此外，需要消除核糖核酸酶（RNase）在实验环境中的影响。研究人员应始终注意皮肤和头发中RNase的存在17。实验时必须戴上一次性手套、口罩和发帽。此外，必须清洁微量移液器、移液器吸头和收集管等实验室设备，以确保不含RNase17。必要时应使用高压灭菌器使RNA酶失活17。否则，研究人员应使用无RNase认证的项目17。所有样品都应在推荐的条件下妥善储存，以降低RNase污染的风险。
我们的方法有三个重要的局限性。首先，我们没有证明它是否可以应用于其他动物和其他器官。这是相关的，因为已知miRNA在IgA肾病2,6,7的血细胞中起重要作用，但我们没有研究我们的方法是否可以用于血细胞。其次，我们实验的样本量可能很小。样本量应根据研究设计、统计分析、所需时间和所需成本来确定。因此，每个研究人员必须在开始此实验之前确定适当的样本量。第三，HIGA小鼠IgA肾病的严重程度和表型可能因个体而异9。此外，性别和年龄的偏见尚未得到充分调查。如有必要，建议添加免疫组织化学检查以确认IgA肾病的严重程度和表型。此外，建议根据需要使用PCR以外的方法，包括微阵列、北方印迹和核糖核酸酶保护测定。
总之，我们开发了一种可靠的方法来测量IgA小鼠模型（HIGA小鼠）肾脏中miRNA的表达水平。
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Disclosures
提交人声明他们没有利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢Edanz Group（www.edanzediting.com）的Sarah Williams博士编辑了这份手稿的草稿。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BALB/cCrSlc (25-week-old, female) | Japan SLC, Inc. | none | Mouse for control |
| HIGA/NscSlc (25-week-old, female) | Japan SLC, Inc. | none | IgA nephropathy mouse model |
| MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | adhesive film for 96-well reaction plate |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | Experimental kit for synthesis of cDNA |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Experimental kit fot extraction of total RNA |
| miScript Primer Assay (RNU6-2) | Qiagen | MS00033740 | miRNA-specific primer |
| miScript Primer Assay (miR-155-5p) | Qiagen | MS00001701 | miRNA-specific primer |
| miScript Primer Assay (miR-146a-5p) | Qiagen | MS00001638 | miRNA-specific primer |
| miScript Primer Assay (miR-21-5p) | Qiagen | MS00009079 | miRNA-specific primer |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | Experimental kit for real-time PCR |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | biopolymer-shredding spin column |
| QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument |
| QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument software |
| takara biomasher standard | Takara Bio | 9790B | silicon homogenizer |
References
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