Summary
Det overordnede målet med denne protokollen er å gi instruksjon om hvordan man måler kapasiteten til antistoffer som finnes i sera eller plasma av individer, naturlig utsatt for Plasmodium falciparum infeksjon, å opsonisere og indusere fagocytose av parasitt-infiserte erytrocytter (IE).
Abstract
Protokollen beskriver hvordan du setter opp og kjører en strømningscytometribasert fagocytoseanalyse av Plasmodium falciparum-infiserteerytrocytter (IE) opsonisert av naturlig ervervede IgG-antistoffer som er spesifikke for VAR2CSA. VAR2CSA er parasittantigenet som formidler selektiv sekvestrasjon av IE i morkaken som kan forårsake en alvorlig form for malaria hos gravide kvinner, kalt placenta malaria (PM). Beskyttelse mot PM er mediert av VAR2CSA-spesifikke antistoffer som antas å fungere ved å hemme placentasequestration og/eller ved å opsonisere IE for fagocytose. Analysen benytter sene stadium-synkroniserte IEer som er valgt in vitro å uttrykke VAR2CSA, plasma / serum-antistoffer fra kvinner med naturlig ervervet PM-spesifikk immunitet, og fagocytisk cellelinje THP-1. Protokollen kan imidlertid enkelt endres for å analysere funksjonaliteten til antistoffer mot ethvert parasittantigen tilstede på IE-overflaten, enten indusert av naturlig eksponering eller ved vaksinasjon. Analysen tilbyr enkel og høy gjennomstrømningsevaluering, med god reproduserbarhet, av et viktig funksjonelt aspekt av antistoffmediert immunitet i malaria. Det er derfor nyttig når man vurderer klinisk immunitet mot P. falciparum malaria, en viktig årsak til sykelighet og dødelighet i tropene, spesielt i Afrika sør for Sahara.
Introduction
Malaria er en vektorbåren sykdom forårsaket hos mennesker ved infeksjon med fem forskjellige arter av slekten Plasmodium. Den mest utbredte arten er P. falciparum, som også er ansvarlig for den mest sykelighet og dødelighet1. Malaria klinisk presentasjon varierer fra asymptomatiske eller godartede infeksjoner til komplisert / alvorlig sykdom, sistnevnte forekommer hovedsakelig hos barn under fem år. Eksponering for P. falciparum induserer ikke steril immunitet, men personer som bor i endemiske områder utvikler langsomt immunitet mot den kliniske sykdommen. Beskyttelse er alder/eksponering avhengig og immunitet er normalt ervervet i løpet av de første 5-10 årene av livet2. Voksne kvinner er et viktig unntak, da alvorlig malaria kan oppstå under graviditet i en klinisk presentasjon kjent som placenta malaria (PM). PM er en viktig årsak til abort, dødfødsel, for tidlig levering, lav fødselsvekt, fosterdød, og mors anemi. Motstand mot PM utvikler seg over påfølgende graviditeter3. Beskyttelse mot PM er forbundet med oppkjøpet av antistoffer mot VAR2CSA-type PfEMP14,5, et infisert erytrocytt (IE) overflateantigen som binder seg til kondroitinsulfat A (CSA) som muliggjør IE-sekvestrasjon i morkaken. Antistoffer mediere beskyttelse utfører ulike funksjonelle aktiviteter (gjennomgåtti 6,7) inkludert opsonisering av IE for å indusere fagocytose. Tidlige in vitro studier viste at antistoffer kan begrense P. falciparum vekst i nærvær av monocytter via phagocytosis8,9. Nyere studier har vist at høyere nivåer av fagocytose-induserende antistoffer er forbundet med bedre graviditetsutfall (i sammenheng med HIV-samtidig infeksjon)10,11, noe som indikerer relevansen av denne effektorfunksjonen i naturlig ervervet immunrespons.
Her presenterer vi en protokoll for å måle denne funksjonen av antistoffer som finnes i humant plasma/serum, ved hjelp av in vitro kultiverte IEer som uttrykker VAR2CSA sammen med monocyttlinjen THP-1. Analysen har tidligere blitt brukt11,12,13,14,15,16,17,18 og regnes som en forbedret og enklere tilnærming sammenlignet med tidligere mikroskopbaserteprotokoller 8, siden det tillater testing av et større antall antistoffprøver i et enkelt løp ved hjelp av mindre mengder antistoff og unngår kjedelig og partisk mikroskoptelling. Selv om analysen har blitt brukt av flere laboratorier og utførelsen er enkel nok, krever det nøye planlegging og forberedelse, derfor vil en detaljert protokoll tillate anvendelse av laboratorier og forskere som mangler tidligere erfaring. Vi bruker, som et eksempel, sene fase-synkroniserte IEer som uttrykker VAR2CSA opsonisert med antistoffer tilstede i serum samlet inn fra kvinner med naturlig ervervet PM-spesifikk immunitet. Protokollen kan imidlertid enkelt endres for å analysere funksjonaliteten til antistoffer mot ethvert parasittantigen tilstede på IE-overflaten, enten indusert av naturlig eksponering eller ved vaksinasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De humane serumprøvene som ble brukt til resultatene som presenteres her, ble samlet inn i en egenstudie 19. Samlingen ble godkjent av Institutional Review Board of Noguchi Memorial Institute for Medical Research, University of Ghana (studie 038/10-11), og av Regional Research Ethics Committees, Capital Region of Denmark (protokoll H-4-2013-083).
1. Parasittkultur
MERK: Følg de lokale forskriftene for håndtering av menneskelige patogener.
- Vedlikehold P. falciparum parasitter i henhold til standardprotokollen som beskrevet før20 i parasittkulturmedium (se Materialtabell).
- Hold parasittene tett synkronisert ved hjelp av sorbitolbehandling som tidligere beskrevet21.
- For å sikre VAR2CSA-uttrykk på overflaten av IE, utfør gjentatte runder med immunmagnetisk utvalg ved hjelp av et anti-VAR2CSA-antistoff (f.eks. PAM1.4 antistoff, et tverrreaktivt humant monoklonalt VAR2CSA-spesifikt IgG22) kombinert med protein G-magnetiske perler23.
- Kort sagt, inkuber sen-scenen trophozoite-IE med magnetiske perler sammenlignet med et anti-VAR2CSA antistoff og positivt velge ved hjelp av en magnet.
- Utvid de valgte parasittene i kultur i noen sykluser til parasittemi er minst 5%.
- Alternativt velger du parasitter som binder seg til plastimmobilisert CSA (reseptoren for VAR2CSA) som tidligere beskrevet24.
- For å bekrefte VAR2CSA uttrykk på de valgte parasittene utføre flyt cytometri som tidligere beskrevet25.
- Kort sagt, merk senfasetrophozoite-IE-ene med samme antistoff som brukes til magnetisk valg (trinn 1.3) etterfulgt av et fluorescerende merket sekundært antistoff.
- Mål IE overflatereaktivitet ved strømningscytometri. Vellykket antistoffvalg resulterer normalt i en parasittpopulasjon som uttrykker VAR2CSA i de fleste parasittene (≈80%).
- For fagocytoseanalysen, bruk renset mid- til sen-stadium trophozoite-IE. Utfør rensing ved hjelp av magnetisk separasjon som tidligere beskrevet26.
MERK: For å nøyaktig bestemme parasittenes stadium, utfør Giemsa-farging på blodsutstryk etterfulgt av lett mikroskopiobservasjon. Følg standardprosedyrer og morfologiske retningslinjer som beskrevet før27. Sen-scenen rensing kan også utføres ved hjelp av tetthet gradient medium. IE-utbyttet er imidlertid etter vår erfaring lavere, og derfor er magnetisk rensing å foretrekke.- For magnetisk separasjon, spinn parasittkulturen (5-10% parasittemi) ved 500 x g i 10 min ved romtemperatur. Fjern den supernatante og re-suspendere cellepellet i 10 ml parasittkulturmedium.
- Legg parasittsuspensjonen i en CS-kolonne skrevet til en magnet (se Materialse tabell) og la den sakte passere gjennom kolonnen. Trophozoite-IE er paramagnetiske (på grunn av tilstedeværelsen av hemozoin) og vil holde seg inn i kolonnenettet.
- Vask kolonnen med 50 ml parasittkulturmedium og elute IEene fra den magnetiske kolonnen ved hjelp av 50 ml parasittkulturmedium.
- Spinn eluat fra 1.5.3 ved 500 x g i 10 min ved romtemperatur. Kast forsiktig det overnaturlige og re-suspendere i 1 ml parasittkulturmedium.
- Ved hjelp av et hemocytometer teller du antall IEer (lett identifisert ved lys mikroskopi som erytrocytter med mørkt hemozoinpigment) og totalt cellenummer for å beregne den endelige parasittemien (prosentandel av IE).
MERK: Bruk kun parasitter med minst 80 % renhet (80 % IE). - Basert på antall serum / antistoffprøver planlagt for testing, estimere den totale mengden IE som trengs og skalere opp parasittkulturene tilsvarende. En 75 cm2 kulturkolbe med 25 ml kultur ved 5% hematokrit og 5-10% parasittemi bør gi nok IE til å kjøre en full 96 brønnplate. For en full plate (42 prøver pluss 6 kontroller i duplikat), er det nødvendig med minst 1,5 ml parasittsuspensjon ved 3,3 x 107 IEs / ml.
2. THP-1 celler
MERK: THP-1-cellelinjen brukes i denne analysen. Denne monocyttcellelinjen er avledet fra en pasient med monocytisk leukemi28 og kan kjøpes fra ATCC. Vedlikehold cellelinjen i henhold til leverandørens instruksjoner i THP-1 kulturmedium (se Materialse tabell).
- For regelmessig vedlikehold, start THP-1 cellekultur ved 2-4 x 105 celler / ml og subkultur når cellekonsentrasjonen når 8 x 105 celler / ml.
MERK: Ikke la cellekonsentrasjonen overstige 1 x 106 celler/ml og holde oversikt over passasjenummeret. Unngå bruk av celler som er utenfor passasje 25. Gjennomsnittlig doblingstid for THP-1-cellelinjen varierer mellom 19-50 timer. Bestem doblingstiden for cellegruppen før du starter fagocytoseeksperimentene. Dette vil bidra til å grovt estimere den nødvendige mengden kultur som trengs for et bestemt antall serumprøver som skal testes (f.eks. for en full 96 brønnplate, er det nødvendig med 10 ml kultur ved 5 x 105 celler / ml). - Kontroller regelmessig THP-1-cellene for overflateuttrykket til Fcγ-reseptorene I (CD64), II (CD32) og III (CD16) som tidligere beskrevet15.
- Kort sagt, beis THP-1-cellene (separat) med anti-CD64, anti-CD32 og anti-CD16 fluorescerende merkede antistoffer (Table of Materials) i 30 min ved romtemperatur (1:100 fortynning tilberedt i 2% FBS i PBS).
- Vask tre ganger med 2% FBS i PBS og mål overflatefarging ved strømningscytometri.
MERK: THP-1-cellene er negative for CD16 og positive for CD32 og CD64 som tidligere rapportert29,,30 (figur 1).
- For phagocytosis analysen, sette opp en THP-1 celle kultur kolbe med 2,5 x 105 celler / ml dagen før eksperimentet for å gi rundt 5 x 105 celler / ml på analysedagen.
MERK: Kontroller at det er 4-6 x10 5 celler/ml på analysedagen.
3. Fagocytose analyse (figur S1)
- Før analysen startes, må du blokkere (> 1 h) to runde bunn 96 brønnplater (en for opsonisering og en annen for fagocytose) ved hjelp av 150 μL per brønn sterile 2% FBS i PBS.
MERK: Etikettplate 1 som opsoniseringsplate og bruk den både til ethidiumbromid (EtBr) farging og opsonisering. Etikettplate 2 som phagocytose plate og bruk både for THP-1 celleplating og for phagocytosis trinn. - Parasittfarging og opsonisering
- Ta IE-suspensjonen tilberedt i 1,6 og juster celletallet til 3,3 x 107 IE/ml ved å legge til parasittkulturmedium og EtBr for å oppnå en endelig konsentrasjon på 2,5 μg/ml (1:40 fortynning, fra en 0,1 mg/ml lager).
MERK: EtBr flekker parasitten DNA, slik at deteksjon ved flytcytometri.
FORSIKTIG: EtBr er en mutagen og hud, øye og respirasjonsirriterende. Bruk egnet beskyttelse og kast avfall i henhold til lokale bestemmelser. - Fjern blokkeringsløsningen fra en av de 96 brønnplatene (opsoniseringsplaten), knipser platen og fjerner flytende overflødig over et stykke håndklepapir.
- Tilsett 30 μL per brønn av IE-fjæringen som er klargjort ovenfor i øvre halvdel av platen. La en godt tom og tilsett 30 μL parasittkulturmedium (uten IE for THP-1 alene kontroll). (Figur S2A). Inkuber i 10 min ved romtemperatur og beskyttet mot lys.
- Tilsett 170 μL per brønn av parasittkulturmedium. Spinn platen på 500 x g i 3 min ved romtemperatur og fjern supernatanten ved å knipse platen over en passende avfallsbeholder.
- Vask EtBr-merkede IEer to ganger til ved hjelp av 200 μL per brønn av parasittkulturmedium som spinner platen ved 500 x g i 3 min ved romtemperatur. Det overnaturlige fra den første vasken kan fjernes ved å knipse platen. Fjern forsiktig supernatanten fra den andre vasken ved hjelp av en flerkanals pipette for å sikre at hele volumet av vaskemediet fjernes. Ikke forstyrr pelleten.
- Re-suspender EtBr-merkede IEer i 30 μL antistoff / plasma / serumoppløsning tilberedt ved de ønskede konsentrasjonene i parasittkulturmedium.
- Ta alltid med følgende kontroller (Figur S2B): en kontroll uten IE/THP-1-cellekontroll (parasittkulturmedium); en kontroll uten antistoff eller plasma/serum (u opsonisert kontroll); en positiv kontroll ved hjelp av kommersielt tilgjengelig kanin anti-menneskelig erytrocytt antistoff på 1:100 fortynning (se Table of Materials); to negative plasma-/serumkontroller ved 1:5 fortynning (et malarianaivt basseng og et basseng fra malaria-eksponerte menn); og en positiv serumkontroll ved 1:5 fortynning (et basseng fra malariaeksponerte kvinner, som tidligere har vært gravide (helst multigravidae)).
MERK: En fortynning på 1:100 for den positive kontrollen ser ut til å fungere konsekvent på tvers av forskjellige grupper av kjøpt antistoff (data vises ikke). Det anbefales imidlertid å utelukke variasjoner mellom partier ved å teste flere fortynninger hver gang en ny gruppe antistoff brukes. - Inkuber i 45 min i mørket ved 37 °C.
- Ta IE-suspensjonen tilberedt i 1,6 og juster celletallet til 3,3 x 107 IE/ml ved å legge til parasittkulturmedium og EtBr for å oppnå en endelig konsentrasjon på 2,5 μg/ml (1:40 fortynning, fra en 0,1 mg/ml lager).
- THP-1 celler forberedelse og fagocytose
- Mens IE-ene opsoniseres (3.2.8), begynner du å forberede THP-1-cellene.
- Fjern THP-1-cellene fra kulturkolben, spinn dem ned (500 x g i 5 min ved romtemperatur), dekanter supernatanten og suspender pelleten i THP-1 cellekulturmedium.
- Spinn igjen (500 x g i 5 min ved romtemperatur), dekanter supernatanten og suspender cellepelleten igjen i 1 ml THP-1 cellekulturmedium.
- Bestem celletallet i løsningen som er utarbeidet ovenfor, og legg til mer medium for å oppnå en endelig konsentrasjon på 5 x10 5 celler / ml.
- Fjern blokkeringsløsningen fra den gjenværende 96 brønnplaten (phagocytosis plate) ved å knipse platen og fjerne flytende overflødig over et stykke håndklepapir.
- Tilsett 100 μL per brønn av THP-1 celle suspensjon utarbeidet i 3.3.4 og satt tilbake i cellekultur inkubator (Figur S2C).
- Når antistoffet /plasma/seruminkubasjonstiden er ferdig, tilsett 170 μL per brønn av parasittkulturmedium. Spinn platen på 500 x g i 3 min ved romtemperatur og fjern supernatanten ved å knipse platen over en passende avfallsbeholder.
- Vask opsoniserte IEer to ganger til ved hjelp av 200 μL per brønn av parasittkulturmedium, og spinn platen på 500 x g i 3 min ved romtemperatur. Det overnaturlige fra den første vasken kan fjernes ved å knipse platen. Fjern forsiktig det overnaturlige fra den andre vasken, ved hjelp av en flerkanals pipette for å sikre at hele volumet av vaskemediet fjernes. Ikke forstyrr pelleten.
- Til slutt re-suspendere opsonized IE i 100 μL av forhåndsoppvarmet THP-1 celle kultur medium. Overfør 50 μL opsonisert IE-suspensjon til hver brønn i fagocytoseplaten. Siden det er totalt 100 μL IE, kan hver antistoff/serumfortynning kjøres i duplikater i fagocytoseplaten (figur S2D)
MERK: Mengden IE-er og THP-1-celler som brukes i analysen, tilsvarer et forhold på 10:1. - Inkuber i 40 min i mørket ved 37 °C, 5 % CO2.
MERK: Ikke la fagocytose fortsette i mer enn 40 min. - Stopp fagocytose ved sentrifugering ved 4 °C (500 x g, 5 min) og kast supernatanten ved å knipse platen. Tilsett 150 μL av ammoniumkloridlysingsløsning (Materialstable ) og bland ved pipettering, inkuber i nøyaktig 3 min.
MERK: Dette trinnet vil lyse erytrocytter som ikke har blitt fagocytosed av THP-1 celler. - Stopp lysis ved å tilsette 100 μL iskald 2% FBS i PBS. Spinn platen ved 4 °C (500 x g i 3 min) og fjern supernatanten ved å knipse platen over en passende avfallsbeholder.
- Vask tre ganger ved hjelp av 200 μL per brønn iskald 2 % FBS i PBS som spinner platen ved 4 °C (500 x g i 3 min). Etter den endelige vasken, re-suspendere i 200 μL av iskalde 2% FBS i PBS og umiddelbart analysere ved flytcytometri.
MERK: Tidligere publikasjoner har brukt cellefiksering i 2% paraformaldehyd før strømningscytometri31, men resultatene som presenteres her ble kjøpt umiddelbart etter analysens ferdigstillelse. Utsetter flytcytometri datainnsamling ved lagring av platen ved 4 ° C anbefales ikke, siden prosentandelen av EtBr+ THP-1 celler forfaller raskt (figur S3).
- Flyt cytometri oppkjøp og analyse
MERK: Enhver strømningssytometer som støtter 96 brønnplateformat og har de riktige lasere/filtrene for å måle EtBr-fluorescens kan brukes.- For oppkjøp, gate på THP-1 celler ved hjelp av en lineær fremover-scatter (FSC) vs. lineær side-scatter (SSC) tomten ved hjelp av brønnene ble ingen IE ble lagt til (Figur 2A) og skaffe 10.000 hendelser på denne porten.
- Mål fluorescensintensiteten for EtBr (FL3-Log) på THP-1-porten ved hjelp av et histogrammeplott.
- For gating, første gate på THP-1 celler i en FSC vs. SSC tetthet tomten, ved hjelp av brønnene ble ingen IE ble lagt (Figur 2A). Deretter setter du opp en positiv port i et FL3 (EtBr) histogrammet ved hjelp av THP-1-cellene (ingen IEer lagt til) og den u opsoniserte kontrollen (figur 2B).
- Kopier disse portene i alle de andre prøvene som er testet i samme plate og bestem prosentandelen av EtBr-positive THP-1-celler (THP-1-celler som har fagocytisert minst én IE). For hver av prøvene som er testet, kan fagocytose rapporteres som de absolutte verdiene (prosentandel av EtBr+ THP-1-celler) eller som relativ fagocytose beregnet som prosentvis ved hjelp av den positive kontrollen som maksimum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her presenterer vi i detalj en protokoll som tidligere har blittbeskrevet 31 ogbrukt 11,12,13,14,15,16,17,18 for å måle kapasiteten til antistoffer rettet mot overflaten av P. falciparum IEs å indusere opsonisering og fagocytose av THP-1 celler.
Analysen måler spesifikt antistoffmediert fagocytose, og derfor er det nødvendig med interaksjon med de aktuelle Fc-reseptorene på overflaten av THP-1-cellene. Av denne grunn, og som nevnt i protokollen, anbefaler vi regelmessig å sjekke uttrykket for Fcγ-reseptorer på overflaten av THP-1-cellene ved flytcytometri. Cellene skal være negative for CD16 (figur 1A) og positive for CD32 og CD64 (figur 1B,C).
For analysen ble rensede sene fase-IE-er merket med EtBr og deretter opsonisert med antistoffer tilstede i plasma/serum av malarianaive eller malariaksponerte personer. Phagocytosis ble målt ved strømningscytometri, og kvantifiserte prosentandelen av EtBr+ THP-1-celler etter 40 min samtidig inkubasjon med EtBr-merkede og antistoff opsoniserte IEer. I utgangspunktet ble THP-1-celler inngjerdet ved hjelp av en FSC vs. SSC tetthet plot (Figur 2A). Deretter ble det opprettet en EtBr+ markør ved hjelp av et FL3 histogrammet på THP-1-cellene og u opsoniserte IEer (figur 2B). Disse portene ble deretter brukt til å analysere alle de andre kontrollene og testprøvene.
De negative kontrollene (inkludert THP-1-cellene alene, den u opsoniserte IE-kontrollen og kontrollene med malaria-naive og malaria-eksponerte menn) bør alle generere en enkelt negativ topp i FL3-kanalen (figur 3A) med bare få hendelser i EtBr+ markøren. Derfor bør gjennomsnittlig fagocytose verdier både som absolutte EtBr+ THP-1 celler og som relative fagocytose prosenter være svært lav (Figur 3B, C, normalt mindre enn 2% for alle tilfeller). I motsetning bør de positive kontrollene (inkludert kaninanti-humant erytrocyttantistoff og malariaeksponert kvinnelig basseng) generere spor med to topper (figur 3A): en negativ (i stor grad overlappende med det som genereres av alle de negative kontrollene) og en tydelig positiv og godt separert en som ligger inne i EtBr+ markøren. En positiv prøve, som det presenterte eksemplet (prøve fra en malariaeksponert multigravid kvinne / NF20) bør generere en lignende profil som de positive kontrollene. De gjennomsnittlige fagocytoseverdiene, målt som absolutte EtBr+ THP-1-celler og som relativ fagocytose, var normalt høyest for den positive kontrollen (58%/100%), etterfulgt av malariaeksponert kvinnelig basseng (29%/53%), og deretter den eneste malariaeksponerte kvinnen (23%/40%). Som observert i figur 3B,C, hvor tre uavhengige eksperimenter presenteres, var det en betydelig variasjon mellom eksperimenter, og vi anbefaler derfor å kjøre prøver beregnet for sammenligning i samme eksperiment. I våre hender kan minst fire fulle 96 brønnplater håndteres av en enkelt erfaren forsker. Variasjonen mellom analysene ble også tydelig observert da to identiske eksperimenter som testet flere serumprøver fra malariaeksponerte kvinner ble utført samtidig. Det samme parasittpreparatet (etter magnetisk rensing av sen-stadium IEer) og serumfortynninger ble brukt. THP-1-celler ble holdt i to separate flasker, men seeded fra samme første kolbe og eksperimentene ble utført av to forskjellige forskere. Selv om analysen ser ut til å generere konsistente resultater når den utføres separat, med stramme lineære korrelasjoner (r> 0,9 for både absolutte og relative phagocytoseverdier) mellom fagocytoseverdier målt i de to eksperimentene, avviker hellingskoeffisienten til de justerte linjene fra en, noe som indikerer at verdiene som genereres i forskjellige eksperimenter, ikke var identiske. Dette avviket var tydeligere for de absolutte verdiene (hellingskoeffisient konfidensintervall 0,55-0,72) sammenlignet med de relative verdiene (hellingskoeffisient konfidensintervall 0,68-1) (figur 4). Vi anbefaler derfor å bruke relative verdier, spesielt hvis det av en eller annen grunn (f.eks. ikke nok rensede IEer, mer enn 4 fulle plater osv.) er det ikke mulig å kjøre alle prøvene i et enkelt eksperiment. Vi anbefaler også å kjøre eksperimenter beregnet for komparativ analyse innen kortest mulig tid, for å unngå å innføre ekstra variasjon på grunn av drivende i PfEMP1-uttrykk (samt andre antigener) og på grunn av subtile forskjeller på THP-1-cellene ved lengre tid i kulturen.
Figur 1: Fc reseptorer uttrykt på THP-1 celleoverflaten.
(A) Fcγ-reseptor III/CD16 (rød). (B) Fcγ-reseptor II/CD32 (grønn). C. Fcγ-reseptor I/CD64 (oransje). Umerkede celler vises i blått. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Strømningscytometri gating strategi.
(A) THP-1 celler inngjerdet på FSC / SSC. (B) Ethidiumbromid positiv (EtBr+) THP-1 celler i en FL3 histogram. THP-1-celler alene/ingen IEer lagt til (blå), THP-1-celler inkubert med u opsoniserte IEer (grønn) og THP-1-celler inkubert med IE opsonisert med en positiv kontroll (rød) vises. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Phagocytosis av IT4VAR04-IE av THP-1 celler.
(A) Representativ flyt cytometri histogrammer av et av eksperimentene presentert i B (identifisert av større symboler). (B) Prosentandel av EtBr+ THP-1 celler (midler og standardavvik for tre uavhengige eksperimenter). (C) Samme data som i B, etter normalisering mot tilsvarende positiv kontroll. Fargekoding er den samme i alle paneler: THP-alene (svart), u opsonisert / ingen antistoffkontroll (blå), malaria-naiv kontroll (cyan), malariaeksponert mannlig basseng (grønn), malariaeksponert kvinnelig basseng (oransje), en malariaeksponert kvinnelig donor (rosa), og positiv kontroll / kanin anti-menneskelige erytrocytter (rød). Gjennomsnitt og standardavvik vises. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Phagocytosis av IT4VAR04 IE-er av THP-1-celler ved opsonisering med serum fra 10 malariaeksponerte kvinner.
Plottene presenterer lineær regresjonsanalyse for to identiske eksperimenter utført på samme dag, men av forskjellige forskere. (A) Data presentert som absolutte verdier og som (B) relative fagocytose verdier. Analyse utført ved hjelp av statistisk analyseprogramvare. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur S1: Phagocytosis analyse flyt diagram. Flytskjema som viser hovedtrinnene i analysen. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.
Figur S2: 96 godt plate eksperiment layout. (A) Layout for IEs EtBr merking. (B) Layout for opsonisering; 6 brønner er alltid reservert for kontroller. (C) Layout for THP-celler plating. (D) Layout for fagocytose. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.
Figur S3: Fargekoding som i figur 3. (A) Flow cytometri histogrammet overlegg av ett eksperiment ervervet umiddelbart og(B) etter lagring ved 4 °C i 12 timer (C) Prosentandel av EtBr+ THP-1 celler målt før og etter lagring. NF## representerer ulike malaria-eksponerte kvinnelige donorer. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen som presenteres her har tidligere blitt beskrevet ogbrukt 12,15,17,31 for å måle kapasiteten til antistoffer rettet mot overflaten av P. falciparum IE for å indusere opsonisering og fagocytose av THP-1 celler. Resultatene som presenteres her fokuserer på naturlig ervervede VAR2CSA-spesifikke antistoffer i plasma/serum av kvinner som bor i en P. falciparum endemisk region. VAR2CSA er en type PfEMP1 involvert i placentasequestration av IEs, og en viktig determinant i patogenesen av PM.
Analysen kan brukes til antistoffer indusert av immunisering og/eller målretting mot andre PfEMP1-varianter eller andre parasittantigener til stede på IE-overflaten, forutsatt at antistoffet som testes samhandler med de menneskelige Fcγ-reseptorene uttrykt av THP-1-cellene (CD32 og CD64). Analysen er enkel, høy gjennomstrømming (slik at analysen av store prøvesett) og kan utføres på en dag. Fagocytose måles ved strømningscytometri, og kvantifiserer prosentandelen av EtBr+ THP-1-celler etter 40 min samtidig inkubasjon med EtBr-merkede og antistoff-opsoniserte IEer.
Selv om analysen gir konsistente resultater over eksperimentelle repliker, er det variasjon mellom de absolutte verdiene som måles, og derfor anbefaler vi å beregne relative verdier ved hjelp av en positiv kontroll som alltid må inkluderes. Vi anbefaler også at du kjører alle prøvene som skal testes i ett enkelt eksperiment, for å unngå variasjon i analyse som beskrevet ovenfor. Ved testing av serumprøver samlet inn fra personer utsatt for P. falciparuminfeksjon, anbefaler vi alltid å inkludere et sett med prøver fra naive personer som skal brukes som en kontrollgruppe. Denne kontrollgruppen kan brukes til å definere en terskel for å finne ut hvilke av testprøvene som skal anses som positive.
Vi har tidligere brukt denne tilnærmingen til å sammenligne den fagocytose-induserende kapasiteten til sera samlet inn fra barn med forskjellige malaria kliniske presentasjoner (alvorlig vs. mild)17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Maiken Visti er takket for utmerket teknisk assistanse. Dette arbeidet ble delvis finansiert av et stipend (MAVARECA II; 17-02-KU) fra Utenriksdepartementet i Danmark og administrert av Danida Fellowship Centre. Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere eller utarbeide manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well cell culture plates, round bottom with lid | Corning | 3799 | Any similar plate can be used, make sure it is compatible with the flow cytometer instrument you intend to use |
| AlbuMAX-II | Gibco | 11021-037 | |
| AlbuMAX-II (5%) | - | - | 5% AlbuMAX-II (Gibco, 11021-037), 0.2g/L hypoxanthine (Sigma, H9377) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Anti-Red Blood Cells antibody | Abcam | ab34858 | Prepare 2μl aliquots and freeze a -20°C. Use one aliquot per experiment. |
| DPBS | Sigma | P8622 | |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10003D | |
| Ethidium bromide solution | Sigma | E1510 | Prepare a stock solution at 0.1mg/mL in RPMI1640 (R5886). Store protected from light |
| FC500 flow cytometer | Beckman Coulter | Any flow cytometer supporting 96 well plate format and having the appropriate lasers/filters to measure EtBr fluorescence can be used. | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10099-141 | Heat inactivate before use. |
| FITC mouse anti-human CD16 | BD Biosciences | 555406 or 556618 | |
| FITC mouse anti-human CD32 | BD Biosciences | 552883 | |
| FITC mouse anti-human CD64 | BD Biosciences | 555527 | |
| FlowLogic software | Inivai technologies | Any flow cytometry analysis can be used, for example FlowJo or Winlist | |
| Gentamicin (10mg/mL) | Sigma | G1272 | |
| Hypoxanthine | Sigma | H9377 | |
| L-glutamine (200mM) | Sigma | G7513 | |
| Lysing solution | - | - | 15mM NH4Cl, 10mM NaHCO3, 1mM EDTA |
| MACS CS-column and accesories | Miltenyi Biotec | 130-041-305 | |
| Parasite culture medium | - | - | 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 50µg/mL Gentamicin (Sigma, G1272), 0.5% AlbuMAX-II (AlbuMAX-II 5%) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Penicillin/Streptomycin (10000U and 10mg/mL) | Sigma | P0781 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma | R5886 | |
| THP-1 culture medium | - | - | 10%FBS (Gibco, 10099-141), 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 100U/mL Penicillin, 0.1mg/mL Streptomycin (Sigma, P0781) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Vario MACS magnet | Miltenyi Biotec |
References
- World Health Organization. World Malaria Report - 2018. World Health Organization. , (2018).
- Pierce, S. K., Miller, L. H. World Malaria Day 2009: What malaria knows about the immune system that immunologists still do not. Journal of Immunology. 182 (9), 5171-5177 (2009).
- Gamain, B., Smith, J. D., Viebig, N. K., Gysin, J., Scherf, A. Pregnancy-associated malaria: Parasite binding, natural immunity and vaccine development. International Journal for Parasitology. 37 (3-4), 273-283 (2007).
- Staalsoe, T., et al. Variant surface antigen-specific IgG and protection against clinical consequences of pregnancy-associated Plasmodium falciparum malaria. Lancet. 363 (9405), 283-289 (2004).
- Feng, G., et al. Antibodies to variant surface antigens of plasmodium falciparum -Infected erythrocytes are associated with protection from treatment failure and the development of anemia in pregnancy. The Journal of Infectious Diseases. 200 (2), 299-306 (2009).
- Teo, A., Feng, G., Brown, G. V., Beeson, J. G., Rogerson, S. J. Functional Antibodies and Protection against Blood-stage Malaria. Trends in Parasitology. 32 (11), 1-12 (2016).
- Aitken, E. H., Mahanty, S., Rogerson, S. J. Antibody effector functions in malaria and other parasitic diseases: a few needles and many haystacks. Immunology & Cell Biology. 98 (4), 264-275 (2020).
- Celada, A., Cruchaud, A., Perrin, L. H. Opsonic activity of human immune serum on in vitro phagocytosis of Plasmodium falciparum infected red blood cells by monocytes. Clinical and Experimental Immunology. 47 (3), 635-644 (1982).
- Celada, A., Cruchaud, A., Perrin, L. H. Phagocytosis of Plasmodium falciparum-Parasitized Erythrocytes by Human Polymorphonuclear Leukocytes. The Journal of Parasitology. 69 (1), 49-53 (1983).
- Jaworowski, A., et al. Relationship between human immunodeficiency virus type 1 coinfection, anemia, and levels and function of antibodies to variant surface antigens in pregnancy-associated malaria. Clinical and Vaccine Immunology. 16 (3), 312-319 (2009).
- Ataíde, R., Mwapasa, V., Molyneux, M. E., Meshnick, S. R., Rogerson, S. J. Antibodies that induce phagocytosis of malaria infected erythrocytes: Effect of HIV infection and correlation with clinical outcomes. PLoS One. 6 (7), 22491 (2011).
- Ghumra, A., et al. Immunisation with recombinant PfEMP1 domains elicits functional rosette-inhibiting and phagocytosis-inducing antibodies to Plasmodium falciparum. PloS One. 6 (1), 0016414 (2011).
- Ghumra, A., et al. Induction of strain-transcending antibodies against Group A PfEMP1 surface antigens from virulent malaria parasites. PLoS Pathogens. 8 (4), 1002665 (2012).
- Chan, J. A., et al. Targets of antibodies against erythrocytes in malaria immunity. J Clin Invest. 122 (9), 3227-3238 (2012).
- Quintana, M. P., Angeletti, D., Moll, K., Chen, Q., Wahlgren, M. Phagocytosis inducing antibodies to Plasmodium falciparum upon immunization with a recombinant PfEMP1 NTS DBL1α domain. Malaria Journal. 1, 1-9 (2016).
- Chan, J. A., et al. A single point in protein trafficking by Plasmodium falciparum determines the expression of major antigens on the surface of infected erythrocytes targeted by human antibodies. Cellular and Molecular Life Sciences. 73, 4141-4158 (2016).
- Quintana, M. P., et al. Antibodies in children with malaria to PfEMP1, RIFIN and SURFIN expressed at the Plasmodium falciparum parasitized red blood cell surface. Scientific Reports. 8 (1), 3262 (2018).
- Hommel, M., et al. Evaluating antibody functional activity and strain-specificity of vaccine candidates for malaria in pregnancy using in vitro phagocytosis assays. Parasites & Vectors. 11 (69), 1-7 (2018).
- Ampomah, P., Stevenson, L., Ofori, M. F., Barfod, L., Hviid, L. B-cell responses to pregnancy-restricted and -unrestricted Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1 antigens in Ghanaian women naturally exposed to malaria parasites. Infection and Immunity. 82 (5), 1860-1871 (2014).
- Cranmer, S. L., Magowan, C., Liang, J., Coppel, R. L., Cooke, B. M. An alternative to serum for cultivation of Plasmodium falciparum in vitro. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 91 (3), 363-365 (1997).
- Lambros, C., Vanderberg, J. P. Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture. Journal of Parasitology. 65 (3), 418-420 (1979).
- Barfod, L., et al. Human pregnancy-associated malaria-specific B cells target polymorphic, conformational epitopes in VAR2CSA. Molecular Microbiology. 63 (2), 335-347 (2007).
- Staalsoe, T., et al. In vitro selection of Plasmodium falciparum 3D7 for expression of variant surface antigens associated with severe malaria in African children. Parasite Immunology. 25 (8-9), 421-427 (2003).
- Chan, S., et al. Regulation of PfEMP1-VAR2CSA translation by a Plasmodium translation-enhancing factor. Nature Microbiology. 2, 17068 (2017).
- Barfod, L., et al. Evasion of immunity to Plasmodium falciparum malaria by IgM masking of protective IgG epitopes in infected erythrocyte surface-exposed PfEMP1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (30), 12485-12490 (2011).
- Moll, K., Kaneko, A., Scherf, A., Wahlgren, M. Methods in Malaria Research. , MR4/ATCC. Manassas, Virginia. (2013).
- WHO. Basic malaria microscopy. Part I. Learner's Guide. World Health Organization. , (1991).
- Tsuchiya, S. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). International Journal of Cancer. Journal International Du Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
- Fleit, H. B., Kobasiuk, C. D. The human monocyte-like cell line THP-1 expresses FcyRl and Fc'yRIl. Journal of Leukocyte Biology. 49, 556-565 (1991).
- Auwerx, J., Staels, B., Van Vaeck, F., Ceuppens, J. L. Changes in IgG Fc receptor expression induced by phorbol 12-myristate 13-acetate treatment of THP-1 monocytic leukemia cells. Leukemia research. 16 (3), 317-327 (1992).
- Ataíde, R., et al. Using an improved phagocytosis assay to evaluate the effect of HIV on specific antibodies to pregnancy-associated malaria. PloS One. 5 (5), 10807 (2010).
