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Biology

Planarian Scrunching como uma leitura comportamental quantitativa para sensoriamento de estímulos nocivos

doi: 10.3791/61549 Published: July 30, 2020

Summary

Os planários de água doce exibem três marchas (deslizamento, peristalse e scrunching) que são distinguíveis pela análise comportamental quantitativa. Descrevemos um método para induzir o scrunching usando vários estímulos nocivos, quantificação e distinção da peristalse e deslizamento. Usando knockdown genético, demonstramos a especificidade do scrunching como uma leitura fenotípica quantitativa.

Abstract

Os planários de água doce normalmente deslizam suavemente através da propulsão ciliar em seu lado ventral. Certas condições ambientais, no entanto, podem induzir formas de locomoção orientadas pela musculatura: peristalse ou scrunching. Embora a peristalse resulte de um defeito ciliar, o scrunching é independente da função cílio e é uma resposta específica a certos estímulos, incluindo amputação, temperatura nociva, pH extremo e etanol. Assim, essas duas marchas orientadas por musculatura são mecanicamente distintas. No entanto, eles podem ser difíceis de distinguir qualitativamente. Aqui, fornecemos um protocolo para induzir o scrunching usando vários estímulos físicos e químicos. Detalhamos a caracterização quantitativa do scrunching, que pode ser usado para distingui-lo da peristalse e do deslizamento, utilizando software livremente disponível. Uma vez que o scrunching é uma marcha planária universal, embora com diferenças específicas características das espécies, este protocolo pode ser amplamente aplicado a todas as espécies de planários, ao usar considerações apropriadas. Para demonstrar isso, comparamos a resposta das duas espécies planárias mais populares utilizadas na pesquisa comportamental, Dugesia japonica e Schmidtea mediterrânea,com o mesmo conjunto de estímulos físicos e químicos. Além disso, a especificidade do scrunching permite que este protocolo seja usado em conjunto com a interferência do RNA e/ou exposição farmacológica para dissecar os alvos moleculares e circuitos neuronais envolvidos, potencialmente fornecendo uma visão mecanicista sobre aspectos importantes da nocicepção e da comunicação neuromuscular.

Introduction

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Além de sua popularidade para a pesquisa de células-tronco e regeneração1,,2,3, os planários de água doce têm sido usados há muito tempo em estudos comportamentais4,,5, aproveitando seu tamanho comparativamente grande (alguns milímetros de comprimento), facilidade e baixo custo de manutenção laboratorial, e amplo espectro de comportamentos observáveis. A introdução da visão computacional e o rastreamento automatizado aos estudos de comportamento planário6,,7,,8,,9,,10,11 permitiram diferenciação quantitativa de fenótipos comportamentais. O comportamento animal é uma leitura direta da função neuronal. Como o sistema nervoso planário é de médio porte e complexidade, mas compartilha elementos-chave conservados com o cérebro vertebrado12,,13,14, estudar o comportamento planário pode fornecer insights sobre mecanismos conservados de ação neuronal que podem ser difíceis de sondar diretamente em organismos mais complexos. Assim, os planários são um modelo valioso para estudos comparativos de neurobiologia8,,12,15,16,17,18,19,20,21. Além disso, o ambiente aquático permite a exposição rápida e fácil a produtos químicos para estudar seu efeito na função cerebral na regeneração e planários adultos, tornando-os um sistema popular de neurotoxicologia22,,23,,24,,25,26.

Os planários possuem três marchas distintas, chamadas de deslizamento, peristalse e scrunching. Cada marcha é exibida em circunstâncias específicas: deslizar é a marcha padrão, a peristose ocorre quando a função ciliar é comprometida7,27, e scrunching é uma marcha de fuga – independente da função cílio – em resposta a certos estímulos nocivos7. Mostramos que o scrunching é uma resposta específica, provocada pela sensação de certos sinais químicos ou físicos, incluindo temperaturas extremas ou pH, lesões mecânicas ou indutores químicos específicos, e portanto não é uma resposta geral ao estresse7,,28,,29.

Devido à sua especificidade e parâmetros estereotipados, que podem ser facilmente quantificados usando este protocolo, o scrunching é um poderoso fenótipo comportamental que permite aos pesquisadores realizar estudos mecanicistas dissecando vias sensoriais e controle neuronal do comportamento25,,28. Além disso, o scrunching tem se mostrado um ponto final sensível para avaliar efeitos químicos adversos no desenvolvimento do sistema nervoso e função em estudos de neurotoxicologia22,,24,,25,,30. Como várias vias sensoriais diferentes parecem convergir para induzir o scrunching através de vários mecanismos28, o scrunching difere de outros comportamentos planários porque vários, mas específicos, estímulos podem ser usados para dissecar circuitos neuronais distintos e estudar como diferentes sinais são integrados para produzir o fenótipo de scrunching.

É importante ressaltar que existem diferenças de espécies, onde um produto químico pode provocar scrunching em uma espécie planária, mas uma resposta comportamental diferente em outra. Por exemplo, descobrimos que a anandamida induz o esmagamento na espécie planária Dugesia japonica, mas induz a peristalse na mediterranea Schmidtea28. Este exemplo destaca a importância de ser capaz de distinguir de forma confiável entre as diferentes marchas, pois são as manifestações fenotípicas de mecanismos moleculares distintos. No entanto, a distinção da peristose é difícil usando dados observacionais qualitativos, pois ambas as marchas são orientadas pela musculatura e compartilham semelhanças qualitativas7,,28. Assim, para distinguir as marchas é necessário realizar imagens de cílios ou um estudo comportamental quantitativo, que permita a distinção com base nos parâmetros característicos7,28. Como a imagem de cílios é experimentalmente desafiadora e requer equipamentos especializados, como um microscópio composto de alta ampliação e uma câmera de alta velocidade7,,28, não é tão amplamente acessível aos pesquisadores quanto a análise comportamental quantitativa.

Aqui, apresentamos um protocolo para (1) a indução de scrunching utilizando vários estímulos físicos (temperatura nociva, amputação, luz quase UV) e químicos (isothiocyanato aliado (AITC), cinnamaldeído) e (2) a análise quantitativa do comportamento planário utilizando software livremente disponível. Quantificando quatro parâmetros (frequência de oscilações do comprimento do corpo, velocidade relativa, amplitude máxima e assimetria do alongamento corporal e contração)7, o scrunching pode ser diferenciado de deslizamento, peristalse e outros estados comportamentais relatados na literatura, como locomoção semelhante a cobra15 ou epilepsias15. Além disso, enquanto o scrunching é conservado entre diferentes espécies planárias7, cada espécie tem sua própria frequência e velocidade características; portanto, uma vez que as velocidades de deslizamento e esmagamento de uma espécie foram determinadas, a velocidade por si só pode ser usada como um meio para distinguir o esmagamento do deslizamento e peristalse29. O protocolo não pressupõe treinamento prévio em análise de imagem computacional ou estudos comportamentais e, portanto, também pode ser aplicado para experimentos comportamentais planários em um contexto laboratorial de ensino no nível de graduação. Exemplos de dados para facilitar a adaptação do protocolo são fornecidos no Material Suplementar.

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Protocol

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1. Ensaios quantitativos de comportamento planário

  1. Configuração experimental
    1. Coloque um painel LED escurecido sobre uma superfície plana. O painel LED serve a dois propósitos: (1) fornecer um fundo branco uniforme e (2) ser usado como fonte de luz ajustável para obter o contraste adequado. Coloque uma arena de placas de Petri de 100 mm sobre o painel LED.
      NOTA: Para aumentar o throughput, uma placa multi-poço pode ser usada como arena23,24, mas arenas maiores facilitam a análise automatizada de imagens.
    2. Monte uma câmera em um suporte de anel acima da arena (Figura 1A). Ajuste a posição da câmera, altura e foco conforme necessário para que toda a arena esteja centrada dentro do campo de visão e esteja em foco(Figura 1B).
      NOTA: A resolução da câmera precisa ser alta o suficiente para distinguir claramente um planário do fundo homogêneo fornecido pelo painel LED.
    3. Encha a arena com os meios de exposição apropriados (água planária ou solução química) ao volume meio máximo (isso será chamado de banho). Isso corresponde a aproximadamente 25 mL para uma placa de Petri de 100 mm. Ligue o painel LED e desligue quaisquer outras fontes de luz que possam afetar negativamente a qualidade da gravação (ou seja, fontes de luz próximas que produzem um brilho na arena).
      ATENÇÃO: Gerencie soluções químicas perigosas adequadamente usando equipamentos de proteção individual completos (EPI) e movendo a configuração experimental para um capô de fumaça, se necessário. Siga as normas federais e estaduais sobre o descarte de resíduos.
    4. Jogue um planário em direção ao centro da arena usando uma pipeta de transferência. Comece a gravar. Registo de dados como sequências de imagem em um formato fiji31 nativo (TIFF, GIF, JPEG, PNG, DICOM, BMP, PGM ou FITS; veja a seção de análise de imagem 1.2).
      NOTA: Como os comportamentos e a sensibilidade aos estímulos externos variam entre os planários individuais, é importante coletar dados sobre um número suficientemente grande de réplicas biológicas, além de realizar réplicas técnicas. Trabalhamos com até 10 planários de tamanho médio (4-7 mm) em uma placa de Petri de 100 mm de uma só vez. Embora o tempo seja eficiente, vários planários na placa de Petri de uma só vez dificultam a análise de dados, uma vez que os planários podem cruzar caminhos.
      1. Para experimentos de deslizamento, grave usando pelo menos 1 quadro por segundo (FPS). Para experimentos de scrunching/peristalsis, registo usando um FPS que é pelo menos o dobro da frequência de scrunching/peristalsis das espécies planárias. Se a espécie planária tiver uma frequência desconhecida de scrunching/peristalsis, use 10 FPS como ponto de partida e aumente/diminua conforme apropriado.
      2. Ao utilizar uma solução química, transfira o planário usando o menor número possível de gotas de água planária para que a concentração da solução química não seja significativamente alterada.
    5. Para experimentos de deslizamento, registo 1-2 minutos de comportamento deslizante. Para experimentos de scrunching/peristalsis, registo tempo suficiente para capturar pelo menos 3 oscilações consecutivas ocorrendo em linha reta. Assim que o experimento estiver concluído, termine a gravação.
      NOTA: Para experimentos de scrunching/peristalse, se um planário não satisfaz o critério de rescisão dentro de um período de tempo fixo que precisa ser consistente entre as réplicas e é empiricamente determinado com base no estímulo, encerre a gravação e teste outro planário.
      1. Se o planário chegar ao limite da arena sem satisfazer o critério de rescisão, pipeta o planário de volta ao centro da arena.
        NOTA: Evite a pipetação repetida de um indivíduo para gravação, pois isso pode mudar seu comportamento.
    6. Remova os planários da arena e descarte a solução planária de água ou química em recipientes de resíduos apropriados. Planários que estavam em água planária podem ser devolvidos ao seu recipiente.
      NOTA: Evite a contaminação cruzada usando diferentes arenas para diferentes mídias (ou seja, deslizar em experimentos de água planariana não deve ser executado em uma arena anteriormente usada para experimentos de scrunching/peristalse com exposição química).
      1. Enxágüe em série planários expostos a uma solução química em 3 pratos de Petri limpos de 100 mm preenchidos com 25 mL de água planariana para diluir completamente quaisquer produtos químicos. Se o esmagamento ou peristalse foi induzido, coloque esses planários em um recipiente separado. Os planários podem ser devolvidos ao seu contêiner depois de um mês, já que a maioria das células teria virado por esse tempo1.
        NOTA: Se vários experimentos diferentes forem necessários para a mesma população de planários, por exemplo, para uma população rnai, permita que os planários se recuperem por 24 horas antes de executar o próximo experimento. Ordene os experimentos de tal forma que o experimento menos invasivo seja o primeiro e o experimento mais invasivo (por exemplo, amputação) seja executado por último.
      2. Se executar vários experimentos na mesma arena, descarte corretamente a solução de banho e remova quaisquer trilhas de muco limpando a arena com uma toalha de papel entre as corridas.
        NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.
  2. Análise quantitativa do comportamento planário
    1. Realize ensaios de comportamento planário descritos na Seção 1.1.
    2. Abra a sequência de imagem bruta para um experimento em Fiji (File > Import > Image Sequence) e selecione a primeira imagem na sequência de imagem. Na janela Opções de sequência, marque a caixa para "Classificar nomes numericamente" e clique em "OK". Uma vez que a sequência de imagem seja carregada, converta a sequência de imagem em 8 bits (Imagem > Tipo > 8 bits) e use a ferramenta de seta ou controle deslizante na parte inferior da pilha de imagens para assistir ou passar pela sequência de imagem.
      NOTA: Para experimentos de deslizamento, todos os dados podem ser usados desde que o planário possa ser claramente visto durante toda a gravação. No entanto, geralmente é suficiente analisar o movimento livre no centro da arena, extraindo a parte relevante como descrito abaixo.
    3. Para extrair um período de tempo e região de interesse, desenhe uma região de interesse que abrange todo o caminho de um planário utilizando a ferramenta retângulo(Figura 2A, 2B). Clique com o botão direito do mouse na pilha de imagens e selecione Duplicar..., marque a caixa para duplicata,digite o primeiro e o último quadros da sequência de interesse e clique em OK. Se vários planários foram imagens simultaneamente, repita essa etapa de seleção e duplicação da região para cada planário na arena para que haja tantas pilhas de imagens abertas quanto planários na arena. As etapas seguintes (Etapas 1.2.4-1.2.10) devem ser executadas em cada pilha de imagens, uma de cada vez.
      1. Para experimentos de deslizamento, extraia um período de deslizamento onde o planário se move pelo menos o dobro do seu comprimento corporal.
        NOTA: Quanto mais dados de deslizamento extraídos por planário, mais confiáveis serão os dados. O planário não precisa estar se movendo em linha reta para a análise de deslizamento.
      2. Para experimentos de scrunching/peristalsis, extrair uma instância em que o planário sofre um mínimo de três oscilações corporais consecutivas (idealmente mais) em linha reta, certificando-se de que cada oscilação é um ciclo completo de alongamento-contração, pois oscilações completas são necessárias para determinar com precisão a frequência.
        NOTA: Quanto mais oscilações puderem ser extraídas, mais confiáveis serão os dados. Não use sequências onde o planário está girando, pois estas resultarão em medidas de comprimento imprecisas.
    4. Aplique um limiar à pilha de imagens duplicada (Image > Adjust > Threshold) para binarizar a imagem e extrair o planário do plano de fundo. Ajuste as barras deslizantes conforme necessário, de modo que todo o planário seja destacado em vermelho. Os valores exatos dependem da qualidade da imagem. Deixe as caixas para fundo escuro, empilhe histogramae não reinicie o intervalo sem controle. Role a pilha de imagens para garantir um bom alcance de limiar (ou seja, o planário está bem separado do plano de fundo em toda a pilha) e, em seguida, clique em Aplicar.
    5. Na pilha converter para binária, defina o método como padrão e o fundo para a luz. Desmarque todas as caixas nesta janela e clique em OK. Uma imagem binarizada mostrando um planário preto em um fundo branco aparecerá(Figura 2C). Certifique-se de que todo o planário esteja visível em todos os quadros da sequência de imagem.
      NOTA: Objetos indesejados na sequência de imagem binarizada menor ou maior que o planário podem ser filtrados na análise subsequente usando um filtro de tamanho(Figura 2Ciii).
    6. Definir medições clicando em Analisar > Definir Medidas. Verifique as caixas para Área, Centro de massa, Posição de pilhae elipse fit e clique em OK.
      NOTA: Esses parâmetros só precisam ser definidos uma vez por sessão Fiji.
    7. Selecione a pilha de imagens abertas e selecione Analisar > Analisar partículas.
    8. Na janela Analisar partículas, selecione Mostrar > Máscaras para abrir uma nova pilha mostrando todos os objetos que foram detectados com os parâmetros escolhidos. Isso pode ser usado para verificar visualmente que apenas medidas do planário estão sendo tomadas. Um filtro de tamanho pode ser definido nesta etapa para remover ruídos indesejados entrando na área aproximada do planário (em unidades pixel2) no espaço fornecido. Verifique as caixas para obter resultados de exibição e limpar resultados e clique em OK.
      NOTA: Na janela Resultados, se o índice (primeira coluna) não for igual ao número de fatia para todas as linhas, isso significa que muitos ou poucos objetos foram rastreados. Uma possibilidade para essa discrepância é a presença de outros objetos além do planário ou que o planário não tenha sido rastreado em quadros específicos.
    9. Passe a pilha de imagens da máscara usando o controle deslizante na parte inferior do painel. Se houver algum ruído ou houver quadros que não tenham um planário, feche a janela Resultados e a pilha de imagens da máscara. Repita as etapas 1.2.7-1.2.8 ajustando o filtro de área para remover apenas objetos que não sejam o planário.
      NOTA: Se faltar o planário do quadro na máscara, isso sugere que o limite inferior do filtro de área estava muito alto.
    10. Na janela Resultados, salve os dados usando File>Save As. Adicione a extensão .csv ao nome do arquivo para salvar dados como valores separados por círias. Uma vez salvos dados da pilha de imagens, feche a respectiva pilha de imagens e as janelas Resultados e Máscaras.
    11. Importe dados e analise ainda mais usando qualquer software de planilha ou freeware. Para calcular a velocidade de deslizamento, consulte a seção 1.3. Para calcular o conjunto completo do parâmetro scrunching/peristalsis, consulte a seção 1.4.
      NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.
    12. Para determinar o pixel para conversão de comprimento real, abra uma imagem em Fiji com um comprimento de referência (por exemplo, o diâmetro da arena). Selecione a ferramenta de linha e desenhe uma linha sobre o comprimento conhecido.
    13. Converta unidades de pixels em uma unidade padrão de comprimento clicando em Analisar > Escala de conjunto. Digite o comprimento correspondente à linha desenhada na imagem na caixa de distância Conhecida e altere a unidade de comprimento do pixel para a unidade padrão de comprimento escolhida. O fator de conversão está escrito ao lado da Escala.
      NOTA: Um valor de conversão de pixels não é necessário para análises de deslizamento ou scrunching/peristalse nas seções 1.3 e 1.4.
  3. Cálculo da velocidade de deslizamento
    1. Usando o arquivo de dados salvo na Seção 1.2, carregue as coordenadas do centro de massa (COM) x e y e os dados principais do eixo. Se os dados forem salvos como um arquivo de valores separados por ímpar, essas listas correspondem às colunas "XM", "YM" e "Major", respectivamente.
    2. Calcule o deslocamento (d) do centro planário de massa em pixels para cada quadro em relação ao próximo quadro usando as colunas de dados "XM" e "YM". O deslocamento (d) é dado por:
      Equation 1
      onde x1 e y1 referem-se às coordenadas COM (XM, YM) de um quadro e x2 ey 2 referem-se às coordenadas COM (XM, YM) do quadro subsequente.
    3. Defina o comprimento do corpoth planário como o percentil 95 da coluna "Major". Uma vez que os planários apresentam um comportamento de preferência de parede32,isso garante que o comprimento do corpo planário calculado seja representativo de quando o planário é alongado24.
    4. Normalizar o deslocamento pelo comprimento do corpo planário dividindo os deslocamentos de pixels por quadro pelo comprimento do corpo planário (l). O deslocamento normalizado (dn) é dado por:
      Equation 2
    5. Gerar uma lista de velocidades normalizadas dividindo os deslocamentos normalizados pelo tempo decorrido por quadro (inverso do FPS gravado). A velocidade de deslizamento normalizada (sn) é dada por:
      Equation 3
    6. Calcule a velocidade de deslizamento normalizada do planário tomando a média da lista de velocidades normalizada (sn). O desvio padrão pode ser usado como uma medida de incerteza para o planário.
    7. Repetir as etapas 1.3.1-1.3.6 para cada planário a ser analisado. Média e tomar o desvio padrão das velocidades de deslizamento para todos os planários para obter a velocidade de deslizamento e incerteza associada, respectivamente, para uma população planária.
  4. Distinção de marchas de scrunching e peristalsis usando o conjunto de parâmetros completos
    1. Carregue a lista de dados do eixo principal do arquivo de dados salvo da Seção 1.2. Se os dados forem salvos como um arquivo de valores separados por ímpar, isso corresponde à coluna Principal.
    2. Crie uma lista que números cada ponto de dados na coluna Principal, começando com 0. Converta esta lista em tempo decorrido por quadro dividindo-se pelo FPS gravado.
    3. Plote os dados da coluna Principal com relação ao tempo decorrido para gerar um gráfico de oscilação scrunching/peristálsis(Figura 3A). Utilizando o gráfico de oscilação, corte os dados para pelo menos três oscilações consecutivas em linha reta(Figura 3Bi). Corte os dados para iniciar e terminar em picos locais (alongamento máximo de oscilação) ou cochos (alongamento mínimo de oscilação).
      NOTA: Se a extrema local não for aproximadamente igual (picos/calhas diferem dramaticamente em alturas), isso sugere que as oscilações não são linha reta(Figura 3Bii). Extrair outra sequência de pelo menos três oscilações consecutivas em linha reta. Consulte a Seção 1.2.
    4. Confirme se a sequência de oscilação de juros foi extraída e aparada adequadamente, replantando os dados principais aparados em relação ao tempo. Use esta lista de dados aparada para todos os cálculos subsequentes.
    5. Para calcular a frequência de oscilação m),divida o número de oscilações (On) pelo número total de pontos de dados na lista de dados do eixo principal aparado (N). Multiplique FPS por este valor para obter frequência em oscilações por segundo.
      Equation 4
    6. Para calcular o alongamento máximo (|Δε| max), subtrair o comprimento mínimo absoluto do corpo (lmin) do comprimento máximo máximo do corpo (lmax). Normalize o comprimento do corpo alongado dividindo-se pelo comprimento máximo absoluto do corpo.
      Equation 5
    7. Para calcular a velocidade por comprimento da carroceria(v*m),multiplique o alongamento máximo calculado pela frequência de oscilação.
      Equation 6
      NOTA: A velocidade por si só pode ser usada para distinguir entre marchas de scrunching e peristalsis7.
    8. Para calcular a fração do tempo gasto alongando (falongado), pegue a derivada da lista de dados do eixo principal aparada em relação ao tempo. Divida o número de pontos de dados positivos (ou seja, quando o derivado é >0 (np), pelo número total de pontos de dados na lista de dados do eixo principal(nt)."
      Equation 7
      NOTA: Os planários de scrunching exibem uma fração assimétrica do tempo gasto alongando enquanto os planários que realizam a peristalse gastam quantidades iguais de tempo alongando e contraindo7.
    9. Repetir as etapas 1.4.1-1.4.8 para cada planário a ser analisado. Calcule um parâmetro populacional planário definido tomando o desvio médio e padrão de cada parâmetro.
      NOTA: O conjunto de parâmetros pode ser usado para determinar se o comportamento de oscilação está oscilando, peristalse ou alguma outra forma de locomoção com alterações periódicas da forma do corpo. Tanto o scrunching quanto a peristalse têm parâmetros fixos para uma determinada espécie7,com parâmetros de scrunching geralmente maiores do que os parâmetros de peristose7. Embora seja possível que um dos parâmetros possa estar fora da faixa específica da espécie, como observamos anteriormente com a indução química28,o comportamento observado deve concordar com pelo menos 3 dos 4 parâmetros publicados a serem categorizados como peristalse ou scrunching.

2. Indução de scrunching

  1. Estímulos físicos (temperatura nociva, luz UV, amputação)
    1. Para todos os experimentos de estímulo físico, consulte a Seção 1.1 para a configuração experimental.
      NOTA: É melhor usar uma grande arena, como uma placa de Petri de 100 mm, para experimentos de estímulos físicos para permitir um espaço mais aberto para manobrar uma pipeta e/ou lâmina de barbear.
    2. Para induzir o esmagamento através da temperatura nociva, aqueça a água planária em um copo de vidro (pelo menos 100 μL por planário a ser testado) a 65 °C em uma placa quente.
      1. Coloque um planário no centro da arena. Espere até que o planário se oriente ereto e comece a deslizar. Comece a gravar.
      2. Usando uma pipeta P-200, pipeta lentamente 100 μL da água planariana de 65 °C pós-faringeally na extremidade traseira do planário para induzir scrunching.
        NOTA: Certifique-se de que a água planária aquecida permanece em 65°C. Se necessário, reaqueça a água para 65°C antes de iniciar outro experimento. Uma vez que a pressão também pode induzir o scrunching, a tubulação lenta é necessária. A tubulação da água da temperatura ambiente da mesma forma que no experimento pode servir como uma opção de controle e prática.
      3. Pare a gravação assim que o scrunching cessar. Coloque o planário em um recipiente de recuperação e troque a mídia na placa de petri com água planária fresca e de temperatura ambiente se realizar mais experimentos.
    3. Para induzir o scrunching via amputação, transfira um planário para o centro da arena e espere até que o planário se oriente ereto e comece a deslizar. Comece a gravar.
      1. Ampute o planário usando uma lâmina de barbear limpa. Amputações podem ser feitas em qualquer lugar ao longo do planário, desde que o local do corte seja consistente entre experimentos.
        NOTA: Os parâmetros de escrúpulos são extraídos da peça anterior. Assim, evite obstruir a visão da câmera desta parte do planário ao aplicar o corte se aproximando da extremidade posterior. Os deslizamentos de cobertura plástica também funcionam bem para o corte e são uma opção mais segura, especialmente em um ambiente de ensino.
      2. Pare a gravação assim que a peça anterior parar de amassar. Retire ambas as peças, coloque-as em um recipiente separado e deixe-as se regenerar por 7 dias. Planários amputados podem ser reincorporados no recipiente doméstico uma vez regenerados.
    4. Para induzir o scrunching usando luz quase UV, conecte filtros apropriados (por exemplo, filtros Roscolux) à lente da câmera para reduzir a quantidade de luz quase UV refletida que é coletada pela câmera e pode interferir na imagem da resposta do planário. Em vez de usar o painel LED para iluminar a arena a partir de baixo, use iluminação vermelha ambiente para a qual os planários são insensíveis33.
      1. Encha uma arena de placas de Petri de 100 mm com água planária e coloque um único planário (5-9 mm) no centro da arena. Comece a gravar a 10 FPS.
      2. Segure um ponteiro laser UV classe II (405 ± 10 nm, potência de saída <5 mW) aproximadamente 30 cm da arena. Posicione o ponteiro laser em um ângulo de 45° do planário deslizante e, em seguida, brilhe o ponteiro laser por 5-10 segundos no meio do caminho entre a extremidade posterior da faringe e a ponta da cauda para induzir o scrunching.
        NOTA: A potência do ponteiro laser pode ser medida usando um medidor de alimentação quase sensível a UV.
      3. Aguarde que o planário comece a deslizar novamente antes de tentar mais duas estimulações no mesmo indivíduo para testar a reprodutibilidade da reação. Se o planário continuar mostrando o mesmo comportamento, pare de gravar e coloque o planário de volta em seu contêiner. Se o comportamento mudar entre estímulos, testes adicionais mostrarão qual resposta é a mais proeminente.
        NOTA: Os planários podem ficar insensitados com luz quase UV e vão parar de reagir. Estimulações consecutivas requerem um período de descanso de 8-10 segundos.
  2. Estímulo químico (AITC)
    1. Para induzir o scrunching usando um produto químico, por exemplo, o Agonista TRPA1 AITC28,os planários são idealmente imersos em um banho do produto químico. Se necessário, a pipetação pode ser aplicada conforme descrito na seção 2.1.2.3.
      ATENÇÃO: A AITC é inflamável, agudamente tóxica, pode causar irritação na pele e nos olhos, sensibilização respiratória e da pele, e é perigosa para a vida aquática. O óleo AITC deve ser manuseado em um capô de fumaça. Antes de fazer soluções de estoque da AITC, coloque epi apropriado (luvas de nitrito e um jaleco) e configure recipientes adequados de descarte de resíduos perigosos sólidos e líquidos.
    2. Em um capô de fumaça, faça uma solução de estoque de 10 mM de AITC em água planariana em um tubo centrífuga de 50 mL. Esta solução de estoque é útil por até um mês quando armazenada a 4°C.
      1. A partir deste estoque, prepare uma solução de trabalho de 25 mL de 100 μM AITC em água planária em um tubo centrífuga de 50 mL. Esta solução AITC de 100 μM será usada para induzir scrunching em planários.
        NOTA: 100 μM AITC induz scrunching consistente em D. japonica e S. mediterranea planarians28. Para outros planários aquáticos, 100 μM pode servir como uma concentração inicial e pode ser ajustado de acordo.
      2. Configure a configuração experimental (consulte a Seção 1.1). Encha a arena com a solução de trabalho da AITC e coloque-a em um recipiente secundário. O recipiente secundário deve conter pelo menos o dobro do volume da arena.
        NOTA: Experimentos podem ser realizados dentro de um capô de fumaça para maior segurança.
      3. Transfira até 10 planários para o centro da arena e comece a gravar.
      4. Uma vez que os planários se tornam dessensibilizados e deixam de escrúpulos, pare de gravar. Remova os planários da solução AITC e enxágue (consulte a Seção 1.1). Descarte resíduos sólidos e líquidos da AITC em recipientes de resíduos apropriados.
      5. Verifique a especificidade da resposta à AITC usando RNAi para TRPA128 seguindo protocolos padrão.

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Representative Results

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A percepção extraocular quase-UV em S. mediterranea planarians é dependente de TRPA1 e foi proposta para ser ligada à versão H2O2 17. Como a exposição H2O2 induz o scrunching dependente de TRPA1 em S. mediterranea e D. japonica planarians28, as etapas da Seção 2.1.4 podem ser usadas para testar se a exposição à luz quase UV induz o esmagamento em ambas as espécies. Enquanto d. japonica planarians scrunch (10/10) quando expostos à luz quase UV, os planários mediterraneas ou exibem o afinamento da cauda (7/10) como descrito anteriormente17 ou nenhuma resposta (3/10) (Figura 4A,4B). Uma quantificação dos parâmetros de scrunching, conforme descrito na Seção 1.4, para os planários D. japonica que exibiram pelo menos 3 scrunches consecutivos em linha reta revela parâmetros característicos de scrunching para esta espécie7,28 (νm = 0,84 ± 0,14, | Δε| max = 0,56 ± 0,06, v*m = 0,47 ± 0,07 e f elong = 0,56 ± 0,03, valores relatados como média ± desvio padrão para N=7).

Em contraste, a exposição a 250 μM cinnamaldeído, um conhecido Agonista TRPA1 em camundongos34, causa scrunching em S. mediterranea7,28 (νm = 0,46 ± 0,08, | Δε| max = 0,36 ± 0,08, v *m = 0,16 ± 0,04, f along = 0,58 ± 0,04, valores relatados como médio n ± desvio padrão para N=8) (Figura 5A), enquanto os planários de D. japonica no mesmo (e 1,6x da concentração) exibem uma mistura de movimento de cobra e oscilação, interrompida por deslizamento e/ou curvas vigorosas de cabeça(Figura 5A). Uma quantificação das amostras (8/24) com pelo menos três oscilações consecutivas rende valores significativamente menores para 3 de 4 parâmetros do que o esperado para scrunching nesta espécie (νm = 0,43 ± 0,08, | Δε| máximo = 0,39 ± 0,03, v*m = 0,17 ± 0,02 e f elong = 0,54 ± 0,06, valores relatados como média ± desvio padrão para N=8). Assim, enquanto D. japonica parece se desamarar sobre a exposição ao cinnamaldeído, uma comparação dos parâmetros calculados com os valores da literatura para esta espécie7,28 mostra que o movimento oscilatório observado não é scrunching. Este exemplo destaca a importância das medições quantitativas em conjunto com a cuidadosa inspeção dos dados comportamentais brutos para interpretar adequadamente os comportamentos observados.

A RNAi confirma a especificidade do scrunching em resposta à exposição ao cinnamaldeído em S. mediterranea. Dentro de 180 segundos de exposição a 250 μM cinnamaldeído em água planária 15/15 unc22 (controle) RNAi S. mediterranea planarians scrunched, enquanto 0/16 SmTRPA1 RNAi planarians scrunched(Figura 5B), demonstrando que S. mediterranea scrunching in cinnamaldehyde requer SmTRPA1. O knockdown do SmTRPA1 foi confirmado através de uma exposição de 60 segundos a um banho AITC de 100 μM28.

Figure 1
Figura 1: Configuração experimental de comportamento planário.
(A) Configuração experimental de amostra para estudar comportamento planário. (B) Arena de placas de Petri de 100 mm centrada no campo de visão da câmera. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Exemplos representativos da análise de imagem fiji de planários na arena.
(A) Região de interesse selecionada, abrangendo o caminho planário completo, indicado pelo retângulo amarelo. (B) Quadros de amostra da região de interesse após a duplicação. (C) Subtrair o planário de fundo e ruído através de limiares (i) imagem de 8 bits de planário com ruído, denotada pelo asterisco. (ii) Imagem binarizada de planário após o limiar. (iii) Máscara de planário após a filtragem por tamanho para remover o ruído. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Plotando o comprimento planário em relação ao tempo.
(A) Parcela bruta de comprimento planário versus tempo para um scrunching S. mediterranea planarian. O asterisco denota um momento em que o planário virou enquanto apertava. (B) Formas possíveis de aparar dados de scrunching. (i) Um gráfico corretamente aparado que remove os dados do evento de giro. (ii) Uma parcela aparada incorretamente que não remove os dados do evento de giro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Respostas específicas de espécies à luz quase UV.
(A) Quadros de amostra de D. japonica scrunching e S. mediterranea tail thinning em resposta à luz quase UV. (B) Parcelas de oscilação representativas de S. mediterranea e D. japonica em resposta à luz quase UV. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Resposta específica das espécies a 250 μM cinnamaldeído, um agonista TRPA1.
(A) Parcelas de oscilação representativas para os planários D. japonica e S. mediterranea em um banho de cinnamaldeído de 250 μM. (B) Parcelas de oscilação representativas mostrando perda de scrunching em 250 μM cinnamaldeído em SmTRPA1 RNAi S. mediterranea planarians. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

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Utilizando este protocolo, pode-se estudar quantitativamente os efeitos dos estímulos físicos e químicos7,,28,29 ou manipulação genética (RNAi)28,29 sobre locomoção planária. Para maximizar a resolução espacial, é melhor mover a câmera o mais perto possível da arena, garantindo que toda a arena esteja no campo de visão. Para aumentar o rendimento, o comportamento de vários planários pode ser exibido de uma só vez registrando vários planários simultaneamente. Ao selecionar mais de um planário em uma única arena, regiões de interesse podem ser desenhadas em Fiji para isolar planários individuais como descrito aqui ou um rastreamento multi-objeto mais avançado pode ser empregado. Uma questão de ter vários planários na mesma arena é que eles podem cruzar caminhos. Esse problema pode ser resolvido através do uso de placas multi-poços para isolar planários uns dos outros, permitindo ainda o registro simultâneo de muitos indivíduos para quantificar o comportamento23,24. No entanto, os planários passarão relativamente mais tempo na parede em arenas menores, exigindo ajustes na análise de imagem e limitando a resolução para quantificação de scrunching/peristalsis.

Quando os estímulos são administrados localmente (por exemplo, pipetting7, amputação7,28, ponteiro laser17), é crucial que os planários sejam consistentemente estimulados na mesma região porque estimular outras regiões do corpo pode potencialmente induzir comportamentos diferentes. Diferentes métodos de entrega (como pipetação ou banho de um produto químico) também podem afetar a consistência do fenótipo comportamental. Além disso, os planários podem dessensibilizar rapidamente28, o que precisa ser levado em consideração ao planejar experimentos como os mesmos planários não devem ser imediatamente reutilizados para múltiplos experimentos, usando os mesmos ou diferentes estímulos. Finalmente, como mostrado aqui para exposição quase UV e cinnamaldeído, é importante estar ciente de que o mesmo estímulo pode induzir comportamentos distintos em diferentes espécies planárias. D. japonica amassou quando estimulado com luz quase UV perto da ponta traseira, enquanto os planários de S. mediterranea exibiam afinamento da cauda. Em contraste, a exposição cinnamaldeído induziu o scrunching em S. mediterranea, mas não em D. japonica planarians. Assim, enquanto o scrunching é uma resposta conservada de várias espécies planárias aos estímulos nocivos7, tem parâmetros específicos de espécies7,28, sensibilidades28e indutores28. Portanto, para uma nova espécie para a qual o scrunching ainda não foi parametrizado, é melhor começar com um indutor bem conservado, como a amputação7, para determinar os parâmetros específicos da espécie antes de testar a resposta a outros estímulos.

Uma limitação da análise descrita aqui é que ela não contabiliza turnos e/ou comportamentos mistos, como scrunching intermitente com agitação da cabeça, deslizamento ou outras alterações de forma corporal. No entanto, a inspeção minuciosa dos dados brutos pode ajudar a mitigar esses problemas se essas instâncias forem excluídas manualmente da análise, conforme demonstrado na Figura 3. Além disso, é possível adicionar a análise da forma corporal ao centro de rastreamento de massa e comprimento descrito aqui e expandir o protocolo para quantificar esses outros comportamentos planários. Dado que a análise não faz suposições sobre o organismo estudado, o protocolo poderia, em princípio, também ser aplicado a outros organismos que apresentem tipos semelhantes de comportamentos.

O método de quantificar as diferentes marchas planárias e distinguir a peristose, como descrito aqui, não pressupõe treinamento prévio em análise de imagem computacional ou estudos comportamentais e não requer equipamento ou software especializado. Para facilitar a adaptação do protocolo, os dados de exemplo são fornecidos no Material Suplementar. A facilidade de obtenção e cultivo de planários, bem como a capacidade de registrar comportamentos sem equipamentos especializados, torna os estudos comportamentais planários amplamente acessíveis à pesquisa em todos os níveis, desde salas de aula do ensino fundamental até laboratórios acadêmicos. Uma versão modificada deste protocolo foi usada com sucesso em um laboratório de ensino que era composto principalmente por calouros e estudantes do segundo ano e incluía tanto os potenciais graduandos STEM quanto não-STEM.

A combinação de ferramentas moleculares (RNAi) e químicas com análise comportamental quantitativa, conforme descrito neste protocolo, permitem aos pesquisadores obter insights mecanicistas sobre o controle molecular do comportamento. Tal trabalho descobriu alguns dos principais mediadores e circuitos neuronais envolvidos no deslizamento planário19,20, fototaxis17,35,36, termotaxis9,,37, e scrunching9,28,29. Embora comportamentos planários possam não ter comportamentos corolários diretos em organismos superiores, como os humanos, esses comportamentos representam funções neuronais fundamentais importantes para todos os organismos - a capacidade de sentir e processar estímulos específicos e reagir adequadamente. Devido à conservação das principais funções neuronais em diferentes organismos, estudos mecanicistas em planários podem nos ensinar de forma mais ampla sobre o controle neuronal do comportamento. Além disso, a análise do comportamento planário em resposta à exposição química pode ser usada para estudar os efeitos do produto químico no sistema nervoso planário23,,24,,25, que pode informar sobre potenciais riscos para o cérebro humano. Em particular, o scrunching induzido pelo calor nocivo foi considerado um ponto final sensível e específico para o ensaio da neurotoxicidade, pois torna-se interrompido pela exposição a certas classes de produtos químicos22,,24,,25,30. Finalmente, as capacidades regenerativas únicas do planário permitem aos pesquisadores dissecar a dinâmica de como diferentes comportamentos são restaurados durante a neuroregeneração.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Os autores agradecem ao Sr. Tapan Goel pelos comentários sobre o manuscrito. Este trabalho foi financiado pela NSF CAREER Grant 1555109.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Allyl isothiocyanate, 95% (AITC) Sigma-Aldrich 377430-5G CAUTION:  Flammable and acutely toxic; handle in a fume hood with appropriate PPE.
Camera lens, 2/3 25mm F/1.4  Tamron 23FM25SP
Cell culture plates, 6 well, tissue culture treated Genesee Scientific  25-105
Centrifuge tubes, 50 mL polypropylene, sterile MedSupply Partners 62-1019-2
Cinnamaldehyde, >95% Sigma-Aldrich W228613-100G-K
Dimmable A4 LED Tracer Light Box Amazon B07HD631RP
Flea3 USB3 camera FLIR FL3-U3-13E4M
Heat resistant gloves Fisher Scientific 11-394-298
Hot plate Fisher Scientific HP88854200
Instant Ocean Sea Salt, prepared in deionized water Instant Ocean SS15-10 Prepare in deionized water at 0.5 g/L.
Montjüic salts, prepared in Milli-Q water Sigma-Aldrich various Prepare in milli-Q water at 1.6 mM NaCl, 1.0 mM CaCl2, 1.0 mM MgSO4, 0.1 mM MgCl2, 0.1 mM KCl, 1.2 mM NaHCO3; adjust pH to 7.0 with HCl.
Petri dishes, 100 mm x 20 mm, sterile polystyrene Simport D210-7
Pipette, 20-200 μL range Rainin 17008652
PYREX 150 mL beaker Sigma-Aldrich CLS1000150
Razor blade, 0.22 mm VWR 55411-050
Roscolux color filter:  Golden Amber Rosco R21 Alternatively purchase the Roscolux Designer Color Selector (Musson Theatrical product #SBLUX0306) which includes all 3 color filters together.
Roscolux color filter:  Medium Red Rosco R27
Roscolux color filter:  Storaro Red Rosco R2001
Samco transfer pipette, 62 µL large aperture Thermo Fisher 691TS
Support stand  Fisher Scientific 12-947-976
Thermometer VWR 89095-600
UV laser pointer Amazon B082DGS86R This is a Class II laser (405nm ±10nm) with output power <5 mW.

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Planarian Scrunching como uma leitura comportamental quantitativa para sensoriamento de estímulos nocivos
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Sabry, Z., Rabeler, C., Ireland, D., Bayingana, K., Collins, E. M. S. Planarian Scrunching as a Quantitative Behavioral Readout for Noxious Stimuli Sensing. J. Vis. Exp. (161), e61549, doi:10.3791/61549 (2020).More

Sabry, Z., Rabeler, C., Ireland, D., Bayingana, K., Collins, E. M. S. Planarian Scrunching as a Quantitative Behavioral Readout for Noxious Stimuli Sensing. J. Vis. Exp. (161), e61549, doi:10.3791/61549 (2020).

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