Imagem celular ao vivo super-resolução de estruturas subcelulares
Summary
Apresentado aqui é um protocolo para imagens de células vivas de super-resolução em tecido intacto. Nós padronizamos as condições para a imagem de uma população de células-tronco adultas altamente sensíveis em seu ambiente de tecido nativo. Esta técnica envolve o equilíbrio da resolução temporal e espacial para permitir a observação direta de fenômenos biológicos no tecido vivo.
Abstract
Há muito tempo há uma troca crucial entre a resolução espacial e temporal na imagem. Imagens além do limite de difração de luz têm sido tradicionalmente restritas a serem usadas apenas em amostras fixas ou células vivas fora do tecido rotulado com forte sinal fluorescente. As técnicas atuais de imagem de células vivas de super-resolução exigem o uso de sondas especiais de fluorescência, alta iluminação, múltiplas aquisições de imagens com processamento pós-aquisição ou muitas vezes uma combinação desses processos. Esses pré-requisitos limitam significativamente as amostras biológicas e contextos aos os que essa técnica pode ser aplicada.
Aqui descrevemos um método para executar a super-resolução (~140 nm XY-resolução) fluorescência de fluorescência de fluorescência ao vivo de imagem em si. Esta técnica também é compatível com baixa intensidade fluorescente, por exemplo, EGFP ou mCherry etiquetada em genes humildemente expressos. Como prova de princípio, usamos este método para visualizar múltiplas estruturas subcelulares no teste de Drosophila. Durante a preparação tecidual, tanto a estrutura celular quanto a morfologia tecidual são mantidas dentro dos testíficos dissecados. Aqui, usamos essa técnica para a dinâmica dos microtúbulos de imagem, as interações entre microtúbulos e a membrana nuclear, bem como a fixação de microtúbulos aos centromeres.
Esta técnica requer procedimentos especiais na preparação da amostra, montagem de amostras e imobilização de amostras. Além disso, os espécimes devem ser mantidos por várias horas após a dissecção sem comprometer a função e a atividade celular. Embora tenhamos otimizado as condições para imagens de super resolução viva especificamente em células-tronco germinais machos Drosophila (GSCs) e células germinativas progenitoras em tecido de testíase dissecado, esta técnica é amplamente aplicável a uma variedade de diferentes tipos de células. A capacidade de observar células sob suas condições fisiológicas sem sacrificar resolução espacial ou temporal servirá como uma ferramenta inestimável para pesquisadores que buscam abordar questões cruciais na biologia celular.
Introduction
Visualizar estruturas subcelulares e dinâmicas proteicas em células vivas com resolução além do limite de difração de luz é tipicamente muito desafiador1-3. Enquanto várias técnicas de super-resolução como A Microscopia Estocástica-Óptica-Reconstrução (STORM), Foto-Ativada-Localização-Microscopia (PALM) e Esgotamento de Emissões Estimuladas (STED)4,5,6 microscopia foram desenvolvidas, complicações na preparação de amostras ao vivo, limitando o uso de microscopia de super resolução convencional para imagens ao vivo. A microscopia confocal convencional não pode alcançar a resolução espacial além da resolução XY de ~230 nm e muitas vezes é insuficiente para observar subestruturas celulares intrincadas5,6. No entanto, um desenvolvimento recente em microscopia confocal, imagem de super-resolução airyscan, é capaz de alcançar aproximadamente 140 nm (resolução XY)7,8 e tem uma preparação amostral relativamente simples que é compatível com imagens vivas. Uma vez que este sistema de detecção de imagens requer um longo tempo de aquisição, sua alta resolução espacial vem ao custo da resolução temporal9. Portanto, é necessário um método para garantir que a imagem de células vivas seja estendida com alta resolução espacial.
Aqui, desenvolvemos um método para observar células vivas em tecido intacto em sua resolução ideal para decifrar estruturas subcelulares com informações espaciais detalhadas. Este método é projetado como tal para que as amostras possam ser montadas de forma estável por um longo período de tempo (~ 10 h) sem se mover ou degenerar. A mídia de células vivas usada nesta técnica pode suportar a função celular e evitar fotobleaching por até 10 horas sob um microscópio de super resolução. Finalmente, este protocolo minimiza a maioria das tensões causadas pela iluminação constante de lasers ao longo de longos períodos de tempo, como hipóxia, mudanças na umidade e temperatura, bem como exaustão de nutrientes.
Utilizando este protocolo para imagem de células-tronco germinais machos Drosophila (GSCs), pudemos observar como a atividade assimétrica dos microtúbulos permite a interação preferencial com cromátides irmãs epigenéticamente distintas10,11,12,13. Esses tipos de eventos celulares são altamente dinâmicos e são muito difíceis de visualizar em células vivas usando outros métodos de imagem de super-resolução, como STORM, PALM ou STED. Prevemos que esse método se tornará altamente útil para os biólogos celulares, pois eles visam entender as estruturas subcelulares dinâmicas das células vivas residentes em tecidos. Existem muitas áreas em que esse método pode ser aplicado, como estudar a dinâmica das proteínas; compreender o movimento das células; e rastreamento de linhagem e processos de diferenciação celular, entre outras possíveis aplicações.
Protocol
Representative Results
Discussion
Métodos de microscopia de super resolução fornecem resolução espacial de até 10s de nanômetros4,5,6. Os métodos de microscopia STORM e PALM permitem resolução de até 20 a 50 nm (resolução XY), enquanto a microscopia STED oferece resolução de 20 a 100 nm (resolução XY). A resolução espacial da microscopia SIM é limitada a 100 a 130 nm15. No entanto, devido à sua alta densidade de fótons e ao longo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer às instalações do Núcleo Integrado de Imagens da Universidade Johns Hopkins por microscópios e software de análise de dados. Agradecemos a J. Snedeker e Q. E. Yu por revisarem e sugestões, e aos membros do laboratório X.C. por discussões e sugestões úteis. Apoiados pelo NIGMS/NIH R35GM127075, o Howard Hughes Medical Institute, a Fundação David e Lucile Packard e os fundos de startup da Universidade Johns Hopkins (X.C.).
Materials
| Adobe Illustrator CS6 (figure making software) | Adobe | N/A | |
| Dialysis membrane | Spectra/Por 1-4 Standard RC Dialysis Membrane | Cat No. 08-67121 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | Cat. no. 26140079 | 15% (V/V) |
| Fiji (analysis software) | NIH | N/A | Image fluorescence intensity quantification |
| Glass bottom cell culture dishes (FluroDish) | World Precision Instrument, Inc. | FD35PDL-100 | |
| Imaris (image reconstruction software) | Bitplane | N/A | 3D image reconstruction |
| Imerssion oil | Zeiss | Immersol 518F/30 °C | |
| Insulin | Sigma | Cat. No. 15550 | 200 µg/ml |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | Cat No. – 15140-122 | 0.6x |
| Schneider Drosophila media | Invitrogen | Cat No. – 11720-034 | |
| Spinning disc confocal microscope | Zeiss | N/A | equipped with an evolve camera (Photometrics), using a 63x Zeiss objective (1.4 NA). |
| Tissue paper | Kimwipe | N/A | Wet to form humid chamber |
| LSM 800 confocal microscope with AiryScan super-resolution module | Zeiss | N/A | equipped with highly sensitive GaAsP (Gallium Arsenide Phosphide) detectors using a 63x Zeiss objective (1.4 NA) |
| ZEN (imaging software) | Zeiss | N/A |
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