Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

رسم خرائط للعلاقات بين الهيكل والوظيفة لعوامل النسخ غير المنضبطة باستخدام التحليل النسخي

Published: June 27, 2020 doi: 10.3791/61564
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1,3, 1,4
1Center for Childhood Cancer and Blood Diseases, Abigail Wexner Research Institute at Nationwide Children's Hospital, 2Molecular, Cellular, and Developmental Biology Program, The Ohio State University, 3Division of Pediatric Hematology/Oncology/Blood & Marrow Transplant, The Ohio State University, 4Department of Pediatrics, The Ohio State University

Summary

المجالات المضطربة في جوهرها مهمة لوظيفة عامل النسخ الإنصهاري. لاستهداف هذه البروتينات علاجيا، هناك حاجة إلى فهم أكثر تفصيلا للآليات التنظيمية المستخدمة من قبل هذه المجالات. هنا ، نستخدم transcriptomics لرسم خريطة السمات الهيكلية الهامة للمجال EWS المضطربة في جوهرها في ساركوما يوينغ.

Abstract

تتميز العديد من أنواع السرطان بنقل الكروموسومات مما يؤدي إلى التعبير عن عوامل النسخ الإنصهاري الأورام. عادة، تحتوي هذه البروتينات على مجال مضطرب في جوهره (IDD) تنصهر مع مجال الحمض النووي ملزمة (DBD) من بروتين آخر وتنسيق تغييرات النسخ على نطاق واسع لتعزيز الخبيثة. وغالبا ما تكون هذه الاندماجات الانحراف الجينومي المتكرر الوحيد في السرطانات التي تسببها، مما يجعلها أهدافا علاجية جذابة. ومع ذلك ، فإن استهداف عوامل النسخ على أساس المنشأ يتطلب فهما أفضل للدور الآلي الذي تلعبه معرفات ال IDDs منخفضة التعقيد في وظيفتها. المجال N-المحطة الطرفية من EWSR1 هو معرف تشارك في مجموعة متنوعة من عوامل النسخ الانصهار oncogenic، بما في ذلك EWS / FLI، EWS / ATF، وEWS/WT1. هنا ، نستخدم تسلسل الحمض النووي الريبي للتحقيق في السمات الهيكلية لنطاق EWS المهم للوظيفة النسخية ل EWS / FLI في Ewing sarcoma. يتم تنفيذ أول استنفاد بوساطة shRNA من الانصهار الداخلي من خلايا ساركوما Ewing مقترنة بتعبير خارج الرحم لمجموعة متنوعة من البنى المتحولة EWS. ثم يتم استخدام تسلسل الحمض النووي الريبي لتحليل نسخ الخلايا التي تعبر عن هذه البنى لتوصيف العجز الوظيفي المرتبط بالطفرات في مجال EWS. من خلال دمج التحليلات النسخية مع المعلومات المنشورة سابقا حول زخارف ربط الحمض النووي EWS / FLI ، وتوطين الجينوم ، وكذلك المقايسات الوظيفية لتحويل القدرة ، تمكنا من تحديد السمات الهيكلية لEWS / FLI مهمة ل oncogenesis وتحديد مجموعة جديدة من الجينات المستهدفة EWS / FLI الحرجة لساركوما Ewing. توضح هذه الورقة استخدام تسلسل الحمض النووي الريبي كوسيلة لرسم خريطة للعلاقة بين الهيكل والوظيفة للمجال المضطرب في جوهره لعوامل النسخ الجيني.

Introduction

وتتميز مجموعة فرعية من السرطانات، بما في ذلك العديد من الأورام الخبيثة في مرحلة الطفولة والمراهقة، عن طريق نقل الكروموسومات التي تولد oncogenes الانصهار رواية1،2،3،4،5،6. بروتينات الانصهار الناتجة كثيرا ما تعمل كعوامل النسخ أونوجينيك، وتنظيم تغييرات واسعة النطاق في التنظيم النسخي لتعزيز الورم7،8. السرطانات مع هذه النقلات تمتلك عادة المناظر الطبيعية الطفرات هادئة خلاف ذلك، مع عدد قليل من الانحرافات الجينومية المتكررة جانبا من الانصهار pathognomonic4،9. على هذا النحو ، فإن استهداف بروتين الانصهار مباشرة هو استراتيجية علاجية جذابة في هذه الأمراض. ومع ذلك ، فإن عوامل النسخ أونكوجيني هذه تتكون عادة من نطاق منخفض التعقيد ، مضطرب في جوهره ، تنشيط نسخي تنصهر مع مجال الحمض النووي ملزمة (DBD)10،11،12،13،14. وقد ثبت أن كلا من المجالات المضطربة في جوهرها (IDDs) وDBDs من هذه البروتينات من الصعب استهدافها بالنهج الدوائية التقليدية. ولذلك، فإن تطوير نهج علاجية جديدة يتطلب فهما جزيئيا أكثر تفصيلا للآليات التي تستخدمها هذه الاندماجات لتنظيم التعبير الجيني بشكل شاذ.

ويندمج عادة جزء N-TERMINAL IDD من EWSR1 إلى DBD في السرطان ، بما في ذلك EWS / FLI في ساركوما Ewing ، EWS / WT1 في ورم الخلايا المستديرة الصغيرة المنتشرة ، وEWS / ATF1 في ساركوما الخلايا الواضحة من الأجزاء الناعمة10. الدور الآلي ل EWS IDD في كل من هذه الاندماجات غير مفهوم بشكل كامل. عائلة EWS / ETS من الانصهار ، وتحديدا EWS / FLI ، هي الأكثر تميزا وظيفيا حتى الآن. EWS / FLI ينسق الجينوم على نطاق التغيرات اللاجينية والنسخية مما يؤدي إلى تنشيط وقمع الآلاف من الجينات7،11،15،16. وقد أظهرت الدراسات أن معرف مهم لتوظيف كل من النسخ المشارك المنشط (مثل P300، WDR5، ومجمع BAF)، فضلا عن المكبوتين المشاركين (مثل مجمع NuRD)11،15،17. إن دمج معرف EWS إلى الجزء C-terminal من FLI1 يمنح خصوصية جديدة لربط الحمض النووي لETS DBD من FLI1 ، بحيث يرتبط بروتين الدمج (EWS / FLI) بالمناطق المتكررة من GGAA-microsatellite من الجينوم بالإضافة إلى توافق الآراء ETS motif18و19و20. جنبا إلى جنب مع وظيفة التوظيف المنشط المشارك، هذا النشاط الناشئة الحمض النووي ملزمة من EWS / FLI يعزز تشكيل محسن دي نوفو في GGAA-microsatellites distal إلى مواقع بدء النسخ (TSS) ("محسن مثل" الأقمار الصناعية الدقيقة) ويجند RNA بوليمراز الثاني لتعزيز النسخ في GGAA-microsatellites قريبة لSSS ("المروج مثل" الأقمار الصناعية الصغيرة)11،15،16،21.

وقد أدت هذه البيانات مجتمعة إلى افتراض أن العناصر المنفصلة داخل نطاق EWS تساهم في توظيف المنظمين المشاركين المتميزين في أنواع مختلفة من مواقع الربط EWS/FLI. ومع ذلك، فإن تمييز هذه العناصر داخل الجزء EWS من EWS/FLI، وكيفية عملها، قد أعاقته الطبيعة المتكررة والمضطربة للغاية للمجال. هنا نستخدم نظام إنقاذ بالضربة القاضية المنشور سابقا في خلايا ساركوما Ewing لرسم خريطة وظيفية لهذه العناصر في معرف EWS. في هذا النظام يتم استنفاد EWS / FLI باستخدام shRNA استهداف 3'UTR من الجين FLI1، ويتم إنقاذ التعبير مع متفاوتة EWS / FLI متحولة cDNA يبني تفتقر إلى 3'UTR7،17،22. ركزت هذه التجارب على البنى ذات الحذف المختلفة لرسم خريطة للعلاقة بين الهيكل والوظيفة بين معرف EWS والأنماط الظاهرية الهامة ، بما في ذلك تنشيط بناء مراسل GGAA-microsatellite ، ومقايسات تشكيل المستعمرة ، والتحقق المستهدف من EWS / FLI - تنشيط والجينات المكبوتة7،17،22 . ومع ذلك، فشلت هذه الدراسات في العثور على مجالات فرعية منفصلة داخل معرف EWS في EWS/FLI التي تعتبر مهمة بشكل فريد للتنشيط أو القمع. وكانت جميع البنى المختبرة إما قادرة على تنشيط وقمع جينات مستهدفة محددة ، مما يؤدي إلى تكوين مستعمرة فعالة ، أو غير قادرة على تنظيم أي من الجينات المستهدفة EWS / FLI ، مما يؤدي إلى فقدان تكوين المستعمرة7و17و22.

وتستخدم عادة التحليلات النسخية التي يتيحها اعتماد تسلسل الجيل التالي على نطاق واسع لمقارنة توقيعات التعبير الجيني في شرطين، في كثير من الأحيان في سياق الفحص أو الدراسات الوصفية. أردنا بدلا من ذلك الاستفادة من القدرة على التقاط بيانات التعبير على نطاق الجينوم باستخدام تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA-seq) لتوصيف مساهمات ال IDDs في وظيفة عامل النسخ. في هذه الحالة يتم إقران RNA-seq مع نظام الإنقاذ بالضربة القاضية لاستكشاف العلاقة بين الهيكل والوظيفة في مجال EWS. ينطبق هذا النهج على عوامل النسخ الانصهار الأخرى ، بما في ذلك الانصهارات الأخرى EWS أو عوامل النسخ البرية ذات الوظيفة غير المفهومة جيدا ، ولها مزايا متعددة على المقايسات الأخرى المستخدمة لدراسات رسم الخرائط الوظيفية ، مثل مقايسات المراسل أو qRT-PCR المستهدفة. وتشمل هذه العوامل اختبار المحددات الهيكلية للوظيفة في سياق الكروماتين ذي الصلة، والقدرة على اختبار أنواع متعددة من عناصر الاستجابة في تقييم واحد (أي تنشيطها وقمعها، والسواتل الصغيرة GGAA وغير الصغيرة، وما إلى ذلك)، والقدرة الناتجة على الكشف بشكل أفضل عن الوظيفة الجزئية.

يعتمد التنفيذ الناجح لهذا النهج على نظام قائم على الخلايا يلتقط الأنماط الظاهرية للاهتمام (في هذه الحالة خلايا A673 مع استنفاد EWS /FLI بوساطة shRNA) ، ولوحة من البنى المتحولة في متجه تعبير مناسب للنظام القائم على الخلية (في هذه الحالة ، pMSCV-hygro مع مختلف المسوخ EWS / FLI الموسومة ب 3x-FLAG ليتم تسليمها عن طريق النقل التحديثي). يوصى بالانبعال الفيروسي إما لبنى الاستنفاد المستندة إلى CRISPR ، وبنى الاستنفاد المستندة إلى shRNA ، وبنى تعبير cDNA مع التحديد المناسب لتوليد خطوط خلايا مستقرة على العدوى العابرة. يتم تعزيز التفسير النهائي للنتائج عندما يمكن إقران البيانات النسخية ببيانات أخرى تتعلق بتوطين عامل النسخ وقراءات أخرى فينوتيبيك حيثما كان ذلك متاحا.

في هذه الورقة، ونحن نطبق هذا النهج لتوصيف نشاط متحولة DAF من EWS / FLI14. متحولة DAF لديه 17 التيروزين إلى الطفرات ألانين في المناطق المتكررة من معرف EWS من EWS / FLI14. وقد تم الإبلاغ عن هذا متحولة EWS خاصة سابقا وغير قادر على تنشيط التعبير الجيني مراسل عندما تنصهر إلى ATF1 DBD14. ومع ذلك، تشير البيانات الأولية qRT-PCR أن هذا متحولة كان قادرا على تفعيل النسخ من EWS / FLI الهدف NR0B123. مكن النهج النسخي الموصوف هنا من الكشف الناجح عن الوظيفة الجزئية لتحول DAF. من خلال إقران هذه البيانات النسخية بمعلومات حول زخارف الربط والتعرف على EWS / FLI ، فإننا نظهر أيضا أن متحولة DAF تحتفظ بوظيفة في تكرار GGAA-microsatellite. وتحدد هذه النتائج DAF كأول متحولة وظيفية جزئيا EWS /FLI وتسليط الضوء على وظيفة في الجينات غير الأقمار الصناعية الصغيرة مهمة ل oncogenesis (كما ورد23). وهذا يدل على قوة هذا النهج رسم الخرائط هيكل وظيفة النسخ لتوفير نظرة ثاقبة في وظيفة عوامل النسخ أونكولينيك.

Protocol

1. اقامة في لوحة في المختبر من الانشاءات

ملاحظة: هذه الخطوة تختلف تبعا للبروتين محددة لتحليلها.

  1. إعداد aliquots من الفيروس لاستنفاد وبناء التعبير حسب الضرورة.
    1. البذور طبق زراعة الأنسجة 10 سم مع 3-5 ×10 6 HEK293-EBNA أو خلايا HEK293T لكل بناء اللازمة لاتنتاج الفيروسية. السماح للخلايا الانضمام بين عشية وضحاها في وسائط النسر المعدلة دولبيكو (DMEM) تكملها 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS), البنسلين / العقدية / الجلوتامين (P/S/Q), و 0.3 ملغم / مل G418.
      ملاحظة: يوصى بخلايا HEK293-EBNA و HEK293T للإنتاج الفيروسي لأنها سهلة النمو ، ولها كفاءة عالية في العدوى ، وتعبر بكفاءة عن البروتينات المؤتلفة من البلازميدات الظهارية. يجب أن تكون الخلايا بين 50-70٪ التقاء يوم العدوى.
    2. إعداد مزيج transfection لكل بناء نقل الفيروسية. الجمع بين 2 مل من وسائل الإعلام انخفاض المصل مع 90 ميكرولتر من كاشف العدوى.
      ملاحظة: ينصح وسائل الإعلام قبل الاحترار انخفاض المصل.
    3. إضافة 10 ميكروغرام كل من plasmid التعبئة والتغليف الفيروسية (على سبيل المثال، gag-pol)، وplasmid المغلف الفيروسي (على سبيل المثال، VSV-G)، واحدة من إما استنفاد مقرها CRISPR، والاستنفاد القائم على shRNA، أو بناء التعبير cDNA (على سبيل المثال، pMKO أو pMSCV) إلى مزيج العدوى. تخلط جيدا عن طريق الأنابيب لطيف.
    4. دع مزيج العدوى يجلس لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إزالة HEK293-EBNA وسائل الإعلام النمو من أطباق زراعة الأنسجة وإضافة 3 مل DMEM تكملها مع 10٪ FBS، P / S / Q، و 10 mM بيروفات الصوديوم. إلى كل طبق، إضافة 2 مل من مزيج العدوى دروبوايز. السماح للخلايا الجلوس في وسائل الإعلام transfection بين عشية وضحاها في حاضنة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
    5. في صباح اليوم التالي إضافة 20 مل من وسائل الإعلام DMEM مع 10٪ FBS، P / S / Q مكملات، و 10 mm بيروفات الصوديوم. احتضان الخلايا في ذلك في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لليلة واحدة.
    6. في صباح اليوم التالي، استبدل الوسائط بوسائط جمع فيروسية سعة 5 مل (VCM) (تكملها DMEM ب FBS معطل حراريا بنسبة 10٪، وP/S/Q، و20 mM HEPES).
    7. بعد 4 ساعة، وجمع VCM من لوحات وتخزينها في أنبوب مخروطي 50 مل على الجليد في 4 درجة مئوية. استبدال مع 5 مل من VCM الطازجة.
    8. بعد 4 ساعة، وجمع VCM من لوحات في نفس أنبوب مخروطي 50 مل وتخزينها على الجليد في 4 درجة مئوية. استبدال مع 8 مل من VCM الطازجة لجمع بين عشية وضحاها.
    9. في الصباح جمع VCM من لوحات وتخزينها في أنبوب مخروطي 50 مل على الجليد في 4 درجة مئوية. استبدال مع 5 مل من VCM الطازجة.
    10. بعد 4 ساعة، وجمع VCM من لوحات وتخزينها في أنبوب مخروطي 50 مل على الجليد في 4°C. استبدال مع 5 مل من VCM الطازجة. بعد 4 ساعة، وجمع VCM من لوحات وإضافة إلى أنبوب مخروطي 50 مل.
    11. مجموعات Aliquot من أنبوب 50 مل في cryotubes (2 مل لكل aliquot) بعد الترشيح من خلال مرشح 0.45 ميكرومتر. تخزين aliquots الفيروسية في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
      ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا، ويمكن تخزين الاقتباسات الفيروسية حتى تصبح جاهزة للاستخدام.
  2. خلايا البذور في الكثافة المناسبة في طبق زراعة الأنسجة 10 سم. الهدف 50٪ التقاء. السماح للخلايا الانضمام بين عشية وضحاها عن طريق وضع في الحاضنة في 37 درجة مئوية تحتوي على 5٪ CO2.
    ملاحظة: لخلايا A673 هذا هو 5 × 106 خلايا في 10 مل من وسائل الإعلام DMEM مع 10٪ FBS، P / S / Q مكملات، و 10 mM بيروفات الصوديوم. قد تختلف هذه الشروط تبعا لمعدل نمو الخلايا المستخدمة.
  3. استنزاف عامل الفائدة الداخلي. إذا كانت الخلايا لا تحتاج إلى أن يكون البروتين الذاتية من الفائدة المنضب، تخطي إلى الخطوة 1.4.
    1. ذوبان aliquot الفيروسية لتصريف shRNA أو CRISPR بناء تستهدف البروتين من الفائدة. ذوبان aliquots المجمدة بسرعة في حمام مائي 37 درجة مئوية.
    2. إضافة 2.5 ميكرولتر من 8 ملغ / مل البوليبرين إلى كل aliquot الفيروسية ومزيج عن طريق pipetting لطيف. إزالة الوسائط من لوحات من الخلايا وإضافة بلطف aliquot الفيروسية إلى لوحة 10 سم عن طريق الأنابيب على طول الجانب من لوحة. صخرة لوحة لنشر 2 مل من aliquot الفيروسية.
    3. احتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الأنسجة لمدة 2 ساعة. صخرة لوحة كل 30 دقيقة لمنع أي مناطق من لوحة تجف.
    4. إضافة 5 مل من وسائط DMEM مع 10٪ FBS, P / S / Q مكملات, و 10 mM بيروفات الصوديوم, مع 5 ميكرولتر من 8 ملغم / مل البوليبرين. دع الخلايا تحتضن بين عشية وضحاها.
    5. في الصباح إزالة الوسائط من الخلايا وخلايا المرور إلى وسائل الإعلام تكملها كاشف الاختيار. عند تمرير الخلايا، البذور لهم بطريقة تسمح لهم بالنمو لمدة 48-72 ساعة والوصول إلى التقاء 50٪.
      ملاحظة: بالنسبة لخلايا A673 ذات pSRP-iEF-2، يتم تصنيف الخلايا في انقسام 1:5 ويتم اختيارها لمدة 72 ساعة مع 2 ميكروغرام/مل بوروميسين.
  4. بناء التعبير عبر cDNA.
    1. فحص الخلايا للتأكد من التقاء 50-70٪.
    2. ذوبان aliquot الفيروسية (ق) لاتنتاج بناء cDNA (ق) من الفائدة. ذوبان aliquots المجمدة بسرعة في حمام مائي 37 درجة مئوية. إضافة 2.5 ميكرولتر من 8 ملغ / مل البوليبرين إلى كل aliquot الفيروسية ومزيج عن طريق pipetting بلطف.
    3. إزالة الوسائط من الخلايا المطلية وإضافة بلطف aliquot الفيروسية إلى لوحة 10 سم عن طريق pipetting على طول الجانب من لوحة. صخرة لوحة لنشر 2 مل من aliquot الفيروسية.
    4. احتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الأنسجة لمدة 2 ساعة. صخرة لوحة كل 30 دقيقة لمنع أي مناطق من لوحة تجف.
    5. إضافة 5 مل من وسائط DMEM مع 10٪ FBS, P / S / Q مكملات, و 10 mM بيروفات الصوديوم, مع 5 ميكرولتر من 8 ملغم / مل البوليبرين. دع الخلايا تحتضن بين عشية وضحاها.
    6. في الصباح إزالة الوسائط من الخلايا وخلايا المرور إلى وسائط التحديد المزدوج. تنمو وممرات الخلايا حسب الحاجة لمدة 7-10 أيام للسماح لاختيار مزدوج والتعبير عن بناء cDNA.
      ملاحظة: قد يتطلب هذا التقسيم من هذا المقطع أمثلية لخطوط الخلايا المختلفة. بالنسبة لخلايا A673 ذات pSRP-iEF-2 وبناء pMSCV-hygro، يتم تمرير الخلايا دون تقسيمها إلى 2 ميكروغرام/مل بوروميسين و100 ميكروغرام/مل هيغروميسين.

2. جمع الخلايا، والتحقق من صحة التعبير عن البنى، وإعداد المقايسات الظاهرية المترابطة

  1. بعد 7-10 أيام من الاختيار المزدوج جمع الخلايا في أنبوب مخروطي 15 مل. عد الخلايا التي تم جمعها مع مقياس الدم. Aliquot جمعت خلايا لتسلسل الحمض النووي الريبي والتحقق من صحة التعبير عن بنيات cDNA.
    ملاحظة: إعداد أية المقايسات الظاهرية المترابطة المطلوبة من قبل مسألة البحث قيد التحقيق. مستعمرة تشكيل المقايسات هي مثال على الفحص الظاهري المترابطة التي تستخدم هنا.
    1. جمع ما بين 5 × 105 و 1 ×10 6 خلايا لتسلسل الحمض النووي الريبي و 2 × 106 خلايا لاستخراج البروتين. خلايا بيليه عن طريق الطرد المركزي في 1000 × غرام في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وإزالة supernatant.
    2. غسل بيليه مع 1 مل برنامج تلفزيوني الباردة. بيليه عن طريق الطرد المركزي في 1000 × ز في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وإزالة supernatant. فلاش تجميد الكريات في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 درجة مئوية.
    3. إعداد أية مقايسات مترابطة مع الخلايا المتبقية.
      ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا مع عينات تم جمعها مخزنة في الثلاجة -80 درجة مئوية.
  2. التحقق من صحة الضربة القاضية للبروتين من الفائدة (إذا ما استخدمت) والتعبير عن لوحة من البنى.
    1. إذابة الكريات الخلية لاستخراج البروتين على الجليد. Resuspend الخلايا في الجليد الباردة 500 ميكرولتر العازلة استخراج النووية (20 mM HEPES درجة الحموضة 7.9، 140 mM NaCl، 10٪ الجلسرين، 1.5 مللي متر ملغ2،1 mM EDTA، 1 MM DTT، 1٪ IGEPAL) مع مثبطات البروتيز. دعه يجلس لمدة 5 دقائق على الجليد.
    2. بيليه نواة عن طريق الطرد المركزي في 1000 x ز في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وإزالة supernatant. غسل النوى في 500 ميكرولتر الجليد الباردة استخراج النووية العازلة (20 mM HEPES درجة الحموضة 7.9، 140 mM NaCl، 10٪ الجلسرين، 1.5 mM MgCl2،1 mM EDTA، 1 MM DTT، 1٪ IGEPAL) مع مثبط البروتيز.
    3. بيليه نواة عن طريق الطرد المركزي في 1000 x ز في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وإزالة supernatant. Resuspend نواة في 200 ميكرولتر الباردة RIPA العازلة مع مثبطات البروتيز (ضبط حجم العازلة RIPA وفقا لحجم بيليه.) السماح لها الجلوس على الجليد لمدة 45-60 دقيقة مع دوامة قوية كل 15 دقيقة.
    4. حطام خلايا بيليه عن طريق الطرد المركزي عند 16000 × غرام عند 4 درجات مئوية لمدة 45-60 دقيقة. الحفاظ على supernatant ونقل إلى أنبوب بارد جديد
    5. إعداد عينات لSDS-PAGE الكهربائي عن طريق الغليان 5-10 ميكروغرام من البروتين مع 1x تحميل العازلة لمدة 5 دقائق. تشغيل هلام SDS-PAGE كما هو مطلوب للبروتين من الفائدة.
    6. نقل إلى غشاء نيتروسيلولوس أو PVDF حسب الحاجة للبروتين من الفائدة. كتلة، ولطخة مع الأجسام المضادة الأولية والثانوية المناسبة لتأكيد الضربة القاضية للبروتين الذاتية (إذا استخدمت) والتعبير خارج الرحم من بناء cDNA.
      ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.
  3. استخراج الحمض النووي الريبي. تقييم جودة وكمية الحمض النووي الريبي.
    1. إذابة الكريات الخلية على الجليد. استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام السيليكا تدور العمود القائم على عدة استخراج وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    2. باختصار، lyse الخلايا باستخدام المخزن المؤقت تحلل من عدة. إما تطبيق lysate إلى السيليكا تدور العمود مع تدور قصيرة في >13000 دورة في الدقيقة لمدة 30-60 ثانية أو إزالة gDNA عن طريق تطبيق lysate إلى عمود إزالة gDNA مع تدور قصيرة في >13000 دورة في الدقيقة لمدة 30-60 ثانية.
    3. إجراء عملية هضم الحمض النووي على العمود إذا تم تطبيق lysate مباشرة على عمود تدور السيليكا. إذا كنت تستخدم عمود إزالة gDNA، قم بتطبيق eluate على عمود السيليكا-تدور مع تدور قصيرة في >13000 دورة في الدقيقة لمدة 30-60 s.
    4. غسل الحمض النووي الريبي على العمود وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. إلوت الجيش الملكي النيبالي في 30 ميكرولتر من العازلة elution.
    5. تقييم جودة الحمض النووي الريبي وكميته باستخدام مقياس الفلور، أو أي أداة أخرى قابلة للمقارنة. تأكد من أن نسبة 260/280 قريبة من 2 وأن هناك ما لا يقل عن 2.5 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي لتقديمها للتسلسل.
      ملاحظة: كما يتم تجميع النسخ المتماثلة، يجب معالجة كل نسخة متماثلة مع نفس بروتوكول استخراج الجيش الملكي النيبالي.
    6. استخدام aliquot صغيرة من الحمض النووي الريبي لتأكيد ضربة قاضية مستقرة من البروتين من الفائدة، إذا لزم الأمر، من قبل qRT-PCR. تخزين عينة الحمض النووي الريبي المتبقية في -80 درجة مئوية.
    7. جمع يكرر البيولوجية عن طريق تكرار الخطوات 1-2 حتى 3-4 مجموعات كاملة من الحمض النووي الريبي قد تم جمعها. تأكد من أن كل تكرار يعرض التعبير الكافي عن بنيات cDNA وضربة قاضية مستقرة من البروتين الداخلي (إذا ما استخدمت).

3. الجيل التالي التسلسل

  1. إرسال الحمض النووي الريبي المستخرج ليتم تسلسلها باستخدام منصة تسلسل الجيل القادم مع هدف 50 مليون 150 زوج قاعدة (bp) يقرأ نهاية مقترنة. اتبع تعليمات المرفق الذي يعالج العينات. حدد ل RNAs متعددة adenylated وتسلسل حبلا محددة.

4. المحاذاة والنسخ خط أنابيب العد

ملاحظة: يفترض هذا البروتوكول أنه بعد إرسال العينة ومعالجتها، يتم إرجاع مجموعة من الملفات FASTQ المقترنة لكل عينة. يتم ضغط هذه الملفات بشكل متكرر مع لاحقة من "fastq.gz". يتطلب إجراء مزيد من التحليل لملفات FASTQ هذه الوصول إلى مرفق الحوسبة عالي الأداء (HPC) الذي يعمل بنظام تشغيل Linux.

  1. نقل الملفات
    1. افتح محطة طرفية لبيئة HPC باستخدام PuTTY. إنشاء دليل للتحليل يسمى "مشروع".
    2. انتقل إلى دليل "path_to/project" ثم قم بعمل دليل جديد لملفات fastq الخام المضغوطة.gz التي تسمى "fastq". أيضا جعل دليل يسمى "قلصت". يظهر هذا في الشكل S1A-C.
    3. نقل الملفات fastq الخام المضغوط.gz من التخزين المحلي إلى الدليل "path_to/project/fastq/" باستخدام WinSCP أو برنامج مشابه. تحقق من وجود ملف "R1" و "R2" لكل عينة كما هو موضح في الشكل S1B.
    4. اختياري: إذا لزم الأمر، قم بتثبيت TrimGalore. تعيين الدليل الذي يحتوي على الملف القابل للتنفيذ trim_galore في متغير البيئة PATH في Linux.
      ملاحظة: يتم اقتطاع القراءات منخفضة الجودة والمحولات مع TrimGalore. تريمغالور متاح في https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore.
    5. اختياري: انتقل إلى الدليل لحزم البرامج التي تم تنزيلها (أي "path_to/البرامج"). تحميل أحدث حزمة TrimGalore باستخدام الأمر "حليقة -fsSL https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore/archive/ [الإصدار].tar.gz -o trim_galore-[الإصدار].tar.gz."
    6. اختياري: فك ملف .gz القطران. استخدام الأمر "tar-xvzf trim_galore-[version_number].tar.gz".
    7. اختياري: جعل تريمغالور قابلة للتنفيذ. استخدام الأمر "chmod a +x path_to/برنامج/TrimGalore-[الإصدار]/trim_galore". تأكد من أن هذا الدليل الجديد في PATH. استخدم الأمر "تصدير PATH = path_to / البرامج / TrimGalore -[الإصدار]:$PATH".
    8. انتقل إلى path_to/مشروع/فاستق/. استخدام TrimGalore لخفض قراءات ذات جودة منخفضة من الملفات fastq.gz باستخدام الأمر هو مبين في الشكل S1C.
      ملاحظة: قد تكون علامات إضافية لهذا الأمر ذات الصلة ويمكن العثور عليها هنا: https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore/blob/master/Docs/
      Trim_Galore_User_Guide.md
    9. تحقق من وجود ملفات fastq.gz قلصت في الدليل path_to / المشروع / قلصت. تأكد من أنها تسمى sample1_R1_val_1.fq.gz و sample1_R2_val_2.fq.gz
  2. محاذاة الملفات FASTQ قلصت مع ستار وتوليد عدد النسخ.
    ملاحظة: ستار متاح في https://github.com/alexdobin/STAR)
    1. اختياري: تثبيت STAR الإصدار 2.6 أو أحدث. تعيين STAR القابل للتنفيذ في المسار.
    2. اختياري: انتقل إلى الدليل لحزم البرامج التي تم تنزيلها (أي "path_to/البرامج").
    3. اختياري: تحميل حزمة STAR باستخدام الأمر "حليقة -SLO https://github.com/alexdobin/STAR/archive/ [الإصدار].tar.gz". فك ملف .gz القطران.
    4. اختياري: استخدم الأمر "tar-xzf [الإصدار].tar.gz". اجعل STAR قابل للتنفيذ. استخدم الأمر "chmod a+x path_to/البرنامج/STAR-[الإصدار]/bin".
    5. اختياري: تأكد من أن هذا الدليل الجديد في المسار. استخدم الأمر "تصدير PATH = path_to / البرامج / STAR -[version_number]/bin/linux_x86_64_static:$PATH".
      ملاحظة: يتوفر دليل STAR في: (https://github.com/alexdobin/STAR/blob/master/doc/STARmanual.pdf).
    6. تأكد من وجود مؤشر الجينوم لاستخدامها مع STAR. ضع هذا في دليل منفصل عن الدليل path_to/المشروع/. إذا تم إنشاء فهرس مسبقا للتجارب السابقة استخدم ذلك. بدلا من ذلك استخدام فهرس مناسب تم إنشاؤه مسبقا إذا كان متوفرا هنا: http://refgenomes.databio.org/. وإلا، قم بإنشاء فهرس جديد باستخدام الأمر "STAR--runMode genomeGenerate" باستخدام الإرشادات الموجودة في دليل STAR.
      ملاحظة: بالنسبة للباقي من هذا البروتوكول سيتم الإشارة إلى المسار إلى فهرس STAR ك "path_to/STAR_index".
    7. انتقل إلى الدليل path_to/المشروع/. إنشاء دليل جديد يسمى "STAR_output" كما هو موضح في الشكل S1D.
    8. انتقل إلى path_to/ المشروع/قلص/ الدليل. استخدم الأمر الموضح في الشكل S1D لتشغيل STAR لمحاذاة ملفات fastq.gz المشذبة.
      ملاحظة: هذه الخطوة هي الأكثر كثافة حسابيا ويوصى بتنفيذ ذلك على كتلة HPC مع مؤشرات ترابط متعددة (أي >16) المعينة لمهمة المحاذاة. اعتمادا على عدد العينات والموارد الحسابية المتوفرة قد تستغرق هذه الخطوة عدة ساعات إلى أيام.
    9. ابحث عن الإخراج المطلوب للخطوات التالية التي تحتوي على الأعداد لكل نسخة في الموقع التالي: path_to/المشروع/STAR_output/sampleN_ReadsPerGene.out.tab.
      ملاحظة: في عمود الملف ReadsPerGene.out.tab 1 يحمل معلومات حول الميزة التي يتم حسابها. العمود 2 يحمل عدد القراءة غير المتطفلة، العمود 3 يحمل عدد القراءة تقطعت بهم السبل إلى الأمام، والعمود 4 يحمل العد قراءة تقطعت بهم السبل عكس. الصفوف الأربعة الأولى من هذا الملف سوف تحتوي على معلومات حول قراءات المحاذاة التي لم محاذاة إلى جين واحد. يتطلب هذا البروتوكول عدد القراءات غير المتطفلة.
    10. استخدم RStudio (الأفضل) أو R في بيئة HPC لتجميع البيانات من الصف 5 و الأسفل للأعمدة 1 و 2 لكل عينة. تعيين دليل العمل إلى "مشروع" في R.
    11. قراءة في كل ملف ReadsPerGene.out.tab باستخدام الأمر في الشكل S2A. بالنسبة للعمود الأول، خذ الأحرف فقط قبل "." في عمود "معرف الجين Ensembl" لسهولة معالجة المصب.
    12. ترجمة التهم من كافة العينات إلى إطار بيانات يسمى "totcts" باستخدام الأوامر في الشكل S2B. حفظ هذا الجدول الجديد من البيانات العد الخام كعلامة تبويب محددة .txt الملف، أي sample_counts.txt، إذا رغبت في ذلك، وذلك باستخدامالأمر "write.table".
      ملاحظة: ترتيب معرف جين Ensembl هو نفسه لكل ReadsPerGene.out.tab ملف عبر نماذج.

5. التعبير التفاضلي وتحليل المصب

  1. تطبيع للآثار الدفعية بين العينات مع ComBat.
    ملاحظة: هناك متغيران محتملان يفسران التغيرات في التعبير الجيني، الأول هو البناء المستخدم (أي العينة) والثاني هو العوامل الخارجية المرتبطة بمرور الخلايا عبر الزمن (أي الدفعة). ينصح بخطوة لتسوية عينات التباين دفعي إلى دفعة مع ComBat حزمة R.
    1. تثبيت إذا لزم الأمر وتحميل المكتبات لSVA، DESeq2، AnnotationDBI، org. Hs.eg.db، pheatmap، RColorBrewer، جينفيلتر، القاهرة، ggplot2، ggbiplot، rgl، و reshape2 كما هو مبين في الشكل S2C. للتثبيت، استخدم الأمر "install.packages" أو الموصل الحيوي لكل الوثائق لكل حزمة.
    2. أولا تصفية البيانات إلى تلك الجينات فقط التي لديها عدد واحد على الأقل لكل قراءة. احفظ هذا الجدول الجديد للدلالة على التصفية كما هو رؤية في الشكل S2D.
      ملاحظة: في كثير من الأحيان، سيكون لدى العديد من الجينات عدد منخفض جدا أو لا يوجد عدد للقراءة.
    3. إعداد جدول ثاني لتطبيع الدفعة يسمى "vars" كما هو موضح في الشكل S2E. تعيين أسماء الصفوف إلى أسماء فريدة من كل نموذج. تعيين أسماء الأعمدة إلى "عينة" و "دفعة" و "إنشاء".
    4. تعيين كافة العينات رقم فريد في العمود "عينة" من 1 إلى n، مع n هو عدد العينات. تعيين أرقام الدفعات إلى كافة العينات في العمود "دفعة" مثل أن a_1 الشرط b_1 يتم تعيين 1، ويتم تعيين a_2 الشرط b_2 2. تعيين كافة تعيينات الشرط إلى كافة العينات في العمود "بناء" بحيث تكون كافة العينات شرط -a "A" و عينات شرط-b كلها "B".
    5. حدد متغير الدفعة أيضا، ومصفوفة نموذج فارغة محددة ل ComBat كما هو موضح في الشكل S2F. تشغيل ComBat مع الأمر المحدد في الشكل S2F.
  2. قم برعاية البيانات عن طريق تقريبها إلى أقرب عدد صحيح. أيضا إزالة الجينات ذات القيمة السلبية. استخدم الأوامر المعروضة في الشكل S3A.
    ملاحظة: إخراج التطبيع الدفعي سيكون عدد القراءة غير صحيح وبعض الجينات مع القيم السالبة. هذه الخطوة مطلوبة لأن تحليل التعبير التفاضلي في المصب لا يدعم عدد القراءات السلبية.
  3. تعريف التشكيل الجانبي التعبير التفاضلي لكل بناء باستخدام DESeq2.
    1. إدخال تصميم التجربة ل DESeq2 كما هو موضح في الشكل S3B. إنشاء DESeqDataSet (dds) باستخدام الدالة DESeqDataSetFromMatrix وتقدير عوامل الحجم وتشغيل DESEq2 كما هو موضح في الشكل S3B.
      ملاحظة: من الضروري أن بيانات العمود إدخال "شرط" بنفس ترتيب العمود في مصفوفة العد.
    2. من أجل تقييم جودة التحليل، استخراج التهم rlog-تطبيع المستخدمة من قبل DESeq2 كما هو مبين في الشكل S3B.
      ملاحظة: أثناء التحليل، تقوم DESeq2 بتحويل الأعداد باستخدام "سجل منظم"، rlog، تحويل لتقليص الاختلافات عينة إلى عينة للجينات ذات العد المنخفض (معلومات منخفضة) من أجل الحفاظ على الاختلافات في الجينات ذات الأعداد الأعلى عبر العينات (معلومات عالية).
    3. عند استخراج النتائج لكل ملف تعريف نسخي من نتائج DESeq2 ، قم بإجراء مقارنات زوجية في إشارة إلى حالة الضربة القاضية أو متجه خط الأساس الفارغ كما هو موضح في الشكل S3C. مزيد من تعديل هذه النتائج مع رموز الجينات HGNC كما هو مبين في الشكل S3D.
    4. كما رأينا في الشكل S3E، استخراج البيانات من نتائج DESeq2. تصدير كملف واحد مع معرف جين Ensembl رمز HGNC التعبير المتوسط الأساسي وبيانات التعبير التفاضلي لكافة بنيات مع log2FoldChange و القيم p الخام والمعدلة.
      ملاحظة: استخدام قيمة p المعدلة < 0.05 هو قطع الموصى بها للتعبير التفاضلي.
    5. تقييم التطبيع الدفعي الناجح والتشابه داخل العينة. تحقق من تجميع العينة باستخدام PCA ونماذج لعينة من مخططات المسافة باستخدام عمليات العد العادية ل rlog باستخدام التعليمات البرمجية الموضحة في الشكل S4A-B.
  4. استخدام ملامح التعبير التفاضلي لتوليد المؤامرات بركان باستخدام رمز في الشكل S4C. تقييم التغيرات في التعبير الجيني عبر البنى.
  5. استخدم عدد rlog العادية والتكتلات الهرمية لتحديد توقيعات الجينات الفريدة من نوعها في الإنشاءات المختلفة. استخدم الرمز الموضح في الشكل S4D.
    1. استخراج الجينات 1000 الأكثر متغير عبر جميع البنى في مصفوفة. استخدم pheatmap لإجراء تجميع هرمي غير خاضع للرقابة لعيناتك استنادا إلى هذه الجينات.
    2. استخراج مجموعات من الاهتمام من dendrogram عن طريق اتخاذ قرار على أي مستوى من مجموعات dendrogram من الاهتمام تظهر. تعيين "k" يساوي عدد المجموعات في هذا المستوى. إعادة رسم خريطة الحرارة مرتبة بواسطة الكتلة لتحديد المجموعات التي هي ذات أهمية كما هو موضح في الشكل S5.
    3. تصدير قائمة الجينات المرتبطة بكل كتلة كما هو موضح في الجدول S1. استخدم هذه المعلومات لتحديد الجينات في مجموعات الاهتمام.
  6. تحديد الأدوار البيولوجية لمجموعات مختلفة من الجينات المحددة ومقارنتها بين الطبقات. ويمكن إجراء ذلك باستخدام مجموعة متنوعة من أدوات المعلوماتية الحيوية. يستخدم ToppGene24 هنا وهو متاح مجانا على الإنترنت.
    ملاحظة: هناك العديد من الأدوات المجانية التي تتطلب مجرد قائمة من الجينات لنسخ ولصق في حقل على موقع على شبكة الانترنت. اختيار الأدوات التحليلية الأنسب لأسئلة البحث قيد التحقيق.
  7. اختياريا، إذا كانت هناك بيانات متاحة حول الربط الجينومي الذي يدفع الإخراج النسخي لعامل النسخ المثير للاهتمام، قارن الاستجابة النسخية في الجينات المرتبطة بعناصر الربط المختلفة لمواصلة تقييم وظيفة متحولة.

6. مقارنة مع الأنماط الظاهرية ذات الصلة

  1. قارن الأنماط الظاهرية المترابطة ببيانات الملف الشخصي النسخي التي تم إنشاؤها وتفسيرها حسب الاقتضاء.

Representative Results

وتشير البيانات الأولية qRT-PCR أن متحولة EWS / FLI تسمى DAF، مع التيروزين محددة لطفرات ألانين في المنطقة المتكررة والمضطربة من EWS، حافظت على القدرة على تنشيط الجينات المستهدفة EWS / FLI، لكنها فشلت في قمع الجينات المستهدفةالحرجة 23. ومن أجل فهم أفضل للعلاقة بين هذه المخلفات في مجال EWS ووظيفة EWS/FLI، استخدم البروتوكول المذكور أعلاه والمبين في الشكل 1. A673 تم نقل خلايا ساركوما يوينغ فيروسيا مع shRNA استهداف 3'UTR من FLI1, مما أدى إلى استنفاد EWS/FLI الذاتية. بعد أربعة أيام من الاختيار ، تم إنقاذ وظيفة EWS / FLI مع النقل الفيروسي لمختلف 3XFLAG الموسومة EWS / FLI يبني متحولة ، مع ناقلات فارغة كتحكم في عدم الإنقاذ. تم استخدام متحولة غير وظيفية تفتقر إلى مجال EWS ، تسمى Δ22 ، كتحكم سلبي وتم استخدام EWS / FLI البرية ، التي تسمى wtEF ، كتحكم إيجابي(الشكل 2A). تم استخدام DAF كبنية اختبار ، على الرغم من أنه يمكن استخدام أكثر من بناء اختبار واحد إذا رغبت في ذلك. تم اختيار الخلايا لمدة 10 أيام إضافية للسماح لبناء التعبير لتحقيق الاستقرار ومن ثم جمعها للجيش الملكي النيبالي (مع خطوة إزالة gDNA)، البروتين والمستعمرة تشكيل المقايسات. تم جمع أربع نسخ متماثلة وتظهر الممثلة qRT-PCR والبقع الغربية التي تظهر الضربة القاضية الفعالة والإنقاذ في الشكل 2B-D. وتجدر الإشارة إلى أن الخلايا التي أنقذها داف فشلت في تشكيل المستعمرات كما هو مبين في الشكل 2E، مما يشير إلى ضعف التحول أونكوجينيك.

بعد الانتهاء من التحقق من صحة تكرار والمقاايسات phenotypic، تم تقديم الحمض النووي الريبي إلى معهد الطب الجينومي في مستشفى الأطفال على الصعيد الوطني لإعداد المكتبة وتسلسل الجيل القادم مع ما يصل إلى ~ 50 مليون 150 بت في الثانية يقرأ نهاية مقترنة التي تم جمعها. تم إرجاع البيانات كملفات .gz fastq. تم اقتطاع قراءات منخفضة الجودة من هذه الملفات مع TrimGalore واستخدمت STAR لمحاذاة القراءات إلى hg19 الجينوم البشري وعدد القراءات لكل جين. تم استخدام hg19 لأغراض التوافق مع مجموعات البيانات المنسقة الأخرى لEWS / FLI المستخدمة في تحليل المصب. تم دمج هذه الأعداد المقروءة في مصفوفة تعداد واحدة لجميع العينات ، تظهر الصفوف الستة الأولى منها في الشكل 3.

تم تشغيل العد في البداية من خلال DESeq2 دون تطبيع الدفعة ، ومع ذلك ، أظهر الفحص البصري لمسافة العينة إلى العينة تأثيرات دفعية محيرة محتملة كما هو موضح مع الأسهم الحمراء في الشكل 4A. وقد نشأ ذلك على الأرجح بسبب التغير البيولوجي الذي أدخله مرور الخلايا في الثقافة والاختلافات في معالجة كل دفعة. تم إجراء تطبيع للآثار الدفعية مع ComBat ويوصى عموما. يتم عرض مسافات عينة إلى عينة من البيانات التي تم تسويتها الدفعي في الشكل 4B. بعد تطبيع الدفعة، تم استخدام DESeq2 لإنشاء ملفات تعريف نسخية للبنى الثلاثة (wtEF و Δ22 و DAF) بالنسبة لخط الأساس. لاحظ أنه في حين تم تضمين خلايا A673 "الأبوية" (الضربة القاضية الوهمية والإنقاذ الوهمي ، وتسمى "iLuc" هنا) في التحليل التفاضلي ، فإن مرجع هذه التجربة هي الخلايا التي استنفدت EWS / FLI ، تسمى خلايا iEF. يمكن إنشاء الملف الشخصي للنسخ للبروتين الداخلي هنا من خلال مقارنة عينة iLuc ب iEF ، وقد يكون هذا مهما في فهم كيفية عمل نظام الإنقاذ ، ولكن هذا ليس الهدف من هذا التحليل بالذات. تتضمن الملامح النسخية التي تم إنشاؤها للمسوخ ضوابط إيجابية (wtEF) وسلبية (Δ22) ، فيما يتعلق ب iEF ، بحيث يجب أن تعمل هذه كنقاط مرجعية للمسوخ الأخرى. وهذا أمر مهم، كما أن السيطرة الإيجابية في هذا المثال لم يلخص تماما وظيفة EWS/FLI الذاتية كما نوقش في مكان آخر7،23.

ويشير تحليل المكون الرئيسي (PCA) في الشكل 5 إلى أن الملف الشخصي للنسخ من DAF متوسط بين wtEF و Δ22، مما يؤكد الوظيفة الجزئية. وعلاوة على ذلك، أظهر التجمع الهرمي للجينات الأكثر متغيرة 1000 عبر العينات أن DAF فشلت في قمع الجينات المستهدفة EWS /FLI، واحتفظت جزئيا فقط نشاط تنشيط الجينات كما هو مبين في الشكل 6A والشكل S5. تحليل ToppGene اقترح أن فئات الجينات التي ينشط DAF هي متميزة وظيفيا من تلك الأهداف تنشيط EWS / FLI حيث DAF غير وظيفية (الشكل 6B). ومن المثير للاهتمام أن وظيفة الجينات المنشطة التي أنقذها wtEF ، ولكن ليس من قبل DAF ، تبدو مرتبطة بالتحكم النسخي وتنظيم الكروماتين. استنادا إلى نتائج عمليات فحص تكوين المستعمرة ، يجب تحليل الجينات من هذا التوقيع الجيني الأساسي بشكل أكبر لدورها في تكوين الخلايا الجنينية EWS / FLI بوساطة. وقد وصفت سابقا أهمية قمع الجينات EWS / FLI بوساطة17.

ومن المعروف أن EWS / FLI تمتلك تقارب ملزم فريدة من نوعها لGGAA-microsatellite تكرار العناصر19،22، وهذا الربط في هذه العناصر يدفع تنظيم الجينات المصب11،15،18،20،22. وقد وصفت هذه الأقمار الصناعية الصغيرة إما المرتبطة التنشيط أو القمع، وإما قريبة إلى (< 5 kb) TSS أو القاصي إلى (> 5 kb) TSS25. وبالإضافة إلى ذلك، هناك EWS / FLI التي تنظمها الجينات مع تقارب عالية (HA) ETS الزخارف القريبة من TSS23. من أجل مواصلة تحليل خصائص وظيفة DAF وأنواع الجينات التي نشطت EWS / FLI تمكنت DAF من إنقاذها ، تم تحليل التعبير التفاضلي للجينات المرتبطة بهذه الفئات المختلفة. ومن المثير للاهتمام، كان DAF الأكثر قدرة على إنقاذ الجينات تنشيط GGAA-microsatellite، ولكن غير قادر على إنقاذ الجينات المنشطة بالقرب من موقع HA كما رأينا في الشكل 7. وكما رأينا في التجمع الهرمي، يفشل داف في إنقاذ القمع بوساطة EWS/FLI عبر فصول الزخارف. وتشير هذه البيانات إلى أن القوات المسلحة الدافقة تحتفظ بسمات هيكلية كافية من الأنظمة الإنذارية المباشرة لربط السواتل الصغرى التابعة ل GGAA وتنشيطها، سواء كانت قريبة أو بعيدة عن نظام دعم البرامج. هذا من المرجح أن ينشأ من نطاق SYGQ سليمة يعتقد أن تكون مهمة لنشاط EWS / FLI في GGAA يكرر11. وتشير هذه البيانات أيضا إلى أن التيروزينات المحددة التي تحورت في DAF تلعب أدوارا مهمة ، ولكنها غير مفهومة بشكل جيد ، في تنظيم الجينات بوساطة EWS / FLI من مواقع HA ، وكذلك في قمع الجينات ، مما يسلط الضوء على مجال مهم لمزيد من التحقيق.

Figure 1
الشكل 1: سير العمل. تصوير الإجراء خطوة بخطوة لتنفيذ تعيين وظيفة الهيكل بواسطة transcriptomics. تم إعداد الخلايا أولا للتعبير عن مجموعة من الإنشاءات المطلوبة لرسم خرائط وظيفة البنية. بعد التعبير، تم حصاد الخلايا للجيش الملكي النيبالي والبروتين وجرى فحصها للأنماط الظاهرية المترابطة. تم التحقق من صحة التعبير عن البنى ، وتكررت هذه العملية 3-4 مرات لجمع تكرارات بيولوجية مستقلة. ثم تم تقديم الحمض النووي الريبي لتسلسل الجيل التالي (NGS). عند تلقي البيانات، تم اقتطاع البيانات من أجل الجودة، والمحاذاة، وحساب عدد النسخة. وتم التحكم في الآثار الدفعية وتحديد التوقيعات النسخية والتعبير التفاضلي باستخدام DESeq2. ويمكن دمج التجميع الهرمي وتحليل المصب دمج مجموعات البيانات الأخرى -omics ومسار مختلف أو تحليل وظيفي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: التحقق من صحة التعبير البناء والآساءات المترابطة. (أ)تخطيطي يصور البنى التي تم اختبارها في هذا المثال. (ب)التحقق من الضربة القاضية من EWS/FLI الذاتية والتعبير عن 3X-FLAG الموسومة يبني من قبل immunoblot. (C, D) التحقق من صحة نشاط البناء في EWS / FLI (C) الجين المستهدف المنشط ، NR0B1، و (D) الجين المستهدف المكبوت ، TGFBR2، بواسطة qRT-PCR. يتم تقديم البيانات على أنها متوسط الانحراف المعياري +/- . تم حساب القيم P مع اختبار الأهمية الصادق ل Tukey. * ع < 0.05 ، ** ع < 0.01 ، *** ع < 0.005 (ه) مستعمرة التهم من المقايسات لينة أجار يؤديها لتقييم تحويل نشاط البنى. تم حساب القيم P مع اختبار الأهمية الصادق ل Tukey. * ص < 0.05 ، ** ص < 0.01 ، *** ع < 0.005. هذا الرقم مقتبس من Theisen،وآخرون.

Figure 3
الشكل 3: بيانات العد النهائي المجمعة للتحليل. لقطة شاشة للصفوف الستة الأولى من ملف العد مع تعداد الجينات لجميع العينات التي سيتم تطبيعها وتحليلها. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: خرائط الحرارة من عينة إلى عينة. (أ) مخطط المسافة عينة إلى عينة عرض تجميع عينة من بيانات العد الخام. يتم الإشارة إلى العينات التي تتجمع على حد سواء عن طريق الدفعة والعينة مع الأسهم الحمراء. (B) عينة إلى عينة مسافة رسم بعد تطبيع الدفعة مع ComBat. هنا، عينات من كافة النسخ المتماثلة الكتلة معا، مستقلة عن الدفعة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: نتائج تحليل التعبير التفاضلي. (أ)تظهر مؤامرة تحليل المكونات المبدئية (PCA) للتوقيعات النسخية التي تم إنشاؤها لجميع العينات تجمعا قويا داخل العينة وتوضح أن DAF وسيط بين الضوابط الإيجابية (wtEF) والسلبية (Δ22). (ب) مخططات بركان تظهر -log(p-value) المرسومة مقابل log2FoldChange للجينات في كل بناء. الجينات مع القيمة p المعدلة < 0.05 و |log2 (FoldChange)| تعتبر > 1 كبيرة وتظهر باللون الأحمر. تم تكييف لوحة 5B من Theisen، وآخرون23الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: التجميع الهرمي لتحديد فئات الجينات. (أ)التجمع الهرمي للجينات الأكثر متغير 1000 الأعلى عبر جميع البنى وخطوط الأساس، iEF، يظهر DAF ينقذ جزئيا تنشيط الجينات EWS / FLI بوساطة. (ب)الجينات ontology (وظيفة الجزيئية) النتائج من ToppGene تبين الإثراء الوظيفي للEWS / FLI الجينات التي يتم تنشيطها إما إنقاذها أو لم يتم إنقاذها من قبل DAF. تم تكييف لوحة 6B من Theisen، وآخرون23الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: تحليل مفصل لمختلف عناصر الاستجابة لعوامل النسخ لمختلف البنى: (أ)تخطيطي يصور معالجة البيانات المستخدمة لتوليد لوحات (B) و (C) من خلال دمج مجموعات البيانات الأخرى المتاحة مع ملفات تعريف النسخ هنا. (B, C) تجميع يظهر إنقاذ فئات مختلفة من EWS المباشر / FLI -(ب)تنشيط و (ج) أهداف المكبوتة. وكانت الجينات المدرجة فقط تلك الجينات مع التعبير التفاضلي للكشف عن طريق EWS/FLI الذاتية. في كل مخطط دائري، يصور اللون الرمادي جزء الجينات التي لا يتم إنقاذها من قبل البناء. الأحمر يصور جزء من الجينات التي يتم تنشيطها بشكل تفاضلي، والأزرق يصور جزء من الجينات التي يتم قمعها بشكل متفاوت. هذا الرقم مقتبس من Theisen،وآخرون.

الشكل S1: تحميل ملفات .gz fastq إلى بيئة HPC، والتشذيب والمحاذاة. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الرقم.

الشكل S2: تجميع عدد القراءة عبر العينات وتشغيل تطبيع الدفعة مع ComBat. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الرقم.

الشكل S3: تشغيل DESeq2 واستخراج نتائج تحليل التعبير التفاضلي. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الرقم.

الشكل S4: تحليل الإخراج. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الرقم.

الشكل S5: التجميع الهرمي لتحديد فئات الجينات: التجميع الهرمي لأفضل 1000 الجينات الأكثر متغير عبر جميع البنى وخط الأساس، iEF، فرزها إلى مجموعات ك. في هذه الحالة k= 7، ولكن يتم تعيين هذه المعلمة من قبل المستخدم كما هو موضح في الشكل S4D. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الرقم.

الجدول S1: قائمة الجينات (معرف الجين Ensembl) مع تعليق توضيحي للمجموعة. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

Discussion

دراسة الآليات الكيميائية الحيوية لعوامل النسخ الأورام من المهم للغاية لفهم الأمراض التي تسببها وتصميم استراتيجيات علاجية جديدة. ويصدق هذا بشكل خاص في الأورام الخبيثة التي تتميز بنقل الكروموسومات مما يؤدي إلى عوامل نسخ الانصهار. المجالات المدرجة في هذه البروتينات الشميريك قد تفتقر إلى تفاعلات ذات مغزى مع المجالات التنظيمية الموجودة في البروتينات البرية من نوع, تعقيد القدرة على تفسير المعلومات هيكل وظيفة في سياق الانصهار26,27,28. وعلاوة على ذلك، تتميز العديد من هذه الاندماجات oncogenic من قبل المجالات اضطراب في جوهرها منخفضة التعقيد10،13،29،30.

مجال EWS هو مثال على مثل هذا المجال المضطرب في جوهره الذي يشارك في مجموعة متنوعة من الاندماجات أونكوجينيك10. وقد أعاقت الطبيعة المضطربة والمتكررة في جوهرها الجهود الرامية إلى فهم الآليات الجزيئية المستخدمة في مجال EWS. وقد لجأت الجهود السابقة للتحقيق في وظيفة الهيكل إلى حد كبير إلى استخدام المسوخ المختلفة في سياق المقايسات الجينية المراسل أو في خلفيات الخلايا التي تفشل في تلخيص السياق الخلوي ذي الصلة ، أو تفتقر إلى أي اختلافات هيكلية تنتج وظيفة جزئية ذات مغزى11،17،25. الأسلوب المعروض هنا يعالج هذه المشكلات. يتم إجراء رسم خرائط وظيفة الهيكل في سياق الخلية ذات الصلة بالمرض ويمكن تسلسل الجيل التالي التنميط النسخي من تقييم وظيفة عامل النسخ في إعداد الكروماتين الأصلي. في الحالة المحددة للمتحول DAF من EWS / FLI ، أفيد DAF لإظهار القليل من النشاط في المقايسات مراسل باستخدام عناصر استجابة معزولة ، ولكن لإظهار النشاط في سياق المروج الجيني الكامل ، سواء في مقايسة مراسل أو في الكروماتين الأصلي ، مما يشير إلى النمط الظاهري مثيرة للاهتمام23. باستخدام الطريقة الموصوفة هنا بشكل مباشر أكثر يحل مسألة أي نوع من العناصر التنظيمية عبر الجينوم هي الأكثر استجابة في إعداد المرض. من خلال اختبار جميع الجينات المستهدفة المرشحة في سياق الكروماتين الأصلي في وقت واحد ، من المرجح أن يحدد النهج النسخي البنى ذات الوظيفة الجزئية.

القوة الكامنة في استخدام خلفية الخلية ذات الصلة بالمرض ربما يكون أكبر قيد على هذه التقنية. أحد أهم العوامل هو اختيار نظام الخلية المناسب لهذه التجارب. العديد من خطوط الخلايا المستمدة من الأورام الخبيثة مع عوامل النسخ pathognomonic لا تتسامح بسهولة ضربة قاضية من عامل النسخ هذا، وفي كثير من الحالات، وخاصة بالنسبة لسرطانات الأطفال، والخلية الحقيقية للأصل لا تزال مثيرة للجدل والتعبير عن oncogene في خلفيات الخلايا الأخرى سامة للغاية31،32 . في هذه الحالات، قد يكون من المفيد إجراء تجارب في خلفية خلية مختلفة، طالما أن الباحث يتوخى الحذر في تفسير النتائج ويتحقق بشكل مناسب من صحة أي نتائج ذات صلة في نوع خلية أكثر ملاءمة للمرض.

من المهم للغاية التحقق بعناية من الاستقرار والعواقب الظاهرية للتعبير عن oncogene وتقديم عينات فقط للتسلسل التي تلبي معايير صارمة. هنا، وهذا يشمل لطخة الغربية لتأكيد الضربة القاضية والإنقاذ، وqRT-PCR من عدد قليل من الجينات المستهدفة المعروفة للتحقق من صحة السيطرة الإيجابية(الشكل 2). وبالمثل من الأهمية بمكان تقليل أكبر قدر ممكن من التباين الدفعي من خلال إجراء استعدادات الخلية والجيش الملكي النيبالي بعناية على نحو مماثل قدر الإمكان من خلال كل دفعة.

تصبح الطريقة الموصوفة هنا قوية بشكل خاص عندما تقترن بأنواع أخرى من البيانات الجينومية التي تتحدث عن وظيفة عامل النسخ قيد الدراسة على نطاق الجينوم. وستتوسع الاتجاهات المستقبلية لهذا النوع من تحليل وظيفة الهيكل لتشمل ChIP-seq و ATAC-seq لتحديد ربط عامل النسخ وأي تغييرات مستحثة في إمكانية الوصول إلى الكروماتين. كجناح، يمكن أن يشير هذا النوع من البيانات إلى حيث المكونات الهيكلية المختلفة لعامل النسخ على نحو مركب تسهم في جوانب مختلفة من وظيفة (أي ربط الحمض النووي مقابل تعديل الكروماتين مقابل التوظيف المنظم المشترك). وعموما، فإن استخدام النهج القائمة على NGS لرسم خريطة للعلاقات بين الهيكل والوظيفة لعوامل نسخ الاندماج يمكن أن يكشف عن رؤى جديدة في المحددات الكيميائية الحيوية لوظيفة أونوجينيك لهذه البروتينات. وهذا أمر مهم لتعزيز فهمنا للأمراض التي تسببها وفي تمكين وضع استراتيجيات علاجية جديدة.

Disclosures

تعلن شركة SLL عن تضارب في المصالح كعضو في المجلس الاستشاري لشركة سالاريوس للأدوية وصاحب أسهم فيها. SLL هو أيضا مخترع المدرجة على الولايات المتحدة براءات الاختراع رقم. الولايات المتحدة 7,393,253 B2, "طرق وتكوينات لتشخيص وعلاج ساركوما يوينغ," والولايات المتحدة 8,557,532, "تشخيص وعلاج ساركوما يوينغ المقاومة للأدوية." وهذا لا يغير من التزامنا بسياسات JoVE بشأن مشاركة البيانات والمواد.

Acknowledgments

تم دعم هذا البحث من قبل مرفق الحوسبة عالية الأداء في معهد أبحاث أبيغيل ويكسنر في مستشفى الأطفال على مستوى البلاد. وقد دعم هذا العمل المعهد الوطني للسرطان التابع للمعاهد الوطنية للصحة [U54 CA231641 إلى SLL، R01 CA183776 إلى SLL]؛ مؤسسة أليكس موقف عصير الليمون [جائزة المحقق الشاب لERT]؛ بيلوتونيا [زمالة إلى ERT]؛ والمجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية CJ مارتن في الخارج زمالة الطب الحيوي [APP1111032 إلى KIP].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wet Lab Reagents
anti-FLI rabbit pAb Abcam ab15289 1:500
anti-lamin B1 rabbit pAb Abcam ab16048 1:2000
Cell-based system for introduction of mutant constructs Determined by cell system used
Cryotubes For viral aliquots
DMEM Corning Cellgro 10-013-CV For viral production
Fetal bovine serum Gibco 16000-044 For viral production
G418 ThermoFisher 10131027 For viral production
HEK293-EBNAs ATCC CRL-10852 For viral production
HEPES Gibco 15630106
Hygromycin B ThermoFisher 10687010
M2 anti-FLAG mouse mAb Sigma F3165 1:2000
Near IR-secondary antibodies Li-Cor
Optimem Gibco 31985062 For viral production
Penicillin/Streptomycin/Glutamine Gibco 10378-016 For viral production
Polybrene Sigma TR-1003-G For viral transduction
Puromycin Sigma P8833 Stored at 2 mg/mL stock
RNeasy Plus kit Qiagen 74136 Has gDNA removal columns
Selection reagents As dictated by cell system used
Sodium Pyruvate Gibco 11360-070 For viral production
Tissue culture media Determined by cell system used
TransIT-LT1 Mirus MIR 2304 For viral production
Software
Access to HPC environment
AnnotationDbi 1.38.2
Cairo 1.5-10
DESeq2 1.16.1
genefilter 1.58.1
ggbiplot 0.55
ggplot2 3.1.1
org.Hs.eg.db 3.4.1
pheatmap 1.0.12
PuTTY
R 3.4.0
RColorBrewer 1.1-2
reshape2 1.4.3
rgl 0.100.19
R-studio
STAR Version 2.6 or later
sva 3.24.4
TrimGalore!
WinSCP

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Miettinen, M., et al. New fusion sarcomas: histopathology and clinical significance of selected entities. Human Pathology. 86, 57-65 (2019).
  2. Knott, M. M. L., et al. Targeting the undruggable: exploiting neomorphic features of fusion oncoproteins in childhood sarcomas for innovative therapies. Cancer and Metastasis Reviews. 38, 625-642 (2019).
  3. Yoshihara, K., et al. The landscape and therapeutic relevance of cancer-associated transcript fusions. Oncogene. 34, 4845-4854 (2015).
  4. Duesberg, P. H. Cancer genes generated by rare chromosomal rearrangements rather than activation of oncogenes. Medical Oncology and Tumor Pharmacotherapy. 4, 163-175 (1987).
  5. Dupain, C., Harttrampf, A. C., Urbinati, G., Geoerger, B., Massaad-Massade, L. Relevance of Fusion Genes in Pediatric Cancers: Toward Precision Medicine. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 6, 315-326 (2017).
  6. Mitelman, F., Johansson, B., Mertens, F. The impact of translocations and gene fusions on cancer causation. Nature Reviews Cancer. 7, 233-245 (2007).
  7. Smith, R., et al. Expression profiling of EWS/FLI identifies NKX2.2 as a critical target gene in Ewing's sarcoma. Cancer Cell. 9, 405-416 (2006).
  8. Davicioni, E., et al. Identification of a PAX-FKHR gene expression signature that defines molecular classes and determines the prognosis of alveolar rhabdomyosarcomas. Cancer Research. 66, 6936-6946 (2006).
  9. Gröbner, S. N., et al. The landscape of genomic alterations across childhood cancers. Nature. 555, 321-327 (2018).
  10. Kim, J., Pelletier, J. Molecular genetics of chromosome translocations involving EWS and related family members. Physiological Genomics. 1, 127-138 (1999).
  11. Boulay, G., et al. Cancer-Specific Retargeting of BAF Complexes by a Prion-like Domain. Cell. 171, 163-178 (2017).
  12. Lessnick, S. L., Braun, B. S., Denny, C. T., May, W. A. Multiple domains mediate transformation by the Ewing’s sarcoma EWS/FLI-1 fusion gene. Oncogene. 10, 423-431 (1995).
  13. Leach, B. I., et al. Leukemia fusion target AF9 is an intrinsically disordered transcriptional regulator that recruits multiple partners via coupled folding and binding. Structure. 21, 176-183 (2013).
  14. Ng, K. P., et al. Multiple aromatic side chains within a disordered structure are critical for transcription and transforming activity of EWS family oncoproteins. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 104, 479-484 (2007).
  15. Riggi, N., et al. EWS-FLI1 Divergent Chromatin Remodeling Mechanisms to Directly Activate or Repress Enhancer Elements in Ewing Sarcoma. Cancer Cell. 26, 668-681 (2014).
  16. Tomazou, E. M., et al. Epigenome Mapping Reveals Distinct Modes of Gene Regulation and Widespread Enhancer Reprogramming by the Oncogenic Fusion Protein EWS-FLI1. Cell Reports. 10, 1082-1095 (2015).
  17. Sankar, S., et al. Mechanism and relevance of EWS/FLI-mediated transcriptional repression in Ewing sarcoma. Oncogene. 32, 5089-5100 (2013).
  18. Gangwal, K., et al. Microsatellites as EWS/FLI response elements in Ewing's sarcoma. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 105, 10149-10154 (2008).
  19. Gangwal, K., Close, D., Enriquez, C. A., Hill, C. P., Lessnick, S. L. Emergent Properties of EWS/FLI Regulation via GGAA Microsatellites in Ewing's Sarcoma. Genes & Cancer. 1, 177-187 (2010).
  20. Guillon, N., et al. The Oncogenic EWS-FLI1 Protein Binds In Vivo GGAA Microsatellite Sequences with Potential Transcriptional Activation Function. PLoS One. 4, 4932 (2009).
  21. Chong, S., et al. Imaging dynamic and selective low-complexity domain interactions that control gene transcription. Science. 361, (2018).
  22. Johnson, K. M., et al. Role for the EWS domain of EWS/FLI in binding GGAA-microsatellites required for Ewing sarcoma anchorage independent growth. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 114, 9870-9875 (2017).
  23. Theisen, E. R., et al. Transcriptomic analysis functionally maps the intrinsically disordered domain of EWS/FLI and reveals novel transcriptional dependencies for oncogenesis. Genes & Cancer. 10, 21-38 (2019).
  24. Chen, J., Bardes, E. E., Aronow, B. J., Jegga, A. G. ToppGene Suite for gene list enrichment analysis and candidate gene prioritization. Nucleic Acids Research. 37, 305-311 (2009).
  25. Johnson, K. M., Taslim, C., Saund, R. S., Lessnick, S. L. Identification of two types of GGAA-microsatellites and their roles in EWS/FLI binding and gene regulation in Ewing sarcoma. PLOS One. 12, 0186275 (2017).
  26. Kim, P., Ballester, L. Y., Zhao, Z. Domain retention in transcription factor fusion genes and its biological and clinical implications: a pan-cancer study. Oncotarget. 8, 110103-110117 (2017).
  27. de Mendíbil, I. O., Vizmanos, J. L., Novo, F. J. Signatures of Selection in Fusion Transcripts Resulting from Chromosomal Translocations in Human Cancer. PLOS One. 4, 4805 (2009).
  28. Frenkel-Morgenstern, M., Valencia, A. Novel domain combinations in proteins encoded by chimeric transcripts. Bioinformatics. 28, 67-74 (2012).
  29. Hegyi, H., Buday, L., Tompa, P. Intrinsic Structural Disorder Confers Cellular Viability on Oncogenic Fusion Proteins. PLoS Computational Biology. 5, 1000552 (2009).
  30. Latysheva, N. S., Babu, M. M. Discovering and understanding oncogenic gene fusions through data intensive computational approaches. Nucleic Acids Research. 44, 4487-4503 (2016).
  31. Deneen, B., Denny, C. T. Loss of p16 pathways stabilizes EWS/FLI1 expression and complements EWS/FLI1 mediated transformation. Oncogene. 20, 6731-6741 (2001).
  32. Kendall, G. C., et al. PAX3-FOXO1 transgenic zebrafish models identify HES3 as a mediator of rhabdomyosarcoma tumorigenesis. eLife. 7, 33800 (2018).

Tags

أبحاث السرطان، العدد 160، transcriptomics، RNA-seq، هيكل وظيفة، عوامل النسخ، المجالات المضطربة في جوهرها، EWS / FLI، ساركوما يوينغ، تنظيم الجينات
رسم خرائط للعلاقات بين الهيكل والوظيفة لعوامل النسخ غير المنضبطة باستخدام التحليل النسخي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Showpnil, I. A., Miller, K. R.,… More

Showpnil, I. A., Miller, K. R., Taslim, C., Pishas, K. I., Lessnick, S. L., Theisen, E. R. Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis. J. Vis. Exp. (160), e61564, doi:10.3791/61564 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter