Summary
Onkojenik füzyon transkripsiyon faktörü fonksiyonu için özünde düzensiz alan adları önemlidir. Bu proteinleri terapötik olarak hedeflemek için, bu alanlar tarafından kullanılan düzenleyici mekanizmaların daha ayrıntılı bir şekilde anlaşılması gerekir. Burada, Ewing sarkomunda özünde düzensiz olan EWS alanının önemli yapısal özelliklerini haritalamak için transkriptomik kullanıyoruz.
Abstract
Birçok kanser, onkojenik füzyon transkripsiyon faktörlerinin ekspresyonu ile sonuçlanan kromozomal translokasyonlarla karakterizedir. Tipik olarak, bu proteinler başka bir proteinin DNA bağlayıcı etki alanı (DBD) ile kaynaşmış özünde düzensiz bir etki alanı (IDD) içerir ve maligniteyi teşvik etmek için yaygın transkripsiyonel değişiklikler düzenler. Bu füzyonlar genellikle neden oldukları kanserlerde tekrarlayan tek genomik sapmadır ve bu da onları çekici terapötik hedefler haline getirir. Bununla birlikte, onkojenik transkripsiyon faktörlerini hedeflemek, düşük karmaşıklıktaki, IDD'lerin işlevlerinde oynadığı mekanistik rolün daha iyi anlaşılmasını gerektirir. EWSR1'in N-terminal etki alanı, EWS/FLI, EWS/ATF ve EWS/WT1 dahil olmak üzere çeşitli onkojenik füzyon transkripsiyon faktörlerinde yer alan bir IDD'dir. Burada, Ewing sarkomunda EWS/FLI'nin transkripsiyonel işlevi için önemli olan EWS alanının yapısal özelliklerini araştırmak için RNA dizilimini kullanıyoruz. Ewing sarkom hücrelerinden gelen endojen füzyonun ilk shRNA aracılı tükenmesi, çeşitli EWS-mutant yapılarının ektopik ekspresyonu ile eşleştirilmiştir. Daha sonra RNA dizilimi, EWS etki alanındaki mutasyonlarla ilişkili fonksiyonel açıkları karakterize etmek için bu yapıları ifade eden hücrelerin transkriptomlarını analiz etmek için kullanılır. Transkriptomik analizleri EWS/FLI DNA bağlama motifleri ve genomik lokalizasyon hakkında daha önce yayınlanan bilgilerle ve dönüşüm yeteneği için fonksiyonel testlerle entegre ederek, EWS/FLI'nin onkogenez için önemli yapısal özelliklerini belirleyebildik ve Ewing sarkomu için kritik öneme sahip yeni bir EWS/FLI hedef gen seti tanımlayabildik. Bu makale, onkojenik transkripsiyon faktörlerinin özünde düzensiz olan etki alanının yapı-işlev ilişkisini haritalamak için bir yöntem olarak RNA diziliminin kullanımını göstermektedir.
Introduction
Çocukluk ve ergenlik birçok malignitesi de dahil olmak üzere kanserlerin bir alt kümesi, yeni füzyon onkogenleri 1 , 2 ,3,4,5,6oluşturan kromozomal translokasyonlarla karakterizedir. Elde eden füzyon proteinleri sıklıkla onkojenik transkripsiyon faktörleri olarak işlev görür ve tümöregenez7,8'iteşvik etmek için transkripsiyonel düzenlemede yaygın değişiklikler düzenler. Bu translokasyonlara sahip kanserler genellikle patognomonik füzyon4,9dışında az sayıda tekrarlayan genomik sapma ile sessiz bir mutasyonel manzaraya sahiptir. Bu nedenle, füzyon proteinini doğrudan hedeflemek bu hastalıklarda çekici bir terapötik stratejidir. Bununla birlikte, bu onkojenik transkripsiyon faktörleri genellikle DNA bağlayıcı bir etki alanı (DBD)10 , 11 , 12 , 13,14ile kaynaşmış düşük karmaşıklıklı, özünde düzensiz, transkripsiyonsal olarak aktive edici bir etki alanından oluşur. Bu proteinlerin hem özünde düzensiz etki alanları (IDD'ler) hem de DBD'leri geleneksel farmakolojik yaklaşımlarla hedef almakta zorlanmıştır. Bu nedenle, yeni terapötik yaklaşımların geliştirilmesi, gen ekspresyonunu sapkın bir şekilde düzenlemek için bu füzyonların kullandığı mekanizmaların daha ayrıntılı bir moleküler anlayışını gerektirir.
EWSR1'in N-terminal IDD kısmı, Ewing sarkomunda EWS / FLI, dağınık küçük yuvarlak hücreli tümörde EWS / WT1 ve yumuşak parçaların açık hücre sarkomunda EWS / ATF1 dahil olmak üzere kanserde bir DBD ilekaynaşmıştır. Bu füzyonların her birinde EWS IDD'nin mekanistik rolü tam olarak anlaşılmaktadır. EWS/ETS füzyon ailesi, özellikle EWS/FLI, bugüne kadar işlevsel olarak en çok karakterize edilen ailedir. EWS/FLI, binlerce genin aktivasyonuna ve baskısına yol açan genom çapındaki epigenetik ve transkripsiyonel değişiklikleri koordine eder7,11,15,16. Çalışmalar, IDD'nin hem transkripsiyonal ko-aktivatörlerin (p300, WDR5 ve BAF kompleksi gibi) hem de yardımcı baskılayıcıların (NuRD kompleksi gibi)11 , 15,17. EWS IDD'nin FLI1'in C-terminal kısmına füzyonu, FLI1'in ETS DBD'sine yeni DNA bağlayıcı özgüllük kazandırır, böylece füzyon onkoprotein (EWS / FLI), konsensüs ETS motifi18 , 19,20'yeek olarak genomun tekrarlayan GGAA-mikrosatellit bölgelerine bağlanır. Yardımcı aktivatör işe alım fonksiyonu ile birlikte, EWS/FLI'nin bu acil DNA bağlama aktivitesi, GGAA-microsatellites distal to transkripsiyon başlangıç sahalarında (TSS) ("arttırıcı benzeri" mikrosatellitler) de novo arttırıcı oluşumunu teşvik eder ve işe alımlar GGAA-microsatellites proksimal ila TSS ("promotör benzeri" mikrosatellitler)11 , 15,16,21'detranskripsiyonu teşvik etmek için RNA polimeraz II.
Birlikte ele alındığında, bu veriler, EWS etki alanındaki ayrık unsurların farklı EWS / FLI bağlama sitelerine farklı yardımcı düzenleyicilerin işe alınmasına katkıda bulunduğu varsayımına yol açtı. Bununla birlikte, bu unsurların EWS/FLI'nin EWS bölümünde ayırt etmek ve nasıl çalıştıkları, etki alanının son derece tekrarlayan ve düzensiz doğası tarafından engellenmiştir. Burada, EWS IDD'deki bu elementleri işlevsel olarak haritalamak için Ewing sarkom hücrelerinde daha önce yayınlanan bir nakavt kurtarma sistemini kullanıyoruz. Bu sistemde EWS/FLI, FLI1 geninin 3'UTR'sını hedefleyen bir shRNA kullanılarak tükeniyor ve ifade, 3'UTR 7,17, 22'denyoksun değişen EWS/FLI mutant cDNA yapıları ile kurtarılıyor. Bu deneyler, GGAA-mikrosatellit muhabir yapısının aktivasyonu, koloni oluşumu tahlilleri ve EWS/FLI tarafından aktive edilen ve bastırılmış genlerin7,17,22 gibi önemli onkojenik fenotipler arasındaki yapı-işlev ilişkisini haritalamak için çeşitli silmelere sahip yapılara odaklanmıştır. . Ancak, bu çalışmalar EWS/FLI'deki EWS IDD'de etkinleştirme veya baskı için benzersiz olarak önemli olan ayrık alt etki alanları bulamadı. Test edilen tüm yapılar, belirli hedef genleri hem aktive edebildi hem de bastırabildi, verimli koloni oluşumuna yol açtı veya EWS / FLI hedef genlerinin hiçbirini düzenleyemedi, koloni oluşumunun kaybına yol açtı7,17,22.
Yeni nesil dizilemenin yaygın olarak benimsenmesinin sağladığı transkriptomik analizler, gen ekspresyon imzalarını tarama veya açıklayıcı çalışmalar bağlamında iki koşulda karşılaştırmak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bunun yerine, IDD'lerin transkripsiyon faktörü işlevine katkılarını karakterize etmek için RNA dizilimini (RNA-seq) kullanarak genom çapında ifade verilerini yakalama yeteneğinden yararlanmak istedik. Bu durumda RNA-seq, EWS etki alanının yapı işlevi ilişkisini keşfetmek için devirme-kurtarma sistemiyle eşleştirilir. Bu yaklaşım, diğer EWS füzyonları veya iyi anlaşılamayan işleve sahip wildtype transkripsiyon faktörleri de dahil olmak üzere diğer füzyon transkripsiyon faktörleri için geçerlidir ve muhabir tahlilleri veya hedeflenen qRT-PCR gibi fonksiyonel haritalama çalışmaları için kullanılan diğer testlere göre birden fazla avantaja sahiptir. Bunlar arasında fonksiyonun yapısal belirleyicilerinin ilgili kromatin bağlamında test edilmesi, birden fazla yanıt elemanının bir testte test edilebilmesi (örneğin, etkinleştirilmiş ve bastırılmış, GGAA-mikrosatellit ve mikrosatellit olmayan vb.) ve ortaya çıkan kısmi işlevi daha iyi tespit etme yeteneği sayılmalıdır.
Bu yaklaşımın başarılı bir şekilde uygulanması, ilgi fenotiplerini yakalayan hücre tabanlı bir sisteme (bu durumda shRNA aracılı EWS/FLI tükenmesine sahip A673 hücreleri) ve hücre tabanlı sisteme uygun bir ifade vektöründeki mutant yapılar paneline bağlıdır (bu durumda, retroviral transdüksiyon ile teslim edilecek çeşitli 3x BAYRAK etiketli EWS/FLI mutantları ile pMSCV-hygro). CRISPR tabanlı tükenme yapılarının, shRNA tabanlı tükenme yapılarının ve kararlı hücre çizgileri oluşturmak için uygun seçime sahip cDNA ifade yapılarının viral transdüksiyonunun geçici transeksiyon üzerinden yapılması önerilir. Transkriptomik veriler, transkripsiyon faktörünün yerelleştirilmesi ve mevcut olan diğer fenotipik okumalarla ilgili diğer verilerle eşleştirilebildiğinde sonuçların aşağı yönlü yorumu güçlenir.
Bu yazıda, EWS / FLI14'ünDAF mutantının aktivitesini karakterize etmek için bu yaklaşımı uyguluyoruz. DAF mutant, EWS/FLI 14'ün EWS IDD'nin tekrarlayan bölgelerinde alanin mutasyonlarına17tirozin içerir. Bu özel EWS mutant daha önce rapor edilmişti ve ATF1 DBD14ile kaynaştığında muhabir gen ekspresyonını etkinleştiremiyor. Bununla birlikte, ön qRT-PCR verileri, bu mutantın EWS / FLI hedefinin transkripsiyonunu etkinleştirebildiğini öne sürdü NR0B123. Burada açıklanan transkriptomik yaklaşım, DAF mutantının kısmi işlevinin başarılı bir şekilde algılanmasını sağladı. Bu transkriptomik verileri EWS/FLI bağlama ve tanıma motifleri hakkındaki bilgilerle eşleştirerek, DAF mutantın GGAA-mikrosatellite tekrarlarında işlevini koruduğunu daha da gösteriyoruz. Bu sonuçlar DAF'ı ilk kısmen işlevsel EWS/FLI mutant olarak tanımlar ve onkogenez için önemli olan mikrosatellit olmayan genlerdeki işlevi vurgular (bildirildiği gibi23). Bu, onkojenik transkripsiyon faktörlerinin işlevi hakkında fikir vermek için bu transkriptomik yapı fonksiyonu haritalama yaklaşımının gücünü göstermektedir.
Protocol
1. İn vitro yapı paneli kurun
NOT: Bu adım analiz edilecek belirli proteine bağlı olarak değişecektir.
- Gerektiğinde tükenme ve ifade yapıları için virüs aliquots hazırlayın.
- Viral transdüksiyon için gerekli her yapı için 3-5 x 106 HEK293-EBNA veya HEK293T hücreli 10 cm'lik bir doku kültürü yemeği tohumlayın. Hücrelerin Dulbecco'nun Modifiye Kartal Medyasında (DMEM) %10 fetal sığır serumu (FBS), penisilin/streptomisin/glutamin (P/S/Q) ve 0,3 mg/mL G418 ile desteklenmiş bir gecede yapışmasına izin verin.
NOT: HEK293-EBNA ve HEK293T hücreleri, büyümesi kolay, transfeksiyon verimliliği yüksek ve epizomal plazmidlerden rekombinant proteinleri verimli bir şekilde ifade ettikleri için viral üretim için önerilir. Hücreler transfeksiyon günü% 50-70 arasında bir araya gelmelidir. - Her viral transdüksiyon yapısı için bir transfeksiyon karışımı hazırlayın. 2 mL azaltılmış serum medyayı 90 μL transfeksiyon reaktifi ile birleştirin.
NOT: Önceden ısınma öncesi azaltılmış serum ortamı önerilir. - Transeksiyon karışımına viral ambalaj plazmidi (örneğin, gag-pol), viral zarf plazmidi (örneğin VSV-G) ve CRISPR tabanlı tükenme, shRNA tabanlı tükenme veya cDNA ifade yapısından (örneğin, pMKO veya pMSCV) 10 μg ekleyin. Hafif pipetleme ile iyice karıştırın.
- Transfeksiyon karışımını oda sıcaklığında 20 dakika bekletin. HEK293-EBNA büyüme ortamlarını doku kültürü yemeklerinden çıkarın ve % 10 FBS, P / S / Q ve 10 mM sodyum piruvat ile desteklenmiş 3 mL DMEM ekleyin. Her yemeğe damla yönünde 2 mL transfeksiyon karışımı ekleyin. Hücrelerin transfection media'da bir gecede 37 °C ve% 5 CO2'debir inkübatörde oturmasına izin verin.
- Ertesi sabah% 10 FBS, P / S / Q takviyesi ve 10 mM sodyum piruvat ile 20 mL DMEM ortam ekleyin. Bir gecede 37 °C ve %5 CO2'de hücreleri kuluçkaya yatırın.
- Ertesi sabah, medyayı 5 mL viral toplama ortamı (VCM) (%10 ısı inaktive FBS, P/S/Q ve 20 mM HEPES ile desteklenmiş DMEM) ile değiştirin.
- 4 saat sonra, plakalardan VCM toplayın ve 4 °C'de buz üzerinde 50 mL konik bir tüpte saklayın. 5 mL taze VCM ile değiştirin.
- 4 saat sonra, VCM'yi aynı 50 mL konik tüpteki plakalardan toplayın ve 4 °C'de buz üzerinde saklayın. Gecelik toplama için 8 mL taze VCM ile değiştirin.
- Sabahları plakalardan VCM toplayın ve 4 °C'de buz üzerinde 50 mL konik tüpte saklayın. 5 mL taze VCM ile değiştirin.
- 4 saat sonra, plakalardan VCM toplayın ve 4 ° C'de buz üzerinde 50 mL konik tüpte saklayın. 5 mL taze VCM ile değiştirin. 4 saat sonra, plakalardan VCM toplayın ve 50 mL konik tüpe ekleyin.
- Aliquot, 0,45 μm filtreden filtrasyondan sonra 50 mL tüpten kriyotüplere (aliquot başına 2 mL) toplar. Viral aliquotları kullanıma kadar -80 °C'de saklayın.
NOT: Protokol burada duraklatılabilir ve viral aliquotlar kullanıma hazır olana kadar saklanabilir.
- Viral transdüksiyon için gerekli her yapı için 3-5 x 106 HEK293-EBNA veya HEK293T hücreli 10 cm'lik bir doku kültürü yemeği tohumlayın. Hücrelerin Dulbecco'nun Modifiye Kartal Medyasında (DMEM) %10 fetal sığır serumu (FBS), penisilin/streptomisin/glutamin (P/S/Q) ve 0,3 mg/mL G418 ile desteklenmiş bir gecede yapışmasına izin verin.
- 10 cm'lik doku kültürü çanasında uygun yoğunlukta tohum hücreleri. Hedef %50 izdiham. Hücrelerin% 5 CO2içeren 37 ° C'de inkübatöre yerleştirerek gece boyunca yapışmasına izin verin.
NOT: A673 hücreleri için bu, %10 FBS, P/S/Q takviyesi ve 10 mM sodyum piruvat ile 10 mL DMEM ortamlarında 5 x 106 hücredir. Bu koşullar kullanılan hücrelerin büyüme hızına bağlı olarak değişebilir. - İlginin endojen faktörünü tükenmiş. Hücrelerin endojen faiz proteininin tükenmesi gerekmezse, 1.4.
- İlgi proteinini hedefleyen shRNA veya CRISPR yapının transdüksiyonu için viral aliquot çözün. Donmuş aliquotları 37 °C'lik bir su banyosunda hızlı bir şekilde çözün.
- Her viral aliquot'a 2,5 μL 8 mg/mL polibren ekleyin ve hafif pipetleme ile karıştırın. Hücre plakalarından medyayı çıkarın ve plakanın yan tarafı boyunca pipetleme yaparak 10 cm plakaya hafifçe viral aliquot ekleyin. 2 mL viral aliquot yaymak için plakayı salla.
- Doku kültürü inkübatöründe 37 °C'de 2 saat kuluçkaya yatırın. Plakanın herhangi bir alanının kurumasını önlemek için plakayı her 30 dakikada bir sallayın.
- %10 FBS, P/S/Q takviyesi ve 10 mM sodyum piruvat ile 5 μL 8 mg/mL polibren ile 5 mL DMEM ortam ekleyin. Hücrelerin gece boyunca kuluçkaya yatmasına izin verin.
- Sabahları medyayı hücrelerden çıkarın ve hücreleri seçim reaktifi ile desteklenmiş ortamlara geçiş yaptırın. Hücreleri geçirirken, 48-72 saat boyunca büyümelerini ve% 50 izdiah etmelerine izin vermek için onları tohumlayın.
NOT: pSRP-iEF-2'li A673 hücreleri için hücreler 1:5 bölmeli olarak tohumlanır ve 2 μg/mL puromycin ile 72 saat boyunca seçilir.
- cDNA ifade yapılarını çevirin.
- %50-70 izdiah onaylamak için hücreleri kontrol edin.
- İlgi çekici cDNA yapılarının transdüksiyonu için viral aliquot(ları) çözün. Donmuş aliquotları 37 °C'lik bir su banyosunda hızlı bir şekilde çözün. Her viral aliquot'a 2,5 μL 8 mg/mL polibren ekleyin ve hafifçe pipetleme ile karıştırın.
- Plakalı hücrelerden ortamı çıkarın ve plakanın yan tarafı boyunca pipetleme yaparak 10 cm plakaya hafifçe viral aliquot ekleyin. 2 mL viral aliquot yaymak için plakayı salla.
- Doku kültürü inkübatöründe 37 °C'de 2 saat kuluçkaya yatırın. Plakanın herhangi bir alanının kurumasını önlemek için plakayı her 30 dakikada bir sallayın.
- %10 FBS, P/S/Q takviyesi ve 10 mM sodyum piruvat ile 5 μL 8 mg/mL polibren ile 5 mL DMEM ortam ekleyin. Hücrelerin gece boyunca kuluçkaya yatmasına izin verin.
- Sabahları ortamları hücrelerden çıkarın ve hücreleri çift seçim ortamına geçiş yaptırın. CDNA yapının çift seçilmesine ve ifadesine izin vermek için hücreleri 7-10 gün boyunca gerektiği gibi büyütün ve geçiş yaptırın.
NOT: Bu bölümün bu bölünmesi, farklı hücre hatları için iyileştirme gerektirebilir. pSRP-iEF-2 ve pMSCV-hygro yapılı A673 hücreleri için hücreler 2 μg/mL puromycin ve 100 μg/mL higromisin'e bölünmeden geçirilir.
2. Hücreleri toplayın, yapıların ifadesini doğrulayın ve korelatif fenotipik tahliller ayarlayın
- 7-10 günlük çift seçimden sonra hücreleri 15 mL konik bir tüpte toplayın. Toplanan hücreleri hemositometre ile sayın. Aliquot, RNA dizilimi ve cDNA yapılarının ifadesini doğrulamak için hücreler topladı.
NOT: Araştırılan araştırma sorusunun gerektirdiği korelatif fenotipik tahlilleri ayarlayın. Koloni oluşturan tahliller, burada kullanılan korelatif fenotipik bir test örneğidir.- RNA dizilimi için 5 x10 5 ila 1 x10 6 hücre ve protein ekstraksiyonu için 2 x10 6 hücre toplayın. 5 dakika boyunca 4 °C'de 1.000 x g'da santrifüjleme ile pelet hücreleri ve süpernatantı çıkarın.
- Peleti 1 mL soğuk PBS ile yıkayın. 5 dakika boyunca 4 °C'de 1.000 x g'da santrifüjleme ile pelet ve süpernatantı çıkarın. Sıvı nitrojendeki flaş dondurma peletleri ve -80 °C'de saklayın.
- Kalan hücrelerle herhangi bir korelatif test ayarlayın.
NOT: Protokol burada -80 °C dondurucuda saklanan toplanan numunelerle duraklatılabilir.
- İlgi proteininin (kullanılıyorsa) devrilmesini ve yapı panelinin ifadesini doğrulayın.
- Buzda protein ekstraksiyonu için hücre peletlerini çözün. Proteaz inhibitörü ile buz soğuğunda hücreleri yeniden kullanın 500 μL nükleer ekstraksiyon tamponu (20 mM HEPES pH 7.9, 140 mM NaCl, %10 gliserol, 1.5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, %1 IGEPAL). Buz üzerinde 5 dakika bekletin.
- 5 dakika boyunca 4 °C'de 1.000 x g'da santrifüjleme ile pelet çekirdeği ve süpernatantı çıkarın. Çekirdekleri proteaz inhibitörü ile 500 μL buz soğuk nükleer ekstraksiyon tamponunda (20 mM HEPES pH 7.9, 140 mM NaCl, %10 gliserol, 1.5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, %1 IGEPAL) yıkayın.
- 5 dakika boyunca 4 °C'de 1.000 x g'da santrifüjleme ile pelet çekirdeği ve süpernatantı çıkarın. Proteaz inhibitörü ile 200 μL soğuk RIPA tamponunda resüspend çekirdek (RIPA tamponunun hacmini pelet boyutuna göre ayarlayın.) Her 15 dakikada bir güçlü girdap ile 45-60 dakika buz üzerinde bekletin.
- 45-60 dakika boyunca 4 °C'de 16.000 x g'da santrifüjleme ile pelet hücresi kalıntıları. Süpernatant tutun ve taze soğuk bir tüpe aktarın
- 5-10 μg proteini 1x yükleme tamponu ile 5 dakika kaynatarak SDS-PAGE elektroforezi için numuneler hazırlayın. İlgi çekici protein için gerektiği gibi bir SDS-PAGE jeli çalıştırın.
- İlgi proteini için gerektiğinde bir nitroselüloz veya PVDF membranına aktarın. CDNA yapının endojen proteininin (kullanılırsa) ve ektopik ekspresyonunun altının konmasını doğrulamak için uygun birincil ve ikincil antikorlarla bloke ve leke.
NOT: Protokol burada duraklatılabilir.
- RNA'yı ayıkla. RNA kalitesini ve miktarını değerlendirin.
- Hücre topaklarını buzda eritin. Üreticinin talimatlarına göre silika spin-column tabanlı ekstraksiyon kiti kullanarak toplam RNA'yı çıkarın.
- Kısaca, kitten lizis tamponu kullanarak hücreleri kür. Lisat'ı 30-60 saniye boyunca >13000 rpm'de kısa bir dönüşle bir silika spin sütununa uygulayın veya 30-60 saniye boyunca >13000 rpm'de kısa bir dönüşle bir gDNA kaldırma sütununa uygulayarak gDNA'yı çıkarın.
- Lysate doğrudan bir silika spin sütununa uygulanmışsa, sütun üzerinde DNA sindirimi gerçekleştirin. GDNA kaldırma sütunu kullanıyorsanız, eluat'ı 30-60 sn için >13000 rpm'de kısa bir dönüşle bir silika-spin sütununa uygulayın.
- RNA'yı üreticinin talimatlarına göre sütunda yıkayın. 30 μL elution tamponda Elute RNA.
- Bir florometre veya başka bir karşılaştırılabilir cihaz kullanarak RNA kalitesini ve miktarını değerlendirin. 260/280 oranının 2'ye yakın olduğundan ve sıralama için göndermek üzere en az 2,5 μg RNA olduğundan emin olun.
NOT: Çoğaltmalar toplandıkça, her çoğaltma aynı RNA ayıklama protokolü ile işlenmelidir. - Gerekirse, qRT-PCR tarafından ilgi proteininin kararlı bir şekilde devrilmesini onaylamak için küçük bir RNA aliquot kullanın. Kalan RNA örneğini -80 °C'de saklayın.
- 3-4 komple RNA seti toplanana kadar 1-2 adımlarını tekrarlayarak biyolojik çoğaltmaları toplayın. Her yinelemenin cDNA yapılarının yeterli ifadesini ve endojen proteinin (kullanılıyorsa) kararlı bir şekilde devrilmesini görüntülediğinden emin olun.
3. Yeni Nesil Sıralama
- Ayıklanmış RNA'yı, 50 milyon 150 baz çifti (bp) eşleştirilmiş uç okuma hedefine sahip yeni nesil bir sıralama platformu kullanılarak sıralanacak şekilde gönderin. Numuneleri işleyen tesisin talimatlarını izleyin. Poli-adenilasyonlu RNA'lar ve karaya özgü sıralama için seçin.
4. Hizalama ve Transkript Sayım Boru Hattı
NOT: Bu protokol, örnek gönderim ve işlemeden sonra, her örnek için eşleştirilmiş FASTQ dosyaları kümesinin döndürür olduğunu varsayar. Bu dosyalar sık sık "fastq.gz" soneki ile sıkıştırılır. Bu FASTQ dosyalarının daha fazla analizi, bir Linux işletim sistemi çalıştıran yüksek performanslı bir bilgi işlem (HPC) tesisine erişim gerektirecektir.
- Dosyaları aktarma
- PuTTY ile HPC ortamına bir terminal açın. Çözümleme için "proje" adlı bir dizin yapın.
- "path_to/proje" dizinine gidin ve sıkıştırılmış ham fastq.gz dosyaları için "fastq" adı verilen yeni bir dizin yapın. Ayrıca "kırpılmış" adlı bir dizin yapın. Bu Şekil S1A-C'de gösterilmiştir.
- Sıkıştırılmış ham fastq.gz dosyalarını WinSCP veya benzer bir program kullanarak yerel depolama alanından "path_to/project/fastq/" dizinine aktarın. Şekil S1B 'de gösterildiği gibi her örnek için bir "R1" ve bir "R2" dosyası olup olmadığını denetleyin.
- İsteğe bağlı: Gerekirse TrimGalore'u yükleyin. Linux'taki PATH ortam değişkeninde trim_galore yürütülebilir dosyayı içeren dizini ayarlayın.
NOT: Düşük kaliteli okumalar ve adaptörler TrimGalore ile kırpılır. TrimGalore https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore mevcuttur. - İsteğe bağlı: İndirilen yazılım paketleri için dizine gidin (örneğin "path_to/yazılım"). "curl -fsSL https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore/archive/[version].tar.gz -o trim_galore-[version].tar.gz" komutunu kullanarak en son TrimGalore paketini karşıdan yükleyin.
- İsteğe bağlı: Katran.gz dosyasını açın. "tar -xvzf trim_galore-[version_number].tar.gz" komutunu kullanın.
- İsteğe bağlı: TrimGalore'ı yürütülebilir hale getirin. "chmod a+x path_to/software/TrimGalore-[version]/trim_galore" komutunu kullanın. Bu yeni dizinin PATH içinde olduğundan emin olun. "PATH=path_to/software/TrimGalore-[version]:$PATH" komutunu kullanın.
- path_to/project/fastq/ adresine gidin. Şekil S1C'de gösterilen komutu kullanarak fastq.gz dosyalarından düşük kaliteli okumaları kırpmak için TrimGalore'ı kullanın.
NOT: Bu komut için ek bayraklar alakalı olabilir ve burada bulunabilir: https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore/blob/master/Docs/
Trim_Galore_User_Guide.md - path_to/project/trimmed dizininde kırpılmış fastq.gz dosyalarını denetleyin. sample1_R1_val_1.fq.gz ve sample1_R2_val_2.fq olarak adlandırıldıklarından emin olun.gz
- Kırpılmış FASTQ dosyalarını STAR ile hizalayın ve transkript sayıları oluşturun.
NOT: STAR https://github.com/alexdobin/STAR) adresinde mevcuttur- İsteğe bağlı: STAR sürüm 2.6 veya sonraki sürümünü yükleyin. Star yürütülebilir dosyayı yolda ayarlayın.
- İsteğe bağlı: İndirilen yazılım paketleri için dizine gidin (örneğin "path_to/yazılım").
- İsteğe bağlı: "curl -SLO https://github.com/alexdobin/STAR/archive/[version].tar.gz" komutunu kullanarak STAR paketini indirin. Katran.gz dosyasını açın.
- İsteğe bağlı: "tar -xzf [version].tar.gz" komutunu kullanın. STAR'ı yürütülebilir hale getirin. "chmod a+x path_to/software/STAR-[version]/bin" komutunu kullanın.
- İsteğe bağlı: Bu yeni dizinin yolda olduğundan emin olun. "PATH=path_to/software/STAR-[version_number]/bin/linux_x86_64_static:$PATH" komutunu kullanın.
NOT: STAR kılavuzu şu adresinde mevcuttur: (https://github.com/alexdobin/STAR/blob/master/doc/STARmanual.pdf). - STAR ile kullanılacak genom indeksi olduğundan emin olun. Bunu path_to/project/ dizininden ayrı bir dizine yerleştirin. Önceki denemeler için daha önce bir dizin oluşturulmuşsa, bunu kullanın. Alternatif olarak, burada varsa önceden oluşturulmuş uygun bir dizin kullanın: http://refgenomes.databio.org/. Aksi takdirde, STAR kılavuzundaki yönergeleri kullanarak "STAR-runMode genomeGenerate" komutunu kullanarak yeni bir dizin oluşturun.
NOT: Bu protokolün geri kalanı için STAR dizininin yolu "path_to/STAR_index" olarak adlandırılır. - path_to/project/ dizinine gidin. Şekil S1D'de gösterildiği gibi "STAR_output" adlı yeni bir dizin yapın.
- path_to/project/trimmed/ dizinine gidin. Kesilen fastq.gz dosyalarını hizalamak üzere STAR'ı çalıştırmak için Şekil S1D'de gösterilen komutu kullanın.
NOT: Bu adım hesaplama açısından en yoğun adımdır ve bunu hizalama görevi için belirlenmiş birden çok iş parçacığı (>16) olan bir HPC kümesinde gerçekleştirmeniz önerilir. Örneklerin sayısına ve kullanılabilir hesaplama kaynaklarına bağlı olarak, bu adım saatler ila günler sürebilir. - Transkript başına sayımları içeren sonraki adımlar için gerekli çıktıyı aşağıdaki konumda bulun: path_to/project/STAR_output/sampleN_ReadsPerGene.out.tab.
NOT: ReadsPerGene.out.tab dosyasında sütun 1, sayılan özellik hakkında bilgi tutar. Sütun 2 sınırsız okuma sayılarını, sütun 3 ileriye doğru iplikli okuma sayılarını ve sütun 4 ters iplikli okuma sayılarını tutar. Bu dosyanın ilk dört satırı, tek bir genle hizalanmamış hizalanmış okumalar hakkında bilgi sahibi olacaktır. Bu protokol, sınırsız okuma sayılarını gerektirir. - Her örnek için sütun 1 ve 2 için satır 5 ve altındaki verileri derlemek için HPC ortamında RStudio (tercih edilebilir) veya R kullanın. Çalışma dizinini R'de "proje" olarak ayarlayın.
- Şekil S2A'dakikomutu kullanarak her ReadsPerGene.out.tab dosyasında okuyun. İlk sütun için, aşağı akış işleme kolaylığı için yalnızca "Ensembl gen kimliği" sütunundaki "." öğesinin önceki karakterleri alın.
- Şekil S2B'dekikomutları kullanarak tüm örneklerden sayıları "totcts" adı verilen bir veri çerçevesine derleyin. Bu yeni ham sayım veri tablosunu sekmeyle ayrılmış bir .txt dosyası olarak, yani istenirse "write.table" komutunu kullanarak sample_counts.txt olarakkaydedin.
NOT: Ensembl gen kimliği sırası, örnekler arasında her ReadsPerGene.out.tab dosyası için aynıdır.
5. Diferansiyel ifade ve aşağı akış analizi
- ComBat ile örnekler arasındaki toplu iş efektleri için normalleştirin.
NOT: Gen ifadesindeki değişiklikleri açıklayan iki olası değişken vardır: birincisi kullanılan yapı (yani örnek) ve ikincisi hücrelerin zaman içinde geçişiyle ilişkili dış faktörlerdir (yani toplu iş). R-package ComBat ile toplu iş varyasyonu için örnekleri normalleştirmek için bir adım önerilir.- Gerekirse yükleyin ve sva, DESeq2, AnnotationDBI, org için kitaplıkları yükleyin. Hs.eg.db, pheatmap, RColorBrewer, genefilter, Kahire, ggplot2, ggbiplot, rgl ve reshape2 Şekil S2C'degösterildiği gibi. Yükleme için, her paketin belgeleri başına "install.packages" komutunu veya Bioconductor komutunu kullanın.
- İlk önce verileri yalnızca okuma başına en az bir sayıma sahip genlere filtreleyin. Şekil S2D'de görüldüğü gibi filtrelemeyi belirtmek için bu yeni tabloyu kaydedin.
NOT: Çoğu zaman, birçok genin okuma sayısı çok düşük olacaktır veya hiç olmayacaktır. - Şekil S2E'de gösterildiği gibi "vars" adı verilen toplu normalleştirme için ikinci bir tablo hazırlayın. Satır adlarını her örneğin benzersiz adlarına ayarlayın. Sütun adlarını "örnek", "toplu iş" ve "yapı" olarak ayarlayın.
- Tüm örneklere "örnek" sütununda 1 ile n arasında benzersiz bir sayı atayın; "Toplu iş" sütunundaki tüm örneklere, koşul a_1 ve koşul b_1 hem 1 hem de koşul a_2 ve koşul b_2 atanacak şekilde toplu iş numaraları atayın 2. "Yapı" sütunundaki tüm örneklere, koşul-a örneklerinin tümü "A" ve koşul-b örneklerinin tümü "B" olacak şekilde tüm koşul tanımlamalarını atayın.
- Şekil S2F'degösterildiği gibi, toplu iş değişkenini ve ComBat için belirli bir boş model matrisini de tanımlayın. ComBat'ı Şekil S2F'de tanımlanan komutla çalıştırın.
- En yakın tamsayıya yuvarlayarak verileri daha fazla küratörlük edin. Ayrıca negatif değerli genleri çıkarın. Şekil S3A'da gösterilen komutları kullanın.
NOT: Toplu normalleştirme çıktısı tamsayı olmayan okuma sayılarına ve negatif değerlere sahip bazı genlere sahip olacaktır. Aşağı akış diferansiyel ifade çözümlemesi negatif okuma sayılarını desteklemediği için bu adım gereklidir. - DESeq2 kullanarak her yapı için fark ifade profilini tanımlayın.
- Şekil S3B'degösterildiği gibi DESeq2 için deneme tasarımını girin. DESeqDataSetFromMatrix işlevini kullanarak bir DESeqDataSet (dds) oluşturun, boyut faktörlerini tahmin edin ve Şekil S3B'degösterildiği gibi DESEq2'yi çalıştırın.
NOT: "Koşul" için girilen sütun verilerinin sayım matrislerindeki sütunla aynı sırada olması zorunludur. - Analizin kalitesini değerlendirmek için, Şekil S3B'degösterildiği gibi DESeq2 tarafından kullanılan rlog normalleştirilmiş sayımları ayıklayın.
NOT: Analiz sırasında DESeq2, örnekler arasında daha yüksek sayımlara (yüksek bilgi) sahip genlerdeki farklılıkları korumak için, düşük sayımlı (düşük bilgili) genler için örnek-örnek farklılıklarını küçültmek için "düzenli bir günlük", rlog, dönüşüm ile sayımları dönüştürür. - DESeq2 sonuçlarından her transkripsiyonel profilin sonuçlarını ayıklarken, Şekil S3C'degösterildiği gibi devirme koşuluna veya taban çizgisi boş vektörüne atıfta bulunarak çift yönlü karşılaştırmalar gerçekleştirin. Şekil S3D'degösterildiği gibi HGNC gen sembolleri ile bu sonuçları daha da değiştirin.
- Şekil S3E'degörüldüğü gibi, DESeq2 sonuçlarından veri ayıklayın. Log2FoldChange ve ham ve ayarlanmış p değerlerine sahip tüm yapılar için Ensembl gen kimliği, HGNC sembolü, temel ortalama ifade ve fark ifade verileriyle tek bir dosya olarak dışa aktar.
NOT: Ayarlanmış bir p değeri < 0,05 kullanmak, diferansiyel ifade için önerilen kesmedir. - Başarılı toplu normalleştirmeyi ve örnek içi benzerliği değerlendirin. Şekil S4A-B'degösterilen athe kodunu kullanarak rlog normalleştirilmiş sayımları kullanarak PCA ve örnekle örneklem mesafe çizimleri ile örnek kümelemeyi kontrol edin.
- Şekil S3B'degösterildiği gibi DESeq2 için deneme tasarımını girin. DESeqDataSetFromMatrix işlevini kullanarak bir DESeqDataSet (dds) oluşturun, boyut faktörlerini tahmin edin ve Şekil S3B'degösterildiği gibi DESEq2'yi çalıştırın.
- Şekil S4C'deki kodu kullanarak volkan çizimleri oluşturmak için diferansiyel ifade profillerini kullanın. Yapılar arasında gen ifadesindeki değişiklikleri değerlendirin.
- Farklı yapılara özgü gen imzalarını tanımlamak için rlog normalleştirilmiş sayımlarını ve hiyerarşik kümelemeyi kullanın. Şekil S4D'de gösterilen kodu kullanın.
- Bir matristeki tüm yapılardaki en değişken 1000 geni çıkarın. Bu genlere dayanarak numunelerinizi denetimsiz hiyerarşik kümeleme gerçekleştirmek için pheatmap kullanın.
- İlgi kümelerinin hangi düzeyinde görüntüğüne karar vererek, ilgi kümelerini dendrogramdan çıkarın. "k" öğesini bu düzeydeki küme sayısına eşit olarak ayarlayın. Şekil S5 'te gösterildiği gibi hangi kümelerin ilgi çekici olduğunu belirlemek için küme tarafından sipariş edilen ısı eşlemini yeniden pilota alın.
- Tablo S1'degösterildiği gibi her kümeyle ilişkili genlerin listesini dışa aktarın. İlgi kümelerindeki genleri belirlemek için bu bilgileri kullanın.
- Tanımlanan farklı gen kümeleri için biyolojik rolleri tanımlayın ve sınıflar arasında karşılaştırın. Bu, çeşitli biyoinformatik araçlar kullanılarak gerçekleştirilebilir. ToppGene24 burada kullanılır ve çevrimiçi olarak serbestçe kullanılabilir.
NOT: Bir web sitesindeki bir alana kopyalayıp yapıştırmak için sadece genlerin bir listesini gerektiren birçok ücretsiz araç vardır. Araştırılan araştırma soruları için en uygun analitik araçları seçin. - İsteğe bağlı olarak, transkripsiyon faktörü için transkripsiyonel çıktıyı yönlendiren genomik bağlama hakkında mevcut veriler varsa, mutant fonksiyonunu daha fazla değerlendirmek için farklı bağlayıcı elemanlarla ilişkili genlerde transkripsiyonel yanıtı karşılaştırın.
6. İlgili Fenotiplerle Karşılaştırma
- Korelatif fenotipleri oluşturulan transkriptomik profil verileriyle karşılaştırın ve uygun şekilde yorumlayın.
Representative Results
Ön qRT-PCR verileri, EWS'nin tekrarlayan ve düzensiz bölgesindeki alanin mutasyonlarına özgü tirozin içeren DAF adlı bir EWS / FLI mutantının, EWS / FLI hedef genlerini aktive etme yeteneğini koruduğunu, ancak kritik hedef genleri bastırmayı başaramadığını öne sürdü23. EWS etki alanındaki bu kalıntılar ile EWS/FLI işlevi arasındaki ilişkiyi daha iyi anlamak için yukarıda açıklanan ve Şekil 1'de özetlenen protokol kullanılmıştır. A673 Ewing sarkom hücreleri, FLI1'in3'UTR'sını hedefleyen bir shRNA ile viral olarak transdüklendi ve endojen EWS / FLI'nin tükenmesiyle sonuçlandı. Dört günlük seçimden sonra, EWS/FLI fonksiyonu, farklı 3XFLAG etiketli EWS/FLI mutant yapılarının viral transdüksiyonu ile kurtarıldı ve kurtarma için kontrol olarak boş vektör vardı. Δ22 adı verilen EWS etki alanından yoksun işlevsel olmayan bir mutant negatif kontrol olarak, wtEF adı verilen vahşi tip EWS/FLI ise pozitif kontrol olarak kullanılmıştır (Şekil 2A). DAF test yapısı olarak kullanılmıştır, ancak istenirse birden fazla test yapısı kullanılabilir. Hücreler, yapı ekspresyonlarının stabilize olmasını sağlamak için ek 10 gün boyunca seçildi ve daha sonra RNA (gDNA kaldırma adımı ile), protein ve koloni oluşturan tahliller için toplandı. Dört çoğaltma toplandı ve etkili devirme ve kurtarma gösteren temsili qRT-PCR ve batı lekeleri Şekil 2B-D'degösterilmiştir. DAF tarafından kurtarılan hücrelerin Şekil 2E'degösterildiği gibi koloniler oluşturamadığı belirtilmelidir , bu da onkojenik dönüşümün bozulacağını düşündürmektedir.
Çoğaltma doğrulama ve fenotipik testlerin tamamlanmasının ardından RNA, toplanan ~50 milyon 150 bp eşleştirilmiş uç okuma ile kütüphane hazırlama ve yeni nesil sıralama için Nationwide Çocuk Hastanesi Genomik Tıp Enstitüsü'ne gönderildi. Veriler fastq.gz dosyaları olarak döndürüldü. TrimGalore ile bu dosyalardan düşük kaliteli okumalar kesildi ve STAR, okumaları insan genomu hg19'a hizalamak ve gen başına okumaları saymak için kullanıldı. HG19, aşağı akış analizinde kullanılan EWS/FLI için diğer seçilmiş veri kümeleriyle uyumluluk amacıyla kullanılmıştır. Bu okuma sayıları, ilk 6 satırı Şekil 3'tegösterilen tüm örnekler için tek bir sayım matrisinde birleştirildi.
Sayımlar başlangıçta toplu normalleştirme olmadan DESeq2 üzerinden çalıştırıldı, ancak örnekten örneğe mesafenin görsel incelemesi, Şekil 4A'dakırmızı oklarla vurgulandığı gibi potansiyel kafa karıştırıcı toplu iş efektleri gösterdi. Bu muhtemelen kültürdeki hücrelerin geçişi ve her partinin işlenmesindeki farklılıklar nedeniyle ortaya çıktı. Toplu iş efektleri için normalleştirme ComBat ile gerçekleştirildi ve genellikle önerilir. Toplu olarak normalleştirilen verilerin örneklemden örneğe mesafeleri Şekil 4B'de gösterilmiştir. Toplu normalleştirmeden sonra, DESeq2 taban çizgisine göre üç yapı (wtEF, Δ22 ve DAF) için transkripsiyon profilleri oluşturmak için kullanıldı. "Ebeveyn" A673 hücreleri (burada "iLuc" olarak adlandırılan sahte nakavt ve sahte kurtarma) diferansiyel analize dahil edilirken, bu deney için referansın iEF hücreleri adı verilen EWS / FLI tükenmiş hücreler olduğunu unutmayın. Transkripsiyonal profil, iLuc örneğini iEF ile karşılaştırarak buradaki endojen protein için oluşturulabilir ve bu, kurtarma sisteminin nasıl çalıştığını anlamakla ilgilenebilir, ancak bu özel analizin amacı bu değildir. Mutantlar için oluşturulan transkripsiyon profilleri, iEF ile ilgili olarak pozitif (wtEF) ve negatif (Δ22) kontrolleri içerir, böylece bunlar diğer mutantlar için ölçüt olarak işlev görmelidir. Bu, bu örnekteki pozitif kontrol, başka bir yerde tartışıldığı gibi endojen EWS / FLI işlevini tamamen yeniden yakalamadığı için önemlidir7,23.
Şekil 5'teki ana bileşen analizi (PCA), DAF'ın transkripsiyon profilinin wtEF ve Δ22 arasında orta olduğunu ve kısmi işlevi doğruladığını göstermektedir. Ayrıca, örnekler arasında en değişken 1000 genin hiyerarşik kümelenmesi, DAF'ın EWS / FLI hedef genlerini bastıramadığını ve Şekil 6A ve Şekil S5'te gösterildiği gibi gen aktivasyon aktivitesini sadece kısmen koruduğunu göstermiştir. ToppGene analizi, DAF'ın aktive ettiği gen sınıflarının, DAF'ın işlevsel olmadığı EWS/FLI ile etkinleştirilen hedeflerden işlevsel olarak farklı olduğunu ileri sürmektedir (Şekil 6B). İlginçtir ki, wtEF tarafından kurtarılan aktif genlerin işlevi, ancak DAF tarafından değil, transkripsiyon kontrolü ve kromatin regülasyonu ile ilgili görünüyor. Koloni oluşumunun sonuçlarına dayanarak, bu çekirdek gen imzasından elde edilen genler EWS/FLI aracılı onkogenezdeki rolleri için daha fazla analiz edilmelidir. EWS/FLI aracılı gen baskısının önemi daha önce tanımlanmıştır17.
EWS/FLI'nin GGAA-mikrosatellit tekrar elemanları19,22için benzersiz bir bağlayıcı benzeşime sahip olduğu ve bu elemanlardaki bağlamanın aşağı akış gen regülasyon 11 ,15,18,20,22' yi yönlendirdiği bilinmektedir. Bu mikrosatellitler aktivasyon veya baskı ile ilişkili ve proksimal ila (< 5 kb) TSS veya distal (> 5 kb) TSS 25 olarak karakterizeedilmiştir. Ek olarak, TSS23'eproksimal olarak yüksek benzeşimli (HA) ETS motiflerine sahip EWS / FLI düzenlemeli genler vardır. DAF fonksiyonunun özelliklerini ve DAF'ın ne tür EWS/FLI ile aktive genleri kurtarabildiğini daha fazla analiz etmek için, bu farklı sınıflarla ilişkili genlerin diferansiyel ekspresyöz ifadesi analiz edildi. İlginçtir ki, DAF en çok GGAA-mikrosatellit aktive genlerini kurtarabildi, ancak Şekil 7'degörüldüğü gibi bir HA sitesinin yakınında aktif genleri kurtaramadı. Hiyerarşik kümelemede görüldüğü gibi, DAF motif sınıfları arasında EWS/FLI aracılı baskıyı kurtaramaz. Bu veriler, DAF'ın GGAA-mikrosatellitlerden TSS'ye hem proksimal hem de distal olarak bağlanmak ve etkinleştirmek için EWS'nin yeterli yapısal özelliklerini koruduğunu göstermektedir. Bu büyük olasılıkla GGAA'daki EWS / FLI etkinliği için önemli olduğu düşünülen bozulmamış SYGQ etki alanından kaynaklanmaktadır11. Bu veriler ayrıca, DAF'ta mutasyona uğrayan spesifik tirozinlerin HA sitelerinden EWS/ FLI aracılı gen düzenlemesinde ve gen baskısında önemli rol oynadığını ve daha fazla araştırmanın önemli bir alanını vurguladığını göstermektedir.
Şekil 1: İş Akışı. Transkriptomik olarak yapı işlevi eşlemesi gerçekleştirmek için adım adım yordamın tasviri. Hücreler ilk olarak yapı-işlev eşlemesi için gerekli yapı paketini ifade etmek için hazırlandı. İfadenin ardından, hücreler RNA ve protein için hasat edildi ve korelatif fenotipler için test edildi. Yapıların ekspresys doğrulandı ve bu süreç bağımsız biyolojik kopyaları toplamak için 3-4 kez tekrarlandı. RNA daha sonra yeni nesil sıralama (NGS) için gönderildi. Veriler alındığında, veriler kalite için kırpıldı, hizalandı ve transkript başına sayımlar hesaplandı. Deseq2 kullanılarak parti efektleri kontrol edildi ve transkriptomik imzalar ve diferansiyel ekspresyonu belirlendi. Hiyerarşik kümeleme ve aşağı akış analizi entegre diğer -omics veri kümeleri ve farklı yol veya fonksiyonel analiz dahil edilebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Yapı ifadesinin ve korelatif tahlillerin doğrulanması. (A) Bu örnekte sınanan yapıları gösteren şematik. (B) Endojen EWS/FLI'nin devrilmesinin doğrulanması ve 3X-FLAG etiketli yapıların immünoblot tarafından ifade edilerek. (C,D) EWS/FLI (C) aktif hedef gen, NR0B1ve (D) bastırılmış hedef gen olan TGFBR2'deyapı aktivitesinin qRT-PCR ile doğrulanması. Veriler ortalama +/- standart sapma olarak sunulur. P değerleri Tukey'in dürüst önem testi ile hesaplandı. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.005 (E) Yapıların dönüşüm aktivitesini değerlendirmek için gerçekleştirilen yumuşak agar tahlillerinden koloni sayısı. P değerleri Tukey'in dürüst önem testi ile hesaplandı. * s < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.005. Bu rakam Theisen,vd.23'tenuyarlanmıştırBu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Analiz için son harmanlanmış sayım verileri. Toplu olarak normalleştirilecek ve analiz edilecek tüm örnekler için gen sayısına sahip sayım dosyasının ilk 6 satırının ekran görüntüsü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Örnek-numune mesafesi ısı eşlemleri. (A) Ham sayım verilerinin örnek kümelenini gösteren örnek-örnek mesafe çizimi. Hem toplu iş hem de örnekle kümelenen örnekler kırmızı oklarla gösterilir. (B) ComBat ile toplu normalleşmenin ardından örnek-örnek mesafe çizimi. Burada, tüm çoğaltma kümesinden örnekler toplu işlemden bağımsız olarak birlikte çoğalır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Diferansiyel ekspresyon analizinin sonuçları. (A) Tüm numuneler için oluşturulan transkriptomik imzaların prensip bileşen analizi (PCA) grafiği güçlü numune içi kümeleme gösterir ve DAF'ın pozitif (wtEF) ve negatif (Δ22) kontroller arasında ara olduğunu gösterir. (B) Her yapıdaki genler için log2FoldChange'e çizilen -log(p-değerini) gösteren volkan çizimleri. Ayarlanmış p değeri 0,05 < ve |log2(FoldChange)| > 1 önemli olarak kabul edilir ve kırmızı renkle gösterilir. Panel 5B Theisen'den uyarlanmıştır, ve diğerleri23Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Gen sınıflarını tanımlamak için hiyerarşik kümeleme. (A) Tüm yapılarda en değişken 1000 genin hiyerarşik kümelenmesi ve temel olan iEF, DAF'ın EWS/FLI aracılı gen aktivasyonunu kısmen kurtar ettiğini gösterir. (B) Gen ontolojisi (moleküler fonksiyon) ToppGene'den elde edilen ve DAF tarafından kurtarılan veya kurtarılmayan EWS/FLI ile aktive genlerin fonksiyonel zenginleştirilmesini gösteren sonuçlar. Panel 6B Theisen'den uyarlanmıştır, ve diğerleri23Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Farklı transkripsiyon faktörü yanıt öğelerinin farklı yapılara ayrıntılı analizi: (A) Buradaki transkriptomik profillerle mevcut diğer veri kümelerini birleştirerek panel (B) ve (C) oluşturmak için kullanılan veri işlemeyi gösteren şematik. (B,C) Doğrudan EWS/FLI- (B) etkinleştirilmiş ve (C) bastırılmış hedeflerin farklı sınıflarının kurtarılmasını gösteren derleme. Genler sadece endojen EWS/FLI ile sapkınabilir diferansiyel ekspresyonu olan genlerdi. Her pasta grafikte gri, genlerin yapı tarafından kurtarılmayan kısmını tasvir eder. Kırmızı, genlerin farklı olarak aktive olan kısmını, mavi ise genlerin farklı olarak bastırılan kısmını tasvir eder. Bu rakam Theisen,vd.23'tenuyarlanmıştırBu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil S1: Fastq.gz dosyalarını HPC ortamına yükleme, kırpma ve hizalama. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Şekil S2: Örnekler arasında okuma sayılarını harmanlama ve ComBat ile toplu normalleştirme çalıştırma. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Şekil S3: DESeq2 çalıştırıyor ve diferansiyel ifade analizinin sonuçlarını ayıklıyor. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Şekil S4: Çıktı analiz. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Şekil S5: Gen sınıflarını tanımlamak için hiyerarşik kümeleme: Tüm yapılarda en değişken ilk 1000 genin hiyerarşik kümelenmesi ve taban çizgisi olan iEF, k kümeleri halinde sıralanır. Bu örnekte k=7, ancak bu parametre Şekil S4D'de gösterildiği gibi kullanıcı tarafından ayarlanır. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Tablo S1: Küme ek açıklamalı genlerin (Ensembl gen kimliği) listesi. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Discussion
Onkojenik transkripsiyon faktörlerinin biyokimyasal mekanizmalarının incelenmesi, neden oldukları hastalıkları anlamak ve yeni terapötik stratejiler tasarlamak için kritik öneme sahiptir. Bu özellikle füzyon transkripsiyon faktörleri ile sonuçlanan kromozomal translokasyonlarla karakterize malignitelerde geçerlidir. Bu kimerik proteinlere dahil edilen etki alanları, vahşi tip proteinlerde bulunan düzenleyici alan adlarıyla anlamlı etkileşimlerden yoksun olabilir ve füzyon bağlamında yapı işlev bilgilerini yorumlama yeteneğini zorlaştırabilir26,27,28. Ayrıca, bu onkojenik füzyonların çoğu, özünde düzensiz alan adları10 , 13,29,30.
EWS etki alanı, çeşitli onkojenik füzyonlarda yer alan bu tür özünde düzensiz bir etki alanı örneğidir10. Özünde düzensiz ve tekrarlayan doğa, EWS etki alanı tarafından kullanılan moleküler mekanizmaları anlama çabalarını engellemıştır. Yapı işlevini araştırmak için önceki çabalar büyük ölçüde muhabir gen tahlilleri bağlamında veya ilgili hücresel bağlamı yeniden yakalayamayan veya anlamlı kısmi işlev 11,17,25üreten herhangi bir yapısal varyasyondan yoksun hücre arka planlarında farklı mutantlar kullanmaya başvurmuşlardır. Burada sunulan yöntem bu sorunları gidermektedir. Yapı fonksiyonu eşlemesi hastalıkla ilgili bir hücre bağlamında gerçekleştirilir ve yeni nesil sıralama, transkripsiyon faktörü işlevini yerel kromatin ayarında değerlendirmek için transkriptomik profil oluşturmayı sağlar. EWS / FLI'nin DAF mutantının özel durumunda, DAF'ın izole yanıt öğeleri kullanarak muhabir testlerinde çok az aktivite gösterdiği, ancak tam gen promotörü bağlamında, bir muhabir testinde veya yerel kromatin bağlamında aktivite gösterdiği bildirildi, ilginç bir fenotip23. Burada açıklanan yöntemin daha doğrudan kullanılması, genom genelinde hangi tür düzenleyici elementlerin hastalık ortamında en duyarlı olduğu sorusunu doğrudan çözmektedir. Tüm aday hedef genleri kendi doğal kromatin bağlamlarında aynı anda test ederek, transkriptomik bir yaklaşımın kısmi işleve sahip yapıları tanımlama olasılığı daha yüksektir.
Hastalıkla ilgili bir hücre arka planı kullanmanın doğal gücü, bu tekniğin belki de en büyük sınırlamasıdır. En önemli faktörlerden biri bu deneyler için uygun hücre sistemini seçmektir. Patognomonik transkripsiyon faktörlerine sahip malignitelerden elde edilen birçok hücre hattı, bu transkripsiyon faktörünün devrilmesini kolayca tolere etmez ve birçok durumda, özellikle pediatrik kanserler için, gerçek orijin hücresi tartışmalı olmaya devam eder ve onkogenin diğer hücre arka planlarındaki ifadesi yasaklayıcı derecede toksiktir31,32 . Bu durumlarda, araştırmacı sonuçların yorumlanmasında dikkatli olduğu ve daha hastalıkla ilgili bir hücre tipinde ilgili bulguları uygun şekilde doğrulediği sürece, farklı bir hücre arka planında deneyler yapmak yararlı olabilir.
Onkogen ekspresyonunun stabilitesini ve fenotipik sonuçlarını dikkatlice doğrulamak ve yalnızca katı kriterleri karşılayan sıralama için örnekler göndermek kritik öneme sahiptir. Burada, bu, nakavt ve kurtarmayı onaylamak için batı lekesini ve pozitif kontrolü doğrulamak için az sayıda bilinen hedef genin qRT-PCR'ını içeriyordu (Şekil 2). Aynı şekilde, hücre ve RNA preparatlarını her parti boyunca mümkün olduğunca benzer şekilde gerçekleştirerek mümkün olduğunca fazla parti değişkenliğini azaltmak çok önemlidir.
Burada açıklanan yöntem, çalışma altındaki transkripsiyon faktörünün genom çapındaki işlevine hitap eden diğer genomik veri türleriyle eşleştirildiğinde özellikle güçlü hale gelir. Bu tür yapı-işlev analizi için gelecekteki yönler, transkripsiyon faktörünün bağlanmasını ve kromatin erişilebilirliğindeki herhangi bir indüklenen değişiklikleri belirlemek için ChIP-seq ve ATAC-seq'i içerecek şekilde genişleyecektir. Bir paket olarak, bu tür veriler, onkojenik transkripsiyon faktörünün farklı yapısal bileşenlerinin işlevin farklı yönlerine katkıda bulunduğu yere işaret edebilir (örneğin DNA bağlama ve kromatin modifikasyonu ve yardımcı düzenleyici işe alımı). Genel olarak, füzyon transkripsiyon faktörlerinin yapı-fonksiyon ilişkilerini haritalamak için NGS tabanlı yaklaşımların kullanılması, bu proteinlerin onkojenik işlevinin biyokimyasal belirleyicileri hakkında yeni içgörüler ortaya çıkarabilir. Bu, neden oldukları hastalıkları daha iyi anlamamız ve yeni terapötik stratejilerin geliştirilmesini sağlamak için önemlidir.
Disclosures
SLL, Salarius İlaç'ın danışma kurulu üyesi ve özkaynak sahibi olarak çıkar çatışması ilan eder. SLL ayrıca Amerika Birleşik Devletleri Patent No.'da listelenen bir mucittir. ABD 7.393.253 B2, "Ewing Sarkomu tanı ve tedavisi için yöntem ve kompozisyonlar", ve ABD 8.557.532, "İlaca dirençli Ewing sarkomunun tanı ve tedavisi." Bu, veri ve materyallerin paylaşımına ilişkin JoVE politikalarına bağlılığımızı değiştirmez.
Acknowledgments
Bu araştırma, Nationwide Çocuk Hastanesi Abigail Wexner Araştırma Enstitüsü'ndeki Yüksek Performanslı Bilgi İşlem Tesisi tarafından desteklendi. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Kanser Enstitüsü [U54 CA231641 to SLL, R01 CA183776 to SLL] tarafından desteklendi; Alex'in Limonata Standı Vakfı [ERT'ye Genç Araştırmacı Ödülü]; Pelotonia [ERT Bursu]; ve Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi CJ Martin Yurtdışı Biyomedikal Bursu [APP1111032'den Kİp'e].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wet Lab Reagents | |||
| anti-FLI rabbit pAb | Abcam | ab15289 | 1:500 |
| anti-lamin B1 rabbit pAb | Abcam | ab16048 | 1:2000 |
| Cell-based system for introduction of mutant constructs | Determined by cell system used | ||
| Cryotubes | For viral aliquots | ||
| DMEM | Corning Cellgro | 10-013-CV | For viral production |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | For viral production |
| G418 | ThermoFisher | 10131027 | For viral production |
| HEK293-EBNAs | ATCC | CRL-10852 | For viral production |
| HEPES | Gibco | 15630106 | |
| Hygromycin B | ThermoFisher | 10687010 | |
| M2 anti-FLAG mouse mAb | Sigma | F3165 | 1:2000 |
| Near IR-secondary antibodies | Li-Cor | ||
| Optimem | Gibco | 31985062 | For viral production |
| Penicillin/Streptomycin/Glutamine | Gibco | 10378-016 | For viral production |
| Polybrene | Sigma | TR-1003-G | For viral transduction |
| Puromycin | Sigma | P8833 | Stored at 2 mg/mL stock |
| RNeasy Plus kit | Qiagen | 74136 | Has gDNA removal columns |
| Selection reagents | As dictated by cell system used | ||
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | For viral production |
| Tissue culture media | Determined by cell system used | ||
| TransIT-LT1 | Mirus | MIR 2304 | For viral production |
| Software | |||
| Access to HPC environment | |||
| AnnotationDbi | 1.38.2 | ||
| Cairo | 1.5-10 | ||
| DESeq2 | 1.16.1 | ||
| genefilter | 1.58.1 | ||
| ggbiplot | 0.55 | ||
| ggplot2 | 3.1.1 | ||
| org.Hs.eg.db | 3.4.1 | ||
| pheatmap | 1.0.12 | ||
| PuTTY | |||
| R | 3.4.0 | ||
| RColorBrewer | 1.1-2 | ||
| reshape2 | 1.4.3 | ||
| rgl | 0.100.19 | ||
| R-studio | |||
| STAR | Version 2.6 or later | ||
| sva | 3.24.4 | ||
| TrimGalore! | |||
| WinSCP |
References
- Miettinen, M., et al. New fusion sarcomas: histopathology and clinical significance of selected entities. Human Pathology. 86, 57-65 (2019).
- Knott, M. M. L., et al. Targeting the undruggable: exploiting neomorphic features of fusion oncoproteins in childhood sarcomas for innovative therapies. Cancer and Metastasis Reviews. 38, 625-642 (2019).
- Yoshihara, K., et al. The landscape and therapeutic relevance of cancer-associated transcript fusions. Oncogene. 34, 4845-4854 (2015).
- Duesberg, P. H. Cancer genes generated by rare chromosomal rearrangements rather than activation of oncogenes. Medical Oncology and Tumor Pharmacotherapy. 4, 163-175 (1987).
- Dupain, C., Harttrampf, A. C., Urbinati, G., Geoerger, B., Massaad-Massade, L. Relevance of Fusion Genes in Pediatric Cancers: Toward Precision Medicine. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 6, 315-326 (2017).
- Mitelman, F., Johansson, B., Mertens, F. The impact of translocations and gene fusions on cancer causation. Nature Reviews Cancer. 7, 233-245 (2007).
- Smith, R., et al. Expression profiling of EWS/FLI identifies NKX2.2 as a critical target gene in Ewing's sarcoma. Cancer Cell. 9, 405-416 (2006).
- Davicioni, E., et al. Identification of a PAX-FKHR gene expression signature that defines molecular classes and determines the prognosis of alveolar rhabdomyosarcomas. Cancer Research. 66, 6936-6946 (2006).
- Gröbner, S. N., et al. The landscape of genomic alterations across childhood cancers. Nature. 555, 321-327 (2018).
- Kim, J., Pelletier, J. Molecular genetics of chromosome translocations involving EWS and related family members. Physiological Genomics. 1, 127-138 (1999).
- Boulay, G., et al. Cancer-Specific Retargeting of BAF Complexes by a Prion-like Domain. Cell. 171, 163-178 (2017).
- Lessnick, S. L., Braun, B. S., Denny, C. T., May, W. A. Multiple domains mediate transformation by the Ewing’s sarcoma EWS/FLI-1 fusion gene. Oncogene. 10, 423-431 (1995).
- Leach, B. I., et al. Leukemia fusion target AF9 is an intrinsically disordered transcriptional regulator that recruits multiple partners via coupled folding and binding. Structure. 21, 176-183 (2013).
- Ng, K. P., et al. Multiple aromatic side chains within a disordered structure are critical for transcription and transforming activity of EWS family oncoproteins. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 104, 479-484 (2007).
- Riggi, N., et al. EWS-FLI1 Divergent Chromatin Remodeling Mechanisms to Directly Activate or Repress Enhancer Elements in Ewing Sarcoma. Cancer Cell. 26, 668-681 (2014).
- Tomazou, E. M., et al. Epigenome Mapping Reveals Distinct Modes of Gene Regulation and Widespread Enhancer Reprogramming by the Oncogenic Fusion Protein EWS-FLI1. Cell Reports. 10, 1082-1095 (2015).
- Sankar, S., et al. Mechanism and relevance of EWS/FLI-mediated transcriptional repression in Ewing sarcoma. Oncogene. 32, 5089-5100 (2013).
- Gangwal, K., et al. Microsatellites as EWS/FLI response elements in Ewing's sarcoma. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 105, 10149-10154 (2008).
- Gangwal, K., Close, D., Enriquez, C. A., Hill, C. P., Lessnick, S. L. Emergent Properties of EWS/FLI Regulation via GGAA Microsatellites in Ewing's Sarcoma. Genes & Cancer. 1, 177-187 (2010).
- Guillon, N., et al. The Oncogenic EWS-FLI1 Protein Binds In Vivo GGAA Microsatellite Sequences with Potential Transcriptional Activation Function. PLoS One. 4, 4932 (2009).
- Chong, S., et al. Imaging dynamic and selective low-complexity domain interactions that control gene transcription. Science. 361, (2018).
- Johnson, K. M., et al. Role for the EWS domain of EWS/FLI in binding GGAA-microsatellites required for Ewing sarcoma anchorage independent growth. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 114, 9870-9875 (2017).
- Theisen, E. R., et al. Transcriptomic analysis functionally maps the intrinsically disordered domain of EWS/FLI and reveals novel transcriptional dependencies for oncogenesis. Genes & Cancer. 10, 21-38 (2019).
- Chen, J., Bardes, E. E., Aronow, B. J., Jegga, A. G. ToppGene Suite for gene list enrichment analysis and candidate gene prioritization. Nucleic Acids Research. 37, 305-311 (2009).
- Johnson, K. M., Taslim, C., Saund, R. S., Lessnick, S. L. Identification of two types of GGAA-microsatellites and their roles in EWS/FLI binding and gene regulation in Ewing sarcoma. PLOS One. 12, 0186275 (2017).
- Kim, P., Ballester, L. Y., Zhao, Z. Domain retention in transcription factor fusion genes and its biological and clinical implications: a pan-cancer study. Oncotarget. 8, 110103-110117 (2017).
- de Mendíbil, I. O., Vizmanos, J. L., Novo, F. J. Signatures of Selection in Fusion Transcripts Resulting from Chromosomal Translocations in Human Cancer. PLOS One. 4, 4805 (2009).
- Frenkel-Morgenstern, M., Valencia, A. Novel domain combinations in proteins encoded by chimeric transcripts. Bioinformatics. 28, 67-74 (2012).
- Hegyi, H., Buday, L., Tompa, P. Intrinsic Structural Disorder Confers Cellular Viability on Oncogenic Fusion Proteins. PLoS Computational Biology. 5, 1000552 (2009).
- Latysheva, N. S., Babu, M. M. Discovering and understanding oncogenic gene fusions through data intensive computational approaches. Nucleic Acids Research. 44, 4487-4503 (2016).
- Deneen, B., Denny, C. T. Loss of p16 pathways stabilizes EWS/FLI1 expression and complements EWS/FLI1 mediated transformation. Oncogene. 20, 6731-6741 (2001).
- Kendall, G. C., et al. PAX3-FOXO1 transgenic zebrafish models identify HES3 as a mediator of rhabdomyosarcoma tumorigenesis. eLife. 7, 33800 (2018).
