Summary
広視野イメージングとリアルタイムイメージングを統合したデュアルラスタースキャン光音響イメージャーが設計されました。
Abstract
小動物の血管ネットワークのイメージングは、生物医学の基礎研究において重要な役割を果たしてきました。光音響イメージング技術は、小動物の画像学に応用する大きな可能性を秘めています。小動物の広視野光音響イメージングは、高い時空間分解能、深い浸透、および複数のコントラストを持つ画像を提供することができます。また、リアルタイム光音響イメージングシステムは、小動物の血管系の血行力学的活性を観察することが望ましく、小動物の生理学的特徴の動的モニタリングを研究するために使用することができる。ここでは、デュアルラスタースキャン光音響イメージャーが提示され、切り替え可能なダブルモードイメージング機能を搭載しています。広視野のイメージ投射は2次元の電動翻訳段階によって駆動され、リアルタイムのイメージ投射はガルバノメーターによって実現される。異なるパラメータおよび撮像モードを設定することにより、小動物血管ネットワークの生体内可視化が行える。リアルタイムイメージングを用いて、薬物誘発の脈拍変化や血流変化などを観察することができる。広視野イメージングは、腫瘍血管系の成長変化を追跡するために使用することができる。これらは、基礎生物医学研究の様々な分野で容易に採用されます。
Introduction
基本的な生物医学分野では、小動物はヒトの生理機能をシミュレートすることができる。したがって、小動物イメージングは、ヒト相同病の研究を導き、有効な治療1を求める上で重要な役割を果たす。光音響イメージング(PAI)は、光学画像化と超音波画像2の利点を組み合わせた非侵襲的なイメージング技術である。光音響顕微鏡(PAM)は、小型動物3の基礎研究に有用なイメージング法である。PAMは、光学励起および超音波検出4に基づいて、高解像度、深浸透、高特異性および高コントラスト画像を容易に得ることができる。
特定の波長のパルスレーザーは、組織の内因性クロモフォアによって吸収されます。その後、組織の温度が上昇し、光誘導超音波の生成をもたらす。超音波は超音波トランスデューサで検出できます。信号取得と画像再構成後、吸収体の空間分布が5に得られる。一方で、全臓器血管ネットワークの可視化には広い視野が必要である。広視野スキャンのプロセスは、通常、高解像度6、7、8を確保するために長い時間がかかります。一方、小動物の血行力学的活動を観察するには、高速リアルタイムイメージングが必要です。リアルタイムイメージングは、リアルタイム9、10、11で小動物のバイタルサインを研究するのに有益です。リアルタイムイメージングの視野は、通常、高い更新率を確保するのに十分に小さいです。したがって、広い視野を達成することとリアルタイムイメージングを達成することとの間にはトレードオフが存在することが多い。以前は、2つの異なるシステムが、広視野イメージングまたはリアルタイムイメージングに別々に使用されていました。
この研究は、2次元電動変換ステージに基づく広視野イメージングと2軸ガルバノスキャナに基づくリアルタイムイメージングを統合した、二重ラスタスキャン光音響イメージャー(DRS-PAI)を報告しています。広視野イメージングモード(WIM)は、血管形態を示すために行われる。リアルタイムイメージングモード(RIM)では、現在2つの機能があります。まず、RIMはリアルタイムのB-スキャン画像を提供することができます。深さ方向に沿った脈管系の変位を測定することで、呼吸や脈拍の特性を明らかにすることができる。次に、RIM は、WIM イメージ内の特定の領域を定量的に測定できます。ローカル WIM リージョンの同等の画像を提供することで、ローカルの変更の詳細を正確に明らかにすることができます。このシステムは、血管可視化の広視野イメージングと局所的なダイナミックのリアルタイムイメージングとの間の柔軟な移行を設計します。このシステムは、小動物イメージングが必要な基礎生物医学研究において望ましい。
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Protocol
すべての動物実験は、中国広州南華師範大学の機関動物管理および使用委員会が提供するガイドラインに従って行われた。
1. システムのセットアップ
- 光路 (図 1)
- システムレーザーソースとして532 nmパルスレーザーを使用します。レーザーの繰り返しレートを10kHzに、出力エネルギーを100%に、トリガ設定をユーザ定義プログラムを使用して外部トリガに設定します。
- 光ファイバ カプラ (FC1) を介して、レーザービームをシングルモードファイバ(SMF)に結合します。2次元の電動ステージ(モーター、最高速度:20mm/s)で、光ファイバーコリメータ(FC2)を使用してレーザービームをコリメートします。
- 2 軸ガルバノスキャナー (Galva) を使用してレーザー光を偏向させます。移動可能ミラー(M1)を使用して、ビームを反射します。4×対物レンズ(OL、数値絞り:0.1)を通してビームを焦点を合わせます。
- XY変換器マウント(TM)を使用して、自作の中空超音波トランスデューサー(UT、中央周波数:25MHz)を固定します。帯域幅:90%以上。中心穴:3 mm)OL12の底部に。超音波トランスデューサの中心穴を通して、焦点を合わせるビームを渡します。
- スキャンパス
- WIM中にフィールドプログラマブルゲートアレイ(FPGA 2)を使用してGalvaをロックします。ユーザー定義のプログラムで、適切なスキャン範囲とスキャン速度を設定します。
- RIM の間にフィールドプログラマブル ゲート アレイ(FPGA 1)を使用してモータをロックします。FPGA 2を使用して、スキャン周波数とスキャンポイント数を設定します。ユーザー定義プログラムを使用して、スキャンの開始と停止を制御します。
- データ取得
- PA信号を増幅するには、50dBアンプ(AMP)を使用します。データ取得カード(DAQ)で信号をデジタイズします。FPGA 1またはFPGA2を介してトリガ信号を取得します。
- グラフィックス処理装置 (GPU) を使用して、データを処理し、イメージを並列表示 13.
- CCDイメージングシステム
- リング状の白色LED(色温度:6500 K;照度:40000ルクス。直径:7.5cm)の光源として。M1を取り外し、固定ミラー(M2)を使用して光を反射します。
- PAイメージングシステム上のCCDカメラ(630万ピクセル)を使用して画像を記録します。ディスプレイ ソフトウェアで画像を表示します。
2. システムアライメント
- 水タンク(10cm×10cm×4.4cm、下窓:3cm×3cm)を選択します。ポリエチレン膜(膜厚:10 μm)を使用して、水タンク全体を覆います。十分な超純水を加える。
- 作業段階に水タンクを置きます。
- レーザースイッチをオンにします。レーザーコントロールプログラムを選択します。5分間予熱します。ポンプスイッチの「ON」ボタンを押します。ステップ 1.1.1 に従ってレーザーパラメータを設定します。レーザーのバッフルを開きます。
- A ライン収集プログラムを選択します。「Start」ボタンを押して単一点信号をキャプチャし、現在のA線信号の振幅とスペクトルを表示します。
- 水槽の底に刃を置きます。UTの底部を水槽に浸して、音響カップリングを行います。UTの下部に泡を避けてください。
- ガルバの位置を調整し、UTとOLの間でXY変換器を調整して振動信号を避け、これが共焦点であることを確認します。
- 信号の振幅を最大化するために作業段階の高さを調整し、フォーカス位置を決定します。
3. 動物実験
- 体重が 20\u201230 g の 5\u20126 週齢の BALB/c マウスを使用してください。
- 実験前に尿タン(1g/kg)を使用して腹腔内注射を行い、動物を麻酔します。
- WIM と RIM の間で移行を行います。
- 平面超音波トランスデューサを使用してください。トリマーと脱毛クリームを使用して、マウスの背面に毛皮を剃ります。マウスをホルダー(8cm×2.8cm×2cm)に置きます。
- 超音波ゲルを使用してポリエチレン膜と接触するイメージング領域を許可します。接触部分の泡を避けてください。
- 音響カップリングのための作業段階にホルダーを置きます。ステップ 2.3\u20122.4 に従ってレーザーを開始し、A ライン信号を収集します。手順 2.6\u20122.7 に従って整列します。「停止」を押すと、配置後にコレクションが終了します。
- WIM プログラムを選択します。新しく作成したフォルダに名前を付けます。「スキャン速度」タブで20mm/s、"スキャン領域"タブの「20mm*20mm」、および「ステップ」タブの「20」にスキャンパラメータを設定します。[ 収集 ]ボタンをクリックしてスキャンを開始します。
- 取得後にスキャンを終了するには、[ 停止 ]ボタンをクリックします。[ ゼロに戻る ]をクリックして、モータをゼロにします。レーザーバッフルを閉じます。トリガー設定を内部トリガーに設定します。スイッチをポンピングするには 、OFF ボタンを押します。
- WIMトリガーをRIMトリガーに交換し、外部レーザートリガーに接続します。スイッチをポンピングするには 、ON ボタンを押します。トリガ設定を外部トリガに設定します。[ 終了 ] ボタンをクリックして WIM プログラムを終了します。
- ステップ 2.4 を使用して、A 回線信号を収集します。レーザーバッフルを開きます。手順 2.6\u20122.7 に従って整列します。配置後にコレクションを終了するには 、[停止] を押します。
- RIM プログラムを選択します。新しく作成したフォルダに名前を付けます。[ 収集 ]ボタンをクリックしてスキャンを開始します。
- 取得完了後にスキャンを終了するには、[ 停止] ボタンをクリックします。「 終了 」ボタンをクリックして、RIM プログラムを終了します。
- 画像化の終わりに子宮頸部脱臼を使用して動物を安楽死させる。
- 血管可視化のWIMを実施する。
- 焦点を合わせ超音波トランスデューサ(中心周波数:25 MHz;;帯域幅:90%以上。焦点の長さ:8 mm)。マウスの耳や頭皮の毛を取り除きます。
- メスを使用して、マウスの頭蓋側頭側(頭蓋骨への深さ)に小さな切開を行います。この切開から始めるには、眼科用のはさみを使用してください。頭蓋骨の外側の周りに頭皮をカットします。出血を止めるために出血点を圧縮します。通常の生理学で傷口を洗います。マウスをホルダーの上に置きます。
- 超音波ゲルを使用してポリエチレン膜と接触するイメージング領域を許可します。接触領域の気泡を避けてください(補助図1)。
- 音響カップリングのために、ホルダーを作業段階に置きます。手順 2.3\u20122.4 を使用して、レーザーを開き、A 回線信号を収集します。手順 2.6\u20122.7 を使用して整列します。配置後にコレクションを終了するには 、[停止] を押します。
- [WIM プログラム] を選択します。新しく作成したフォルダに名前を付けます。「スキャン速度」タブで「10mm/s」、"スキャン領域"タブの下の「10mm*10mm」、および「ステップ」タブの「10」にスキャンパラメータを設定します。[ 収集 ]ボタンをクリックしてスキャンを開始します。
- 取得完了後にスキャンを終了するには、[ 停止] ボタンをクリックします。「 ゼロに戻る」 をクリックして、モータをゼロに戻します。[ 終了 ] ボタンをクリックして WIM プログラムを終了します。
- 動物がまだ麻酔下にある間、手順の終わりに動物を安楽死させる。
- 焦点を合わせ超音波トランスデューサ(中心周波数:25 MHz;;帯域幅:90%以上。焦点の長さ:8 mm)。マウスの耳や頭皮の毛を取り除きます。
- 小型動物の動的モニタリングのためにRIMを実施する。
- マウスの腹部の髪を剃ります。ホルダの上にマウスを置きます。
- 超音波ゲルを使用してポリエチレン膜と接触するイメージング領域を許可します。接触領域で気泡を避けます。
- 音響カップリングのために、ホルダーを作業段階に置きます。ステップ 2.3\u20122.4 を実行してレーザーを開始し、A ライン信号を収集します。手順 2.6\u20122.7 を実行して整列します。配置後にコレクションを終了するには 、[停止] を押します。
- RIM プログラムを選択します。新しく作成したフォルダに名前を付けます。[ 収集 ]ボタンをクリックしてスキャンを開始します。
- 取得完了後にスキャンを終了するには、[ 停止] ボタンをクリックします。「 終了 」ボタンをクリックして、RIM プログラムを終了します。
- ユーザー定義プログラムによる深度方向に沿った最大振幅投影(MAP)の再構築には、RIM データを使用します。動物の動的変化を観察します。
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Representative Results
DRS-PAI の概略を図 1に示します。このシステムは、RIM を使用した WIM 間の柔軟で繰り返し可能な切り替えを可能にします。取得したPA信号は、PA B-スキャンおよびMAP画像を生成するために迅速に処理されます。CCDカメラはサンプルの写真を提供することができます。
DRS-PAIのすべてのコンポーネントは、イメージャーのセットアップ(図2)に統合され、組み立て可能であり、組み立てや操作が容易です。WIMでは、2次元電動ステージの連続ラスタスキャンが使用されます。ランニングステージの信号が記録されます。データ取得は、ステージの均一な変換中に進行しました。RIM では、2 軸ガルバノメーター スキャナを使用しました。データは、Galva スキャンと同期的に収集されました (図 3)。
ここで、各撮像モードを有するサンプルの血管画像を収集した。 図 4A は 、WIM でのマウスの MAP イメージを示しています。撮像時間は約33分であった図 4B は、RIM中のマウスのB-スキャン画像を示す。RIM のプロセス全体をビデオ 1に示します。次に、集熱超音波トランスデューサを用いた。マウスの耳と脳の血管ネットワークを 図5に示す。撮像時間は約16分であった。これは、広視野血管系を画像化するDRS-PAIの能力を示す。また、 図6Aは 、撮像範囲が容器を含むことを示す。RIMの撮像範囲は、集光超音波トランスデューサの使用により約100μmです。マウス腹部の深さ方向と時間の方向に沿った変位画像を 図6Bに示します。 ビデオ2は 、血管変位の過程と電流パルスまたは呼吸曲線を取得する様子を示す。
図1:DRS-PAIシステムの概略図。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:DRS-PAIシステムの設計
(A)DRS-PAIシステムの写真。(B)レーザーパスアセンブリのセットアップの写真がパネルに表示されます。(C)パネルにはレーザーパスアセンブリの3Dモデルが表示されます。(D) パネルには、2 軸高速ガルバノスキャナーアセンブリが表示されます。(E) パネルにプローブアセンブリが表示されます。(F) パネルに CCD 光路アセンブリーが表示されます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: 異なるイメージング モードのスキャンの設定。
(A) WIM のスキャン パス。(B) RIM のスキャンパス。(C)2つのイメージングモードのトリガ設定。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:マウスバックの光音響WIMとRIM。
(A) WIM でのマウスの MAP イメージ。(B) RIM に戻るマウスの B スキャンイメージ。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:マウスの光音響WIM。
(A) WIM のマウス耳の MAP イメージ。(B) WIM のマウス脳の MAP 画像。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:マウス腹部の光音響的なRIM。
(A) RIM のマウス腹部の B スキャン画像。(B) RIM におけるマウス腹部の深さ方向と時間方向に沿った MAP イメージ。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
ビデオ1:マウスバックのRIMのプロセス。こちらをクリックして、このビデオをダウンロードしてください。
ビデオ2:マウス腹部と時間の深さ方向に沿ったMAP画像のプロセス。こちらをクリックして、このビデオをダウンロードしてください。
補足図1:ポリエチレン膜と接触する撮像領域の一部。こちらをダウンロードしてください。
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Discussion
ここでは、血管構造の構造と関連する血液の動的変化を捉えるために設計および開発された非侵襲的な血管視覚化のための二重ラスタースキャン光音響小動物イメージャーを発表した。DRS-PAIの利点は、WIMとRIMを1つのシステムに統合し、小動物の血管の動的および血管ネットワーク構造を研究しやすくすることです。システムは高解像広視野の脈管視覚化およびリアルタイムの血球の動態を提供できる。
現在のシステムでは、光励起を単一波長の光源で実装した。将来の多波長システムは、血液酸素飽和度などの他のパラメータを提供するであろう。また、血管径、血管密度、血管歪度の推定など、定量的な解析用に特別な画像処理アルゴリズムを開発することができます。定量分析は、疾患の早期診断と治療に貴重な情報を提供することができます。
要約すると、このシステムは、研究者が生物医学的関連性を持つ小動物研究に対する高次元の生理学的および病理学的洞察を得ることを可能にする。このシステムは、ほとんどの小動物の研究設定に適応することができ、血管新生のイメージング、腫瘍微小環境、血行力学的、脳内の機能的な接続、微小循環、薬物応答、および治療応答を含むがこれらに限定されない。プロトコル内の重要なステップには、デュアルスキャン構造の設計、WIMにおける光と音響フォーカスの共焦点調整、およびRIMの音場の中心点調整が含まれます。
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Disclosures
すべての動物実験は、制度的動物の世話と使用委員会の承認されたガイドラインと規制に従って行われました。著者らは、原稿に関連する金銭的利益を持っていないし、開示する他の潜在的な利益相反はありません。
Acknowledgments
著者らは、中国国立自然科学財団(61822505;11774101;61627827;81630046)、中国広東省科学技術計画プロジェクト(2015B0233016)、広州科学技術プログラム(200010年)からの財政支援を認めたい。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 bit multi-purpose digitizer | Spectrum | M3i.3221 | Data acquisition card |
| A-line collected program | National Instrument | LabVIEW | User-defined program |
| Amplifier | RF Bay | LNA-650 | Amplifier |
| Depilatory Cream | Veet | 33-II | Animal depilatory |
| Fiberport Coupler | Thorlab | PAF-X-7-A | Fiber Coupler |
| Field Programmable Gate Array | Altera | Cyclone IV | Trigger Control |
| Fixed Focus Collomation Packages | Thorlabs | F240FC-532 | Fiber Collimator |
| Foused ultrasonic transducer | Self-made | ||
| Graphics Processing Unit | NVIDIA | GeForce GTX 1060 | Processing data |
| Holder | Self-made | Animal fixation | |
| Laser control program | National Instrument | LabVIEW | User-defined program |
| Mice | Guangdong Medical Laboratory Animal Center | BALB/c | Animal Model |
| Microscope camera | Mshot | MS60 | CCD camera |
| Microscope Objective | Daheng Optics | GCO-2111 | Objective Lens |
| Mirror | Daheng Optics | GCC-1011 | Moveable/Fixed Mirror |
| Moving Magnet Capacitive Detector Galvanometer Scanner | Century Sunny | S8107 | real-time scanner |
| Mshot image analysis system | Mshot | Display software | |
| Normal Saline | CR DOUBLE-CRANE | H34023609 | Normal Saline |
| Ophthalmic Scissors | SUJIE | Scalp Remove | |
| Planar ultrasonic transducer | Self-made | ||
| Plastic Wrap | HJSJLSL | Polyethylene Membrane | |
| Program Control Software | National Instrument | LabVIEW | User-defined Program |
| Pulsed Q-swithched Laser | Laser-export | DTL-314QT | 532-nm pulse Laser |
| Real-time imaging program | National Instrument | LabVIEW | User-defined program |
| Ring-shaped white LED | Self-made | ||
| Shaver | Codos | CP-9200 | Animal Shaver |
| Single-Mode Fibers | Nufern | 460-HP | Single-mode fiber |
| Surgical Blade | SUJIE | 11 | Blade |
| Surgical Scalpel | SUJIE | 7 | Scalp Remove |
| Translation Stage | Jiancheng Optics | LS2-25T | wide-field scanning stage |
| Ultrasonic Transducer | Self-made | ||
| Ultrasound gel | GUANGGONG PAI | ZC4252418 | Acoustic Coupling |
| Urethane | Tokyo Chemical Industry | C0028 | Animal Anestheized |
| Water tank | Self-made | ||
| Wide-field imaging program | National Instrument | LabVIEW | User-defined program |
| XY Translator Mount | Self-made |
References
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