Summary
Foi projetado um imager fotoacoustic de varredura dupla rastering, que integrou imagens de campo amplo e imagens em tempo real.
Abstract
A imagem de redes vasculares em animais de pequeno porte tem desempenhado um papel importante na pesquisa biomédica básica. A tecnologia de imagem fotoacoustic tem grande potencial para aplicação na imagemologia de pequenos animais. A imagem fotoacâmica de campo largo de pequenos animais pode fornecer imagens com alta resolução espástica, penetração profunda e múltiplos contrastes. Além disso, o sistema de imagem fotoacâmica em tempo real é desejável observar as atividades hemodinâmicas da vasculatura de pequenos animais, que podem ser usadas para pesquisar o monitoramento dinâmico de características fisiológicas de pequenos animais. Aqui, um imager fotoacoustic de varredura dupla é apresentado, apresentando uma função de imagem de modo duplo comutavel. A imagem de campo largo é conduzida por um estágio de tradução motorizada bidimensional, enquanto a imagem em tempo real é realizada com galvanômetros. Ao definir diferentes parâmetros e modos de imagem, a visualização in vivo da rede vascular de pequenos animais pode ser realizada. A imagem em tempo real pode ser usada para observar a mudança de pulso e a mudança de fluxo sanguíneo de induzida por drogas, etc. A imagem de campo largo pode ser usada para acompanhar a mudança de crescimento da vasculatura tumoral. São fáceis de serem adotados em diversas áreas da pesquisa básica de biomedicina.
Introduction
No campo biomédico básico, pequenos animais podem simular a função fisiológica humana. Portanto, a imagem de pequenos animais desempenha um papel importante na orientação da pesquisa de doenças homólogas humanas e na busca de um tratamento eficaz1. A imagem fotoacâmica (PAI) é uma técnica de imagem não invasiva que combina as vantagens da imagem óptica e da imagem de ultrassom2. A microscopia fotoacústica (PAM) é um valioso método de imagem para pesquisa básica de animais de pequeno porte3. Pam pode facilmente obter imagens de alta resolução, penetração profunda, alta especificidade e alto contraste com base na excitação óptica e detecção de ultrassom4.
Um laser de pulso com um comprimento de onda específico é absorvido por cromóforos endógenos de tecidos. Posteriormente, a temperatura do tecido sobe, o que resulta na produção de ondas ultrassônicas induzidas por foto. As ondas ultrassônicas podem ser detectadas por um transdutor ultrassônico. Após aquisição de sinal e reconstrução de imagem, a distribuição espacial do absorvente pode ser obtida5. Por um lado, a visualização da rede vascular de órgãos inteiros requer um amplo campo de visão. O processo de varredura em larga área geralmente leva muito tempo para garantir alta resolução6,7,8. Por outro lado, observar as atividades hemodinâmicas de pequenos animais requer imagens rápidas em tempo real. A imagem em tempo real é benéfica para estudar os sinais vitais de pequenos animais em tempo real9,10,11. O campo de visão da imagem em tempo real geralmente é suficientemente pequeno para garantir uma alta taxa de atualização. Assim, muitas vezes há uma troca entre alcançar um amplo campo de visão e imagens em tempo real. Anteriormente, dois sistemas diferentes eram usados para imagens em larga campo ou imagens em tempo real, separadamente.
Este trabalho relata um imager fotoacústico de varredura dupla (DRS-PAI), que integrou imagens de campo largo com base em um estágio de tradução motorizada bidimensional e imagens em tempo real baseadas em um scanner galvanômetro de dois eixos. O modo de imagem de campo largo (WIM) é realizado para mostrar morfologia vascular. Para o modo de imagem em tempo real (RIM), existem atualmente duas funções. Primeiro, o RIM pode fornecer imagens de varredura B em tempo real. Medindo o deslocamento da vasculatura ao longo da direção de profundidade, as características da respiração ou pulso podem ser reveladas. Em segundo lugar, o RIM pode medir quantitativamente a área específica na imagem WIM. Ao fornecer imagens comparáveis das regiões locais de WIM, os detalhes da mudança local podem ser revelados com precisão. O sistema projeta uma transição flexível entre imagens de campo amplo de visualização vascular e imagens em tempo real da dinâmica local. O sistema é desejável em pesquisas biomédicas básicas onde há necessidade de imagens de pequenos animais.
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Protocol
Todos os experimentos em animais foram realizados em conformidade com as diretrizes fornecidas pelo comitê institucional de cuidados e uso de animais da Universidade Normal do Sul da China, Guangzhou, China.
1. Configuração do sistema
- Caminho óptico(Figura 1)
- Use um laser de pulso de 532 nm como fonte de laser do sistema. Defina a taxa de repetição do laser para 10 kHz, a energia de saída para 100% e a configuração do gatilho externo para o gatilho externo usando um programa definido pelo usuário.
- Acople o raio laser à fibra de modo único (SMF) através de um acoalador de fibra óptica (FC1). Cobrem o raio laser usando um collimador de fibra óptica (FC2) em um estágio motorizado bidimensional (Motor, velocidade máxima: 20 mm/s).
- Desvie o raio laser usando um scanner galvanômetro de dois eixos (Galva). Use um espelho movevel (M1) para refletir o feixe. Concentre o feixe através de uma lente objetiva de 4× (OL, abertura numérica: 0,1).
- Use um suporte de tradutor XY (TM) para corrigir o transdutor ultrassônico oco auto-fabricado (UT, frequência central: 25 MHz; Largura de banda: mais de 90%; Orifício central: 3 mm) na parte inferior do OL12. Passe o feixe focado através do buraco central do transdutor ultrassônico.
- Caminho de digitalização
- Bloqueie a Galva usando uma matriz de portão programável de campo (FPGA 2) durante o WIM. Defina o intervalo de varredura apropriado e a velocidade de digitalização por um programa definido pelo usuário.
- Bloqueie o motor usando uma matriz de portão programável de campo (FPGA 1) durante o RIM. Defina a frequência de digitalização e o número de pontos de varredura usando FPGA 2. Use um programa definido pelo usuário para controlar o início e parar a varredura.
- Aquisição de dados
- Use um amplificador de 50 dB (AMP) para amplificar o sinal PA. Digitalizar o sinal pelo cartão de aquisição de dados (DAQ). Obtenha o sinal de gatilho através de FPGA 1 ou FPGA 2.
- Use uma unidade de processamento gráfica (GPU) para processar dados e exibir imagens em paralelo13.
- Sistema de imagem CCD
- Use um LED branco em forma de anel (Temperatura da cor: 6500 K; Illuminance: 40000 lux; Diâmetro: 7,5 cm) como fonte de iluminação. Remova M1, use um espelho fixo (M2) para refletir a luz.
- Registo as imagens usando uma câmera CCD (6,3 milhões de pixels) no sistema de imagem PA. Exibir as imagens com um software de exibição.
2. Alinhamento do sistema
- Selecione um reservatório de água (10 cm × 10 cm × 4,4 cm; janela inferior: 3 cm × 3 cm). Cubra todo o reservatório de água usando uma membrana de polietileno (membrana grossa: 10 μm). Adicione água ultrauso suficiente.
- Coloque o reservatório de água na etapa de trabalho.
- Ligue o interruptor laser. Selecione o programa de controle a laser. Pré-aqueça por 5 minutos. Pressione o botão "ON" no interruptor de bombeamento. Defina os parâmetros de laser conforme a etapa 1.1.1. Abra o defletor do laser.
- Selecione o programa coletado da linha A. Pressione o botão "Iniciar" para capturar o sinal de ponto único e exibir amplitude e espectro do sinal atual da linha A.
- Coloque uma lâmina no fundo do reservatório de água. Mergulhe a parte inferior da UT no reservatório de água para acoplamento acústico. Evite bolhas na parte inferior da UT.
- Ajuste a posição de Galva, ajuste o tradutor XY entre UT e OL para evitar sinal de oscilação e certifique-se de que isso seja confocal.
- Ajuste a altura do estágio de trabalho para maximizar a amplitude do sinal e determine a posição de foco.
3. Experimento animal
- Use um mouse BALB/c de 5\u20126 semanas de idade com um peso corporal de 20\u201230 g.
- Anestesiar o animal usando uretano (1 g/kg) injetado intraperitoneally antes do experimento.
- Realizar transição entre WIM e RIM.
- Use um transdutor ultrassônico planar. Raspe a pele na parte de trás do mouse usando um aparador e creme depilatório. Coloque o mouse no suporte (8 cm × 2,8 cm × 2 cm) na posição propensa.
- Permita que a região de imagem esteja em contato com a membrana de polietileno usando gel de ultrassom. Evite bolhas na parte de contato.
- Coloque o suporte no estágio de trabalho para acoplamento acústico. Siga os passos 2.3\u20122.4 para iniciar o laser e coletar o sinal de linha A. Siga os passos 2.6\u20122.7 para alinhar. Pressione "Pare" para terminar a coleção após o alinhamento.
- Selecione o programa WIM. Nomeie a pasta recém-criada. Defina o parâmetro de digitalização em 20 mm/s na guia "Velocidade de varredura", "20 mm*20 mm" na guia "Área de varredura" e "20" na guia "Passo". Clique no botão Coletar para iniciar a varredura.
- Clique no botão Parar para finalizar a digitalização após a aquisição. Clique em Devolver a Zero para trazer o Motor a zero. Feche o defletor do laser. Ajuste a configuração do gatilho para o gatilho interno. Pressione o botão OFF para o interruptor de bombeamento.
- Substitua o gatilho WIM como gatilho RIM e conecte-o ao gatilho externo do laser. Pressione o botão ON para o interruptor de bombeamento. Ajuste a configuração do gatilho para o gatilho externo. Clique no botão Sair para sair do programa WIM.
- Use a etapa 2.4 para coletar o sinal da linha A. Abra o defletor do laser. Siga os passos 2.6\u20122.7 para alinhar. Pressione Pare para finalizar a coleta após o alinhamento.
- Selecione o programa RIM. Nomeie a pasta recém-criada. Clique no botão Coletar para iniciar a varredura.
- Clique no botão Parar para finalizar a digitalização após concluir a aquisição. Clique no botão Sair para sair do programa RIM.
- Eutanize o animal usando luxação cervical na conclusão da imagem.
- Conduzir WIM de visualização vascular.
- Use um transdutor ultrassônico focado (frequência central: 25 MHz; Largura de banda: mais de 90%; Distância focal: 8 mm). Remova o cabelo da orelha ou couro cabeludo dos ratos.
- Use um bisturi para fazer uma pequena incisão no lado lateral da parte superior temporal craniana do mouse (profundidade para o crânio). Use uma tesoura oftálmica para começar a partir desta incisão. Corte o couro cabeludo ao redor do lado externo do crânio. Comprimir o ponto de sangramento para parar de sangrar. Lave a ferida com soro fisiológico normal. Coloque o mouse no suporte.
- Permita que a região de imagem esteja em contato com a membrana de polietileno usando gel de ultrassom. Evite bolhas na região de contato(Figura Complementar 1).
- Coloque o suporte no palco de trabalho para acoplamento acústico. Use as etapas 2.3\u20122.4 para abrir o laser e coletar sinal de linha A. Use a etapa 2.6\u20122.7 para alinhar. Pressione Pare para finalizar a coleta após o alinhamento.
- Selecione o programa WIM. Nomeie a pasta recém-criada. Defina o parâmetro de digitalização como "10 mm/s" na guia "Velocidade de varredura", "10 mm*10 mm" sob a guia "Área de varredura" e "10" na guia "Passo". Clique no botão Coletar para iniciar a varredura.
- Clique no botão Parar para finalizar a digitalização após concluir a aquisição. Clique no Return to Zero para fazer o Motor voltar a zero. Clique no botão Sair para sair do programa WIM.
- Eutanize o animal na conclusão do procedimento enquanto o animal ainda está sob anestesia.
- Use um transdutor ultrassônico focado (frequência central: 25 MHz; Largura de banda: mais de 90%; Distância focal: 8 mm). Remova o cabelo da orelha ou couro cabeludo dos ratos.
- Conduzir RIM para monitoramento dinâmico de animais de pequeno porte.
- Raspe o cabelo do abdômen do rato. Coloque o mouse sobre o suporte na posição supina.
- Permita que a região de imagem esteja em contato com a membrana de polietileno usando gel de ultrassom. Evite bolhas na região de contato.
- Coloque o suporte no palco de trabalho para acoplamento acústico. Execute as etapas 2.3\u20122.4 para iniciar o laser e coletar o sinal de linha A. Execute a etapa 2.6\u20122.7 para alinhar. Pressione Pare para finalizar a coleta após o alinhamento.
- Selecione o programa RIM. Nomeie a pasta recém-criada. Clique no botão Coletar para iniciar a varredura.
- Clique no botão Parar para finalizar a digitalização após concluir a aquisição. Clique no botão Sair para sair do programa RIM.
- Use os dados RIM para reconstrução da projeção de amplitude máxima (MAP) ao longo da direção de profundidade pelo programa definido pelo usuário. Observe as mudanças dinâmicas no animal.
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Representative Results
O esquema do DRS-PAI é mostrado na Figura 1. O sistema permite uma comutação flexível e repetível entre WIM e RIM. O sinal PA adquirido é processado rapidamente para gerar imagens PA B-Scan e MAP. A câmera CCD pode fornecer fotografias de amostras.
Todos os componentes do DRS-PAI são integrados e montados em uma configuração de imager(Figura 2),facilitando a montagem e opere. No WIM, é utilizada a varredura contínua de raster de um estágio motorizado bidimensional. O sinal do estágio de execução é gravado. A aquisição de dados prosseguiu durante a tradução uniforme da etapa. Na RIM, foi utilizado um scanner galvanômetro de dois eixos. Os dados foram coletados de forma sincronizada com a varredura de Galva (Figura 3).
Aqui, foram coletadas as imagens vasculares das amostras a cada modo de imagem. A Figura 4A mostra a imagem MAP do mouse de volta no WIM. O tempo de imagem foi de cerca de 33 min. Figura 4B mostra imagens b-scan do mouse de volta durante rim. Todo o processo de RIM é mostrado no Vídeo 1. Em seguida, foi usado um transdutor ultrassônico focado. As redes vasculares da orelha e do cérebro do camundongo são mostradas na Figura 5. O tempo de imagem foi de cerca de 16 minutos. Isso demonstra a capacidade do DRS-PAI de imagem vasculatura de campo amplo. Além disso, a Figura 6A mostra que o alcance de imagem contém um vaso. A faixa de imagem de RIM é de cerca de 100 μm devido ao uso do transdutor ultrassônico focado. A imagem de deslocamento ao longo da direção de profundidade do abdômen do rato versus tempo é mostrada na Figura 6B. O vídeo 2 mostra o processo de deslocamento vascular e obtenção da curva de pulso ou respiração atual.
Figura 1: O esquema do sistema DRS-PAI. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: O projeto do sistema DRS-PAI.
AFotografia do sistema DRS-PAI. (B) O painel mostra uma fotografia da configuração para montagem do caminho a laser. (C) O painel mostra o modelo 3D para montagem do caminho a laser. (D) O painel mostra o conjunto do scanner de galvanômetro rápido de dois eixos. (E) O painel mostra o conjunto da sonda. (F) O painel mostra o conjunto do caminho óptico CCD. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: A configuração da varredura para diferentes modos de imagem.
(A) O caminho de varredura do WIM. (B) O caminho de varredura da RIM. (C) A configuração do gatilho de dois modos de imagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: O WIM fotoacâmico e rim do mouse de volta.
(A) A imagem MAP do mouse de volta em WIM. (B) As imagens B-Scan do mouse de volta em RIM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: O WIM fotoacâmico de um mouse.
(A) A imagem MAP do ouvido do mouse em WIM. (B) A imagem MAP do cérebro do rato em WIM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: A borda fotoacâmtica do abdômen do rato.
(A) As imagens de escaneamento B do abdômen do rato em RIM. (B) A imagem MAP ao longo da direção de profundidade do abdômen do mouse versus tempo em RIM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Vídeo 1: O processo de RIM do mouse de volta. Clique aqui para baixar este vídeo.
Vídeo 2: O processo de imagem MAP ao longo da direção de profundidade do abdômen do rato versus tempo. Clique aqui para baixar este vídeo.
Figura suplementar 1: A parte da região de imagem em contato com a membrana de polietileno. Clique aqui para baixar este número.
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Discussion
Aqui apresentamos um biomedusor fotoacâmico de pequeno animal para visualização vascular não invasiva que foi projetado e desenvolvido para capturar a estrutura da vasculatura e a mudança dinâmica relacionada do sangue. A vantagem do DRS-PAI é que ele integra o WIM e o RIM em um sistema, o que facilita o estudo da estrutura de rede vascular dinâmica e vascular de pequenos animais. O sistema pode fornecer visualização vascular de campo amplo de alta resolução e dinâmica sanguínea em tempo real.
No sistema atual, a excitação óptica foi implementada com uma fonte de luz de comprimento de onda única. Um futuro sistema de comprimento de onda forneceria outros parâmetros, como a saturação do oxigênio no sangue. Além disso, um algoritmo especial de processamento de imagem pode ser desenvolvido para análise quantitativa, incluindo estimativa do diâmetro vascular, densidade vascular, tortuosidade vascular, etc. A análise quantitativa pode fornecer informações valiosas para o diagnóstico precoce e tratamento de doenças.
Em resumo, o sistema permite que os pesquisadores obtenham insights fisiológicos e patológicos de alta dimensão sobre pesquisas em animais pequenos com relevância biomédica. O sistema pode ser adaptado à maioria das configurações de pesquisa de animais pequenos, incluindo, mas não se limitando a, imagens de angiogênese, microambientes tumorais, conexões hemodinâmicas, funcionais no cérebro, microcirculação, respostas medicamentosas e respostas terapêuticas. As etapas críticas dentro do protocolo incluem o design da estrutura de digitalização dupla, o ajuste confocal do foco óptico e acústico no WIM e o ajuste do ponto central do campo de som na RIM.
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Disclosures
Todos os experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos aprovados do Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais. Os autores não têm interesses financeiros relevantes no manuscrito e nenhum outro potencial conflito de interesse para divulgar.
Acknowledgments
Os autores gostariam de reconhecer o apoio financeiro da Fundação Nacional de Ciência Natural da China (61822505; 11774101; 61627827; 81630046), O Projeto de Planejamento científico e tecnológico da província de Guangdong, China (2015B020233016) e o Programa de Ciência e Tecnologia de Guangzhou (Nº 2019020001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 bit multi-purpose digitizer | Spectrum | M3i.3221 | Data acquisition card |
| A-line collected program | National Instrument | LabVIEW | User-defined program |
| Amplifier | RF Bay | LNA-650 | Amplifier |
| Depilatory Cream | Veet | 33-II | Animal depilatory |
| Fiberport Coupler | Thorlab | PAF-X-7-A | Fiber Coupler |
| Field Programmable Gate Array | Altera | Cyclone IV | Trigger Control |
| Fixed Focus Collomation Packages | Thorlabs | F240FC-532 | Fiber Collimator |
| Foused ultrasonic transducer | Self-made | ||
| Graphics Processing Unit | NVIDIA | GeForce GTX 1060 | Processing data |
| Holder | Self-made | Animal fixation | |
| Laser control program | National Instrument | LabVIEW | User-defined program |
| Mice | Guangdong Medical Laboratory Animal Center | BALB/c | Animal Model |
| Microscope camera | Mshot | MS60 | CCD camera |
| Microscope Objective | Daheng Optics | GCO-2111 | Objective Lens |
| Mirror | Daheng Optics | GCC-1011 | Moveable/Fixed Mirror |
| Moving Magnet Capacitive Detector Galvanometer Scanner | Century Sunny | S8107 | real-time scanner |
| Mshot image analysis system | Mshot | Display software | |
| Normal Saline | CR DOUBLE-CRANE | H34023609 | Normal Saline |
| Ophthalmic Scissors | SUJIE | Scalp Remove | |
| Planar ultrasonic transducer | Self-made | ||
| Plastic Wrap | HJSJLSL | Polyethylene Membrane | |
| Program Control Software | National Instrument | LabVIEW | User-defined Program |
| Pulsed Q-swithched Laser | Laser-export | DTL-314QT | 532-nm pulse Laser |
| Real-time imaging program | National Instrument | LabVIEW | User-defined program |
| Ring-shaped white LED | Self-made | ||
| Shaver | Codos | CP-9200 | Animal Shaver |
| Single-Mode Fibers | Nufern | 460-HP | Single-mode fiber |
| Surgical Blade | SUJIE | 11 | Blade |
| Surgical Scalpel | SUJIE | 7 | Scalp Remove |
| Translation Stage | Jiancheng Optics | LS2-25T | wide-field scanning stage |
| Ultrasonic Transducer | Self-made | ||
| Ultrasound gel | GUANGGONG PAI | ZC4252418 | Acoustic Coupling |
| Urethane | Tokyo Chemical Industry | C0028 | Animal Anestheized |
| Water tank | Self-made | ||
| Wide-field imaging program | National Instrument | LabVIEW | User-defined program |
| XY Translator Mount | Self-made |
References
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