Summary
Un double imageur photoacoustique à balayage raster a été conçu, qui a intégré l’imagerie à champ large et l’imagerie en temps réel.
Abstract
L’imagerie des réseaux vasculaires sur les petits animaux a joué un rôle important dans la recherche biomédicale fondamentale. La technologie d’imagerie photoacoustique a un grand potentiel d’application dans l’imageologie des petits animaux. L’imagerie photoacoustique à large champ des petits animaux peut fournir des images avec une résolution spatiotemporale élevée, une pénétration profonde et de multiples contrastes. En outre, le système d’imagerie photoacoustique en temps réel est souhaitable pour observer les activités hémodynamiques de la vascularisation des petits animaux, qui peuvent être utilisées pour rechercher la surveillance dynamique des caractéristiques physiologiques des petits animaux. Ici, un imageur photoacoustique à double balayage est présenté, doté d’une fonction d’imagerie commutable en double mode. L’imagerie à champ large est pilotée par une étape de traduction motorisée bidimensionnelle, tandis que l’imagerie en temps réel est réalisée avec des galvanomètres. En définissant différents paramètres et modes d’imagerie, la visualisation in vivo du réseau vasculaire des petits animaux peut être effectuée. L’imagerie en temps réel peut être utilisée pour observer le changement d’impulsion et le changement de flux sanguin induit par la drogue, etc. L’imagerie à champ large peut être utilisée pour suivre le changement de croissance de la vascularisation tumorale. Ceux-ci sont faciles à adopter dans divers domaines de la recherche fondamentale en biomédecine.
Introduction
Dans le domaine biomédical de base, les petits animaux peuvent simuler la fonction physiologique humaine. Par conséquent, l’imagerie des petits animaux joue un rôle important en guidant la recherche sur les maladies humaines homologues et en cherchant un traitementefficace 1. L’imagerie photoacoustique (IPA) est une technique d’imagerie non invasive combinant les avantages de l’imagerie optique et de l’imagerie parultrasons 2. La microscopie photoacoustique (PAM) est une méthode d’imagerie précieuse pour la recherche fondamentale sur les petits animaux3. PAM peut facilement obtenir des images à haute résolution, à pénétration profonde, à haute spécificité et à contraste élevé basées sur l’excitation optique et la détection parultrasons 4.
Un laser pulsé avec une longueur d’onde spécifique est absorbé par les chromophores endogènes des tissus. Par la suite, la température du tissu augmente, ce qui entraîne la production d’ondes ultrasoniques induites par photo. Les ondes ultrasoniques peuvent être détectées par un transducteur ultrasonique. Après l’acquisition du signal et la reconstruction de l’image, la distribution spatiale de l’absorbeur peut êtreobtenue 5. D’une part, la visualisation du réseau vasculaire à organe entier nécessite un large champ de vision. Le processus de balayage à champ large prend généralement beaucoup de temps pour assurer la haute résolution6,7,8. D’autre part, l’observation des activités hémodynamiques des petits animaux nécessite une imagerie rapide en temps réel. L’imagerie en temps réel est bénéfique pour étudier les signes vitaux des petits animaux entemps réel 9,10,11. Le champ de vision de l’imagerie en temps réel est généralement suffisamment petit pour assurer un taux de mise à jour élevé. Ainsi, il existe souvent un compromis entre la réalisation d’un large champ de vision et l’imagerie en temps réel. Auparavant, deux systèmes différents étaient utilisés séparément pour l’imagerie à champ large ou l’imagerie en temps réel.
Ces travaux font état d’un double imageur photoacoustique à balayage raster (DRS-PAI), qui a intégré l’imagerie à large champ basée sur une étape de traduction motorisée bidimensionnelle et une imagerie en temps réel basée sur un scanner galvanomètre à deux axes. Le mode d’imagerie à champ large (WIM) est effectué pour montrer la morphologie vasculaire. Pour le mode d’imagerie en temps réel (RIM), il existe actuellement deux fonctions. Tout d’abord, RIM peut fournir des images en temps réel B-scan. En mesurant le déplacement de la vascularisation le long de la direction de la profondeur, les caractéristiques de la respiration ou du pouls peuvent être révélées. Deuxièmement, la JANTE peut mesurer quantitativement la zone spécifique de l’image WIM. En fournissant des images comparables des régions wim locales, les détails du changement local peuvent être révélés avec précision. Le système conçoit une transition flexible entre l’imagerie à large champ de la visualisation vasculaire et l’imagerie en temps réel de la dynamique locale. Le système est souhaitable dans la recherche biomédicale fondamentale où il y a un besoin d’imagerie des petits animaux.
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Protocol
Toutes les expériences sur les animaux ont été réalisées conformément aux lignes directrices fournies par le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université normale de Chine méridionale, Guangzhou, Chine.
1. Configuration du système
- Chemin optique (Figure 1)
- Utilisez un laser à impulsions de 532 nm comme source laser système. Réglez le taux de répétition du laser à 10 kHz, l’énergie de sortie à 100% et le réglage de la gâchette à la gâchette externe à l’aide d’un programme défini par l’utilisateur.
- Couplez le faisceau laser à la fibre mono-mode (SMF) via un coupler de fibre optique (FC1). Collimate le faisceau laser à l’aide d’un collimateur en fibre optique (FC2) sur une scène motorisée bidimensionnelle (Moteur, vitesse maximale: 20 mm/s).
- Dévier le faisceau laser à l’aide d’un scanner galvanomètre à deux axes (Galva). Utilisez un miroir moveable (M1) pour refléter le faisceau. Concentrez le faisceau à travers une lentille × 4°C (OL, Ouverture numérique: 0,1).
- Utilisez une monture de traducteur XY (TM) pour fixer le transducteur ultrasonique creux self-made (UT, fréquence centrale : 25 MHz ; Bande passante : plus de 90 %; Trou central: 3 mm) sur le fond de l’OL12. Passez le faisceau focalisé à travers le trou central du transducteur ultrasonique.
- Chemin de numérisation
- Verrouillez le Galva à l’aide d’un tableau de portes programmable sur le terrain (FPGA 2) pendant wim. Définissez la plage de numérisation et la vitesse de numérisation appropriées par un programme défini par l’utilisateur.
- Verrouillez le moteur à l’aide d’un tableau de porte programmable sur le terrain (FPGA 1) pendant RIM. Définissez la fréquence de numérisation et le nombre de points de numérisation à l’aide de FPGA 2. Utilisez un programme défini par l’utilisateur pour contrôler le démarrage et arrêter la numérisation.
- Acquisition de données
- Utilisez un amplificateur de 50 dB (AMP) pour amplifier le signal pa. Numériser le signal par la carte d’acquisition de données (DAQ). Obtenez le signal de déclenchement par FPGA 1 ou FPGA 2.
- Utilisez une unité de traitement graphique (GPU) pour traiter les données et afficher des images en parallèle13.
- Système d’imagerie CCD
- Utilisez une LED blanche en forme d’anneau (Température de couleur : 6500 K; Illuminance: 40000 lux; Diamètre : 7,5 cm) comme source d’éclairage. Retirez M1, utilisez un miroir fixe (M2) pour refléter la lumière.
- Enregistrez les images à l’aide d’une caméra CCD (6,3 millions de pixels) sur le système d’imagerie PA. Affichez les images avec un logiciel d’affichage.
2. Alignement du système
- Sélectionnez un réservoir d’eau (10 cm × 10 cm × 4,4 cm; fenêtre inférieure : 3 cm × 3 cm). Couvrir l’ensemble du réservoir d’eau à l’aide d’une membrane en polyéthylène (membrane épaisse : 10 μm). Ajouter suffisamment d’eau ultrapure.
- Placez le réservoir d’eau sur la scène de travail.
- Allumez l’interrupteur laser. Sélectionnez le programme de contrôle laser. Préchauffer pendant 5 min. Appuyez sur le bouton « ON » sur l’interrupteur de pompage. Définissez les paramètres laser selon l’étape 1.1.1. Ouvrez la déroute du laser.
- Sélectionnez le programme de collecte de la ligne A. Appuyez sur le bouton « Démarrer » pour capturer le signal à un point et afficher l’amplitude et le spectre du signal actuel de la ligne A.
- Placez une lame au fond du réservoir d’eau. Immerger la partie inférieure de l’UT dans le réservoir d’eau pour un couplage acoustique. Évitez les bulles dans la partie inférieure de l’UT.
- Ajustez la position de Galva, ajustez le traducteur XY entre UT et OL pour éviter le signal d’oscillation, et assurez-vous que c’est confocal.
- Ajustez la hauteur de l’étape de travail pour maximiser l’amplitude du signal et déterminer la position de mise au point.
3. Expérience animale
- Utilisez une souris BALB/c vieille de 5\u20126 semaines avec un poids corporel de 20\u201230 g.
- Anesthésier l’animal à l’aide d’uréthane (1 g/kg) injecté intraperitoneally avant l’expérience.
- Effectuer la transition entre WIM et RIM.
- Utilisez un transducteur ultrasonique planaire. Raser la fourrure sur le dos de la souris à l’aide d’une tondeuse et d’une crème depilatory. Placer la souris sur le support (8 cm × 2,8 cm × 2 cm) en position couchée.
- Permettre à la région d’imagerie d’être en contact avec la membrane de polyéthylène à l’aide d’un gel à ultrasons. Évitez les bulles dans la partie de contact.
- Placez le support sur la scène de travail pour le couplage acoustique. Suivez les étapes 2.3\u20122.4 pour démarrer le laser et collecter le signal de la ligne A. Suivez les étapes 2.6\u20122.7 pour aligner. Appuyez sur « Stop » pour terminer la collecte après alignement.
- Sélectionnez le programme WIM. Nommez le dossier nouvellement créé. Réglez le paramètre de balayage à 20 mm/s dans l’onglet « Vitesse de balayage », « 20 mm*20 mm » dans l’onglet « Zone de balayage » et « 20 » dans l’onglet « Étape ». Cliquez sur le bouton Collect pour commencer à numériser.
- Cliquez sur le bouton Stop pour terminer la numérisation après l’acquisition. Cliquez sur Retour à zéro pour ramener le moteur à zéro. Fermez le déflecteur laser. Réglez le paramètre de déclenchement sur la gâchette interne. Appuyez sur le bouton OFF pour le commutateur de pompage.
- Remplacez la gâchette WIM comme déclencheur RIM et connectez-la à la gâchette laser externe. Appuyez sur le bouton ON pour le commutateur de pompage. Réglez le réglage de la gâchette sur la gâchette externe. Cliquez sur le bouton Exit pour quitter le programme WIM.
- Utilisez l’étape 2.4 pour recueillir le signal de la ligne A. Ouvrez la déroute laser. Suivez les étapes 2.6\u20122.7 pour aligner. Appuyez sur Arrêt pour terminer la collecte après alignement.
- Sélectionnez le programme RIM. Nommez le dossier nouvellement créé. Cliquez sur le bouton Collect pour commencer à numériser.
- Cliquez sur le bouton Stop pour terminer la numérisation après l’acquisition. Cliquez sur le bouton Exit pour quitter le programme RIM.
- Euthanasier l’animal à l’aide d’une dislocation cervicale à la fin de l’imagerie.
- Effectuer WIM de visualisation vasculaire.
- Utilisez un transducteur ultrasonique focalisé (fréquence centrale : 25 MHz; Bande passante : plus de 90 %; Longueur focale: 8 mm). Enlever les cheveux des souris oreille ou le cuir chevelu.
- Utilisez un scalpel pour faire une petite incision sur le côté latéral du dessus temporel crânien de la souris (profondeur du crâne). Utilisez des ciseaux ophtalmiques pour commencer à partir de cette incision. Couper le cuir chevelu autour du côté extérieur du crâne. Compresser le point de saignement pour arrêter le saignement. Lavez la plaie avec de la solution saline normale. Placez la souris sur le support.
- Permettre à la région d’imagerie d’être en contact avec la membrane de polyéthylène à l’aide d’un gel à ultrasons. Évitez les bulles dans la région de contact( Figure supplémentaire 1).
- Placez le support sur la scène de travail pour le couplage acoustique. Utilisez les étapes 2.3\u20122.4 pour ouvrir le laser et recueillir le signal de la ligne A. Utilisez l’étape 2.6\u20122.7 pour aligner. Appuyez sur Arrêt pour terminer la collecte après alignement.
- Sélectionnez le programme WIM. Nommez le dossier nouvellement créé. Réglez le paramètre de balayage à « 10 mm/s » dans l’onglet « Vitesse de balayage », « 10 mm*10 mm » sous l’onglet « Zone de balayage » et « 10 » dans l’onglet « Étape ». Cliquez sur le bouton Collect pour commencer à numériser.
- Cliquez sur le bouton Stop pour terminer la numérisation après l’acquisition. Cliquez sur le retour à zéro pour faire revenir le moteur à zéro. Cliquez sur le bouton Exit pour quitter le programme WIM.
- Euthanasier l’animal à la fin de l’intervention pendant que l’animal est encore sous anesthésie.
- Utilisez un transducteur ultrasonique focalisé (fréquence centrale : 25 MHz; Bande passante : plus de 90 %; Longueur focale: 8 mm). Enlever les cheveux des souris oreille ou le cuir chevelu.
- Conduct RIM pour la surveillance dynamique des petits animaux.
- Raser les cheveux de l’abdomen de la souris. Placez la souris sur le support en position supine.
- Permettre à la région d’imagerie d’être en contact avec la membrane de polyéthylène à l’aide d’un gel à ultrasons. Évitez les bulles dans la région de contact.
- Placez le support sur la scène de travail pour le couplage acoustique. Effectuez les étapes 2.3\u20122.4 pour démarrer le laser et recueillir le signal de la ligne A. Effectuez l’étape 2.6\u20122.7 pour aligner. Appuyez sur Arrêt pour terminer la collecte après alignement.
- Sélectionnez le programme RIM. Nommez le dossier nouvellement créé. Cliquez sur le bouton Collect pour commencer à numériser.
- Cliquez sur le bouton Stop pour terminer la numérisation après l’acquisition. Cliquez sur le bouton Exit pour quitter le programme RIM.
- Utilisez les données rim pour la reconstruction de la projection maximale d’amplitude (MAP) le long de la direction de profondeur par programme défini par l’utilisateur. Observez les changements dynamiques chez l’animal.
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Representative Results
Le schéma du DRS-PAI est indiqué dans la figure 1. Le système permet une commutation flexible et reproductible entre WIM et RIM. Le signal PA acquis est traité rapidement pour générer des images PA B-Scan et MAP. La caméra CCD peut fournir des photographies d’échantillons.
Tous les composants du DRS-PAI sont intégrés et assemblés dans une configuration d’imageur (Figure 2), ce qui facilite l’assemblage et le fonctionnement. Dans le WIM, le balayage raster continu d’un stade motorisé bidimensionnel est utilisé. Le signal de l’étape de course est enregistré. L’acquisition de données s’est déroulée au cours de la traduction uniforme de l’étape. Dans le RIM, un scanner de galvanomètre à deux axes a été utilisé. Les données ont été recueillies de façon synchrone avec la numérisation Galva( Figure 3).
Ici, les images vasculaires des échantillons avec chaque mode d’imagerie ont été rassemblées. La figure 4A montre l’image MAP de la souris dans WIM. Le temps d’imagerie était d’environ 33 min. La figure 4B montre des images de souris à balayage B pendant RIM. L’ensemble du processus de RIM est montré dans la vidéo 1. Puis, un transducteur ultrasonique focalisée a été utilisé. Les réseaux vasculaires de l’oreille et du cerveau de la souris sont indiqués dans la figure 5. Le temps d’imagerie était d’environ 16 min. Cela démontre la capacité de DRS-PAI à l’image vasculature à large champ. De plus, la figure 6A montre que la plage d’imagerie contient un navire. La plage d’imagerie de RIM est d’environ 100 μm en raison de l’utilisation du transducteur ultrasonique focalisée. L’image de déplacement le long de la direction de profondeur de l’abdomen de la souris par rapport au temps est indiquée dans la figure 6B. La vidéo 2 montre le processus de déplacement vasculaire et l’obtention de l’impulsion actuelle ou de la courbe de respiration.
Figure 1 : Le schéma du système DRS-PAI. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Conception du système DRS-PAI.
(A) La photographie du système DRS-PAI. (B) Le panneau montre une photographie de la configuration pour l’assemblage de chemin laser. (C) Le panneau montre le modèle 3D pour l’assemblage de chemin laser. (D) Le panneau montre l’assemblage rapide du scanner galvanomètre à deux axes. (E) Le panneau montre l’assemblage de la sonde. (F) Le panneau affiche l’assemblage optique du chemin CCD. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Configuration de l’analyse des différents modes d’imagerie.
(A) Le chemin d’analyse de WIM. (B) Le chemin d’analyse de RIM. (C) La configuration de la gâchette de deux modes d’imagerie. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Wim photoacoustique et JANTE de la souris en arrière.
(A) L’image MAP de la souris de retour dans WIM. (B) Les images B-Scan de la souris de retour dans RIM. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Wim photoacoustique d’une souris.
(A) L’image MAP de l’oreille de la souris dans WIM. (B) L’image MAP du cerveau de la souris dans WIM. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6 : La JANTE photoacoustique de l’abdomen de la souris.
(A) Les images B-scan de l’abdomen de la souris dans RIM. (B) L’image MAP le long de la direction de profondeur de l’abdomen de la souris par rapport au temps dans RIM. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Vidéo 1: Le processus de RIM de la souris en arrière. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo.
Vidéo 2: Le processus de l’image MAP le long de la direction de profondeur de l’abdomen de la souris par rapport au temps. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo.
Figure supplémentaire 1 : Partie de la région d’imagerie en contact avec la membrane du polyéthylène. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.
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Discussion
Ici nous avons présenté un double imageur photoacoustic photoacoustic de raster-balayage de petit animal pour la visualisation vasculaire non invasive qui a été conçue et développée pour capturer la structure de la vascularisation et le changement dynamique connexe du sang. L’avantage du DRS-PAI est qu’il intègre le WIM et le RIM dans un seul système, ce qui facilite l’étude de la structure dynamique vasculaire et vasculaire du réseau des petits animaux. Le système peut fournir une visualisation vasculaire à champ large haute résolution et une dynamique sanguine en temps réel.
Dans le système actuel, l’excitation optique a été implémentée avec une source de lumière à longueur d’onde unique. Un futur système multi-longueurs d’onde fournirait d’autres paramètres tels que la saturation en oxygène dans le sang. En outre, un algorithme spécial de traitement d’image peut être développé pour l’analyse quantitative, y compris l’estimation du diamètre vasculaire, la densité vasculaire, la tortuosité vasculaire, etc. L’analyse quantitative peut fournir des informations précieuses pour le diagnostic précoce et le traitement des maladies.
En résumé, le système permet aux chercheurs d’obtenir des connaissances physiologiques et pathologiques de haute dimension sur la recherche sur les petits animaux ayant une pertinence biomédicale. Le système peut être adapté à la plupart des milieux de recherche sur les petits animaux, y compris, sans s’y limiter, l’imagerie de l’angiogenèse, les microenvironnements tumoraux, l’hémodynamique, les connexions fonctionnelles dans le cerveau, la microcirculation, les réponses médicamenteuse et les réponses thérapeutiques. Les étapes critiques du protocole comprennent la conception de la structure à double balayage, l’ajustement confocal de la mise au point optique et acoustique dans le WIM, et l’ajustement du point central du champ sonore dans la JANTE.
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Disclosures
Toutes les expériences sur les animaux ont été réalisées conformément aux lignes directrices et règlements approuvés par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux. Les auteurs n’ont aucun intérêt financier pertinent dans le manuscrit et aucun autre conflit d’intérêts potentiel à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs aimeraient souligner le soutien financier de la National Natural Science Foundation of China (61822505; 11774101; 61627827; 81630046), The Science and Technology Planning Project of Guangdong Province, Chine (2015B020233016), et The Science and Technology Program of Guangzhou (no 2019020001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 bit multi-purpose digitizer | Spectrum | M3i.3221 | Data acquisition card |
| A-line collected program | National Instrument | LabVIEW | User-defined program |
| Amplifier | RF Bay | LNA-650 | Amplifier |
| Depilatory Cream | Veet | 33-II | Animal depilatory |
| Fiberport Coupler | Thorlab | PAF-X-7-A | Fiber Coupler |
| Field Programmable Gate Array | Altera | Cyclone IV | Trigger Control |
| Fixed Focus Collomation Packages | Thorlabs | F240FC-532 | Fiber Collimator |
| Foused ultrasonic transducer | Self-made | ||
| Graphics Processing Unit | NVIDIA | GeForce GTX 1060 | Processing data |
| Holder | Self-made | Animal fixation | |
| Laser control program | National Instrument | LabVIEW | User-defined program |
| Mice | Guangdong Medical Laboratory Animal Center | BALB/c | Animal Model |
| Microscope camera | Mshot | MS60 | CCD camera |
| Microscope Objective | Daheng Optics | GCO-2111 | Objective Lens |
| Mirror | Daheng Optics | GCC-1011 | Moveable/Fixed Mirror |
| Moving Magnet Capacitive Detector Galvanometer Scanner | Century Sunny | S8107 | real-time scanner |
| Mshot image analysis system | Mshot | Display software | |
| Normal Saline | CR DOUBLE-CRANE | H34023609 | Normal Saline |
| Ophthalmic Scissors | SUJIE | Scalp Remove | |
| Planar ultrasonic transducer | Self-made | ||
| Plastic Wrap | HJSJLSL | Polyethylene Membrane | |
| Program Control Software | National Instrument | LabVIEW | User-defined Program |
| Pulsed Q-swithched Laser | Laser-export | DTL-314QT | 532-nm pulse Laser |
| Real-time imaging program | National Instrument | LabVIEW | User-defined program |
| Ring-shaped white LED | Self-made | ||
| Shaver | Codos | CP-9200 | Animal Shaver |
| Single-Mode Fibers | Nufern | 460-HP | Single-mode fiber |
| Surgical Blade | SUJIE | 11 | Blade |
| Surgical Scalpel | SUJIE | 7 | Scalp Remove |
| Translation Stage | Jiancheng Optics | LS2-25T | wide-field scanning stage |
| Ultrasonic Transducer | Self-made | ||
| Ultrasound gel | GUANGGONG PAI | ZC4252418 | Acoustic Coupling |
| Urethane | Tokyo Chemical Industry | C0028 | Animal Anestheized |
| Water tank | Self-made | ||
| Wide-field imaging program | National Instrument | LabVIEW | User-defined program |
| XY Translator Mount | Self-made |
References
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