Summary
Der blev designet en fotoakdannende billeddannelse med dobbelt rasterscanning, som integrerede billedbehandling i bred felt og billedbehandling i realtid.
Abstract
Billeddannelse af vaskulære netværk på små dyr har spillet en vigtig rolle i den grundlæggende biomedicinske forskning. Fotoakoustisk billeddannelsesteknologi har et stort potentiale for anvendelse i billedologien af små dyr. Den fotoakstiske billeddannelse i det brede felt af små dyr kan give billeder med høj spatiotemporal opløsning, dyb penetration og flere kontraster. Også det fotoakkutiske billeddannelsessystem i realtid er ønskeligt at observere de hæmodynamiske aktiviteter af smådyrsvakulature, som kan bruges til at forske i dynamisk overvågning af små dyrs fysiologiske egenskaber. Her præsenteres en fotoakustisk billeddannelse med to rasterscanninger med en skiftende dobbelttilstandsbilledfunktion. Den brede felt billedbehandling er drevet af en to-dimensionel motoriseret oversættelse fase, mens real-time billedbehandling er realiseret med galvanometre. Ved at indstille forskellige parametre og billedbehandlingstilstande kan in vivo-visualisering af smådyrs vaskulære netværk udføres. Den real-time billeddannelse kan bruges til at observere puls forandring og blodgennemstrømning ændring af narkotika-induceret, osv. Den brede felt billeddannelse kan bruges til at spore vækstændringen af tumor vaskulatur. Disse er nemme at vedtage inden for forskellige områder af grundlæggende biomedicinforskning.
Introduction
I det grundlæggende biomedicinske felt kan små dyr simulere menneskets fysiologiske funktion. Derfor spiller små dyr billeddannelse en vigtig rolle i at vejlede forskningen i humane homologe sygdomme og søge effektiv behandling1. Photoacoustic imaging (PAI) er en ikke-invasiv billeddannelse teknik, der kombinerer fordelene ved optisk billeddannelse og ultralydsscanning2. Fotoakskopi (PAM) er en værdifuld billeddannelse metode til grundforskning af små dyr3. PAM kan nemt opnå billeder med høj opløsning, dyb penetration, høj specificitet og høj kontrast baseret på optisk excitation og ultralydsdetektering4.
En puls laser med en bestemt bølgelængde absorberes af endogene kromoforer af væv. Derefter stiger vævets temperatur, hvilket resulterer i produktion af fotoinducerede ultralydbølger. Ultralydbølgerne kan detekteres af en ultralydstransducer. Efter signalopsamling og billedgenopbygning kan absorberens rumlige fordeling opnås5. På den ene side kræver visualiseringen af hele orgelvaskulært netværk et bredt synsfelt. Processen med bred scanning tager normalt lang tid at sikre høj opløsning6,7,8. På den anden side kræver observation af små dyrs hæmodynamiske aktiviteter hurtig realtidsbilleddannelse. Den real-time billeddannelse er gavnligt at studere de vitale tegn på små dyr i realtid9,10,11. Synsfeltet for realtidsbilleder er normalt tilstrækkeligt lille til at sikre en høj opdateringshastighed. Således er der ofte en afvejning mellem at opnå et bredt synsfelt og real-time imaging. Tidligere blev to forskellige systemer brugt til billedbehandling i bred kvalitet eller realtidsbilleddannelse separat.
Dette arbejde rapporterer en dobbelt raster-scanning photoacoustic imager (DRS-PAI), som integrerede wide-field imaging baseret på en to-dimensionel motoriseret oversættelse fase og real-time imaging baseret på en to-akset galvanometer scanner. Wim (Wide Field Imaging Mode) udføres for at vise vaskulær morfologi. Til realtidsbilledtilstanden (RIM) er der i øjeblikket to funktioner. For det første kan RIM give B-scanningsbilleder i realtid. Ved at måle forskydningen af vaskulatur langs dybderetningen kan respirationens eller pulsens egenskaber afsløres. For det andet kan RIM kvantitativt måle det specifikke område i WIM-billedet. Ved at give sammenlignelige billeder af lokale WIM-regioner kan detaljerne om den lokale ændring afsløres nøjagtigt. Systemet designer en fleksibel overgang mellem wide-field imaging af vaskulær visualisering og real-time billeddannelse af den lokale dynamik. Systemet er ønskeligt i grundlæggende biomedicinsk forskning, hvor der er behov for små-dyr billeddannelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med retningslinjer fra den institutionelle dyrepleje- og brugskomité for South China Normal University, Guangzhou, Kina.
1. Systemopsætning
- Optisk sti (Figur 1)
- Brug en 532 nm puls laser som systemet laser kilde. Indstil gentagelseshastigheden for laseren til 10 kHz, udgangsenergien til 100% og udløserindstillingen til ekstern udløser ved hjælp af et brugerdefineret program.
- Par laserstrålen til single-mode fiber (SMF) via en optisk fiberkobling (FC1). Collimate laserstrålen ved hjælp af en optisk fiber collimator (FC2) på en to-dimensionel motoriseret scene (Motor, maksimal hastighed: 20 mm / s).
- Afbøje laserstrålen ved hjælp af en galvanometerscanner med to akser (Galva). Brug et bevægeligt spejl (M1) til at reflektere strålen. Fokuser strålen gennem en 4× objektiv linse (OL, Numerisk blænde: 0,1).
- Brug en XY oversætter mount (TM) til at fastsætte den selvfremstillede hule ultralyd transducer (UT, Central frekvens: 25 MHz; Båndbredde: mere end 90%; Midterhul: 3 mm) i bunden af OL12. Pass den fokuserede stråle gennem midterhullet af ultralydstransduceren.
- Scanningssti
- Lås Galva ved hjælp af et felt-programmerbart portsystem (FPGA 2) under WIM. Angiv det relevante scanningsområde og scanningshastigheden af et brugerdefineret program.
- Lås motoren ved hjælp af et felt-programmerbart portsystem (FPGA 1) under RIM. Indstil scanningsfrekvensen og antallet af scanningspunkter ved hjælp af FPGA 2. Brug et brugerdefineret program til at styre start- og stopscanningen.
- Hent data
- Brug en 50-dB forstærker (AMP) til at forstærke PA-signalet. Digitaliser signalet med daq-kortet (Data Acquisition Card). Anskaf udløsersignalet via FPGA 1 eller FPGA 2.
- Brug en GPU (Graphics Processing Unit) til at behandle data og vise billeder parallelt13.
- CCD-billedsystem
- Brug en ringformet hvid LED (Farvetemperatur: 6500 K; Illuminance: 40000 lux; Diameter: 7,5 cm) som lyskilde. Fjern M1, brug et fast spejl (M2) til at reflektere lyset.
- Optag billederne ved hjælp af et CCD-kamera (6,3 millioner pixel) på PA-billedsystemet. Vis billederne med en skærmsoftware.
2. Systemjustering
- Vælg en vandtank (10 cm × 10 cm × 4,4 cm; bundvindue: 3 cm × 3 cm). Hele vandtanken dækkes ved hjælp af en polyethylenmembran (membran tyk: 10 μm). Tilsæt tilstrækkeligt ultrapure vand.
- Placer vandtanken på arbejdsstadiet.
- Tænd for laserkontakten. Vælg laserstyringsprogrammet. Forvarm i 5 min. Tryk på tænd-knappen på pumpekontakten. Angiv laserparametrene pr. trin 1.1.1. Åbn laserens baffel.
- Vælg det A-linjes indsamlede program. Tryk på knappen "Start" for at registrere enkeltpunktssignalet og vise amplitude og spektrum af det aktuelle A-linjesignal.
- Placer en kniv i bunden af vandtanken. Fordyb den nederste del af UT i vandtanken til akustisk kobling. Undgå bobler i den nederste del af UT.
- Juster Galvas position, juster XY-oversætteren mellem UT og OL for at undgå svingningssignal, og sørg for, at dette er konfokalt.
- Juster arbejdsstadiets højde for at maksimere signalets amplitude, og bestem fokuspositionen.
3. Dyreforsøg
- Brug en 5\u20126 uger gammel BALB/c mus med en kropsvægt på 20\u201230 g.
- Bedøve dyret ved hjælp af urethan (1 g/kg), der injiceres intraperitoneally før forsøget.
- Udfør overgang mellem WIM og RIM.
- Brug en planar ultralyd transducer. Barber pelsen på bagsiden af musen ved hjælp af en trimmer og depilatory creme. Placer musen på holderen (8 cm × 2,8 cm × 2 cm) i udsat position.
- Lad billedområdet være i kontakt med polyethylenmembranen ved hjælp af ultralydgel. Undgå bobler i kontaktdelen.
- Placer holderen på arbejdsstadiet for akustisk kobling. Følg trin 2.3\u20122.4 for at starte laseren og indsamle A-linjesignalet. Følg trin 2.6\u20122.7 for at justere. Tryk på "Stop" for at afslutte samlingen efter justering.
- Vælg WIM-programmet. Navngiv den nyoprettede mappe. Indstil scanningsparameteren til 20 mm/s under fanen "Scanningshastighed", "20 mm*20 mm" under fanen "Scanningsområde" og "20" under fanen "Trin". Klik på knappen Indsaml for at starte scanningen.
- Klik på knappen Stop for at afslutte scanningen efter anskaffelse. Klik på Vend tilbage til nul for at bringe motoren op på nul. Luk laser baflen. Indstil udløserindstillingen til intern udløser. Tryk på OFF-knappen for at pumpe kontakten.
- Udskift WIM-udløseren som RIM-udløser, og tilslut den til den eksterne laserudløser. Tryk på tænd-knappen for at pumpe kontakten. Angiv udløserindstillingen til den eksterne udløser. Klik på knappen Afslut for at afslutte WIM-programmet.
- Brug trin 2.4 til at indsamle A-linjesignalet. Åbn laser baflen. Følg trin 2.6\u20122.7 for at justere. Tryk på Stop for at afslutte samlingen efter justering.
- Vælg programmet RIM. Navngiv den nyoprettede mappe. Klik på knappen Indsaml for at starte scanningen.
- Klik på knappen Stop for at afslutte scanningen, når anskaffelsen er fuldført. Klik på knappen Afslut for at afslutte RIM-programmet.
- Aflive dyret ved hjælp af livmoderhalskræft dislokation ved afslutningen af billeddannelse.
- Udfør WIM af vaskulær visualisering.
- Brug en fokuseret ultralydstransducer (Centralfrekvens: 25 MHz; Båndbredde: mere end 90%; Brændvidde: 8 mm). Fjern håret af mus øre eller hovedbund.
- Brug en skalpel til at lave et lille snit på sidesiden af musens kraniale tidsmæssige top (dybde til kraniet). Brug oftalmisk saks til at starte fra dette snit. Skær hovedbunden rundt om ydersiden af kraniet. Komprimer blødningspunktet for at stoppe blødningen. Vask såret med normal saltvand. Placer musen på holderen.
- Lad billedområdet være i kontakt med polyethylenmembranen ved hjælp af ultralydgel. Undgå bobler i kontaktområdet (Supplerende figur 1).
- Placer holderen på arbejdsstadiet for akustisk kobling. Brug trin 2.3\u20122.4 til at åbne laser og indsamle A-linjesignal. Brug trin 2.6\u20122.7 til at justere. Tryk på Stop for at afslutte samlingen efter justering.
- Vælg WIM-program. Navngiv den nyoprettede mappe. Indstil scanningsparameteren til "10 mm/s" under fanen "Scanningshastighed", "10 mm*10 mm" under fanen "Scanningsområde" og "10" under fanen "Trin". Klik på knappen Indsaml for at starte scanningen.
- Klik på knappen Stop for at afslutte scanningen, når anskaffelsen er fuldført. Klik på Returner til nul for at få motoren til at vende tilbage til nul. Klik på knappen Afslut for at afslutte WIM-programmet.
- Aflive dyret ved afslutningen af proceduren, mens dyret stadig er under anæstesi.
- Brug en fokuseret ultralydstransducer (Centralfrekvens: 25 MHz; Båndbredde: mere end 90%; Brændvidde: 8 mm). Fjern håret af mus øre eller hovedbund.
- Udfør RIM for dynamisk overvågning af små dyr.
- Barber håret af musens mave. Placer musen på holderen i liggende stilling.
- Lad billedområdet være i kontakt med polyethylenmembranen ved hjælp af ultralydgel. Undgå bobler i kontaktområdet.
- Placer holderen på arbejdsstadiet for akustisk kobling. Udfør trin 2.3\u20122.4 for at starte laseren og indsamle A-linjesignal. Udfør trin 2.6\u20122.7 for at justere. Tryk på Stop for at afslutte samlingen efter justering.
- Vælg programmet RIM. Navngiv den nyoprettede mappe. Klik på knappen Indsaml for at starte scanningen.
- Klik på knappen Stop for at afslutte scanningen, når anskaffelsen er fuldført. Klik på knappen Afslut for at afslutte RIM-programmet.
- Brug RIM-dataene til rekonstruktion af den maksimale AMPLITUDE-projektion (MAP) langs dybderetningen efter brugerdefineret program. Overhold de dynamiske ændringer i dyret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DRS-PAI's skema er vist i figur 1. Systemet giver mulighed for fleksibelt og repeterbart skift mellem WIM med RIM. Det erhvervede PA-signal behandles hurtigt for at generere PA B-Scan- og MAP-billeder. CCD-kameraet kan give fotografier af prøver.
Alle komponenter i DRS-PAI er integreret og samlet i en imager setup (Figur 2), hvilket gør det nemt at samle og betjene. I WIM anvendes kontinuerlig rasterscanning af en todimensionel motoriseret fase. Signalet fra kørefasen registreres. Dataindsamlingen fortsatte under en ensartet oversættelse af fasen. I RIM blev der anvendt en galvanometerscanner med to akser. Dataene blev indsamlet synkront med Galva-scanningen (Figur 3).
Her blev de vaskulære billeder af prøver med hver billedbehandlingstilstand indsamlet. Figur 4A viser MAP-billedet af musen tilbage i WIM. Billedbehandling tid var omkring 33 min. Figur 4B viser B-scan billeder af musen tilbage under RIM. Hele processen med RIM er vist i Video 1. Derefter blev der brugt en fokuseret ultralydstransducer. Musens øres og hjernes vaskulære netværk er vist i figur 5. Billedtiden var ca. 16 minutter. Dette viser DRS-PAI's evne til at forestille sig wide-field vaskulatur. Desuden viser figur 6A, at billedområdet indeholder en beholder. Rims billedbehandlingsområde er ca. 100 μm på grund af brugen af den fokuserede ultralydstransducer. Forskydningsbilledet langs musens underlivsdybdes dybderetning kontra tid er vist i figur 6B. Video 2 viser processen med vaskulær forskydning og opnåelse af den aktuelle puls eller åndedrætskurve.
Figur 1: Skematisk over DRS-PAI-systemet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Udformningen af DRS-PAI-systemet.
(A)Fotografiet af DRS-PAI-systemet. (B) Panelet viser et fotografi af opsætningen af laserstisamling. (C) Panelet viser 3D-modellen til laserstisamling. (D) Panelet viser den toaksede hurtige galvanometerscannersamling. (E) Panelet viser sondesamlingen. (F) Panelet viser CCD optiske sti samling. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Opsætning af scanning for forskellige billedbehandlingstilstande.
(A) Scanningsstien for WIM. (B) FÆLGens scanningssti. (C) Udløseropsætningen af to billedbehandlingstilstande. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Musens fotoakstiske WIM og FÆLG tilbage.
(a)MAP-billedet af musen tilbage i WIM. (B) B-Scan billeder af musen tilbage i RIM. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Musens fotoakumiske WIM.
(a)MAP-billedet af museøret i WIM. (B) MAP-billedet af musehjernen i WIM. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Musens fotoakstiske fælg.
(A)B-scanning billeder af musen maven i RIM. (B) MAP-billedet langs musens underlivsdybdes dybderetning kontra tid i RIM. Klik her for at se en større version af dette tal.
Video 1: Processen med RIM af musen tilbage. Klik her for at downloade denne video.
Video 2: Processen med MAP billede langs dybden retning af musen maven versus tid. Klik her for at downloade denne video.
Supplerende figur 1: Den del af billeddannelsesområdet, der er i kontakt med polyethylenmembranen. Klik her for at downloade dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her præsenterede vi en dobbelt raster-scanning fotoakkustik lille-dyr billedsprog for noninvasive vaskulær visualisering, som blev designet og udviklet til at fange strukturen af vaskulaturen og den tilhørende dynamiske ændring af blod. Fordelen ved DRS-PAI er, at det integrerer WIM og RIM i ét system, hvilket gør det lettere at studere vaskulær dynamisk og vaskulær netværksstruktur af små dyr. Systemet kan give høj opløsning wide-field vaskulær visualisering og real-time bloddynamik.
I det nuværende system blev den optiske excitation implementeret med en enkelt bølgelængdelyskilde. En fremtidig multi-bølgelængde system ville give andre parametre såsom iltmætning i blodet. Desuden kan der udvikles en særlig billedbehandlingsalgoritme til kvantitativ analyse, herunder estimering af vaskulær diameter, vaskulær tæthed, vaskulær tortuositet osv. Den kvantitative analyse kan give værdifulde oplysninger til tidlig diagnosticering og behandling af sygdomme.
Sammenfattende gør systemet det muligt for forskere at opnå højdimensionel fysiologisk og patologisk indsigt i forskning i små dyr med biomedicinsk relevans. Systemet kan tilpasses de fleste små-dyr forskning indstillinger, omfatter, men ikke begrænset til, billeddannelse af angiogenese, tumor mikromiljøer, hæmodynamiske, funktionelle forbindelser i hjernen, mikrocirkulation, lægemiddelresponser, og terapi svar. Kritiske trin i protokollen omfatter udformningen af den dobbelte scanningsstruktur, den konfokale justering af det optiske og akustiske fokus i WIM og midtpunktsjusteringen af lydfeltet i RIM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med de godkendte retningslinjer og bestemmelser i Den Institutionelle Dyrepleje- og Brugskomité. Forfatterne har ingen relevante økonomiske interesser i manuskriptet og ingen andre potentielle interessekonflikter at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende den finansielle støtte fra National Natural Science Foundation of China (61822505; 11774101; 61627827; 81630046), The Science and Technology Planning Project of Guangdong Province, China (2015B020233016) og Guangzhous videnskabs- og teknologiprogram (nr. 2019020001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 bit multi-purpose digitizer | Spectrum | M3i.3221 | Data acquisition card |
| A-line collected program | National Instrument | LabVIEW | User-defined program |
| Amplifier | RF Bay | LNA-650 | Amplifier |
| Depilatory Cream | Veet | 33-II | Animal depilatory |
| Fiberport Coupler | Thorlab | PAF-X-7-A | Fiber Coupler |
| Field Programmable Gate Array | Altera | Cyclone IV | Trigger Control |
| Fixed Focus Collomation Packages | Thorlabs | F240FC-532 | Fiber Collimator |
| Foused ultrasonic transducer | Self-made | ||
| Graphics Processing Unit | NVIDIA | GeForce GTX 1060 | Processing data |
| Holder | Self-made | Animal fixation | |
| Laser control program | National Instrument | LabVIEW | User-defined program |
| Mice | Guangdong Medical Laboratory Animal Center | BALB/c | Animal Model |
| Microscope camera | Mshot | MS60 | CCD camera |
| Microscope Objective | Daheng Optics | GCO-2111 | Objective Lens |
| Mirror | Daheng Optics | GCC-1011 | Moveable/Fixed Mirror |
| Moving Magnet Capacitive Detector Galvanometer Scanner | Century Sunny | S8107 | real-time scanner |
| Mshot image analysis system | Mshot | Display software | |
| Normal Saline | CR DOUBLE-CRANE | H34023609 | Normal Saline |
| Ophthalmic Scissors | SUJIE | Scalp Remove | |
| Planar ultrasonic transducer | Self-made | ||
| Plastic Wrap | HJSJLSL | Polyethylene Membrane | |
| Program Control Software | National Instrument | LabVIEW | User-defined Program |
| Pulsed Q-swithched Laser | Laser-export | DTL-314QT | 532-nm pulse Laser |
| Real-time imaging program | National Instrument | LabVIEW | User-defined program |
| Ring-shaped white LED | Self-made | ||
| Shaver | Codos | CP-9200 | Animal Shaver |
| Single-Mode Fibers | Nufern | 460-HP | Single-mode fiber |
| Surgical Blade | SUJIE | 11 | Blade |
| Surgical Scalpel | SUJIE | 7 | Scalp Remove |
| Translation Stage | Jiancheng Optics | LS2-25T | wide-field scanning stage |
| Ultrasonic Transducer | Self-made | ||
| Ultrasound gel | GUANGGONG PAI | ZC4252418 | Acoustic Coupling |
| Urethane | Tokyo Chemical Industry | C0028 | Animal Anestheized |
| Water tank | Self-made | ||
| Wide-field imaging program | National Instrument | LabVIEW | User-defined program |
| XY Translator Mount | Self-made |
References
- Li, L., et al. Single-impulse panoramic photoacoustic computed tomography of small-animal whole-body dynamics at high spatiotemporal resolution. Nature Biomedical Engineering. 1 (5), 0071 (2017).
- Jeon, S., Kim, J., Lee, D., Baik, J. W., Kim, C. Review on practical photoacoustic microscopy. Photoacoustics. 15, 100141 (2019).
- Baik, J. W., et al. Super wide-field photoacoustic microscopy of animal and humans in vivo. IEEE Transactions on Medical Imaging. 39 (4), 975-984 (2019).
- Omar, M., Aguirre, J., Ntziachristos, V.
- Lin, L., et al. Single-breath-hold photoacoustic computed tomography of the breast. Nature Communications. 9 (1), 2352 (2018).
- Yang, F., et al. Wide-field monitoring and real-time local recoding microvascular networks on small animals with a dual-raster-scanned photoacoustic microscope. Journal of Biophotonics. 13 (6), 202000022 (2020).
- Sun, J., Zhou, Q., Yang, S. Label-free photoacoustic imaging guided sclerotherapy for vascular malformations: a feasibility study. Optics Express. 26 (4), 4967-4978 (2018).
- Xu, D., Yang, S., Wang, Y., Gu, Y., Xing, D. Noninvasive and high-resolving photoacoustic dermoscopy of human skin. Biomedical Optics Express. 7 (6), 2095-2102 (2016).
- Zhang, W., et al. Miniaturized photoacoustic probe for in vivo imaging of subcutaneous microvessels within human skin. Quantitative Imaging in Medicine and Surgery. 9 (5), 807-814 (2019).
- Chen, Q., et al.
- Lan, B., et al. High-speed widefield photoacoustic microscopy of small-animal hemodynamics. Biomedical Optics Express. 9, 4689-4700 (2018).
- Ma, H., Yang, S., Cheng, Z., Xing, D. Photoacoustic confocal dermoscope with a waterless coupling and impedance matching opto-sono probe. Optics Letters. 42 (12), 2342-2345 (2017).
- Kang, H., Lee, S. W., Lee, E. S., Kim, S. H., Lee, T. G. Real-time GPU-accelerated processing and volumetric display for wide-field laser-scanning optical-resolution photoacoustic microscopy. Biomedical Optics Express. 6 (12), 4650-4660 (2015).
