Summary
En fotoakustisk bildbild med dubbel rasterskanning designades, som integrerade bredfältsavbildning och avbildning i realtid.
Abstract
Avbildning av kärlnätverk på små djur har spelat en viktig roll i grundläggande biomedicinsk forskning. Fotoakustisk bildteknik har stor potential att tillskansa sig små djurs bildologi. Den breda fotoakustiska avbildningen av små djur kan ge bilder med hög spatiotemporal upplösning, djup penetration och flera kontraster. Dessutom är det verkliga fotoakustiska bildsystemet önskvärt att observera de hemodynamiska aktiviteterna hos smådjursvaskulatur, som kan användas för att undersöka den dynamiska övervakningen av smådjurs fysiologiska egenskaper. Här presenteras en fotoakustisk bildbild med dubbel rasterskanning, med en omkopplingsbar dubbellägesavbildningsfunktion. Den breda avbildningen drivs av ett tvådimensionellt motoriserat översättningsstadium, medan realtidsavbildningen realiseras med galvanometrar. Genom att ställa in olika parametrar och bildlägen kan in vivo-visualisering av smådjursvaskulärt nätverk utföras. Realtidsavbildningen kan användas för att observera pulsförändring och blodflödesförändring av läkemedelsinducerade etc. Den breda avbildningen kan användas för att spåra tillväxtförändringen av tumörvaskulatur. Dessa är lätta att anamna inom olika områden av grundläggande biomedicinsk forskning.
Introduction
Inom det grundläggande biomedicinska området kan små djur simulera människans fysiologiska funktion. Därför spelar smådjursbilder en viktig roll för att vägleda forskningen om mänskliga homologa sjukdomar och söka effektiv behandling1. Fotoakustisk avbildning (PAI) är en icke-invasiv bildteknik som kombinerar fördelarna med optisk avbildning och ultraljudsavbildning2. Fotoakustisk mikroskopi (PAM) är en värdefull bildmetod för grundforskning av smådjur3. PAM kan enkelt få högupplösta, djuppenetrerande, hög specificitets- och kontrastbilder baserade på optisk excitation och ultraljudsdetektering4.
En pulslaser med en specifik våglängd absorberas av endogena kromoforer av vävnader. Därefter stiger temperaturen på vävnaden, vilket resulterar i produktion av fotoinducerade ultraljudsvågor. Ultraljud vågor kan detekteras av en ultraljud givare. Efter signalförvärv och bildrekonstruktion kan absorbörens rumsliga fördelning erhållas5. Å ena sidan kräver visualiseringen av helorgansvaskulärt nätverk ett brett synfält. Processen med bred fältskanning tar vanligtvis lång tid att säkerställa högupplöst6,7,8. Å andra sidan kräver observation av de hemodynamiska aktiviteterna hos små djur snabb avbildning i realtid. Realtidsavbildningen är fördelaktig för att studera de vitala tecknen på små djur i realtid9,10,11. Synfältet för realtidsavbildning är vanligtvis tillräckligt litet för att säkerställa en hög uppdateringshastighet. Således finns det ofta en kompromiss mellan att uppnå ett brett synfält och realtidsavbildning. Tidigare användes två olika system för bredfältsavbildning eller realtidsavbildning, separat.
Detta arbete rapporterar en dubbel raster-scanning photoacoustic imager (DRS-PAI), som integrerade bredfältsavbildning baserat på en tvådimensionell motoriserad översättningsfas och realtidsavbildning baserad på en tvåaxlig galvanometerskanner. Wim (wide-field imaging mode) utförs för att visa vaskulär morfologi. För realtidsavbildningsläget (RIM) finns det för närvarande två funktioner. Först kan RIM tillhandahålla B-skanningsbilder i realtid. Genom att mäta förskjutningen av vaskulatur längs djupriktningen kan andningsegenskaperna eller pulsen avslöjas. För det andra kan RIM kvantitativt mäta det specifika området i WIM-bilden. Genom att tillhandahålla jämförbara bilder av lokala WIM-regioner kan detaljerna i den lokala ändringen avslöjas korrekt. Systemet utformar en flexibel övergång mellan bredfältsavbildning av vaskulär visualisering och realtidsavbildning av den lokala dynamiken. Systemet är önskvärt inom grundläggande biomedicinsk forskning där det finns behov av smådjursavbildning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök utfördes i enlighet med riktlinjer från den institutionella djurvårds- och användningskommittén vid South China Normal University, Guangzhou, Kina.
1. Systeminställningar
- Optisk bana (Bild 1)
- Använd en 532 nm pulslaser som systemlaserkälla. Ställ in laserns repetitionshastighet på 10 kHz, uteffektenergin till 100 % och utlösarinställningen till extern utlösare med hjälp av ett användardefinierat program.
- Koppla laserstrålen till enlägesfiber (SMF) via ett optiskt fiberkpar (FC1). Samverka laserstrålen med hjälp av en optisk fiberkollimatör (FC2) på ett tvådimensionellt motoriserat steg (Motor, maxhastighet: 20 mm/s).
- Avled laserstrålen med hjälp av en tvåaxlig galvanometerskanner (Galva). Använd en flyttbar spegel (M1) för att reflektera balken. Fokusera strålen genom en 4× objektiv (OL, Numerisk bländare: 0,1).
- Använd ett XY-översättarfäste (TM) för att fixa den självtillverkade ihåliga ultraljudsgivaren (UT, Centralfrekvens: 25 MHz; Bandbredd: mer än 90%; Mitthål: 3 mm) på botten av OL12. Passera den fokuserade strålen genom den ultraljudsgivarens mitthål.
- Sökväg för skanning
- Lås Galva med hjälp av en fältprogrammabel portmatris (FPGA 2) under WIM. Ställ in lämpligt skanningsområde och skanningshastighet med ett användardefinierat program.
- Lås motorn med hjälp av en fältprogrammabel grindmatris (FPGA 1) under RIM. Ställ in skanningsfrekvensen och antalet skanningspunkter med FPGA 2. Använd ett användardefinierat program för att styra start- och stoppskanningen.
- Datainsamling
- Använd en 50-dB förstärkare (AMP) för att förstärka PA-signalen. Digitalisera signalen med dataförvärvskortet (DAQ). Få avtryckarsignalen via FPGA 1 eller FPGA 2.
- Använd en grafikprocessor (GPU) för att bearbeta data och visa bilder parallellt13.
- CCD-bildsystem
- Använd en ringformad vit lysdiod (Färgtemperatur: 6500 K; Belysning: 40000 lux; Diameter: 7,5 cm) som belysningskälla. Ta bort M1, använd en fast spegel (M2) för att reflektera ljuset.
- Spela in bilderna med en CCD-kamera (6,3 miljoner pixlar) på PA-bildsystemet. Visa bilderna med en displayprogramvara.
2. Systeminriktning
- Välj en vattentank (10 cm × 10 cm × 4,4 cm; bottenfönster: 3 cm × 3 cm). Täck hela vattentanken med ett polyetenmembran (membran tjockt: 10 μm). Tillsätt tillräckligt med ultrapurevatten.
- Placera vattentanken på arbetsstadiet.
- Slå på laserbrytaren. Välj laserkontrollprogram. Förvärm i 5 min. Tryck på "ON"-knappen på pumpbrytaren. Ställ in laserparametrarna enligt steg 1.1.1. Öppna laserns baffel.
- Välj det insamlade programmet för A-raden. Tryck på "Start"-knappen för att fånga enpunktssignalen och visa amplitud och spektrum av den aktuella A-linjesignalen.
- Placera ett blad längst ner i vattentanken. Sänk ned den nedre delen av UT i vattentanken för akustisk koppling. Undvik bubblor i den nedre delen av UT.
- Justera Galvas position, justera XY-översättaren mellan UT och OL för att undvika svängningssignal och se till att den är konfokal.
- Justera arbetsstadiets höjd för att maximera signalens amplitud och bestämma fokuspositionen.
3. Djurförsök
- Använd en 5\u20126 veckor gammal BALB/c mus med en kroppsvikt på 20\u201230 g.
- Bedöva djuret med uretan (1 g/kg) injicerat intraperitoneally före experimentet.
- Genomför övergången mellan WIM och RIM.
- Använd en planar ultraljud givare. Raka pälsen på baksidan av musen med en trimmer och depilatorisk kräm. Placera musen på hållaren (8 cm × 2,8 cm × 2 cm) i utsatt läge.
- Låt bildområdet komma i kontakt med polyetenmembranet med ultraljudsgel. Undvik bubblor i kontaktdelen.
- Placera hållaren på arbetsstadiet för akustisk koppling. Följ steg 2.3\u20122.4 för att starta lasern och samla in A-linjesignal. Så här justerar du stegen 2.6\u20122.7. Tryck på "Stopp" för att avsluta samlingen efter justering.
- Välj WIM-programmet. Namnge den nyskapade mappen. Ställ in skanningsparametern på 20 mm/s på fliken "Skanningshastighet", "20 mm *20 mm" på fliken "Skanningsområde" och "20" på fliken "Steg". Klicka på knappen Samla för att börja skanna.
- Klicka på stoppknappen för att avsluta skanningen efter förvärvet. Klicka på Återgå till noll för att få motorn till noll. Stäng laserbaffeln. Ställ in utlösarinställningen på intern utlösare. Tryck på OFF-knappen för att pumpa omkopplaren.
- Byt ut WIM-utlösaren som RIM-utlösare och anslut den till den externa laserutlösaren. Tryck på ON-knappen för att pumpa omkopplaren. Ställ in utlösarinställningen på den externa utlösaren. Klicka på knappen Avsluta om du vill avsluta WIM-programmet.
- Använd steg 2.4 för att samla in A-linjesignalen. Öppna laserbaffeln. Så här justerar du stegen 2.6\u20122.7. Tryck på Stoppa för att avsluta samlingen efter justering.
- Välj RIM-programmet. Namnge den nyskapade mappen. Klicka på knappen Samla för att börja skanna.
- Klicka på stoppknappen om du vill avsluta skanningen när du har slutfört förvärvet. Klicka på knappen Avsluta om du vill avsluta RIM-programmet.
- Avliva djuret med hjälp av livmoderhalscancer förskjutning vid slutet av avbildningen.
- Utför WIM av vaskulär visualisering.
- Använd en fokuserad ultraljudsgivare (Central frekvens: 25 MHz; Bandbredd: mer än 90%; Brännvidd: 8 mm). Ta bort håret på mössens öra eller hårbotten.
- Använd en skalpell för att göra ett litet snitt på den laterala sidan av musens kraniala temporala topp (djup till skallen). Använd oftalmisk sax för att utt börja med detta snitt. Skär hårbotten runt skallens yttre sida. Komprimera blödningspunkten för att stoppa blödningen. Tvätta såret med normal saltlösning. Placera musen på hållaren.
- Låt bildområdet komma i kontakt med polyetenmembranet med ultraljudsgel. Undvik bubblor i kontaktområdet (kompletterande figur 1).
- Placera hållaren på arbetsstadiet för akustisk koppling. Använd steg 2.3\u20122.4 för att öppna laser och samla in A-linjesignal. Använd steg 2.6\u20122.7 för att justera. Tryck på Stoppa för att avsluta samlingen efter justering.
- Välj WIM-program. Namnge den nyskapade mappen. Ställ in skanningsparametern på "10 mm/s" på fliken "Skanningshastighet", "10 mm *10 mm" under fliken "Skanningsområde" och "10" på fliken "Steg". Klicka på knappen Samla för att börja skanna.
- Klicka på stoppknappen om du vill avsluta skanningen när du har slutfört förvärvet. Klicka på Återgå till noll för att få motorn att återgå till noll. Klicka på knappen Avsluta om du vill avsluta WIM-programmet.
- Avliva djuret vid slutet av proceduren medan djuret fortfarande är under anestesi.
- Använd en fokuserad ultraljudsgivare (Central frekvens: 25 MHz; Bandbredd: mer än 90%; Brännvidd: 8 mm). Ta bort håret på mössens öra eller hårbotten.
- Utför RIM för dynamisk övervakning av små djur.
- Raka musens hår. Placera musen på hållaren i överläge.
- Låt bildområdet komma i kontakt med polyetenmembranet med ultraljudsgel. Undvik bubblor i kontaktområdet.
- Placera hållaren på arbetsstadiet för akustisk koppling. Utför steg 2.3\u20122.4 för att starta lasern och samla in A-line-signalen. Utför steg 2.6\u20122.7 för att justera. Tryck på Stoppa för att avsluta samlingen efter justering.
- Välj RIM-programmet. Namnge den nyskapade mappen. Klicka på knappen Samla för att börja skanna.
- Klicka på stoppknappen om du vill avsluta skanningen när du har slutfört förvärvet. Klicka på knappen Avsluta om du vill avsluta RIM-programmet.
- Använd RIM-data för rekonstruktion av maximal amplitudprojektion (MAP) längs djupriktningen efter användardefinierat program. Observera de dynamiska förändringarna i djuret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Schemat för DRS-PAI visas i figur 1. Systemet möjliggör flexibel och repeterbar växling mellan WIM med RIM. Den förvärvade PA-signalen bearbetas snabbt för att generera PA B-Scan- och MAP-bilder. CCD-kameran kan tillhandahålla fotografier av prover.
Alla komponenter i DRS-PAI är integrerade och monterade i en bilduppsättning (figur 2), vilket gör det enkelt att montera och använda. I WIM används kontinuerlig rasterskanning av ett tvådimensionellt motoriserat stadium. Signalen för löpsteget registreras. Datainsamlingen fortsatte under en enhetlig översättning av etappen. I RIM användes en tvåaxlig galvanometerskanner. Uppgifterna samlades in synkront med Galvaskanningen (figur 3).
Här samlades kärlbilder av prover med varje bildläge in. Bild 4A visar MAP-bilden av musen i WIM. Bildtiden var ca 33 min. Bild 4B visar B-scan bilder av musen tillbaka under RIM. Hela RIM-processen visas i video 1. Sedan användes en fokuserad ultraljud givare. Musörat och hjärnas kärlnätverk visas i figur 5. Bildtiden var ca 16 min. Detta visar drs-PAI:s förmåga att avbilda bredfältsvaskulatur. Dessutom visar figur 6A att bildområdet innehåller ett kärl. Avbildningsområdet för RIM är ca 100 μm på grund av användningen av den fokuserade ultraljudsgivaren. Förskjutningsbilden längs musens djupriktning kontra tiden visas i figur 6B. Video 2 visar processen med vaskulär förskjutning och erhållande av den aktuella pulsen eller andningskurvan.
Figur 1: Schemat för DRS-PAI-systemet. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Utformningen av DRS-PAI-systemet.
A)Fotografiet av DRS-PAI-systemet. (B) Panelen visar ett fotografi av inställningen för lasersökvägsmontering. (C) Panelen visar 3D-modellen för laservägsmontering. (D) Panelen visar den tvåaxlade snabba galvanometerskannerenheten. ( E) Panelen visar sondenheten. (F) Panelen visar CCD optisk banuppsättning. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 3: Installation av skanning för olika bildlägen.
(A) Skanningssökvägen för WIM. (B) Rimts skanningssökväg. (C) Utlösarinställningen av två bildlägen. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 4: Den fotoakustiska WIM och RIM på musen tillbaka.
(A) MAP-bilden av musen tillbaka i WIM. (B) B-Scan bilder av musen tillbaka i RIM. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 5: En muss fotoakustiska WIM.
(A) MAP-bilden av musörat i WIM. (B) MAP-bilden av mushjärnan i WIM. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 6: Musens fotoakustiska kant.
( A) B-skanningsbilderna av musens buk i RIM. (B) MAP-bilden längs musens djupriktning kontra tiden i RIM. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Video 1: Processen med RIM på musen tillbaka. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Video 2: Processen med MAP-bild längs mus bukens djupriktning kontra tiden. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Kompletterande figur 1: Den del av bildområdet som kommer i kontakt med polyetenmembranet. Klicka här för att ladda ner den här siffran.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här presenterade vi en dubbel raster-scanning photoacoustic små-djur imager för noninvasive Vaskulär visualisering som utformades och utvecklats för att fånga strukturen i vaskulaturen och den relaterade dynamiska förändringen av blod. Fördelen med DRS-PAI är att den integrerar WIM och RIM i ett system, vilket gör det lättare att studera vaskulär dynamisk och vaskulär nätverksstruktur hos små djur. Systemet kan ge högupplöst bred kärlvisualisering och bloddynamik i realtid.
I det nuvarande systemet implementerades den optiska excitationen med en enda våglängds ljuskälla. Ett framtida multivåglängdssystem skulle ge andra parametrar som syremättnad i blodet. Vidare kan en speciell bildbehandlingsalgoritm utvecklas för kvantitativ analys, inklusive uppskattning av kärldiameter, vaskulär densitet, vaskulär tortuositet etc. Den kvantitativa analysen kan ge värdefull information för tidig diagnos och behandling av sjukdomar.
Sammanfattningsvis gör systemet det möjligt för forskare att få högdimensionella fysiologiska och patologiska insikter om smådjursforskning med biomedicinsk relevans. Systemet kan anpassas till de flesta smådjursforskningsmiljöer, inklusive men inte begränsat till, avbildning av angiogenes, tumörmikromiljöer, hemodynamiska, funktionella kopplingar i hjärnan, mikrocirkulation, läkemedelssvar och terapisvar. Kritiska steg i protokollet inkluderar utformningen av den dubbla skanningsstrukturen, den konfokala justeringen av det optiska och akustiska fokuset i WIM och mittpunktsjustering av ljudfältet i RIM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alla djurförsök utfördes i enlighet med de godkända riktlinjerna och föreskrifterna från den institutionella djurvårds- och användningskommittén. Författarna har inga relevanta ekonomiska intressen i manuskriptet och inga andra potentiella intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill erkänna det ekonomiska stödet från National Natural Science Foundation of China (61822505; 11774101; 61627827; 81630046), Vetenskaps- och teknikplaneringsprojektet i Guangdongprovinsen, Kina (2015B020233016) och Guangzhous vetenskaps- och teknikprogram (nr 2019020001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 bit multi-purpose digitizer | Spectrum | M3i.3221 | Data acquisition card |
| A-line collected program | National Instrument | LabVIEW | User-defined program |
| Amplifier | RF Bay | LNA-650 | Amplifier |
| Depilatory Cream | Veet | 33-II | Animal depilatory |
| Fiberport Coupler | Thorlab | PAF-X-7-A | Fiber Coupler |
| Field Programmable Gate Array | Altera | Cyclone IV | Trigger Control |
| Fixed Focus Collomation Packages | Thorlabs | F240FC-532 | Fiber Collimator |
| Foused ultrasonic transducer | Self-made | ||
| Graphics Processing Unit | NVIDIA | GeForce GTX 1060 | Processing data |
| Holder | Self-made | Animal fixation | |
| Laser control program | National Instrument | LabVIEW | User-defined program |
| Mice | Guangdong Medical Laboratory Animal Center | BALB/c | Animal Model |
| Microscope camera | Mshot | MS60 | CCD camera |
| Microscope Objective | Daheng Optics | GCO-2111 | Objective Lens |
| Mirror | Daheng Optics | GCC-1011 | Moveable/Fixed Mirror |
| Moving Magnet Capacitive Detector Galvanometer Scanner | Century Sunny | S8107 | real-time scanner |
| Mshot image analysis system | Mshot | Display software | |
| Normal Saline | CR DOUBLE-CRANE | H34023609 | Normal Saline |
| Ophthalmic Scissors | SUJIE | Scalp Remove | |
| Planar ultrasonic transducer | Self-made | ||
| Plastic Wrap | HJSJLSL | Polyethylene Membrane | |
| Program Control Software | National Instrument | LabVIEW | User-defined Program |
| Pulsed Q-swithched Laser | Laser-export | DTL-314QT | 532-nm pulse Laser |
| Real-time imaging program | National Instrument | LabVIEW | User-defined program |
| Ring-shaped white LED | Self-made | ||
| Shaver | Codos | CP-9200 | Animal Shaver |
| Single-Mode Fibers | Nufern | 460-HP | Single-mode fiber |
| Surgical Blade | SUJIE | 11 | Blade |
| Surgical Scalpel | SUJIE | 7 | Scalp Remove |
| Translation Stage | Jiancheng Optics | LS2-25T | wide-field scanning stage |
| Ultrasonic Transducer | Self-made | ||
| Ultrasound gel | GUANGGONG PAI | ZC4252418 | Acoustic Coupling |
| Urethane | Tokyo Chemical Industry | C0028 | Animal Anestheized |
| Water tank | Self-made | ||
| Wide-field imaging program | National Instrument | LabVIEW | User-defined program |
| XY Translator Mount | Self-made |
References
- Li, L., et al. Single-impulse panoramic photoacoustic computed tomography of small-animal whole-body dynamics at high spatiotemporal resolution. Nature Biomedical Engineering. 1 (5), 0071 (2017).
- Jeon, S., Kim, J., Lee, D., Baik, J. W., Kim, C. Review on practical photoacoustic microscopy. Photoacoustics. 15, 100141 (2019).
- Baik, J. W., et al. Super wide-field photoacoustic microscopy of animal and humans in vivo. IEEE Transactions on Medical Imaging. 39 (4), 975-984 (2019).
- Omar, M., Aguirre, J., Ntziachristos, V.
- Lin, L., et al. Single-breath-hold photoacoustic computed tomography of the breast. Nature Communications. 9 (1), 2352 (2018).
- Yang, F., et al. Wide-field monitoring and real-time local recoding microvascular networks on small animals with a dual-raster-scanned photoacoustic microscope. Journal of Biophotonics. 13 (6), 202000022 (2020).
- Sun, J., Zhou, Q., Yang, S. Label-free photoacoustic imaging guided sclerotherapy for vascular malformations: a feasibility study. Optics Express. 26 (4), 4967-4978 (2018).
- Xu, D., Yang, S., Wang, Y., Gu, Y., Xing, D. Noninvasive and high-resolving photoacoustic dermoscopy of human skin. Biomedical Optics Express. 7 (6), 2095-2102 (2016).
- Zhang, W., et al. Miniaturized photoacoustic probe for in vivo imaging of subcutaneous microvessels within human skin. Quantitative Imaging in Medicine and Surgery. 9 (5), 807-814 (2019).
- Chen, Q., et al.
- Lan, B., et al. High-speed widefield photoacoustic microscopy of small-animal hemodynamics. Biomedical Optics Express. 9, 4689-4700 (2018).
- Ma, H., Yang, S., Cheng, Z., Xing, D. Photoacoustic confocal dermoscope with a waterless coupling and impedance matching opto-sono probe. Optics Letters. 42 (12), 2342-2345 (2017).
- Kang, H., Lee, S. W., Lee, E. S., Kim, S. H., Lee, T. G. Real-time GPU-accelerated processing and volumetric display for wide-field laser-scanning optical-resolution photoacoustic microscopy. Biomedical Optics Express. 6 (12), 4650-4660 (2015).
