Summary
En dobbel rasterskanningsfotoakustisk imager ble designet, som integrert bredfeltsbilde og bildebehandling i sanntid.
Abstract
Avbildning av vaskulære nettverk på små dyr har spilt en viktig rolle i grunnleggende biomedisinsk forskning. Fotoakustisk bildeteknologi har stort potensial for anvendelse i bildeologien til små dyr. Den brede feltfotoakustiske avbildningen av små dyr kan gi bilder med høy spatiotemporal oppløsning, dyp penetrasjon og flere kontraster. Også sanntids fotoakustisk bildesystem er ønskelig å observere de hemododynamiske aktivitetene til smådyrvaskulatur, som kan brukes til å forske på dynamisk overvåking av smådyrfysiologiske egenskaper. Her presenteres en fotoaktiker med to rasterskanninger, med en byttbar dobbeltmodusbildefunksjon. Bredfeltsbildebilde er drevet av et todimensjonalt motorisert oversettelsesstadium, mens sanntidsavbildningen realiseres med galvaniskere. Ved å sette ulike parametere og bildebehandlingsmoduser, kan in vivo visualisering av smådyrvaskulært nettverk utføres. Sanntidsavbildningen kan brukes til å observere pulsendring og blodstrømendring av legemiddelindusert, etc. Den brede feltavbildningen kan brukes til å spore vekstendringen av tumorvaskulatur. Disse er enkle å bli vedtatt i ulike områder av grunnleggende biomedisin forskning.
Introduction
I det grunnleggende biomedisinske feltet kan små dyr simulere menneskelig fysiologisk funksjon. Derfor spiller smådyravbildning en viktig rolle i å veilede forskningen på menneskelige homologe sykdommer og søke effektiv behandling1. Fotoakustisk bildebehandling (PAI) er en ikke-invasiv bildeteknikk som kombinerer fordelene med optisk bildebehandling og ultralydavbildning2. Fotoakustisk mikroskopi (PAM) er en verdifull bildemetode for grunnleggende forskning av små dyr3. PAM kan enkelt få høyoppløselige, dyppenetrasjonsbilder, høyspesifisitet og høykontrastbilder basert på optisk eksitasjon og ultralyddeteksjon4.
En pulslaser med en bestemt bølgelengde absorberes av endogene kromoforer av vev. Deretter stiger temperaturen i vevet, noe som resulterer i produksjon av fotoinduserte ultralydbølger. Ultralydbølgene kan oppdages av en ultralydtransduser. Etter signaloppkjøp og bilderekonstruksjon kan den romlige fordelingen av absorberen oppnås5. På den ene siden krever visualiseringen av hele orgelvaskulært nettverk et bredt synsfelt. Prosessen med bredfeltskanning tar vanligvis lang tid å sikre høy oppløsning6,7,8. På den annen side krever det å observere de heodynamiske aktivitetene til små dyr rask sanntidsavbildning. Sanntidsbildebilde er gunstig for å studere vitale tegn på små dyr i sanntid9,10,11. Synsfeltet for sanntidsavbildning er vanligvis tilstrekkelig liten til å sikre en høy oppdateringsfrekvens. Dermed er det ofte en avveining mellom å oppnå et bredt synsfelt og sanntidsbildebehandling. Tidligere ble to forskjellige systemer brukt til bredfeltsavbildning eller sanntidsbilder, separat.
Dette arbeidet rapporterer en dobbel raster-skanning fotoakustisk imager (DRS-PAI), som integrert wide-field imaging basert på en todimensjonal motorisert oversettelsesstadium og sanntidsbildebehandling basert på en to-akset galvanometer skanner. Wide-field imaging mode (WIM) utføres for å vise vaskulær morfologi. For sanntidsbildemodus (RIM) er det for øyeblikket to funksjoner. Først kan RIM gi B-skannebilder i sanntid. Ved å måle forskyvningen av vaskulatur langs dybderetningen, kan egenskapene til åndedrett eller puls avsløres. For det andre kan RIM kvantitativt måle det spesifikke området i WIM-bildet. Ved å gi sammenlignbare bilder av lokale WIM-regioner, kan detaljene for den lokale endringen bli nøyaktig avslørt. Systemet utformer en fleksibel overgang mellom bredfeltsavbildning av vaskulær visualisering og sanntidsavbildning av den lokale dynamikken. Systemet er ønskelig i grunnleggende biomedisinsk forskning der det er behov for smådyravbildning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med retningslinjer gitt av institusjonell dyrepleie og brukskomité ved South China Normal University, Guangzhou, Kina.
1. Systemoppsett
- Optisk bane (Figur 1)
- Bruk en 532 nm pulslaser som systemlaserkilde. Sett repetisjonshastigheten til laseren til 10 kHz, utgangsenergien til 100 % og utløserinnstillingen til ekstern utløser ved hjelp av et brukerdefinert program.
- Par laserstrålen til en-modus fiber (SMF) via en optisk fiber koblet (FC1). Collimate laserstrålen ved hjelp av en optisk fiber collimator (FC2) på en todimensjonal motorisert scene (Motor, maksimal hastighet: 20 mm / s).
- Avbøy laserstrålen ved hjelp av en toakset galvanometerskanner (Galva). Bruk et flyttbart speil (M1) til å reflektere strålen. Fokuser strålen gjennom en 4× objektivobjektiv (OL, numerisk blenderåpning: 0,1).
- Bruk en XY oversetter mount (TM) for å fikse den selvproduserte hule ultralydtransduseren (UT, Sentral frekvens: 25 MHz; Båndbredde: mer enn 90%; Midthull: 3 mm) på bunnen av OL12. Pass den fokuserte strålen gjennom det midterre hullet i ultralydtransduseren.
- Skannebane
- Lås Galva ved hjelp av en feltprogrambar portmatrise (FPGA 2) under WIM. Angi riktig skanneområde og skannehastighet etter et brukerdefinert program.
- Lås motoren ved hjelp av en feltprogrambar portmatrise (FPGA 1) under RIM. Angi skannefrekvensen og antall skannepunkter ved hjelp av FPGA 2. Bruk et brukerdefinert program til å kontrollere start- og stoppskanningen.
- Innhenting av data
- Bruk en 50-dB forsterker (AMP) til å forsterke PA-signalet. Digitaliser signalet med datainnhentingskortet (DAQ). Få tak i utløsersignalet via FPGA 1 eller FPGA 2.
- Bruk en grafikkbehandlingsenhet (GPU) til å behandle data og vise bilder parallelt13.
- CCD-bildebehandlingssystem
- Bruk en ringformet hvit LED (Fargetemperatur: 6500 K; Belysning: 40000 lux; Diameter: 7,5 cm) som lyskilde. Fjern M1, bruk et fast speil (M2) for å reflektere lyset.
- Ta opp bildene ved hjelp av et CCD-kamera (6,3 millioner piksler) på PA-bildesystemet. Vis bildene med en skjermprogramvare.
2. Systemjustering
- Velg en vanntank (10 cm × 10 cm × 4,4 cm; bunnvindu: 3 cm × 3 cm). Dekk hele vanntanken med en polyetylenmembran (membran tykk: 10 μm). Tilsett tilstrekkelig ultrarent vann.
- Plasser vanntanken på arbeidsstadiet.
- Slå på laserbryteren. Velg laserkontrollprogrammet. Forvarm i 5 min. Trykk på "ON"-knappen på pumpebryteren. Angi laserparametrene i henhold til trinn 1.1.1. Åpne laserens hvelv.
- Velg det innsamlede programmet for A-linje. Trykk på "Start" -knappen for å fange enkeltpunktsignalet og vise amplitud og spektrum av gjeldende A-linjesignal.
- Plasser et blad nederst i vanntanken. Senk den nederste delen av UT ned i vanntanken for akustisk kobling. Unngå bobler i den nederste delen av UT.
- Juster posisjonen til Galva, juster XY oversetter mellom UT og OL for å unngå oscillasjonssignal, og sørg for at dette er konfokalt.
- Juster høyden på arbeidsstadiet for å maksimere amplituden på signalet, og bestem fokusposisjonen.
3. Dyreeksperiment
- Bruk en 5\u20126 uker gammel BALB/c mus med en kroppsvekt på 20\u201230 g.
- Bedøve dyret ved hjelp av uretin (1 g/kg) injisert intraperitonealt før forsøket.
- Gjennomføre overgangen mellom WIM og RIM.
- Bruk en planar ultralyd transduser. Barber pelsen på baksiden av musen ved hjelp av en trimmer og hårfjerningskrem. Plasser musen på holderen (8 cm × 2,8 cm × 2 cm) i utsatt stilling.
- La bildeområdet være i kontakt med polyetylenmembranen ved hjelp av ultralydgel. Unngå bobler i kontaktdelen.
- Plasser holderen på arbeidsstadiet for akustisk kobling. Følg trinn 2.3\u20122.4 for å starte laseren og samle A-linjesignal. Følg trinn 2.6\u20122.7 for å justere. Trykk på "Stopp" for å avslutte samlingen etter justering.
- Velg WIM-programmet. Gi den nyopprettede mappen et navn. Sett skanneparameteren til 20 mm/s i kategorien "Skannehastighet", "20 mm*20 mm" i kategorien "Skanneområde" og "20" i "Trinn" -fanen. Klikk på Samle knapp for å begynne å skanne.
- Klikk stoppknappen for å avslutte skanningen etter anskaffelse. Klikk Gå tilbake til null for å bringe motoren til null. Lukk laserhvelvet. Sett utløserinnstillingen til intern utløser. Trykk på AV-knappen for pumpebryter.
- Bytt WIM-utløseren som RIM-utløser og koble den til den eksterne laserutløseren. Trykk på PÅ (ON)-knappen for pumpebryter. Sett utløserinnstillingen til den eksterne utløseren. Klikk på Avslutt-knappen for å avslutte WIM-programmet.
- Bruk trinn 2.4 til å samle inn A-linjesignalet. Åpne laserhvelvet. Følg trinn 2.6\u20122.7 for å justere. Trykk på Stopp for å avslutte samlingen etter justering.
- Velg RIM-programmet. Gi den nyopprettede mappen et navn. Klikk på Samle knapp for å begynne å skanne.
- Klikk stoppknappen for å avslutte skanningen etter at du har fullført anskaffelsen. Klikk på Avslutt-knappen for å avslutte RIM-programmet.
- Euthanize dyret ved hjelp av cervical forvridning ved avslutningen av avbildningen.
- Utukning av WIM av vaskulær visualisering.
- Bruk en fokusert ultralydtransduser (Sentral frekvens: 25 MHz; Båndbredde: mer enn 90%; Brennvidde: 8 mm). Fjern håret til mus øre eller hodebunn.
- Bruk en skalpell for å gjøre et lite snitt på sidesiden av den kraniale temporale toppen av musen (dybde til skallen). Bruk oftalmisk saks for å starte fra dette snittet. Skjær hodebunnen rundt den ytre siden av skallen. Komprimer blødningspunktet for å stoppe blødningen. Vask såret med normal saltvann. Plasser musen på holderen.
- La bildeområdet være i kontakt med polyetylenmembranen ved hjelp av ultralydgel. Unngå bobler i kontaktområdet (Tilleggstall 1).
- Plasser holderen på arbeidsstadiet for akustisk kobling. Bruk trinn 2.3\u20122.4 til å åpne laser og samle inn A-linjesignal. Bruk trinn 2.6\u20122.7 til å justere. Trykk på Stopp for å avslutte samlingen etter justering.
- Velg WIM-program. Gi den nyopprettede mappen et navn. Sett skanneparameteren til "10 mm/s" i kategorien "Skannehastighet", "10 mm*10 mm" under kategorien "Skanneområde" og "10" i "Trinn" -fanen. Klikk på Samle knapp for å begynne å skanne.
- Klikk stoppknappen for å avslutte skanningen etter at du har fullført anskaffelsen. Klikk på Gå tilbake til null for å få motoren tilbake til null. Klikk på Avslutt-knappen for å avslutte WIM-programmet.
- Euthanize dyret ved avslutningen av prosedyren mens dyret er fortsatt under anestesi.
- Bruk en fokusert ultralydtransduser (Sentral frekvens: 25 MHz; Båndbredde: mer enn 90%; Brennvidde: 8 mm). Fjern håret til mus øre eller hodebunn.
- Utukne RIM for dynamisk overvåking av små dyr.
- Barber håret i muselivet. Plasser musen på holderen i liggende stilling.
- La bildeområdet være i kontakt med polyetylenmembranen ved hjelp av ultralydgel. Unngå bobler i kontaktområdet.
- Plasser holderen på arbeidsstadiet for akustisk kobling. Utfør trinn 2.3\u20122.4 for å starte laseren og samle inn A-linjesignal. Utfør trinn 2.6\u20122.7 for å justere. Trykk på Stopp for å avslutte samlingen etter justering.
- Velg RIM-programmet. Gi den nyopprettede mappen et navn. Klikk på Samle knapp for å begynne å skanne.
- Klikk stoppknappen for å avslutte skanningen etter at du har fullført anskaffelsen. Klikk på Avslutt-knappen for å avslutte RIM-programmet.
- Bruk RIM-dataene til rekonstruksjon av den maksimale amplitudeprojeksjonen (MAP) langs dybderetningen etter brukerdefinert program. Vær oppmerksom på de dynamiske endringene i dyret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Skjematisk for DRS-PAI er vist i figur 1. Systemet tillater fleksibel og repeterbar veksling mellom WIM med RIM. Det oppkjøpte PA-signalet behandles raskt for å generere PA B-Scan- og MAP-bilder. CCD-kameraet kan gi fotografier av prøver.
Alle komponentene i DRS-PAI er integrert og montert i et imageroppsett (figur 2), noe som gjør det enkelt å montere og betjene. I WIM brukes kontinuerlig rasterskanning av et todimensjonalt motorisert stadium. Signalet fra løpefasen registreres. Datainnsamlingen fortsatte under ensartet oversettelse av scenen. I RIM ble en toakset galvanometerskanner brukt. Dataene ble samlet inn synkront med Galva-skanningen (figur 3).
Her ble de vaskulære bildene av prøver med hver bildemodus samlet inn. Figur 4A viser MAP-bildet av musen tilbake i WIM. Bildetiden var ca 33 min. Figur 4B viser B-skannebilder av musen tilbake under RIM. Hele prosessen med RIM vises i Video 1. Deretter ble en fokusert ultralydtransduser brukt. De vaskulære nettverkene til museøret og hjernen er vist i figur 5. Bildetiden var ca 16 min. Dette demonstrerer drs-PAIs evne til å bilde av bredfeltsvaskulatur. I tillegg viser figur 6A at bildeområdet inneholder et fartøy. Bildeområdet til RIM er ca 100 μm på grunn av bruk av den fokuserte ultralydtransduseren. Forskyvningsbildet langs dybderetningen til muselivet versus tiden er vist i figur 6B. Video 2 viser prosessen med vaskulær forskyvning og oppnå gjeldende puls eller respirasjonskurve.
Figur 1: Skjematisk for DRS-PAI-systemet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Utformingen av DRS-PAI-systemet.
Bildetav DRS-PAI-systemet. (B) Panelet viser et bilde av oppsettet for laserbanemontering. (C) Panelet viser 3D-modellen for laserbanemontering. (D)Panelet viser toakse rask galvanometer skannerenhet. (E) Panelet viser probeenheten. (F) Panelet viser ccd optisk baneenhet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Oppsettet av skanning for ulike bildemoduser.
(A)Skannebanen til WIM. (B)Skannebanen til RIM. (C) Utløseroppsettet for to bildemoduser. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Den fotoakustiske WIM og FELG på musen tilbake.
(A)KART-bildet av musen tilbake i WIM. (B)B-Scan-bildene av musen tilbake i RIM. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Den fotoakustiske WIM av en mus.
(A)KART-bildet av museøret i WIM. (B)KART-bildet av musehjernen i WIM. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Den fotoakustiske KANTEN av muselivet.
(A)B-skannebildene av muselivet i RIM. (B)MAP-bildet langs dybderetningen til muselivet kontra tid i RIM. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Video 1: Prosessen med RIM av musen tilbake. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
Video 2: Prosessen med MAP-bilde langs dybderetningen til muselivet kontra tid. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
Tilleggsfigur 1: Den delen av bildeområdet i kontakt med polyetylenmembranen. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her presenterte vi en dobbel rasterskanning fotoakustisk smådyrbilder for ikke-invasiv vaskulær visualisering som ble designet og utviklet for å fange strukturen i vaskulaturen og den relaterte dynamiske blodendringen. Fordelen med DRS-PAI er at den integrerer WIM og RIM i ett system, noe som gjør det lettere å studere vaskulær dynamisk og vaskulær nettverksstruktur av små dyr. Systemet kan gi høyoppløselig bredfeltvaskulær visualisering og bloddynamikk i sanntid.
I dagens system ble den optiske eksitasjonen implementert med en enkeltbølgelengdelyskilde. Et fremtidig multibølgelengdesystem ville gi andre parametere som blod oksygenmetning. Videre kan en spesiell bildebehandlingsalgoritme utvikles for kvantitativ analyse, inkludert estimering av vaskulær diameter, vaskulær tetthet, vaskulær tortuositet, etc. Den kvantitative analysen kan gi verdifull informasjon for tidlig diagnose og behandling av sykdommer.
Oppsummert gjør systemet det mulig for forskere å oppnå høydimensjonal fysiologisk og patologisk innsikt i smådyrforskning med biomedisinsk relevans. Systemet kan tilpasses de fleste smådyrforskningsinnstillinger, inkluderer, men ikke begrenset til, avbildning av angiogenese, tumormikromiljøer, hemodynamic, funksjonelle forbindelser i hjernen, mikrosirkulasjon, legemiddelresponser og terapiresponser. Kritiske trinn i protokollen inkluderer utformingen av den doble skannestrukturen, den konfokale justeringen av det optiske og akustiske fokuset i WIM, og midtpunktjustering av lydfeltet i RIM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle dyreforsøk ble utført i henhold til de godkjente retningslinjene og forskriftene til Institutional Animal Care and Use Committee. Forfatterne har ingen relevante økonomiske interesser i manuskriptet og ingen andre potensielle interessekonflikter å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å anerkjenne den økonomiske støtten fra National Natural Science Foundation of China (61822505; 11774101; 61627827; 81630046), The Science and Technology Planning Project of Guangdong Province, Kina (2015B020233016) og The Science and Technology Program of Guangzhou (nr. 2019020001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 bit multi-purpose digitizer | Spectrum | M3i.3221 | Data acquisition card |
| A-line collected program | National Instrument | LabVIEW | User-defined program |
| Amplifier | RF Bay | LNA-650 | Amplifier |
| Depilatory Cream | Veet | 33-II | Animal depilatory |
| Fiberport Coupler | Thorlab | PAF-X-7-A | Fiber Coupler |
| Field Programmable Gate Array | Altera | Cyclone IV | Trigger Control |
| Fixed Focus Collomation Packages | Thorlabs | F240FC-532 | Fiber Collimator |
| Foused ultrasonic transducer | Self-made | ||
| Graphics Processing Unit | NVIDIA | GeForce GTX 1060 | Processing data |
| Holder | Self-made | Animal fixation | |
| Laser control program | National Instrument | LabVIEW | User-defined program |
| Mice | Guangdong Medical Laboratory Animal Center | BALB/c | Animal Model |
| Microscope camera | Mshot | MS60 | CCD camera |
| Microscope Objective | Daheng Optics | GCO-2111 | Objective Lens |
| Mirror | Daheng Optics | GCC-1011 | Moveable/Fixed Mirror |
| Moving Magnet Capacitive Detector Galvanometer Scanner | Century Sunny | S8107 | real-time scanner |
| Mshot image analysis system | Mshot | Display software | |
| Normal Saline | CR DOUBLE-CRANE | H34023609 | Normal Saline |
| Ophthalmic Scissors | SUJIE | Scalp Remove | |
| Planar ultrasonic transducer | Self-made | ||
| Plastic Wrap | HJSJLSL | Polyethylene Membrane | |
| Program Control Software | National Instrument | LabVIEW | User-defined Program |
| Pulsed Q-swithched Laser | Laser-export | DTL-314QT | 532-nm pulse Laser |
| Real-time imaging program | National Instrument | LabVIEW | User-defined program |
| Ring-shaped white LED | Self-made | ||
| Shaver | Codos | CP-9200 | Animal Shaver |
| Single-Mode Fibers | Nufern | 460-HP | Single-mode fiber |
| Surgical Blade | SUJIE | 11 | Blade |
| Surgical Scalpel | SUJIE | 7 | Scalp Remove |
| Translation Stage | Jiancheng Optics | LS2-25T | wide-field scanning stage |
| Ultrasonic Transducer | Self-made | ||
| Ultrasound gel | GUANGGONG PAI | ZC4252418 | Acoustic Coupling |
| Urethane | Tokyo Chemical Industry | C0028 | Animal Anestheized |
| Water tank | Self-made | ||
| Wide-field imaging program | National Instrument | LabVIEW | User-defined program |
| XY Translator Mount | Self-made |
References
- Li, L., et al. Single-impulse panoramic photoacoustic computed tomography of small-animal whole-body dynamics at high spatiotemporal resolution. Nature Biomedical Engineering. 1 (5), 0071 (2017).
- Jeon, S., Kim, J., Lee, D., Baik, J. W., Kim, C. Review on practical photoacoustic microscopy. Photoacoustics. 15, 100141 (2019).
- Baik, J. W., et al. Super wide-field photoacoustic microscopy of animal and humans in vivo. IEEE Transactions on Medical Imaging. 39 (4), 975-984 (2019).
- Omar, M., Aguirre, J., Ntziachristos, V.
- Lin, L., et al. Single-breath-hold photoacoustic computed tomography of the breast. Nature Communications. 9 (1), 2352 (2018).
- Yang, F., et al. Wide-field monitoring and real-time local recoding microvascular networks on small animals with a dual-raster-scanned photoacoustic microscope. Journal of Biophotonics. 13 (6), 202000022 (2020).
- Sun, J., Zhou, Q., Yang, S. Label-free photoacoustic imaging guided sclerotherapy for vascular malformations: a feasibility study. Optics Express. 26 (4), 4967-4978 (2018).
- Xu, D., Yang, S., Wang, Y., Gu, Y., Xing, D. Noninvasive and high-resolving photoacoustic dermoscopy of human skin. Biomedical Optics Express. 7 (6), 2095-2102 (2016).
- Zhang, W., et al. Miniaturized photoacoustic probe for in vivo imaging of subcutaneous microvessels within human skin. Quantitative Imaging in Medicine and Surgery. 9 (5), 807-814 (2019).
- Chen, Q., et al.
- Lan, B., et al. High-speed widefield photoacoustic microscopy of small-animal hemodynamics. Biomedical Optics Express. 9, 4689-4700 (2018).
- Ma, H., Yang, S., Cheng, Z., Xing, D. Photoacoustic confocal dermoscope with a waterless coupling and impedance matching opto-sono probe. Optics Letters. 42 (12), 2342-2345 (2017).
- Kang, H., Lee, S. W., Lee, E. S., Kim, S. H., Lee, T. G. Real-time GPU-accelerated processing and volumetric display for wide-field laser-scanning optical-resolution photoacoustic microscopy. Biomedical Optics Express. 6 (12), 4650-4660 (2015).
