Summary
여기서, 우리는 세포막에 금 나노로드 (AuNRs)의 역학을 감시하기 위하여 전통적인 암장 현미경 검사법의 사용을 보여줍니다. 단일 AuNR의 위치와 방향은 ImageJ 및 MATLAB을 사용하여 감지되며 AuNRs의 확산 상태는 단일 입자 추적 해석을 특징으로 합니다.
Abstract
세포막에 나노 입자의 확산 역학을 분석하는 것은 세포 섭취 과정을 더 잘 이해하는 데 중요한 역할을하며 나노 의학 전달의 합리적 설계를위한 이론적 근거를 제공합니다. 단일 입자 추적(SPT) 분석은 세포막에 개별 나노 입자의 위치와 방향을 조사하고 그들의 번역 및 회전 상태를 나타낼 수 있었습니다. 여기에서, 우리는 살아있는 세포막에 금 나노로드 (AuNRs)의 역학을 감시하기 위하여 전통적인 암장 현미경 검사를 사용하는 방법을 보여줍니다. 또한 ImageJ 및 MATLAB을 사용하여 AuN의 위치와 방향을 추출하는 방법과 AuNR의 확산 상태를 특성화하는 방법을 보여줍니다. 수백 개의 입자의 통계 적 분석은 단일 AuNRs가 U87 MG 세포막의 표면에 브라운 운동을 수행한다는 것을 보여줍니다. 그러나 개별 적인 긴 궤적 분석은 AuNRs가 멤브레인, 즉 장거리 운송 및 제한된 면적 감금에 두 가지 유형의 모션 상태를 가지고 있음을 보여줍니다. 우리의 SPT 방법은 잠재적으로 다른 생물학적 세포에 있는 표면 또는 세포내 입자 확산을 연구하기 위하여 이용될 수 있고 복잡한 세포 기계장치의 조사를 위한 강력한 공구가 될 수 있습니다.
Introduction
멤브레인상 나노입자(NPs)의 역학은 세포 기능, 바이러스 또는 세균 감염 및 인공 나노 의료 전달 시스템의 개발에 필수적인 세포 섭취 과정과 밀접한 관련이 있다1,2. 단일 입자 추적(SPT) 기술은 NPs3,4의이기종 동작을 특성화하는 강력한 도구이다. 일반적으로, 세포막은 단백질 및 지질과 같은 성분이 혈장 막평면5,6,7에서측면으로 이동할 수 있음을 의미하는 유체이다. 멤브레인 조직과 구조의 현면복잡성은 NP와 멤브레인 간의 상호 작용의 현면적 이질성으로 이어질 수 있다. 따라서 멤브레인에서 의한 NPs 의 움직임을 직접 시각화하려면 높은 공간 및 시간적 해상도가 필요합니다.
수십 나노미터의 공간 분해능과 밀리초의 시간 분해능을 가진 살아있는 세포에서 개별 입자의 국소화를 모니터링하는 단일 입자 추적 현미경 검사법은 NPs 또는 멤브레인 분자 역학8,9를연구하기 위해 잘 개발되었다. 형광계 현미경 이미징 기술은 살아있는 세포 환경에서 NPs/분자를 관찰하기 위한 귀중한도구가 되었다9,10,11,12. 예를 들어, 높은 스피처럴 분해능을 가진 기판/용액 인터페이스에서 시료의 얇은 층(~100nm)을 이미지하는 총 내부 반사 형광 현미경검사법은 멤브레인 분자 역학13,14의연구에 널리 사용되고 있다. 그러나, 낮은 강도및 신속한 돌이킬 수 없는 광표백과 같은 단일 형광의 내재된 단점은추적13의정확도와 지속시간을 감소시다. 따라서 형광 프로브를 대체하는 비형성 플라스모닉 PPs는 독특한 광학특성(15)으로인해 장기 이미징 연구에서 점점 더 많은 관심을 받고 있다. 플라스모닉 NP 프로브의 산란 신호에 기초하여, 여러 종류의 광학 현미경 이미징 기술은 암야 현미경 검사법(DFM)16,간섭 성 산란(iSCAT) 현미경 검사법(DICM)18과같은 생물학적 과정의 메커니즘을 연구하기 위해 사용되어 왔다. 또한, AuNRs의 동작 및 회전 역학은 DFM 및 DICM18,19,20,21,22를사용하여 얻을 수 있다. 전형적으로, SPT 실험에서, 물체의 움직임은 광학 현미경에 의해 기록된 다음 SPT 분석 방법3에의해 분석된다. 개별 NP에 의해 생성된 시간 해결 궤적 및 방향 각도는 일반적으로 스토카스틱및 이기종이므로 다양한 분석 방법으로 풍부한 동적 정보를 제시할 필요가 있습니다.
여기서는 DFM을 사용하여 세포막에 대한 AuNRs의 역학을 모니터링하고 ImageJ 및 MATLAB을 사용하여 AuNRs의 위치와 방향을 추출하고 SPT 분석 방법으로 AuNRs의 확산을 특징으로하는 통합 프로토콜을 제공합니다. 시연으로, 우리는 U87 MG 세포막에 수정되지 않은 AuNRs (CTAB-AuNRs, 보호 에이전트로 cetyltrimelammonium 암모늄 브로마이저 분자에 의해 합성)의 역학을 시각화하기 위해 SPT 프로토콜을 사용하는 방법을 여기에 보여줍니다. CTAB-AuNRs가 생물학적 환경에서 단백질을 흡착하고 세포막으로 이동한 다음 세포2,20,22를입력할 수 있음을 입증하였다. U87 MG 세포는 중추 신경계의 가장 일반적이고 가장 악성 종양이며, 그 막 수용체는 비정상적으로 발현된다. 멤브레인 수용체는 AuNRs의 역학에 영향을 미치는 AuNRs의 단백질과 상호 작용할 수 있습니다. 우리의 프로토콜은 일반적으로 생물학 분야의 다른 SPT 실험에 적용됩니다.
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Protocol
1. 세포 배양
- 태아소 혈청을 추가하여 U87 MG 세포에 대한 완전한 배지 준비(최종 농도 10%) 및 페니실린 연쇄 절제술 (최종 농도 1%) 최소 필수 매체(MEM)에. 세포 하위 문화에 플라스틱 세포 배양 접시를 사용합니다.
- 통로 세포는 일주일에 2 ~ 3 번.
- 배양 배지를 제거하고 덜벡코의 인산완충식염(D-PBS)으로 세포층을 헹구면 컨실루(80%~90%)가 2~3배 나 늘어서 있다.
- 세포 배양 접시에 Trypsin-EDTA 용액의 1.0 내지 2.0 mL을 추가하고 세포가 둥글게 될 때까지 반전된 현미경으로 세포를 관찰한다(3~5분).
- 준비된 완전한 배지의 3.0mL를 추가하고 부드럽게 파이펫팅하여 셀을 분산시십시오.
- 신선한 세포 배지 (3 mL)와 새로운 배양 접시에 셀 서스펜션 (1 mL)을 추가하고 세포를 다시 중단합니다.
- 가습된 대기에서 세포를 37°C 및 5% CO2로 유지한다.
2. 현미경 슬라이드 준비
참고: 높은 활성을 가진 3~10세대의 U87 MG 세포는 SPT 실험에 사용된다.
- 22mm × 22mm 커버립을 이미 피라냐 용액으로 세척하여 에탄올(99.9%)에 담그고 살균하고 있습니다.
- 집게를 사용하여 에탄올 용액(2.1단계)에서 커버 슬립을 꺼내 화염에 에탄올을 연소하여 살균합니다. 모든 에탄올이 연소되면, 2mL의 세포 배지(페놀 레드 없음)로 채워진 플라스틱 세포 배양 접시(35 x 10mm)에 덮개를 놓습니다.
- 커버슬립에 1.2.3 단계에서 셀 서스펜션의 50 μL을 추가하고 접시를 앞뒤로 그리고 좌우로 부드럽게 밀어 세포를 고르게 분배합니다. 가습된 분위기에 놓습니다.
- 커버슬립의 U87 MG 셀이 20%-40%의 합류(~12시간)에 도달하면 CTAB-AuNR(138pM)의 20μL을 접시에 넣고 분산시니다. 가습 된 분위기에서 5 분 동안 배양하십시오.
- 피라냐 용액으로 세척되는 홈글래스슬라이드(도 1)의홈에 2.4단계에서 접시로부터 배양 배지(페놀 레드 없음)의 100μL을 첨가한다.
- 접시에서 커버 슬립을 꺼내 현미경 유리 슬라이드의 홈 상단에 반전(그림 1). 매니큐어로 밀봉하고 건조하게하고 SPT 실험을 수행하기 위해 무대에 놓습니다.
3. 암장 현미경 검사법으로 단일 입자 추적 실험을 수행(그림 1).
- 기름에 침지된 암야 콘덴서(NA 1.43-1.20)에 오일 한 방울을 놓고 노브를 돌려 응축기가 유리 슬라이드에 접촉하도록 합니다.
- 커버 글래스 위에 오일 한 방울을 넣고 초점 손잡이를 돌려 60배 오일 침수 목표(NA 0.7-1.25)가 오일을 만지도록 합니다.
- 광원을 켜고 초점 손잡이를 약간 돌려 이미징 평면에 초점을 맞춥니다.
참고: 시야에서 배경은 검고, 셀은 밝고, CTAB-AuNRs(종횡비~2:1, 그림 2)는작은 색(빨간색, 노란색 또는 녹색) 산란반입니다. - 컬러 CMOS 카메라로 샘플 산란 라이트를 캡처합니다. TIFF 형식을 기록하고 내보내 이미지를 저장하려면 소프트웨어에서"카메라 아이콘"을클릭합니다.
4. 데이터 수집
- 단일 장기 궤적 추출
- 그림 3에 설명된 대로 작동하여 시계열 다크 필드 이미지를 "RGB 색상" 모드에서 "8비트" 모드로 변환합니다. 이미지 J 클릭 이미지 | | 유형 8 비트. 대비를 조정하려면 이미지를 클릭| 조정 | 밝기 | 대비.
- 대상 파티클을 선택하고"Ctrl+X"로배경을 권투하고 삭제하여 타임시리즈 배경을 차단합니다.
- "플러그인 | 클릭하여 파티클 감지 및 파티클 연결 창을엽니다. 입자 추적기 클래식 | 파티클 트래커".
- 반경을 6으로 설정하고, 0으로, 백분위수는 0.01%로 설정합니다.
참고: 파티클을 감지하려면 미리 보기를 사용하여 세 가지 매개 변수 이상으로 조정합니다. 반경이 대상 파티클보다 약간 크고 가장 작은 파티클 간 분리보다 작은지 확인합니다. 백분위수는 후보 입자인 강도 분포의 하한입니다. - 링크 범위를 5로 설정하고 변위를 10으로 설정합니다.
참고: 파티클을 연속 인접 프레임 간에 연결하려면 위의 두 매개 변수를 조정합니다. 변위는 파티클이 두 개의 후속 프레임 사이에서 이동할 수 있는 최대 픽셀이며, 링크 범위는 최상의 일치를 결정할 때 고려해야 할 연속 프레임 수입니다. - "확인"을클릭하여 ParticleTracker 결과 창을 열어 결과를 확인합니다.
- "모든궤적을 시각화"를클릭하여 생성된 궤적을 검사합니다.
- 소프트웨어생성 궤도가 AuNR의 이동 궤적과 일치하지 않는 경우 상단에 있는"입자 재링크"메뉴를 클릭하여 감지된 입자를 서로 다른 링크 범위 및 백분위수 매개변수로 다시 연결합니다.
- 소프트웨어가 생성된 궤적과 AuNR의 이동 궤적이 일치하는 경우 결과를 저장하려면"전체 보고서 저장"을클릭합니다.
참고: 이미지 J로 단일 장기 궤적을 추출하는 예가 도 4에표시됩니다.
- 다중 궤적 추출
참고: 피지와 다중 궤적을 추출하는 예는 그림 5에표시됩니다. 여러 단계가 있으며 각 단계는 추적 프로세스의 단계를 구성합니다. 각 단계의 결과가 즉시 표시되므로 출력이 만족스럽지 않을 때 사용자가 다시 설정을 재조정할 수 있습니다.- 그림 3에 설명된 대로 작동하여 시계열 다크 필드 이미지를 "RGB 색상" 모드에서 "8비트" 모드로 변환합니다. 이미지 J 경로클릭"이미지 | | 유형 8 비트". 대비를 조정하려면"이미지 | 클릭합니다. 조정 | 밝기 | 대비".
- "플러그인 | 클릭하여 시작패널을 엽니다. 추적 | 트랙메이트". 클릭 "다음".
- 드롭다운 메뉴에서"LoG 검출기"를선택하고다음"를 클릭합니다.
- 검출기 구성 패널의 매개 변수를 조정합니다. 예상 Blob 직경을 10으로 설정하고 임계값을 0으로 설정하고"하위 픽셀 지역화 수행"을선택합니다.
- "다음"을클릭하여 초기 스팟 필터링 패널을 엽니다.
참고: 여러 매개 변수를 조정하여 대상 점을 더욱 최적화할 수 있습니다. 이 예제에서는 다른 매개 변수가 조정되지 않았습니다. - 드롭다운 메뉴에서"다음"을클릭하고"하이퍼스택 디스플레이"를선택합니다.
- 스팟 필터링 패널을 열려면다음 "다음"을클릭합니다. 품질은 1.88, X 38.86 이상, Y를 56.54 이상으로 설정합니다.
- 드롭다운 메뉴에서"다음"을클릭하고"간단한 LAP 트래커"를선택합니다. 세 가지 매개 변수, 즉 연결 최대 거리 = 15, 갭 클로징 최대 거리 = 15 및 갭 클로징 최대 프레임 간격 = 5를 조정하여 간단한 LAP 트래커를 구성합니다.
참고: 최대 연결 거리는 두 프레임 사이의 점의 최대 변위입니다. 간격 닫기 최대 거리는 두 세그먼트의 최대 변위입니다. 간격 을 닫는 최대 프레임 간격은 브리지할 두 점 사이의 가장 큰 프레임입니다. - 추적하려면 "다음"를 클릭합니다. 완료되면 계속 클릭하십시오 "다음".
- 트랙의 스팟 수를 300 이상으로 설정하는 등 트랙의 필터를 설정합니다.
- 마지막 저장 패널이 열릴 때까지"다음"을계속 클릭합니다. 드롭다운 메뉴에서"XML 파일로 트랙 내보내기"를선택한 다음"실행"을클릭하여 csv 형식으로 저장합니다.
- R/G 값
참고: R 및 G 채널에서 표적 AuN의 산란 강도는 MATLAB(https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020/tree/master/RGandPolarangle)에 작성된 코드를 사용하여 색상 암필드 이미지에서 얻어지며 추출 원리는 도 6에제시된다.- x-y 좌표(ImageJ/Fiji에서 추출)에 따라 각 프레임에서 AuNR의 중앙 픽셀 좌표를 찾으려면 xy.m coordination함수를 사용합니다.
- RG추출.m 기능을 사용하여 3 x 3 픽셀 행렬을 제한하고 R 또는 G 채널의 9 산란 강도 값을 추출하고 평균 값(μ R 또는 G로 정의됨)을 계산합니다.
참고: 3 x 3 픽셀 행렬은 4.3.1 단계에서 얻은 픽셀 좌표를 중심으로 합니다.
- 극각
참고: 극각은 AuNR의 경도와 광학 축(도 1에도시된 대로)의 각도로 AuNR의 공간(Z 축) 회전 역학을 반영할 수 있습니다.- 극지의 기능을 사용하여.m 이중 채널 차동방법(22)에의해 극지 각도(θ)를 계산한다.
- 극지의 기능을 사용하여.m 이중 채널 차동방법(22)에의해 극지 각도(θ)를 계산한다.
5. 데이터 분석
참고: 체계적이고 견고한 데이터 분석 프레임워크는 SPT 분석 방법의 성능과 효율성을 위해 필수적입니다. MATLAB에 작성된 사용자 지정 소프트웨어가 사용됩니다(https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020/tree/master/Analysis_parameters). 플롯을 그리는 데 그래프 및 분석 소프트웨어(재료 표참조)가 사용됩니다.
- 분석 매개 변수
- 표 1에표시된 수식에 따라 동적 매개 변수를 계산하기 위해 csv_data_extract_dis_vel_ss.m 및 csv_data_MSD.m 스크립트를 사용합니다.
참고: 이러한 매개 변수는 AuNRs의 역학을 분석하는 데 사용되며 세 부분으로 구성됩니다. (1) 궤적 관련 매개변수: 변위, 단계 크기, 속도, 교향반(Rg),및 터닝 각도(Ta); (2) MSD 매개 변수: 확산 계수(Dt)및 비정상적인 확산 지수(α); 및 (3) 회전 관련 매개변수: 극지 각도 및 회전 용성(σ).
- 표 1에표시된 수식에 따라 동적 매개 변수를 계산하기 위해 csv_data_extract_dis_vel_ss.m 및 csv_data_MSD.m 스크립트를 사용합니다.
| 측정 | 정의 | 물리적 의미 | |
| 변위 |  |
개체 위치 변경 | |
| 단계 크기 |  |
인접한 두 지점 사이의 거리 | |
| 속도 |  |
오브젝트 모션 속도 | |
| Rg |  |
특정 시간 간격으로 개체의 이동 범위 | |
| Ta |  |
인접한 두 점 사이의 오브젝트의 동작 방향 | |
| Msd |  |
특정 시간 간격의 개체의 평균 이동 거리 | |
| Dt |  |
물체의 확산 능력 | |
| Α | |
일반 확산(α~1) | |
| 극각 |  |
개체의 3D 방향 정보 | |
| Σ |  |
극각 데이터 세트의 분산 정도 | |
표 1: 분석에 사용되는 세 가지 유형의 매개 변수입니다. 여기에는 궤적 관련 파라미터(변위, 단계 크기, 속도, Rg 및 Ta),MSD 파라미터(MSD, Dt 및 α) 및 회전 관련 매개변수(극각 및 회전 용 lability)가 포함됩니다.
- 궤적의 시각적 분석
참고: 궤적 시각화는 입자 모션의 현면적 이질성 및 시간 매핑 궤적, Rg및 Dt매핑 궤적 및 극지 각 매핑 궤적과 같은 동적 파라미터의 궤적(좌표) 분포를 직관적으로 제시할 수 있습니다. 매핑 궤적그래프 및 분석 소프트웨어를 사용하여 그려졌습니다.- X 좌표를 X, y 좌표로 설정하고 시간(Rg,Dt,극지 각도)을 Z로 설정합니다.
- "플롯| 클릭합니다. 분산 플롯 | 색상 매핑 플롯".
- 색상 막대를 추가합니다.
- MSD 분석
참고: MSD분석(23)에의해 입자의 동작 활동 및 동작 모드를 얻을 수 있다. Dt가클수록 입자의 확산 운동이 활성화됩니다. α~1일 때, 입자는 정상적인 확산 운동을 하며, 그렇지 않으면 비정상적인 확산 운동을 수행합니다.- MSD θ 수치
- 시간 간격(θ)을 X, MSD 데이터를 Y로 설정합니다.
- "플롯| 클릭합니다. 분산 플롯"
- "분석 | 클릭하여 데이터 맞춤 피팅 | 비선형 곡선 피팅(함수: Allometricl)".
- MSD θ 이중 로개반스피
참고: 경사가 α 가로채는 MSD θ 이중 로개반스도 피규어는 Dt이며,파티클 모션을 직관적으로 표시할 수 있습니다.- 로지산스믹 시간 간격을 X로 설정하고 로지스름 MSD를 Y로 설정합니다.
- "플롯| 클릭합니다. 분산 플롯".
- "분석 | 클릭하여 데이터 맞춤 피팅 | 선형 곡선 피팅".
- D-θ 그림(MSD/4t)
참고: D=MSD/4θ는 α 시간 θ 및 이상 요인의 함수이며, D θ 그림은 시간에 대한 확산 계수의 변화를 직접 보여줍니다. 시간이 지남에 따라 D가 증가하면 α 1보다 크고 입자는 슈퍼퓨전 동작을 수행합니다.- 로지산시간 간격(θ)을 X로 설정하고 로지스믹 D를 Y로 설정합니다.
- "플롯| 클릭합니다. 분산 플롯".
- "분석 | 클릭하여 데이터 맞춤 피팅 | 비선형 곡선 피팅(함수: "Allometricl")".
참고: 궤적이 짧을수록 확산 추정치의 부정확성이 높아지다. 일반적으로, 긴 간격 시간(> 30 θ)의 MSD θ 분석을 통해 Dt 및 α 수득하였다. 그러나 심플하고 거친 피팅은 모션 세부 사항을 부드럽게합니다. 따라서 짧은 간격 시간(&10 θ)에 대한 MSD θ 분석은 짧은 시간에 입자의 동작 거동을 분석하기 위해 수행되어야 합니다.
- MSD θ 수치
- 통계 분석
- 다중 입자 통계 분석
참고: 다중 입자 통계 분석은 공간 영역에서 입자의 동작 상태를 반영할 수 있으며, 이는 공간 이질성 환경을 간접적으로 나타냅니다. 예를 들어 Dt의 히스토그램이 대규모 분포 또는 다중 피크 분포를 나타내는 경우 파티클의 모션 활동이 이질적이라는 것을 의미합니다.- 동적 매개 변수(예: Dt,Rg,최대 변위)를 Y로 설정합니다.
- "플롯| 클릭합니다. 히스토그램".
- 히스토그램을 두 번 클릭하고 분할 크기 또는 분할 수를 설정합니다. "를 클릭합니다"적용".
- 단일 입자 통계 분석
참고: 단일 입자의 통계 분석은 개별 입자의 동작거동을 표시할 수 있으며, 이는 또한 주변 환경의 현면이질성을 간접적으로 반영합니다.- 여러 프레임
- 단일 긴 궤적의 모든 프레임의 동적 매개 변수(예:T,스텝 크기, 극지 각도)를 계산하고 Origin 테이블에 복사하여 Y로 설정합니다.
- "플롯| 클릭합니다. 히스토그램".
- 히스토그램을 두 번 클릭하고 분할 크기 또는 분할 수를 설정합니다. "를 클릭합니다"적용".
참고: Ta와 스텝 크기 모두 작은 값 분포를 나타내는 경우 파티클은 작은 단계의 초확산 모션을 수행합니다.
- 움직이는 창
- 움직이는 창 방법(11프레임)을 통해 단일 긴 궤적의 모든 프레임의 동적 매개변수(예: Rg,Dt)를계산하고 Origin 테이블에 복사하여 Y로 설정합니다.
- "플롯| 클릭합니다. 히스토그램".
- 히스토그램을 두 번 클릭하고 분할 크기 또는 분할 수를 설정합니다. "를 클릭합니다"적용".
- 여러 프레임
- 다중 입자 통계 분석
- 타임시리즈 분석
참고: 통계 분석은 NP의 동작 상태를 나타낼 수 있으며, 타임시리즈 분석은 모션 동작을 보완으로 제시할 수 있다. 여러 타임시리즈 매개 변수를 결합하면 시간적 및 공간 수준에서 NP의 동작 동작을 구별할 수 있습니다.- Y(변위, 극지 각도 및 Rg)와같은 X, 타임 시리즈 매개 변수로 시간을 설정합니다.
- "플롯| 클릭합니다. 다중 창 다이어그램 | 누적 된 플롯 | 선 + 기호".
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Representative Results
프로토콜에서 수정되지 않은 40 x 85 nm CTAB-AuNR이 사용되었습니다. 도 2B에도시된 바와 같이, 세로 플라스모닉 최대값은 ~650nm(적색 영역)이며 횡방향 공명은 520nm(녹색 영역)이다. 이전 문헌은 플라스모닉 AuNR의 광학 특성(예: LSPR 강도)이 직경20,22로크게 변화할 것이라고 밝혔다. 도 2C에서,U87 세포막에 CTAB-AuNRs에서 산란 강도는 좁은 폭으로 전형적인 가우시안 분포를 보였으며 유리에 CTAB-AuNRs의 분포와 일치했으며, 이는 이 실험에서 추적된 CTAB-AuNRs가 잘 단분산되었다는 것을 나타낸다.
멤브레인에 CTAB-AuNRs의 동적 DFM (12 fps)에 의해 모니터링되었다. 도 7에도시된 바와 같이, 500개 이상의 궤적(궤적 길이가 300프레임을 초과)을 얻었다. 또한 셀당 약 40개의 궤적을 생성할 수 있습니다. 모든 500궤적 의 Rg는 작은 값 분포를 보였으며, 평균Rg는 0.5 μm(SD=0.6 μm)이고 최대 변위도 작은 값(도8)으로더 분포되었다. 모든 500개의 궤적을 두 그룹으로 나눌 수 있습니다: 장거리확산(R g>0.5 μm, 흑색 궤적) 및 제한된 확산(R g&0.5 μm, 적색 궤적).
CTAB-AuNRs의 위치 및 방향에 따라 데이터 분석을 위해 여러 매개 변수가 계산됩니다. SPT 분석 중에 매개 변수를 분석하고 제시할 수 있는 많은 수있습니다. 그림 9A에 표시된 앙상블 시간 평균 MSD 분석은 CTAB-AuNRs가 일반적으로 α~1로 확산됨을 보여줍니다. 그러나, 모든 궤도에서 얻은 Dt-α밀도 분포는, AuNRs의 역학이 초다혈 운동, 브라우니아 운동 및 해체 모션(도9B)을가진 이질분포를 보였다는 것을 보여준다.
다중 입자 통계 분석 외에도 단일 입자(multi-frame) 통계 분석도 수행되었습니다. 도 10은 두 가지 대표적인 장기 궤적을 나타낸다: 밀폐(R g=0.34 μm) 및 이동(Rg=1.48 μm). 극지 매핑 궤적은 제한된 AuNRs의 모션 범위와 극성 각도가 모두 AuN을 이동하는 것보다 작다는 것을 보여주었으며, 이는 AuN과 멤브레인 간의 상호 작용이 강할수록 번역 및 회전 역학의 구속을 더 많이 제공합니다. 이에 상응하여, 두 AuNR의 Ta 및 극각의 히스토그램은 다른 모드를 보였다.
AuNRs의 동작 거동을 추가로 연구하기 위해, 타임시리즈 파라미터는 궤적, 변위, 극지 각 및 Rg를포함하여 분석되었다. 도 11에도시된 바와 같이 시간이 지남에 따라 다양한 패턴이 제시되었다. 장거리 확산 AuNR에 비해, 제한된 AuNR의 회전은 상대적으로 제한되었고, 극성 각도는 10° ~ 40°의 범위에서 분포되어 더 집중되었다. 그러나 움직이는 AuNR의 전체 Rg가 제한된 AuNR의 전체 Rg보다 크지만 AuNR을 이동하는 시계열 Rg는 작습니다. 궤적 점과 변위의 타임시리즈 분포를 결합하면 제한된 영역에서 제한된 AuNR이 이동하는 것을 유추할 수 있지만 짧은 시간에 모션 범위는 멤브레인에 국한된 움직이는 AuNR보다 큽습니다. 전반적으로, 번역 및 회전 역학의 현면이질 분포는 막 조직 및 구조의 공간적 및 시간적 복잡성에 기인한다.
도 1: 암장 현미경 검사법의 광학 경로의 회로도, 현미경 슬라이드 제제 및 AuNRs의 극지 각(θ)을 계산하는 이중 채널 차이 방법. 이미지의 배율 막대는 2 μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: CTAB-AuNRs의 특성화. (A)CTAB@AuNRs TEM 이미지. (B)CTAB@AuNRs LSPR 스펙트럼. (C)단일 입자 강도의 분포 : 유리 (왼쪽 패널)에 CTAB@AuNRs, 플라스몬 멤브레인 (오른쪽 패널)에 CTAB@AuNRs. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 암필드 이미지의 전처리. 타임시리즈 컬러 이미지가 "8비트" 모드로 변환되고 대비가 조정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: ImageJ를 통한 단일 장기 궤적 추출. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 피지와 다궤적의 추출. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: MATLAB을 통해 AuNRs의 R/G 값 추출. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 피지로 추적 U87 MG 세포막에 CTAB@AuNRs 모든 527 궤적. 붉은 궤적(R g&0.5 μm)과 검은 색 궤적(Rg>0.5μm)의 두 그룹이 있었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 모든 527개의 궤적을 통계분석하는 다중 입자. Rg (A)및 최대 변위(B)의분포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9: 모든 527개의 궤적을 MSD 분석합니다. (A)앙상블 타임의 플롯은 α- 로그(Dt)평면에서 평균 MSD 대 θ.(B)밀도 플롯. 색상 코드는 0(파란색)과 1(빨간색) 사이의 궤적의 로컬 밀도를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 10: 단일 입자 통계 분석. (A-B) ImageJ로 추적된 두 개의 대표적인 장기 극지 매핑 궤적. 색상 코드는 0(녹색)과 90(빨간색) 사이의 극성 각도 값을 나타냅니다. 터닝 각도(C-D) 및 극지 각(E-F)의 분포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 11: 시계열 분석. (A,C) 시간 매핑 궤적을 참조하십시오. 빨간색에서 파란색으로 색상은 시간의 방향을 나타냅니다. (B,D) 매개 변수의 시간 시리즈 : 변위 (파란색), 극성 각도 (녹색) 및 gyration의 반경 (Rg,빨간색). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
제시된 프로토콜은 세포막에 AuNRs의 역학을 연구하기 위하여 이용됩니다. 이 프로토콜은 현미경 이미징, 데이터 추출, 동적 매개 변수 계산 및 데이터 분석 방법을 포함한 4개의 부분으로 구성되어 있으며 각 부품은 유연하고 보편적입니다. 따라서, 예를 들어, 멤브레인에 NP 연결 멤브레인 분자의 움직임을 연구하는 많은 가능한 미래의 응용 프로그램, NP 라벨 수용체의 내분비역학, 세포 내 NPs및 소포 코팅 NPs 수송의 동적 분석 등등.
기본 단계는 DFM을 사용하여 세포막에서 AuNRs의 움직임을 이미지화하는 것입니다. 현재, 세포막 역학의 분석을 위한 많은 화상 진찰 기술이 개발되고 있으며, 그 중 형광 현미경 검사법은24로널리 사용되고 있다. 그러나 형광 프로브의 광표백 특성은 오랜 시간 동안 입자 역학을 추적할 수 없게 됩니다. 여기서, 빛 안정 플라스모닉 AuN이 사용되었다. 여러 이미징 기술은 플라스모닉NPs(15)의산란 특성에 기초하여 개발되었다. 특히 경사 조명 모드를 갖춘 DFM은 샘플에서 산란된 빛만 수집하므로 신호 대 잡음 비율이 높습니다.
AuNRs의 번역 및 회전 역학을 모두 획득하고 분석합니다. 대부분의 연구는 멤브레인에 대한 NPs의 위치 변동을 조사하고 방향 변경25의효과를 무시하는 데 중점을 둡니다. 또한, 세포막 평면과 이미징 평면(x-y 평면)은 대부분의 경우 대부분 동일하며, AuNR과 세포막 간의 상호 작용의 차이는 z 방향으로 더 주목할 만하다. 따라서, 아무심 부각없이, 극성 각도는 AuNRs와 세포막 사이의 상호 작용의 분석에 유용합니다. DFM 및 AuNR의 고유 광학 특성에 기초하여, 듀얼 채널 편광 DFM은 AuNRs(I1 + I2 
죄2θ)19,26의방향 정보를 얻기 위해 사용된다. 그럼에도 불구하고 극지 각도의 계산 정확도는 주변 환경의 영향을 크게 받는 최대 및 최소 검출 강도의 영향을 받습니다. 따라서 일부 수정이 필요합니다. 여기서, (R-G)는 극각을 계산하는 데 사용되었고, 내부 참조로서 사용되는 G 값은 체계적인 오류를 효율적으로 감소시키고 측정 정확도를 높일 수 있었다.
중요한 단계는 멤브레인에서 NP의 역학을 분석하는 데 필수적인 데이터 추출 및 동적 파라미터 계산입니다. 멤브레인에 AuNRs의 궤적은 ImageJ /피지를 사용하여 시퀀스 분석에서 높은 공간 해상도27,28로 추출됩니다. R\G 값과 극지 각도는MATLAB(https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020)으로계산됩니다. 여러 매개 변수는 위치 및 극성각도(표 1)에따라 MATLAB을 사용하여 유사하게 계산됩니다. SPT 해석에는 매개 변수 분석 및 디스플레이를 수행하는 여러 가지 방법이 있습니다. 따라서 NP의 역학을 분석하기 위해 가능한 한 많은 분석 방법 및 시각화 도구를 사용한 다음 많은 분석 결과에서 새로운 관점을 요약하고 추출할 필요가 있습니다. 일반적으로, 항상 몇 가지 절충안이 있다, 쉬운 일이 아니다.
포괄적인 분석 방법과 다변량 프레젠테이션 방법을 사용하여 NPs의 동적 상태 및 모션 동작을 위에서 아래로 체계적으로 분석하고 제시할 수 있습니다. 다중 입자 통계 분석을 사용하여 전체 세포막 평면에서 NPs의 앙상블 모션 상태를 얻을 수 있습니다. 형광 이미징29에 기초한 개별 적인 NPs/분자에 대한 동적 연구는 주로 많은 수의 단기 궤적을 모니터링 할 수 있기 때문에이 전반적인 통계 방법을 사용합니다. 그러나 앙상블 평균 메서드는 개별 세부 사항을 매끄럽게 하고 무시합니다. 보충교재로서, 단일 입자 통계 분석은 개별 NPs의 동적 상태를 정량적으로 제시하는 데 사용됩니다. 한편, 시간 함수로서 NPs의 동작 동작을 제공할 수 있는 개별 또는 세그먼트 궤적의 시계열 파라미터 분석을 수행하는 것이 중요합니다.
요약하자면, 우리는 SPT 방법을 가진 살아있는 세포막에 AuNRs의 확산 역학을 연구하기 위한 통합 프로토콜을 제안합니다. AuNRs의 다이내믹은 단일 나노 입자 DFM로 모니터링되었으며 ImageJ 및 MATLAB을 사용하여 추출되었으며 포괄적 인 분석 방법을 특징으로합니다. AuNRs는 U87 MG 세포막에 비정상적인 확산 운동을했고, 그 움직임은 현시성 이질성을 보여줍니다. 이 프로토콜은 잠재적으로 복잡한 생물학적 시스템의 다른 유형의 연구에 사용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 21425519, 91853105 및 21621003의 보조금 번호로 중국의 국립 자연 과학 재단에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CTAB coated gold nanorods(CTAB-AuNRs) | Nanoseedz | NR-40-650 | 85 nm * 40 nm |
| Color CMOS camera | Olympus | DP74 | Japan |
| Coverslips | Citoglas | z10212222C | 22*22 mm |
| Dark-field microscopy | Nikon | 80i | upright microscope |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10099141 | |
| Fiji | National Institutes of Health | 2.0.0-rc-69/1.52 p | a distribution of ImageJ |
| Grooved glass slide | Sail brand | 7103 | Single concave |
| Image J | National Institutes of Health | 1.52 j | |
| MATLAB | MathWorks | R2019b | |
| MATLAB Code | https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020 | ||
| Minimum essential medium (MEM) | Gibco | 10-010-CVR | with phenol red |
| Minimum essential medium (MEM) | Gibco | 51200038 | no phenol red |
| Origin | OriginLab | Origin Pro 2018C | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Plastic cell culture dishes | Falcon | 353002 | |
| Plastic cell culture dishes | Falcon | 353001 | 35*10 mm |
| U87 MG cell | American Type Culture Collection | ATCC HTB-14 | a human primary glioblastoma cell line |
References
- Rees, P., Wills, J. W., Brown, M. R., Barnes, C. M., Summers, H. D. The origin of heterogeneous nanoparticle uptake by cells. Nature Communication. 10 (1), 2341 (2019).
- Behzadi, S., et al. Cellular uptake of nanoparticles: journey inside the cell. Chemical Society Reviews. 46 (14), 4218-4244 (2017).
- Shen, H., et al. Single Particle Tracking: From Theory to Biophysical Applications. Chemical Reviews. 117 (11), 7331-7376 (2017).
- Saxton, M. J.
- Kusumi, A., et al. Dynamic organizing principles of the plasma membrane that regulate signal transduction: commemorating the fortieth anniversary of Singer and Nicolson's fluid-mosaic model. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 215-250 (2012).
- Jacobson, K., Liu, P., Lagerholm, B. C. The Lateral Organization and Mobility of Plasma Membrane Components. Cell. 177 (4), 806-819 (2019).
- Sezgin, E., Levental, I., Mayor, S., Eggeling, C. The mystery of membrane organization: composition, regulation and roles of lipid rafts. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 361-374 (2017).
- von Diezmann, A., Shechtman, Y., Moerner, W. E. Three-Dimensional Localization of Single Molecules for Super-Resolution Imaging and Single-Particle Tracking. Chemical Reviews. 117 (11), 7244-7275 (2017).
- Rosenberg, J., Huang, J. Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (155), e59914 (2020).
- Kusumi, A., Tsunoyama, T. A., Hirosawa, K. M., Kasai, R. S., Fujiwara, T. K. Tracking single molecules at work in living cells. Nature Chemical Biology. 10 (7), 524-532 (2014).
- Rocha, J. M., Gahlmann, A. Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules. Journal of Visualized Experiments. (151), e59387 (2019).
- Uphoff, S., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. Visualizing protein-DNA interactions in live bacterial cells using photoactivated single-molecule tracking. Journal of Visualized Experiments. (85), e511177 (2014).
- Pinaud, F., Clarke, S., Sittner, A., Dahan, M. Probing cellular events, one quantum dot at a time. Nature Methods. 7 (4), 275-285 (2010).
- Mehidi, A., et al. Transient Activations of Rac1 at the Lamellipodium Tip Trigger Membrane Protrusion. Current Biology. 29 (17), 2852-2866 (2019).
- Ye, Z., Wang, X., Xiao, L. Single-Particle Tracking with Scattering-Based Optical Microscopy. Analytical Chemistry. 91 (24), 15327-15334 (2019).
- Pan, Q., Zhao, H., Lin, X., He, Y. Spatiotemporal Heterogeneity of Reactions in Solution Observed with High-Speed Single-Nanorod Rotational Sensing. Angewandte Chemie. International Ed. in English. 58 (25), 8389-8393 (2019).
- Taylor, R. W., et al. Interferometric scattering microscopy reveals microsecond nanoscopic protein motion on a live cell membrane. Nature Photonics. 13 (7), 480-487 (2019).
- Chen, K., et al. Characteristic rotational behaviors of rod-shaped cargo revealed by automated five-dimensional single particle tracking. Nature Communication. 8 (1), 887 (2017).
- Xu, D., He, Y., Yeung, E. S. Y. Direct observation of the orientation dynamics of single protein-coated nanoparticles at liquid/solid interfaces. Angewandte Chemie. International Ed. in English. 53 (27), 6951-6955 (2014).
- Lehui, X., Yan, H., Edward, S. Y. Three Dimensional Orientational Imaging of Nanoparticles with Darkfield Microscopy. Analytical Chemistry. 82, 5268-5274 (2010).
- Ge, F., Xue, J., Wang, Z., Xiong, B., He, Y. Real-time observation of dynamic heterogeneity of gold nanorods on plasma membrane with darkfield microscopy. Science China Chemistry. 62, 1072-1081 (2019).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Janczura, J., Weron, A. Ergodicity testing for anomalous diffusion: small sample statistics. The Journal of Chemical Physics. 142 (14), 144103 (2015).
- Kim, D. H., et al. Single particle tracking-based reaction progress kinetic analysis reveals a series of molecular mechanisms of cetuximab-induced EGFR processes in a single living cell. Chemical Science. 8 (7), 4823-4832 (2017).
- Kurzthaler, C., et al. Probing the Spatiotemporal Dynamics of Catalytic Janus Particles with Single-Particle Tracking and Differential Dynamic Microscopy. Physical Review Letters. 121 (7), 078001 (2018).
- Lin, X., Pan, Q., He, Y. In situ detection of protein corona on single particle by rotational diffusivity. Nanoscale. 11 (39), 18367-18374 (2019).
- Wei, L., et al. Sub-diffraction-limit localization imaging of a plasmonic nanoparticle pair with wavelength-resolved dark-field microscopy. Nanoscale. 9 (25), 8747-8755 (2017).
- Cheng, X., Dai, D., Xu, D., He, Y., Yeung, E. S. Subdiffraction-limited plasmonic imaging with anisotropic metal nanoparticles. Analytical Chemistry. 86 (5), 2303-2307 (2014).
- Belyy, V., et al. PhotoGate microscopy to track single molecules in crowded environments. Nature Communication. 8, 13978 (2017).
