Summary
Her viser vi bruken av tradisjonell mørkfeltmikroskopi for å overvåke dynamikken i gullnanoroder (AuNRs) på cellemembran. Plasseringen og orienteringen til enkelt AuNRs oppdages ved hjelp av ImageJ og MATLAB, og de diffusive tilstander av AuNRs er preget av enkelt partikkelsporingsanalyse.
Abstract
Analyse av nanopartiklers diffuse dynamikk på cellemembran spiller en betydelig rolle i bedre forståelse av cellulær opptaksprosessen og gir et teoretisk grunnlag for rasjonell design av nanomedisinlevering. Enkelt partikkelsporing (SPT) analyse kan undersøke posisjonen og orienteringen til individuelle nanopartikler på cellemembran, og avsløre deres translasjonelle og rotasjonstilstander. Her viser vi hvordan du bruker tradisjonell mørkfeltmikroskopi for å overvåke dynamikken i gullnanoroder (AuNRs) på levende cellemembran. Vi viser også hvordan du trekker ut plasseringen og orienteringen til AuNRs ved hjelp av ImageJ og MATLAB, og hvordan man karakteriserer de diffusive tilstander av AuNRs. Statistisk analyse av hundrevis av partikler viser at enkelt AuNRs utfører Brownian bevegelse på overflaten av U87 MG cellemembran. Imidlertid viser individuell lang baneanalyse at AuNRs har to forskjellige typer bevegelsesstater på membranen, nemlig langdistansetransport og begrenset områdebegrensning. Våre SPT-metoder kan potensielt brukes til å studere overflaten eller intracellulær partikkeldiffusjon i forskjellige biologiske celler og kan bli et kraftig verktøy for undersøkelser av komplekse cellulære mekanismer.
Introduction
Dynamikken i nanopartikler (NPs) på membranen er nært forbundet med cellulæropptaksprosessen, noe som er avgjørende for forståelsen av cellefunksjoner, virale eller bakterielle infeksjoner og utvikling av kunstige nanomedisinske leveringssystemer1,2. Enkelt partikkelsporing (SPT) teknikk er et robust verktøy for å karakterisere heterogen atferd av NPs3,4. Generelt er cellemembranen fluidisk, noe som betyr at komponentene som proteiner og lipider kan bevege seg sidealt i plasmamembranplan5,6,7. Den spatiotemporale kompleksiteten i membranorganisasjon og struktur kan føre til spatiotemporal heterogenitet av samspillet mellom NPs og membran. Derfor krever direkte visualisering av bevegelsen av NPs på membranen både høy romlig og timelig oppløsning.
Enkeltpartikkelsporing mikroskopi som overvåker lokalisering av individuelle partikler i levende celler med en romlig oppløsning på titalls nanometer og en tidsoppløsning på millisekunder har blitt godt utviklet for å studere NPs eller membranmolekylerdynamikk 8,9. Fluorescensbaserte mikroskopiske bildeteknikker har blitt verdifulle verktøy for å observere NPs / molekyler i levende cellemiljø9,10,11,12. For eksempel har total intern refleksjon fluorescensmikroskopi, som bilder tynne lag (~ 100 nm) av prøven på substratet / løsningsgrensesnittet med høy spatiotemporal oppløsning blitt mye brukt i studier av membranmolekylerdynamikk 13,14. Imidlertid reduserer de iboende ulempene ved enkeltfluoforer, for eksempel lav intensitet og rask irreversibel fotobleaching nøyaktigheten og varigheten av sporing13. Derfor har ikke-fluorescerende plasmoniske NPer, som erstatter fluorescerende sonder, tiltrukket seg mer og mer oppmerksomhet i langsiktige bildestudier på grunn av deres unike optiskeegenskaper 15. Basert på spredningssignalene fra plasmoniske NP-sonder, har flere typer optiske mikroskopiske bildeteknologier blitt brukt til å studere mekanismen for biologiske prosesser, for eksempel mørkfeltmikroskopi (DFM)16, interferometrisk spredning (iSCAT) mikroskopi17 og differensial interferenskontrastmikroskopi (DICM)18. I tillegg kan bevegelses- og rotasjonsdynamikken til AuNRs oppnås ved hjelp av DFM og DICM18,19,20,21,22. I et SPT-eksperiment registreres vanligvis objektets bevegelse av det optiske mikroskopet, og analyseres deretter av SPT-analysemetoder3. De tidsløste banene og orienteringsvinklene som genereres av individuelle NPer, er normalt stokastisk og heterogen, så det er nødvendig å presentere rikelig dynamisk informasjon med ulike analysemetoder.
Her gir vi en integrert protokoll som overvåker dynamikken i AuNRs på cellemembran ved hjelp av DFM, trekker ut plasseringen og orienteringen til AuNRs med ImageJ og MATLAB og karakteriserer spredningen av AuNRs med SPT-analysemetoder. Som en demonstrasjon viser vi her hvordan du bruker SPT-protokollen til å visualisere dynamikken i umodifiserte AuNRs (CTAB-AuNRs, syntetisert av cetyltrimethylammonium ammoniumbromidmolekyl som beskyttende middel) på U87 MG cellemembran. Det har blitt vist at CTAB-AuNRs kan adsorbere proteiner i biologisk miljø, bevege seg på cellemembran og deretter gåinn i cellene 2,20,22. U87 MG celle er den vanligste og mest ondartede svulsten i sentralnervesystemet, og dets membranreseptorer er unormalt uttrykt. Membranreseptorene kan samhandle med proteiner på AuNRs, som påvirker dynamikken i AuNRs. Vår protokoll gjelder generelt for andre SPT-eksperimenter innen biologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellekultur
- Forbered komplett medium for U87 MG-celler ved å tilsette føtal storfeserum (endelig konsentrasjon 10%) og penicillin-streptomycin (endelig konsentrasjon 1 %) til det minste essensielle mediet (MEM). Bruk plastcellekulturrett for celler subkultur.
- Passage celler 2 til 3 ganger i uken.
- Fjern kulturmediet og skyll cellelaget med Dulbeccos fosfatbufret saltvann (D-PBS) 2 ~ 3 ganger når samløpet (80% ~ 90%).
- Tilsett 1,0 til 2,0 ml Trypsin-EDTA-løsning i cellekulturfatet og observer celler under et omvendt mikroskop til cellene blir runde (3 ~ 5 min).
- Tilsett 3,0 ml forberedt komplett medium og spre cellene ved å forsiktig pipettering.
- Legg celle suspensjon (1 ml) til ny kultur rett med friske celle medium (3 ml) og resuspend cellene.
- Vedlikehold cellene ved 37 °C og 5 % CO2 i en fuktet atmosfære.
2. Forberedelse av mikroskopsklie
MERK: U87 MG-celler i tredje til tiende generasjon med høy aktivitet brukes i SPT-eksperimenter.
- Steriliser 22 mm × 22 mm dekkslepper som allerede er rengjort med Piranha-oppløsning ved å senke i etanol (99,9 %).
- Bruk tang til å ta ut dekselet slip fra etanol oppløsning (trinn 2.1) og sterilisere ved å brenne etanol på flammen. Når alt etanol er brent, legg dekkglassene i en plastcellekulturrett (35 x 10 mm) fylt med 2 ml cellemedium (ingen fenolrød).
- Tilsett 50 μL av cellesuspensjonen fra trinn 1.2.3 på dekkslippen og skyv forsiktig fatet frem og tilbake og til venstre og høyre for å fordele cellene jevnt. Plasser den i en fuktet atmosfære.
- Når U87 MG-celler på dekkslipsen når 20%–40 % samløpet (~12 timer), legger du til 20 μL CTAB-AuNRs (138 pM) i fatet og spre. Inkuber i fuktet atmosfære i 5 min.
- Tilsett 100 μL av kulturmediet (ingen fenolrød) fra fatet i trinn 2.4 i sporet på det rillede glassskliet (figur 1) som er forhåndsrenovert med Piranha-oppløsning.
- Ta dekkglasset ut fra fatet og invertert på toppen av sporet på mikroskopglasslysbildet (figur 1). Forsegle med neglelakk, la den tørke og plasser den på scenen for å utføre SPT eksperimenter.
3. Utføre enkelt partikkelsporingseksperimenter med darkfield mikroskopi (figur 1).
- Legg en dråpe olje på den oljedytede mørkefeltkondensatoren (NA 1.43-1.20) og vri på knappen for å få kondensatoren til å ta kontakt med glassraset.
- Sett en dråpe olje på toppen av dekkglasset og vri fokuseringsknappen for å få 60x oljenedsenkingsmålet (NA 0,7–1,25) til å berøre oljen.
- Slå på lyskilden og vri litt fokuseringsknappen for å fokusere bildeplanet.
MERK: I synsfeltet er bakgrunnen svart, cellene er lyse, og CTAB-AuNRs (sideforhold~2:1, figur 2) er små fargede (røde, gule eller grønne) spredningspunkter. - Fang prøvespødlys med et CMOS-fargekamera. Klikk på "Kameraikon" i programvaren for å ta opp og eksportere TIFF-format for å lagre bilder.
4. Datainnhenting
- Trekk ut én langsiktig bane
- Fungere som beskrevet i figur 3 for å konvertere mørkefeltsbilder i tidsserien fra "RGB-farge"-modus til "8 bit"-modus. Klikk på Bilde J i bilde J| Skriv | 8 bit. Hvis du vil justere kontrasten, klikker du | Juster | Lysstyrke | Kontrast.
- Velg en målpartikkel og avskjæring av tidsseriebakgrunnene ved å bokse og slette bakgrunnen med "Ctrl+ X".
- Åpne vinduet partikkeldeteksjon og partikkelkobling ved å klikke på vinduet "Plugins | Partikkel Tracker Klassisk | Partikkel Tracker".
- Sett Radius til 6, Cutoff til 0 og Persentil til 0,01%.
MERK: For å oppdage partikkelen, juster over tre parametere ved hjelp av Preview. Sørg for at radiusen er litt større enn den målrettede partikkelen og mindre enn den minste interpartikkelseparasjonen. Persentil er den nedre grensen for intensitetsfordeling som å være kandidatpartikler. - Sett koblingsområdet til 5 og forskyvning til 10.
MERK: Hvis du vil knytte partikkelen mellom sammenhengende tilstøtende rammer, justerer du de to parametrene ovenfor. Forskyvning er de maksimale pikslene som en partikkel kan bevege seg mellom to etterfølgende rammer, og Link Range er antall påfølgende rammer å vurdere når du bestemmer den beste tilsvarende matchen. - Klikk "OK" for å åpne vinduet ParticleTracker-resultater for å se resultatene.
- Klikk "Visualiser alle baner"for å inspisere de genererte banene.
- Klikk "Koble partikler" menyen øverst for å koble de oppdagede partiklene med forskjellige koblingsområde og persentilparametere, hvis programvaren generert bane ikke samsvarer med den bevegelige banen til AuNR.
- Klikk "Lagre full rapport" for å lagre resultater hvis programvaren generert bane og den bevegelige banen til AuNR er matchet.
MERK: Et eksempel på å trekke ut en enkelt langsiktig bane med bilde J vises i figur 4.
- Trekke ut flere baner
MERK: Et eksempel på å trekke ut flere baner med Fiji er vist i figur 5. Det er flere stadier, og hvert trinn utgjør et trinn i sporingsprosessen. Resultatet av hvert trinn vises umiddelbart, noe som gjør at brukeren kan gå tilbake for å justere innstillingene på nytt når utdataene ikke er tilfredsstillende.- Fungere som beskrevet i figur 3 for å konvertere mørkefeltsbilder i tidsserien fra "RGB-farge"-modus til "8 bit"-modus. Klikk på " Bilde | Skriv | 8 bit". Hvis du vil justere kontrasten, klikker dupå " | Juster | Lysstyrke | Kontrast".
- Åpne startpanelet ved å klikke på "Plugins | Sporing | TrackMate". Klikk "Neste".
- Velg"LoG detektor"fra rullegardinmenyen og klikk "Neste".
- Juster parametrene til detektorkonfigurasjonspanelet. Angi Anslått blobdiameter til 10, sett Terskel til 0 og Velg "Gjør lokalisering for under piksel".
- Klikk på" Neste" for å åpne det første spotfiltreringspanelet.
MERK: Flere parametere kan justeres for å optimalisere målpunktene ytterligere. I dette eksemplet ble ingen andre parametere justert. - Klikk på" Neste" og velg "HyperStack displayer" fra rullegardinmenyen.
- Klikk på" Neste" for å åpne Spotfiltreringspanelet. Sett kvaliteten over 1,88, X over 38,86, Y over 56,54.
- Klikk på" Neste" og velg " SimpleLAP tracker" fra rullegardinmenyen. Konfigurer den enkle LAP tracker ved å justere tre parametere, det vil si Linking maks avstand = 15, Gap-lukking maks avstand = 15 og Gap-lukke maks ramme gap = 5.
MERK: Kobling-maks avstand er maksimal forskyvning av et punkt mellom to rammer. Gap-lukking maks avstand er maksimal forskyvning av to segmenter. Gap-lukking maks ramme gapet er den største rammen mellom to punkter som skal bygges bro. - Klikk "Neste" for å spore. Når du er ferdig, fortsett å klikke" Neste".
- Angi filtre på spor, for eksempel angi Antall plasser i spor over 300.
- Fortsett å klikke "Neste" til det endelige lagringspanelet åpnes. Velg "Eksporter spor til XML-fil" fra rullegardinmenyen, og klikk deretter " Execute "forå lagre i csv-format.
- R/G-verdier
MERK: Spredning av intensiteter av målrettede AuNRs i R- og G-kanalene er hentet fra farge darkfield-bilder ved hjelp av en kode skrevet i MATLAB (https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020/tree/master/RGandPolarangle), og ekstraksjonsprinsippet er presentert i figur 6.- Bruk funksjonen til xycoordination.m for å finne den midterre pikselkoordinaten til AuNR i hver ramme i henhold til x-y-koordinaten (ekstrahert av ImageJ / Fiji).
- Bruk funksjonen til RGextraction.m til å avgrense en matrise på 3 x 3 piksler, trekke ut 9 spredningsintensitetsverdiene for R- eller G-kanaler og beregne en gjennomsnittsverdi (μ, definert som R eller G).
MERK: Matrisen på 3 x 3 piksler er sentrert rundt pikselkoordinatene som er hentet fra trinn 4.3.1.
- Polar vinkel
MERK: Polarvinkelen er vinkelen mellom lengdegraden til AuNR og den optiske aksen (som vist i figur 1), som kan gjenspeile den romlige rotasjonsdynamikken til AuNR.- Bruk funksjonen til polarangle.m til å beregne polarvinklene (θ) ved dual-channel differensialmetoden22,
.
- Bruk funksjonen til polarangle.m til å beregne polarvinklene (θ) ved dual-channel differensialmetoden22,
.5. Dataanalyse
MERK: Et systematisk og robust rammeverk for dataanalyse er avgjørende for ytelsen og effektiviteten til SPT-analysemetoder. Den tilpassede programvaren skrevet i MATLAB brukes (https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020/tree/master/Analysis_parameters). En graf- og analyseprogramvare (se Materials tabell) brukes til å tegne plottene.
- Analyseparametere
- Bruk skript for csv_data_extract_dis_vel_ss.m og csv_data_MSD.m til å beregne dynamiske parametere i henhold til formler som vises i tabell 1.
MERK: Disse parametrene brukes til å analysere dynamikken i AuNRs og består av tre deler. (1) Banerelaterte parametere: forskyvning, trinnstørrelse, hastighet, radius av gyration (Rg)og svingvinkel (Ta); (2) MSD-parametere: diffusjonskoeffisient (Dt)og unormal eksponent for diffusjon (α); og (3) Rotasjonsrelaterte parametere: polarvinkel og rotasjonslability (σ).
- Bruk skript for csv_data_extract_dis_vel_ss.m og csv_data_MSD.m til å beregne dynamiske parametere i henhold til formler som vises i tabell 1.
| Tiltak | Definisjon | Fysisk betydning | |
| Forskyvning |  |
Endringer i posisjon av objekter | |
| Trinn størrelse |  |
Avstand mellom to tilstøtende punkter | |
| Hastighet |  |
Hastigheten på objekter bevegelse | |
| Rg |  |
Flytte objektområde i et bestemt tidsintervall | |
| Ten |  |
Bevegelsesretning av objekter mellom to tilstøtende punkter | |
| Msd |  |
Gjennomsnittlig flytteavstand for objekter i et bestemt tidsintervall | |
| Dt |  |
Objektenes diffusjonsevne | |
| Α | |
Normal diffusjon (α ~ 1) | |
| Polar vinkel |  |
3D-orienteringsinformasjon for objekter | |
| σ |  |
Grad av spredning av polarvinkeldatasettet | |
Tabell 1: Tre typer parametere som brukes til analyse. Disse inkluderer banerelaterte parametere (forskyvning, trinnstørrelse, hastighet, Rg og Ta),MSD-parametere (MSD, Dt og α) og rotasjonsrelaterte parametere (polarvinkel og rotasjonslability).
- Visuell analyse av bane
MERK: Banevisualisering kan intuitivt presentere spatiotemporal heterogenitet av partikkelbevegelse og bane (koordinat) fordeling av dynamiske parametere, for eksempel tidskartleggingsbane, Rg- og Dt-kartleggingsbane og polarvinkelkartbane. Kartleggingsbaner ble tegnet ved hjelp av graf- og analyseprogramvaren.- Angi x-koordinaten som X, y-koordinat som Y og tid (Rg, Dt, polarvinkel) som Z.
- Klikk "Plot | Scatter tomt | Fargekartlegging Plot".
- Legg til fargelinjen.
- MSD-analyse
MERK: Bevegelsesaktivitet og bevegelsesmodus for partiklene kan oppnås ved MSD-analyse23. Jo større Dt, jo mer aktiv diffusjonsbevegelsen til partiklene. når α ~ 1, gjør partikler normal diffusjon bevegelse, ellers utfører de unormal diffusjon bevegelse.- MSD-τ-tall
- Angi tidsintervall (τ) som X, MSD-data som Y.
- Klikk "Plot | Scatter tomt"
- Tilpass data ved å klikke på "Analyser | Montering | Ikke-lineær kurve montering (Funksjon: Allometricl)".
- MSD-τ dobbel-logaritmisk figur
MERK: MSD-τ dobbeltloggaritmisk figur, hvis helling er α og avskjæring er Dt, kan intuitivt presentere partikkelbevegelse.- Angi logaritmisk tidsintervall som X, og logaritmisk MSD som Y.
- Klikk "Plot | Scatter plot".
- Tilpass data ved å klikke på "Analyser | Montering | Lineær kurve montering".
- D-τ-figur (MSD/4t)
MERK: D=MSD/4τ, er en funksjon av tid τ og anomali faktor α, og D-τ figuren viser direkte endringen av diffusjonskoeffisient med tiden. Når D øker med tiden, α er større enn 1 og partikler gjør superdiffusion bevegelse.- Angi logaritmisk tidsintervall (τ) som X, og logaritmisk D som Y.
- Klikk "Plot | Scatter plot".
- Tilpass data ved å klikke på "Analyser | Montering | Ikke-lineær kurvetilpasning (Funksjon: "Allometricl")".
MERK: Jo kortere baner, desto høyere er unøyaktigheten i diffusjonsestimatene. Generelt ble Dt og α gjennom MSD-τ analyse av lang intervalltid (> 30 τ) oppnådd. Enkel og grov tilpasning vil imidlertid jevne ut bevegelsesdetaljer. Derfor bør MSD-τ-analyse av kort intervalltid (< 10 τ) utføres for å analysere partiklenes bevegelsesatferd på kort tid.
- MSD-τ-tall
- Statistisk analyse
- Statistisk analyse av multipartikler
MERK: Statistisk analyse av multipartikler kan gjenspeile bevegelsestilstanden til partikler i et romlig område, som indirekte indikerer det romlige heterogenitetsmiljøet. For eksempel, hvis histogrammet av Dt viser en storskala fordeling eller multi-topper distribusjon, betyr det at bevegelsesaktivitetene til partikler er heterogene.- Angi dynamiske parametere (for eksempel Dt, Rg, maks forskyvning) som Y.
- Klikk "Plot | Histogrammet".
- Dobbeltklikk histogrammet, og angi divisjonsstørrelse eller antall divisjoner. Klikk "Bruk".
- Statistisk analyse av én partikkel
MERK: Den statistiske analysen av enkeltpartikler kan vise bevegelsesatferden til individuelle partikler, noe som også indirekte gjenspeiler det spatiotemporale heterogeniteten i omgivelsene.- Flere rammer
- Beregn dynamiske parametere (for eksempel Ta, trinnstørrelse, polarvinkel) for alle rammer med én lang bane, og kopier til Origin-tabellen og sett som Y.
- Klikk "Plot | Histogrammet".
- Dobbeltklikk histogrammet, og angi divisjonsstørrelse eller antall divisjoner. Klikk "Bruk".
MERK: Hvis både Ta- og trinnstørrelse viser en liten verdifordeling, gjør partiklene en liten trinns superdiffusjonsbevegelse.
- Flytte vinduer
- Beregn dynamiske parametere (for eksempel Rg, Dt) av alle rammer med enkelt lang bane gjennom flyttingsvindusmetode (11 bilder), og kopier til Origin-tabellen og sett som Y.
- Klikk "Plot | Histogrammet".
- Dobbeltklikk histogrammet, og angi divisjonsstørrelse eller antall divisjoner. Klikk "Bruk".
- Flere rammer
- Statistisk analyse av multipartikler
- Tidsserieanalyse
MERK: Statistisk analyse kan avsløre bevegelsestilstanden til NPer, og tidsserieanalyse kan presentere bevegelsesatferden som et supplement. Ved å kombinere flere tidsserieparametere kan den diskriminere bevegelsesatferden til NPs på timelig og romlig nivå.- Angi tid som X, tidsserieparametere som Y (for eksempel forskyvning, polarvinkel og Rg).
- Klikk "Plot | Diagramdiagram med flere | Stablet tomt | Linje + Symbol".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I protokollen ble de umodifiserte 40 x 85 nm CTAB-AuNRs brukt. Som vist i figur 2B,er dens langsgående plasmoniske maksimum på ~ 650 nm (rød region) og tverrgående resonans på 520 nm (grønn region). Tidligere litteratur har vist at de optiske egenskapene (for eksempel LSPR intensitet) av plasmoniske AuNRs vil endre seg betydelig med diameter20,22. I figur 2Cviste spredningsintensiteten fra CTAB-AuNRs på U87-cellemembran, typisk gaussisk fordeling med smal bredde og var i samsvar med CTAB-AuNRs på glass, noe som indikerer at CTAB-AuNRs sporet i dette eksperimentet var godt monodisperert.
Dynamikken i CTAB-AuNRs på membran ble overvåket av DFM (12 fps). Som vist i figur 7ble mer enn 500 baner (banelengden over 300 bilder) oppnådd. I tillegg kan omtrent 40 baner per celle genereres. Rg av alle 500 baner viste en liten verdifordeling, gjennomsnittlig Rg var 0,5 μm (SD = 0,6 μm), og maks forskyvning var også mer fordelt med små verdier (figur 8). Alle 500 baner kan deles inn i to grupper: langtrekkende diffusjon (Rg> 0,5 μm, svarte baner) og begrenset diffusjon (Rg<0,5 μm, røde baner).
I henhold til posisjon og orientering av CTAB-AuNRs beregnes flere parametere for dataanalyse. Det er mange mays å analysere og presentere parametere under SPT analyse. Ensemble-tid gjennomsnittlig MSD analyse vist i figur 9A viser at CTAB-AuNRs normalt diffus med α ~ 1. Tetthetsfordelingen av Dt-α, hentet fra alle baner, avslører imidlertid at dynamikken i AuNRs viste en heterogen fordeling med superdifusjonsbevegelse, Brownian bevegelse og subdiffusionbevegelse (figur 9B).
I tillegg til statistisk analyse av multipartikler ble det også utført enpartikkelanalyse (flere rammer). Figur 10 viser to representative langsiktige baner: begrenset (Rg=0,34 μm) og flytting (Rg=1,48 μm). Polarkartbanen viste at både bevegelsesområdet og polarvinkelen til begrensede AuNRs var mindre enn de som beveger AuNRs, noe som betyr at sterkere samspillet mellom AuNRs og membran, desto mer tjener begrensningen av dens translasjonelle og rotasjonsdynamikk. Tilsvarende viste histogrammene til Ta og polar vinkel på de to AuNRs forskjellige moduser.
For ytterligere å studere bevegelsesatferden til AuNRs ble tidsserieparametrene analysert, inkludert bane, forskyvning, polarvinkel og Rg. Som vist i figur 11ble ulike mønstre presentert over tid. Sammenlignet med langdistansediffusjonen AuNR var rotasjonen av den begrensede AuNR relativt begrenset, og polarvinklene var mer konsentrerte, fordelt i området 10 ° ~ 40 °. Men selv om den totale Rg av den bevegelige AuNR var større enn den generelle Rg av begrenset AuNR, tidsserien R gav bevegelige AuNR var mindre. Ved å kombinere tidsseriefordelingen av banepunkter og forskyvning, kan det utledes at begrenset AuNR beveger seg i et begrenset område, men bevegelsesområdet på kort tid er større enn for den bevegelige AuNR begrenset på membranen. Samlet sett er den spatiotemporale heterogene fordelingen av translasjonell og rotasjonsdynamikk forårsaket av den romlige og timelige kompleksiteten til membranorganisasjon og struktur.
Figur 1: Skjematisk diagram over den optiske banen til darkfield mikroskopikroskopi, mikroskopsklieforberedelse og tokanals forskjellsmetode for beregning av polarvinkel (θ) av AuNRs. Skalalinjen i bildet er 2 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Karakterisering av CTAB-AuNRs. (A) TEM bilder av CTAB@AuNRs. (B)LSPR spekter av CTAB@AuNRs. (C) Fordeling av enkelt partikkelintensitet: CTAB@AuNRs på glass (venstre panel), CTAB@AuNRs på plasmonmembran (høyre panel). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Forbehandling av darkfield-bilder. Tidsseriefargebilder ble konvertert til "8 bit" -modus og kontrasten ble justert. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Ekstraksjon av enkelt langsiktig bane med ImageJ. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Utvinning av multi-baner med Fiji. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Ekstraksjon av R/G-verdier for AuNRs med MATLAB. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Alle 527 baner av CTAB@AuNRs på U87 MG cellemembran sporet med Fiji. Det var to grupper: røde baner (Rg<0,5 μm) og svarte baner (Rg> 0,5 μm). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Statistisk analyse av flere partikler av alle de 527 banene. Fordeling av Rg (A) og maksimal forskyvning (B). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 9: MSD-analyse av alle 527 baner. (A) Plot av ensemble-tid gjennomsnittlig MSD versus τ. (B) Tetthet tomten i α- logg (Dt)plan. Fargekoden representerer den lokale tettheten av baner mellom 0 (blå) og 1 (rød). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 10: Statistisk analyse av enkeltpartikler. (A-B) To representative langsiktige polarkartleggingsbaner som ble sporet med ImageJ. Fargekoden representerer polarvinkelverdien mellom 0 (grønn) og 90 (rød). Fordeling av svingvinkel (C-D) og polarvinkel (E-F). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 11: Tidsserieanalyse. (A,C) Tidskartleggingsbaner. Fargen fra rød til blå representerer tidsretningen. (B, D) Tidsserie av parametere: forskyvning (blå), polar vinkel (grønn) og radius av gyration (Rg, rød). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den presenterte protokollen brukes til å studere dynamikken i AuNRs på cellemembran. Protokollen består av fire deler, inkludert mikroskopisk bildebehandling, datautvinning, beregning av dynamiske parametere og dataanalysemetoder, og hver del er fleksibel og universell. Derfor er det mange mulige fremtidige anvendelser, for eksempel å studere bevegelse av NP-koblede membranmolekyler på membran, endocytose dynamikk av NP-merkede reseptorer, dynamisk analyse av intracellulære NP-er og vesikkelbelagte NP-transport langs mikrotubuli, og så videre.
Det grunnleggende trinnet er å bruke DFM til å bilde bevegelsen av AuNRs på cellemembranen. For tiden er det utviklet mange bildeteknologier for analyse av cellemembrandynamikk, hvorav fluorescensmikroskopi har blitt mye brukt24. Imidlertid fører fotobleaching egenskapene til fluorescerende sonder til manglende evne til å spore partikkeldynamikk i lange perioder. Her ble lysstabilplasmoniske AuNRs brukt. Flere bildeteknikker er utviklet basert på spredningsegenskapene til plasmoniske NPs15. Spesielt samler DFM med skrå belysningsmodus bare spredt lys fra prøvene, noe som gjør at den har et høyt signal-til-støy-forhold.
Både den translasjonelle og rotasjonsdynamikken til AuNRs oppnås og analyseres. De fleste studier fokuserer på å undersøke de posisjonelle svingningene i NPs på membranen, og ignorerer effekten av orienteringsendringer25. I tillegg er cellemembranplanet og bildeplanet (x-y-flyet) stort sett det samme i de fleste tilfeller, og forskjellen i samspillet mellom AuNR og cellemembranen er mer bemerkelsesverdig i z-retningen. Derfor, selv uten asimut vinkler, er polarvinkelen verdifull for analysen av samspillet mellom AuNRs og cellemembran. Basert på DFM og unike optiske egenskaper aunrs, dual-channel polarisering DFM brukes til å få orientering informasjon aunrs (jeg1 + I2 
synd2θ)19,26. Likevel påvirkes beregningsnøyaktigheten til polare vinkler av de maksimale og minimale deteksjonsintensitetene som er sterkt påvirket av omgivelsene. Derfor må noen modifikasjoner gjøres. Her ble (R-G) brukt til å beregne polarvinkelen, og G-verdien som fungerer som en intern referanse kan effektivt redusere de systematiske feilene og øke målenøyaktigheten.
De kritiske trinnene er datautvinning og dynamisk parameterberegning, som er avgjørende for å analysere dynamikken i NP på membranen. Banene til AuNRs på membran ekstraheres med høy romlig oppløsning27,28 fra sekvensanalyse ved hjelp av ImageJ / Fiji. R\G-verdiene og polarvinklene beregnes med MATLAB (https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020). Flere parametere beregnes på samme måte ved hjelp av MATLAB i henhold til posisjoner og polarvinkler (tabell 1). I SPT-analyse er det mange måter å utføre parameteranalyse og visning på. Derfor er det nødvendig å bruke så mange analysemetoder og visualiseringsverktøy som mulig for å analysere dynamikken i NP, og deretter å oppsummere og trekke ut et nytt synspunkt fra mange analyseresultater. Normalt er det alltid noen avveiing å gjøre, noe som ikke er et enkelt arbeid.
Den dynamiske tilstanden og bevegelsesatferden til NPer kan analyseres og presenteres systematisk fra topp til bunn ved hjelp av omfattende analytiske metoder og multivariate presentasjonsmåter. Ved hjelp av statistisk analyse av flere partikler kan vi oppnå ensemblebevegelsestilstanden til NPs over hele cellemembranplanet. De dynamiske studiene på individuelle NPs/molekyler basert på fluorescensavbildning29 bruker for det meste denne generelle statistiske metoden fordi bare et stort antall kortsiktige baner kan overvåkes. Ensemblets snittmetode vil imidlertid jevne ut og ignorere individuelle detaljer. Som et supplement brukes den statistiske enkeltpartikkelanalysen til å kvantitativt presentere den dynamiske tilstanden til individuelle NPer. I mellomtiden er det viktig å utføre tidsserieparameteranalyse av individuelle eller segmentbaner, noe som kan gi bevegelsesatferd av NPs som en funksjon av tid.
Oppsummert foreslår vi en integrert protokoll for å studere diffusjonsdynamikken til AuNRs på levende cellemembran med SPT-metode. Dynamikken i AuNRs ble overvåket med enkelt nanopartikkel DFM, ekstrahert ved hjelp av ImageJ og MATLAB, og preget av omfattende analytiske metoder. AuNRs gjorde unormal diffusjon bevegelse på U87 MG cellemembran, og dens bevegelse viser spatiotemporal heterogenitet. Denne protokollen kan potensielt brukes til studier av andre typer komplekse biologiske systemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China med tilskuddsnummer på 21425519, 91853105 og 21621003.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CTAB coated gold nanorods(CTAB-AuNRs) | Nanoseedz | NR-40-650 | 85 nm * 40 nm |
| Color CMOS camera | Olympus | DP74 | Japan |
| Coverslips | Citoglas | z10212222C | 22*22 mm |
| Dark-field microscopy | Nikon | 80i | upright microscope |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10099141 | |
| Fiji | National Institutes of Health | 2.0.0-rc-69/1.52 p | a distribution of ImageJ |
| Grooved glass slide | Sail brand | 7103 | Single concave |
| Image J | National Institutes of Health | 1.52 j | |
| MATLAB | MathWorks | R2019b | |
| MATLAB Code | https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020 | ||
| Minimum essential medium (MEM) | Gibco | 10-010-CVR | with phenol red |
| Minimum essential medium (MEM) | Gibco | 51200038 | no phenol red |
| Origin | OriginLab | Origin Pro 2018C | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Plastic cell culture dishes | Falcon | 353002 | |
| Plastic cell culture dishes | Falcon | 353001 | 35*10 mm |
| U87 MG cell | American Type Culture Collection | ATCC HTB-14 | a human primary glioblastoma cell line |
References
- Rees, P., Wills, J. W., Brown, M. R., Barnes, C. M., Summers, H. D. The origin of heterogeneous nanoparticle uptake by cells. Nature Communication. 10 (1), 2341 (2019).
- Behzadi, S., et al. Cellular uptake of nanoparticles: journey inside the cell. Chemical Society Reviews. 46 (14), 4218-4244 (2017).
- Shen, H., et al. Single Particle Tracking: From Theory to Biophysical Applications. Chemical Reviews. 117 (11), 7331-7376 (2017).
- Saxton, M. J. Single-particle tracking: connecting the dots. Nature Methods. 5 (8), 671-672 (2008).
- Kusumi, A., et al. Dynamic organizing principles of the plasma membrane that regulate signal transduction: commemorating the fortieth anniversary of Singer and Nicolson's fluid-mosaic model. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 215-250 (2012).
- Jacobson, K., Liu, P., Lagerholm, B. C. The Lateral Organization and Mobility of Plasma Membrane Components. Cell. 177 (4), 806-819 (2019).
- Sezgin, E., Levental, I., Mayor, S., Eggeling, C. The mystery of membrane organization: composition, regulation and roles of lipid rafts. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 361-374 (2017).
- von Diezmann, A., Shechtman, Y., Moerner, W. E. Three-Dimensional Localization of Single Molecules for Super-Resolution Imaging and Single-Particle Tracking. Chemical Reviews. 117 (11), 7244-7275 (2017).
- Rosenberg, J., Huang, J. Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (155), e59914 (2020).
- Kusumi, A., Tsunoyama, T. A., Hirosawa, K. M., Kasai, R. S., Fujiwara, T. K. Tracking single molecules at work in living cells. Nature Chemical Biology. 10 (7), 524-532 (2014).
- Rocha, J. M., Gahlmann, A. Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules. Journal of Visualized Experiments. (151), e59387 (2019).
- Uphoff, S., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. Visualizing protein-DNA interactions in live bacterial cells using photoactivated single-molecule tracking. Journal of Visualized Experiments. (85), e511177 (2014).
- Pinaud, F., Clarke, S., Sittner, A., Dahan, M. Probing cellular events, one quantum dot at a time. Nature Methods. 7 (4), 275-285 (2010).
- Mehidi, A., et al. Transient Activations of Rac1 at the Lamellipodium Tip Trigger Membrane Protrusion. Current Biology. 29 (17), 2852-2866 (2019).
- Ye, Z., Wang, X., Xiao, L. Single-Particle Tracking with Scattering-Based Optical Microscopy. Analytical Chemistry. 91 (24), 15327-15334 (2019).
- Pan, Q., Zhao, H., Lin, X., He, Y. Spatiotemporal Heterogeneity of Reactions in Solution Observed with High-Speed Single-Nanorod Rotational Sensing. Angewandte Chemie. International Ed. in English. 58 (25), 8389-8393 (2019).
- Taylor, R. W., et al. Interferometric scattering microscopy reveals microsecond nanoscopic protein motion on a live cell membrane. Nature Photonics. 13 (7), 480-487 (2019).
- Chen, K., et al. Characteristic rotational behaviors of rod-shaped cargo revealed by automated five-dimensional single particle tracking. Nature Communication. 8 (1), 887 (2017).
- Xu, D., He, Y., Yeung, E. S. Y. Direct observation of the orientation dynamics of single protein-coated nanoparticles at liquid/solid interfaces. Angewandte Chemie. International Ed. in English. 53 (27), 6951-6955 (2014).
- Lehui, X., Yan, H., Edward, S. Y. Three Dimensional Orientational Imaging of Nanoparticles with Darkfield Microscopy. Analytical Chemistry. 82, 5268-5274 (2010).
- Ge, F., Xue, J., Wang, Z., Xiong, B., He, Y. Real-time observation of dynamic heterogeneity of gold nanorods on plasma membrane with darkfield microscopy. Science China Chemistry. 62, 1072-1081 (2019).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Janczura, J., Weron, A. Ergodicity testing for anomalous diffusion: small sample statistics. The Journal of Chemical Physics. 142 (14), 144103 (2015).
- Kim, D. H., et al. Single particle tracking-based reaction progress kinetic analysis reveals a series of molecular mechanisms of cetuximab-induced EGFR processes in a single living cell. Chemical Science. 8 (7), 4823-4832 (2017).
- Kurzthaler, C., et al. Probing the Spatiotemporal Dynamics of Catalytic Janus Particles with Single-Particle Tracking and Differential Dynamic Microscopy. Physical Review Letters. 121 (7), 078001 (2018).
- Lin, X., Pan, Q., He, Y. In situ detection of protein corona on single particle by rotational diffusivity. Nanoscale. 11 (39), 18367-18374 (2019).
- Wei, L., et al. Sub-diffraction-limit localization imaging of a plasmonic nanoparticle pair with wavelength-resolved dark-field microscopy. Nanoscale. 9 (25), 8747-8755 (2017).
- Cheng, X., Dai, D., Xu, D., He, Y., Yeung, E. S. Subdiffraction-limited plasmonic imaging with anisotropic metal nanoparticles. Analytical Chemistry. 86 (5), 2303-2307 (2014).
- Belyy, V., et al. PhotoGate microscopy to track single molecules in crowded environments. Nature Communication. 8, 13978 (2017).
