Summary
Här visar vi användningen av traditionell mörkfältsmikroskopi för att övervaka dynamiken hos guldnanoroder (AuNRs) på cellmembranet. Placeringen och orienteringen av enskilda AuNR identifieras med ImageJ och MATLAB, och aunr:s diffusiva tillstånd kännetecknas av analys av enstaka partikelspårning.
Abstract
Att analysera nanopartiklarnas diffusionella dynamik på cellmembranet spelar en viktig roll för att bättre förstå den cellulära upptagsprocessen och ger en teoretisk grund för den rationella utformningen av nanomedicinsk leverans. SPT-analys (Single Particle Tracking) kan undersöka positionen och orienteringen av enskilda nanopartiklar på cellmembranet och avslöja deras translationella och roterande tillstånd. Här visar vi hur man använder traditionell mörkfältsmikroskopi för att övervaka dynamiken hos guldnanoroder (AuNRs) på levande cellmembran. Vi visar också hur man extraherar platsen och orienteringen för AuNRs med ImageJ och MATLAB, och hur man karakteriserar aunrs diffusiva tillstånd. Statistisk analys av hundratals partiklar visar att enstaka AuNR utför brownsk rörelse på ytan av U87 MG cellmembran. Individuell långloppsanalys visar dock att AuNR har två tydligt olika typer av rörelse tillstånd på membranet, nämligen långdistanstransport och begränsad område inneslutning. Våra SPT-metoder kan potentiellt användas för att studera ytan eller intracellulär partikeldiffusion i olika biologiska celler och kan bli ett kraftfullt verktyg för undersökningar av komplexa cellulära mekanismer.
Introduction
Dynamiken hos nanopartiklar (NPs) på membranet är nära förknippad med cellulära upptagsprocessen, vilket är viktigt för förståelsen av cellfunktioner, virus- eller bakterieinfektioner och utvecklingen av artificiella nanomedicinska leveranssystem1,2. SPT-teknik (Single Particle Tracking) är ett robust verktyg för att karakterisera de heterogena beteendena hos NPs3,4. I allmänhet är cellmembranet fluidiskt, vilket innebär att komponenter som proteiner och lipider kan röra sig i senareled i plasmamembranplanet5,6,7. Spatiotemporal komplexiteten i membran organisation och struktur kan leda till spatiotemporal heterogenitet av interaktionen mellan NPs och membran. Därför kräver direkt visualisering av rörelsen av NPs på membranet både hög rumslig och temporal upplösning.
Enpartikelspårningsmikroskopi som övervakar lokaliseringen av enskilda partiklar i levande celler med en rumslig upplösning på tiotals nanometer och en tidsupplösning av millisekunder har utvecklats väl för att studera NPs eller membranmolekylernasdynamik 8,9. Fluorescensbaserade mikroskopiska avbildningstekniker har blivit värdefulla verktyg för att observera NPs / molekyler i levande cellmiljö9,10,11,12. Till exempel har total intern reflektion fluorescensmikroskopi, som avbildar tunna lager (~ 100 nm) av provet vid substrat/ lösningsgränssnittet med hög spatiotemporal upplösning, använts i stor utsträckning i studier av membranmolekyldynamik13,14. De inneboende nackdelarna med enstaka fluorforer, såsom låg intensitet och snabb irreversibel fotoblekning minskar dock noggrannheten och varaktigheten förspårning 13. Därför har icke-fluorescerande plasmoniska NPs, som ersätter fluorescerande sonder, lockat mer och mer uppmärksamhet i långsiktiga avbildningsstudier på grund av deras unika optiska egenskaper15. Baserat på spridningssignalerna från plasmoniska NP-sonder har flera typer av optisk mikroskopisk bildteknik använts för att studera mekanismen för biologiska processer, såsom mörkfältsmikroskopi (DFM)16, interferometrisk spridning (iSCAT)mikroskopi 17 och differentiell interferenskontrastmikroskopi (DICM)18. Dessutom kan rörelse- och rotationsdynamiken hos AuNR erhållas med DFM och DICM18,19,20,21,22. Vanligtvis registreras objektets rörelse av det optiska mikroskopet i ett SPT-experiment och analyseras sedan med SPT-analysmetoder3. De tidsavgjorda banorna och orienteringsvinklarna som genereras av enskilda NPs är normalt stokastiska och heterogena, så det är nödvändigt att presentera riklig dynamisk information med olika analysmetoder.
Här tillhandahåller vi ett integrerat protokoll som övervakar dynamiken hos AuNRs på cellmembran med DFM, extraherar placeringen och orienteringen av AuNRs med ImageJ och MATLAB och karakteriserar spridningen av AuNRs med SPT-analysmetoder. Som en demonstration visar vi här hur man använder SPT-protokollet för att visualisera dynamiken hos omodifierade aunr (CTAB-AuNRs, syntetiserade av cetyltrimethylammonium ammoniumbromidmolekyl som skyddsmedel) på U87 MG-cellmembran. Det har visat sig att CTAB-AuNRs kan adsorbera proteiner i biologisk miljö, flytta på cellmembranet och sedan komma in icellerna 2,20,22. U87 MG-cellen är den vanligaste och mest maligna tumören i centrala nervsystemet, och dess membranreceptorer uttrycks onormalt. Membranreceptorerna kan interagera med proteiner på AuNR, vilket påverkar dynamiken hos AuNRs. Vårt protokoll är allmänt tillämpligt på andra SPT-experiment inom biologiområdet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellkultur
- Förbered komplett medium för U87 MG-celler genom att tillsätta fetala nötkreatursserum (slutlig koncentration 10%) och penicillin-streptomycin (slutlig koncentration 1%) till det minsta väsentliga mediet (MEM). Använd plastcellsodlingsform för cellsubkultur.
- Passageceller 2 till 3 gånger i veckan.
- Ta bort odlingsmediet och skölj cellskiktet med Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (D-PBS) 2 ~ 3 gånger när den konfluent (80%~ 90%).
- Tillsätt 1,0 till 2,0 ml Trypsin-EDTA-lösning i cellkulturformen och observera celler under ett inverterat mikroskop tills cellerna blir runda (3 ~ 5 min).
- Tillsätt 3,0 ml förberett komplett medium och sprid cellerna genom att försiktigt pipetera.
- Tillsätt cellfjädring (1 ml) till ny odlingsform med färskt cellmedium (3 ml) och återanvänd cellerna.
- Håll cellerna vid 37 °C och 5% CO2 i en fuktig atmosfär.
2. Förberedelse av mikroskoprutschbanor
OBS: U87 MG celler i tredje till tionde generationen med hög aktivitet används i SPT experiment.
- Sterilisera 22 mm × 22 mm täckslips som redan rengjorts med Piranha-lösning genom nedsänkning i etanol (99,9%).
- Använd tång för att ta ut täckspingen från etanollösningen (steg 2.1) och sterilisera genom att bränna etanol på lågan. När all etanol har bränts, placera täcken i en plastcellskulturrätt (35 x 10 mm) fylld med 2 ml cellmedium (ingen fenolröd).
- Tillsätt 50 μL av cellfjädringen från steg 1.2.3 på täckglaset och tryck försiktigt skålen fram och tillbaka och åt vänster och höger för att fördela cellerna jämnt. Placera den i en fuktig atmosfär.
- När U87 MG-celler på täcket når 20%-40% sammanflöde (~ 12 h), tillsätt 20 μL CTAB-AuNRs (138 pM) i skålen och sprid. Inkubera i fuktig atmosfär i 5 min.
- Tillsätt 100 μL av odlingsmediet (ingen fenolrött) från skålen i steg 2.4 i spåret på den räfflade glasrutschbanan (Figur 1) som är förrenad med Piranha-lösning.
- Ta ut täcket ur skålen och vänd på toppen av mikroskopglasets spåret (Bild 1). Försegla med nagellack, låt det torka och placera det på scenen för att utföra SPT-experiment.
3. Utföra enstaka partikelspårningsexperiment med darkfieldmikroskopi (figur 1).
- Placera en droppe olja på den oljesänkta darkfieldkondensorn (NA 1.43-1.20) och vrid ratten för att få kondensorn att komma i kontakt med glaset.
- Lägg en droppe olja på toppen av täckglaset och vrid på fokusknappen för att få 60x oljesänkningsmålet (NA 0,7–1,25) att vidröra oljan.
- Slå på ljuskällan och vrid på fokuseringsknappen något för att fokusera bildplanet.
OBS: I synfältet är bakgrunden svart, cellerna är ljusa och CTAB-AuNRs (bildförhållande~ 2:1, figur 2) är små färgade (röda, gula eller gröna) spridningsfläckar. - Fånga exempel på spridningsljus med en CMOS-färgkamera. Klicka på "Kameraikonen" i programvaran för att spela in och exportera TIFF-format för att spara bilder.
4. Datainsamling
- Extrahera en enda långsiktig bana
- Använd enligt beskrivningen i figur 3 för att konvertera de mörka fältbilderna i tidsserien från läget "RGB-färg" till läget "8 bitar". Klicka på Bild i bild J | Skriv | 8 bitar. Om du vill justera kontrasten klickar du på | Justera | Ljusstyrka | Kontrast.
- Välj en målpartikel och klipp av tidsseriebakgrunderna genom att boxas och ta bort bakgrunden med "Ctrl+X".
- Öppna partikeldetekterings- och partikellänkfönstret genom att klicka på "Plugins | Partikelspårare Klassisk | Partikelspårare".
- Ställ in Radius på 6, Cutoff till 0 och Percentile till 0,01%.
OBS: För att upptäcka partikeln, justera över tre parametrar med hjälp av Preview. Se till att radien är något större än den riktade partikeln och mindre än den minsta interpartikelseparationen. Percentil är den nedre gränsen för intensitetsfördelning som ska vara kandidatpartiklar. - Ställ in länkintervallet på 5 och deplacement till 10.
OBS: Om du vill länka partikeln mellan intilliggande ramar i följd justerar du ovanstående två parametrar. Förskjutning är de maximala pixlar som en partikel kan flytta mellan två efterföljande bildrutor, och länkområde är antalet på varandra följande bildrutor att tänka på när du bestämmer den bästa motsvarande matchningen. - Klicka på" OK" för att öppna fönstret ParticleTracker Results för att se resultaten.
- Klicka på "Visualisera alla banor" för att inspektera de genererade banorna.
- Klicka på menyn" Länka om partiklar" högst upp för att länka om de detekterade partiklarna med olika länkområde och percentilparametrar, om den programvarugenererade banan inte matchar AuNR:s rörliga bana.
- Klicka på" Spara fullständigrapport " för att spara resultat om den programvarugenererade banan och AuNR:s rörliga bana matchas.
OBS: Ett exempel på hur du extraherar en enda långsiktig bana med bild J visas i figur 4.
- Extrahera multibanor
OBS: Ett exempel på extrakt av flera banor med Fiji visas i figur 5. Det finns flera steg, och varje steg utgör ett steg i spårningsprocessen. Resultatet av varje steg visas omedelbart, vilket gör att användaren kan gå tillbaka till justeringsinställningarna när utdata är otillfredsställande.- Använd enligt beskrivningen i figur 3 för att konvertera de mörka fältbilderna i tidsserien från läget "RGB-färg" till läget "8 bitar". Klicka på " Bild | ibild J-| Skriv | 8 bitar". Om du vill justera kontrasten klickar dupå " | Justera | Ljusstyrka | Kontrast".
- Öppna startpanelen genom att klicka på "Plugins | Spåra | TrackMate". Klicka på "Nästa".
- Välj "LoG-detektorn" i rullgardinsmenyn och klicka på "Nästa".
- Justera parametrarna på detektorkonfigurationspanelen. Ange uppskattad blobdiameter till 10, ange Tröskelvärde till 0 och Välj "Gör underpixellokalisering".
- Klicka på "Nästa" för att öppna den första dekorfiltreringspanelen.
OBS: Flera parametrar kan justeras för att ytterligare optimera målpunkterna. I det här exemplet justerades inga andra parametrar. - Klicka på"Nästa " och välj "HyperStack displayer" på rullgardinsmenyn.
- Klicka på "Nästa" för att öppna dekorfiltreringspanelen. Ställ in kvaliteten över 1,88, X över 38,86, Y över 56,54.
- Klicka på"Nästa " och välj" Simple LAP tracker" på rullgardinsmenyn. Konfigurera den enkla LAP-spåraren genom att justera tre parametrar, det vill säga avståndet Länkning max = 15, Gap-closing max avstånd = 15 och Gap-closing max ramgap = 5.
OBS: Länka-max avstånd är den maximala förskjutningen av en punkt mellan två ramar. Gap-closing max avstånd är den maximala förskjutningen av två segment. Gap-closing max ramgap är den största ramen mellan två punkter som ska överbryggas. - Klicka på "Nästa" för att spåra. När du är klar fortsätter du att klicka på "Nästa".
- Ställ in filter på spår, till exempel ange antal platser i spår över 300.
- Fortsätt klicka på "Nästa" tills den slutliga sparpanelen öppnas. Välj "Exportera spår till XML-fil" på den nedrullningsbara menyn och klicka sedan på "Kör" för att spara i csv-format.
- R/G-värden
OBS: Spridningsintensiteter för riktade AuNR i R- och G-kanalerna erhålls från färg darkfield-bilder med hjälp av en kod skriven i MATLAB (https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020/tree/master/RGandPolarangle), och extraktionsprincipen presenteras i figur 6.- Använd funktionen xycoordination.m för att hitta AuNR:s mittpixelkoordinate i varje bildruta enligt x-y-koordinaten (extraherad av ImageJ/Fiji).
- Använd funktionen RGextraction.m för att avgränsa en matris på 3 x 3 bildpunkter, extrahera de 9 spridningsintensitetsvärdena för R- eller G-kanaler och beräkna ett medelvärde (μ, definierat som R eller G).
Matrisen på 3 x 3 pixlar är centrerad på pixelkoordinaterna från steg 4.3.1.
- Polär vinkel
OBS: Polarvinkeln är vinkeln mellan AuNR:s longitud och den optiska axeln (som visas i figur 1), som kan återspegla AuNR:s rumsliga (Z-axel)rotationsdynamik.- Använd funktionen för polarangle.m för att beräkna polära vinklar (θ) med dubbelkanalsskillnadsmetoden22,
.
- Använd funktionen för polarangle.m för att beräkna polära vinklar (θ) med dubbelkanalsskillnadsmetoden22,
.5. Dataanalys
OBS: Ett systematiskt och robust ramverk för dataanalys är avgörande för prestanda och effektivitet hos SPT-analysmetoder. Den anpassade programvaran skriven i MATLAB används (https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020/tree/master/Analysis_parameters). En graf- och analysprogramvara (se Materialförteckning)används för att rita tomterna.
- Analysparametrar
- Använd skript med csv_data_extract_dis_vel_ss.m och csv_data_MSD.m för att beräkna dynamiska parametrar enligt formler som visas i tabell 1.
OBS: Dessa parametrar används för att analysera dynamiken i AuNRs och består av tre delar. (1) Banrelaterade parametrar: förskjutning, stegstorlek, hastighet, gyrationsradie (Rg)och vridvinkel (Ta). (2) Msd-parametrar: diffusionskoefficient (Dt)och onormal diffusionsexponent (α). och (3) Rotationsrelaterade parametrar: polär vinkel och rotationslöslighet (σ).
- Använd skript med csv_data_extract_dis_vel_ss.m och csv_data_MSD.m för att beräkna dynamiska parametrar enligt formler som visas i tabell 1.
| Åtgärder | Definition | Fysisk betydelse | |
| Förskjutning |  |
Förändringar i objektens position | |
| Stegstorlek |  |
Avstånd mellan två intilliggande punkter | |
| Hastighet |  |
Hastigheten på objektens rörelse | |
| Rg |  |
Flytta objektområde inom ett visst tidsintervall | |
| Ta |  |
Objektens rörelseriktning mellan två intilliggande punkter | |
| Msd |  |
Genomsnittligt rörligt avstånd för objekt i ett visst tidsintervall | |
| Dt (D t) |  |
Diffusionsförmåga hos föremål | |
| Α | |
Normal diffusion (α~1) | |
| Polär vinkel |  |
3D-orienteringsinformation för objekt | |
| Σ |  |
Grad av spridning av polarvinkeldatauppsättningen | |
Tabell 1: Tre typer av parametrar som används för analys. Dessa inkluderar banrelaterade parametrar (deplacement, stegstorlek, hastighet, Rg och Ta), MSD-parametrar (MSD, Dt och α) och rotationsrelaterade parametrar (polär vinkel och rotations lability).
- Visuell analys av bana
OBS: Utvecklingsvisualisering kan intuitivt presentera den spatiotemporala heterogeniteten hos partikelrörelse och banan (koordinat) fördelningen av dynamiska parametrar, såsom tidskartläggningsbana, Rg- och Dt-mappningsbana och polärvinkelkartläggningsbana. Kartläggningsbanor ritades med hjälp av graf- och analysprogramvaran.- Ställ in x-koordinaten som X, y-koordinat som Y och tid (Rg, Dt, polär vinkel) som Z.
- Klicka på "| Spridningsdiagram | Färgmappningsdiagram".
- Lägg till färgfältet.
- MSD-analys
OBS: Partiklarnas rörelseaktivitet och rörelseläge kan erhållas genom MSD-analys23. Ju större Dt, desto mer aktiv är partiklarnas diffusionsrörelse. När α ~1, partiklar gör normala diffusionsrörelser, annars utför de onormal diffusionsrörelse.- Siffror för msd-τ
- Ställ in tidsintervall (τ) som X, MSD-data som Y.
- Klicka på "| Spridningsdiagram"
- Anpassa data genom att klicka på "Analysera | Montering | Nonlinear buktar passande (Fungera: Allometricl)".
- MSD-τ dubbel logaritmisk figur
OBS: MSD-τ dubbel-logaritmic figur, vars lutning är α och fånga upp är Dt, kan intuitivt presentera partikelrörelse.- Ange logaritmiskt tidsintervall som X och logaritmiskt MSD som Y.
- Klicka på "| Spridningsplott".
- Anpassa data genom att klicka på "Analysera | Montering | Linjär kurvkoppling".
- D-τ figur (MSD/4t)
OBS: D=MSD/4τ, är en funktion av tid τ och anomali faktor α, och D-τ siffran visar direkt förändringen av diffusionskoefficienten med tiden. När D ökar med tiden är α större än 1 och partiklar gör superdiffusion rörelse.- Ange logaritmiskt tidsintervall (τ) som X och logaritmiskt D som Y.
- Klicka på "| Spridningsplott".
- Anpassa data genom att klicka på "Analysera | Montering | Nonlinear buktar passande (Fungera: "Allometricl")".
OBS: Ju kortare banor, desto högre är felaktigheten i diffusionsuppskattningarna. I allmänheterhölls D t α genom MSD-τ-analys av lång intervalltid (> 30 τ). Enkel och grov montering jämnar dock ut rörelsedetaljerna. Därför bör MSD-τ-analys av kort intervalltid (< 10 τ) utföras för att analysera partiklarnas rörelsebeteende på kort tid.
- Siffror för msd-τ
- Statistisk analys
- Statistisk analys av flera partiklar
OBS: Statistisk analys av multipartiklar kan återspegla partiklarnas rörelsetillstånd i en rumslig region, vilket indirekt indikerar den rumsliga heterogenitetsmiljön. Till exempel, om histogrammet Dt uppvisar en storskalig fördelning eller multi-peaks fördelning, betyder det att partiklarnas rörelseaktiviteter är heterogena.- Ställ in dynamiska parametrar (till exempel Dt, Rg, max förskjutning) som Y.
- Klicka på "| Histogram".
- Dubbelklicka på histogrammet och ange divisionsstorlek eller antal divisioner. Klicka på" Använd".
- Statistisk analys med en partikel
OBS: Den statistiska analysen av enstaka partiklar kan visa rörelsebeteendet hos enskilda partiklar, vilket också indirekt återspeglar den omgivande miljöns spatiotemporala heterogenitet.- Flera bildrutor
- Beräkna dynamiska parametrar (till exempel Ta, stegstorlek, polär vinkel) för alla bildrutor med en enda lång bana och kopiera till Origin-tabellen och ange som Y.
- Klicka på "| Histogram".
- Dubbelklicka på histogrammet och ange divisionsstorlek eller antal divisioner. Klicka på" Använd".
OBS: Om både Ta och stegstorlek uppvisar en liten värdefördelning, gör partiklarna en liten superdiffusionsrörelse.
- Flytta fönster
- Beräkna dynamiska parametrar (till exempel Rg, Dt) för alla bildrutor med en enda lång bana genom metoden för att flytta fönster (11 bildrutor) och kopiera till Origin-tabellen och ange som Y.
- Klicka på "| Histogram".
- Dubbelklicka på histogrammet och ange divisionsstorlek eller antal divisioner. Klicka på" Använd".
- Flera bildrutor
- Statistisk analys av flera partiklar
- Analys av tidsserier
OBS: Statistisk analys kan avslöja rörelsetillståndet för NPs, och tidsserieanalys kan presentera rörelsebeteendet som ett komplement. Genom att kombinera flera tidsserieparametrar kan det diskriminera NPs rörelsebeteende på temporala och rumsliga nivåer.- Ställ in tiden som X, tidsserieparametrar som Y (t.ex. förskjutning, polär vinkel och Rg).
- Klicka på "| Diagram med flera fönster | Staplad tomt | Rad + symbol".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I protokollet användes de oförändrade 40 x 85 nm CTAB-AuNRs. Som visas i figur 2Bär dess längsgående plasmoniska max vid ~650 nm (röd region) och tvärgående resonans 520 nm (grön region). Tidigare litteraturer har visat att de optiska egenskaperna (såsom LSPR-intensitet) hos plasmoniska AuNRs kommer att förändras avsevärt med deras diameter20,22. I figur 2Cvisade spridningsintensiteten från CTAB-AuNRs på U87-cellmembranet typisk gaussisk fördelning med smal bredd och överensstämde med CTAB-AuNRs på glas, vilket indikerar att CTAB-AuNRs som spårades i detta experiment var väl monodispersed.
Dynamiken hos CTAB-AuNRs på membranet övervakades av DFM (12 fps). Som visas i figur 7erhölls mer än 500 banor (banans längd överstiger 300 bilder). Dessutom kan cirka 40 banor per cell genereras. Rg för alla 500 banor visade en liten fördelning, medelvärdet Rg var 0,5 μm (SD=0,6 μm), och maxförskjutningen var också mer fördelad vid små värden (figur 8). Alla 500 banor kan delas in i två grupper: långdistansdiffusion (Rg>0,5 μm, svarta banor) och begränsad diffusion (Rg<0,5 μm, röda banor).
Enligt CTAB-AuNRs position och inriktning beräknas flera parametrar för dataanalys. Det finns många major att analysera och presentera parametrar under SPT-analys. Den genomsnittliga MSD-analysen av ensembletiden som visas i figur 9A visar att CTAB-AuNRs normalt sprids med α~1. Densitetsfördelningen av Dt-α, som erhållits från alla banor, visar dock att aunr-dynamiken visade en heterogen fördelning med superdifusionsrörelse, brownsk rörelse och subdiffusionsrörelse (figur 9B).
Förutom statistisk analys av multipartiklar utfördes också statistisk analys med en partikel (multiramar). Figur 10 visar två representativa långsiktiga banor: begränsade (Rg=0,34 μm) och rörliga (Rg=1,48 μm). Polarkartläggningsbanan visade att både rörelseområdet och polarvinkeln hos begränsade AuNR var mindre än för rörliga AuNR, vilket innebär att ju starkare interaktionen mellan AuNR och membranet, desto mer tjänar inneslutningen av dess translationella och roterande dynamik. På motsvarande sätt visade histogrammen av Ta och polaren metar av de två AuNRsna olika lägen.
För att ytterligare studera rörelsebeteendet hos AuNRs analyserades tidsserieparametrarna, inklusive bana, förskjutning, polär vinkel och Rg. Som visas i figur 11presenterades olika mönster över tid. Jämfört med långdistans diffusion AuNR var rotationen av den begränsade AuNR relativt begränsad, och dess polära vinklar var mer koncentrerade, fördelade i intervallet 10° ~ 40°. Även om det totala Rg för den rörliga AuNR var större än den totala Rg av begränsad AuNR, var dock tidsserien Rg för att flytta AuNR mindre. Genom att kombinera tidsseriefördelningen av banpunkter och förskjutning kan man dra slutsatsen att begränsad AuNR rör sig i ett begränsat område, men dess rörelseområde på kort tid är större än det rörliga AuNR som är begränsat till membranet. Sammantaget orsakas spatiotemporal heterogen fördelning av translationell och roterande dynamik av den rumsliga och tidsmässiga komplexiteten i membran organisation och struktur.
Figur 1: Schematiskt diagram över den optiska banan för darkfieldmikroskopi, mikroskopbildberedning och dubbelkanalsskillnadsmetoden för beräkning av polär vinkel (θ) för AuNR. Skalstrecket i bilden är 2 μm. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Karakterisering av CTAB-AuNR. A)TEM-bilder av CTAB@AuNRs. B)LSPR-spektrum av CTAB@AuNRs. C)Fördelning av enpartikelintensitet: CTAB@AuNRs på glas (vänster panel), CTAB@AuNRs plasmonmembran (höger panel). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Förbehandling av mörkfältsbilder. Färgbilderna i tidsserien konverterades till läget "8 bitar" och kontrasten justerades. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: Utvinning av en enda långsiktig bana med ImageJ. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5: Utvinning av flera banor med Fiji. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 6: Extraktion av R/G-värden för AuNR med MATLAB. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 7: Alla 527 banor CTAB@AuNRs U87 MG cellmembran spåras med Fiji. Det fanns två grupper: röda banor (Rg<0,5 μm) och svarta banor (Rg>0,5 μm). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 8: Statistisk analys av alla 527 banor med flera partiklar. Fördelning av Rg (A) och maximal deplacement (B). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 9: MSD-analys av alla 527 banor. (A)Plot of ensemble-time averaged MSD versus τ. (B) Density plot i α– log (Dt)plan. Färgkoden representerar den lokala densiteten för banor mellan 0 (blå) och 1 (röd). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 10: Statistisk analys med en partikel. (A-B) Två representativa långsiktiga polarkartläggningsbanor som spårades med ImageJ. Färgkoden representerar polarvinkelvärdet mellan 0 (grön) och 90 (röd). Fördelning av vridvinkel (C-D) och polär vinkel (E-F). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 11: Analys av tidsserier. a,C) Tidskartläggningsbanor. Färgen från rött till blått representerar tidens riktning. (B,D) Tidsserie av parametrar: förskjutning (blå), polär vinkel (grön) och gyrationsradie (Rg, röd). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det presenterade protokollet används för att studera dynamiken hos AuNRs på cellmembran. Protokollet består av fyra delar, inklusive mikroskopisk avbildning, datautvinning, beräkning av dynamiska parametrar och dataanalysmetoder, och varje del är flexibel och universell. Därför finns det många möjliga framtida tillämpningar, till exempel studier av rörelse av NP-länkade membranmolekyler på membran, endocytosdynamik hos NP-märkta receptorer, dynamisk analys av intracellulära NPs och vesikelbelagda NPs-transport längs mikrotubuler och så vidare.
Det grundläggande steget är att använda DFM för att avbilda aunr-rörelsen på cellmembranet. För närvarande har många bildteknik för analys av cellmembrandynamik utvecklats, varav fluorescensmikroskopi har använts i stor utsträckning24. De fotoblekande egenskaperna hos fluorescerande sonder leder dock till oförmågan att spåra partikeldynamik under långa tidsperioder. Här användes ljusstabila plasmoniska AuNR: s. Flera avbildningstekniker har utvecklats baserat på spridningsegenskaperna hos plasmoniska NPs15. I synnerhet samlar DFM med sned belysningsläge bara spridda ljus från proverna, vilket gör att det har ett högt signal-till-brusförhållande.
Både den translationella och rotationsdynamiken i AuNRs erhålls och analyseras. De flesta studier fokuserar på att undersöka de positionella fluktuationerna hos NPs på membranet och ignorera effekterna av orienteringsförändringar25. Dessutom är cellmembranplanet och bildplanet (x-y-planet) i stort sett desamma i de flesta fall, och skillnaden i interaktionen mellan AuNR och cellmembranet är mer anmärkningsvärd i z-riktningen. Därför, även utan azimutvinklar, är polarvinkeln värdefull för analysen av interaktionen mellan AuNRs och cellmembranet. Baserat på DFM och unika optiska egenskaper hos AuNR används polarisering med dubbla kanaler DFM för att erhålla orienteringsinformation från AuNRs (I1 + I2 
sin2θ)19,26. Beräkningsnoggrannheten hos polära vinklar påverkas dock av de maximala och minsta detektionsintensiteterna som påverkas starkt av omgivningen. Därför måste vissa ändringar göras. Här användes (R-G) för att beräkna polarvinkeln, och G-värdet som fungerar som en intern referens kan effektivt minska de systematiska felen och öka mätnoggrannheten.
De kritiska stegen är datautvinning och dynamisk parameterberäkning, vilket är viktigt för att analysera dynamiken i NP på membranet. Banor av AuNRs på membran extraheras med hög rumslig upplösning27,28 från sekvensanalys med ImageJ / Fiji. R\G-värdena och polära vinklar beräknas med MATLAB (https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020). Flera parametrar beräknas på samma sätt med MATLAB enligt positioner och polära vinklar (tabell 1). I SPT-analys finns det många sätt att utföra parametrar analys och visning. Därför är det nödvändigt att använda så många analysmetoder och visualiseringsverktyg som möjligt för att analysera dynamiken i NP, och sedan sammanfatta och extrahera en ny synvinkel från många analysresultat. Normalt finns det alltid några kompromisser att göra, vilket inte är ett lätt arbete.
NPs dynamiska tillstånd och rörelsebeteende kan analyseras och presenteras systematiskt uppifrån och ned med hjälp av omfattande analysmetoder och multivariata presentationsmetoder. Med hjälp av statistisk analys av multipartiklar kan vi få ensemblens rörelsetillstånd för NPs över hela cellmembranplanet. De dynamiska studierna på enskilda NPs/molekyler baserade på fluorescensavbildning29 använder oftast denna övergripande statistiska metod eftersom endast ett stort antal kortsiktiga banor kan övervakas. Ensemblens genomsnittsmetod jämnar dock ut och ignorerar enskilda detaljer. Som ett komplement används statistisk analys med en partikel för att kvantitativt presentera det dynamiska tillståndet hos enskilda NPs. Under tiden är det viktigt att utföra tidsserieparameteranalys av enskilda eller segmentbanor, vilket kan ge rörelsebeteenden hos NPs som en funktion av tiden.
Sammanfattningsvis föreslår vi ett integrerat protokoll för att studera diffusionsdynamiken hos AuNRs på levande cellmembran med SPT-metod. Dynamiken hos AuNRs övervakades med en enda nanopartikel DFM, extraheras med ImageJ och MATLAB, och kännetecknas av omfattande analytiska metoder. AuNRs gjorde onormal diffusion rörelse på U87 MG cellmembran, och dess rörelse visar spatiotemporal heterogenitet. Detta protokoll kan potentiellt användas för studier av andra typer av komplexa biologiska system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China med bidragsnummer 21425519, 91853105 och 21621003.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CTAB coated gold nanorods(CTAB-AuNRs) | Nanoseedz | NR-40-650 | 85 nm * 40 nm |
| Color CMOS camera | Olympus | DP74 | Japan |
| Coverslips | Citoglas | z10212222C | 22*22 mm |
| Dark-field microscopy | Nikon | 80i | upright microscope |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10099141 | |
| Fiji | National Institutes of Health | 2.0.0-rc-69/1.52 p | a distribution of ImageJ |
| Grooved glass slide | Sail brand | 7103 | Single concave |
| Image J | National Institutes of Health | 1.52 j | |
| MATLAB | MathWorks | R2019b | |
| MATLAB Code | https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020 | ||
| Minimum essential medium (MEM) | Gibco | 10-010-CVR | with phenol red |
| Minimum essential medium (MEM) | Gibco | 51200038 | no phenol red |
| Origin | OriginLab | Origin Pro 2018C | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Plastic cell culture dishes | Falcon | 353002 | |
| Plastic cell culture dishes | Falcon | 353001 | 35*10 mm |
| U87 MG cell | American Type Culture Collection | ATCC HTB-14 | a human primary glioblastoma cell line |
References
- Rees, P., Wills, J. W., Brown, M. R., Barnes, C. M., Summers, H. D. The origin of heterogeneous nanoparticle uptake by cells. Nature Communication. 10 (1), 2341 (2019).
- Behzadi, S., et al. Cellular uptake of nanoparticles: journey inside the cell. Chemical Society Reviews. 46 (14), 4218-4244 (2017).
- Shen, H., et al. Single Particle Tracking: From Theory to Biophysical Applications. Chemical Reviews. 117 (11), 7331-7376 (2017).
- Saxton, M. J.
- Kusumi, A., et al. Dynamic organizing principles of the plasma membrane that regulate signal transduction: commemorating the fortieth anniversary of Singer and Nicolson's fluid-mosaic model. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 215-250 (2012).
- Jacobson, K., Liu, P., Lagerholm, B. C. The Lateral Organization and Mobility of Plasma Membrane Components. Cell. 177 (4), 806-819 (2019).
- Sezgin, E., Levental, I., Mayor, S., Eggeling, C. The mystery of membrane organization: composition, regulation and roles of lipid rafts. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 361-374 (2017).
- von Diezmann, A., Shechtman, Y., Moerner, W. E. Three-Dimensional Localization of Single Molecules for Super-Resolution Imaging and Single-Particle Tracking. Chemical Reviews. 117 (11), 7244-7275 (2017).
- Rosenberg, J., Huang, J. Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (155), e59914 (2020).
- Kusumi, A., Tsunoyama, T. A., Hirosawa, K. M., Kasai, R. S., Fujiwara, T. K. Tracking single molecules at work in living cells. Nature Chemical Biology. 10 (7), 524-532 (2014).
- Rocha, J. M., Gahlmann, A. Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules. Journal of Visualized Experiments. (151), e59387 (2019).
- Uphoff, S., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. Visualizing protein-DNA interactions in live bacterial cells using photoactivated single-molecule tracking. Journal of Visualized Experiments. (85), e511177 (2014).
- Pinaud, F., Clarke, S., Sittner, A., Dahan, M. Probing cellular events, one quantum dot at a time. Nature Methods. 7 (4), 275-285 (2010).
- Mehidi, A., et al. Transient Activations of Rac1 at the Lamellipodium Tip Trigger Membrane Protrusion. Current Biology. 29 (17), 2852-2866 (2019).
- Ye, Z., Wang, X., Xiao, L. Single-Particle Tracking with Scattering-Based Optical Microscopy. Analytical Chemistry. 91 (24), 15327-15334 (2019).
- Pan, Q., Zhao, H., Lin, X., He, Y. Spatiotemporal Heterogeneity of Reactions in Solution Observed with High-Speed Single-Nanorod Rotational Sensing. Angewandte Chemie. International Ed. in English. 58 (25), 8389-8393 (2019).
- Taylor, R. W., et al. Interferometric scattering microscopy reveals microsecond nanoscopic protein motion on a live cell membrane. Nature Photonics. 13 (7), 480-487 (2019).
- Chen, K., et al. Characteristic rotational behaviors of rod-shaped cargo revealed by automated five-dimensional single particle tracking. Nature Communication. 8 (1), 887 (2017).
- Xu, D., He, Y., Yeung, E. S. Y. Direct observation of the orientation dynamics of single protein-coated nanoparticles at liquid/solid interfaces. Angewandte Chemie. International Ed. in English. 53 (27), 6951-6955 (2014).
- Lehui, X., Yan, H., Edward, S. Y. Three Dimensional Orientational Imaging of Nanoparticles with Darkfield Microscopy. Analytical Chemistry. 82, 5268-5274 (2010).
- Ge, F., Xue, J., Wang, Z., Xiong, B., He, Y. Real-time observation of dynamic heterogeneity of gold nanorods on plasma membrane with darkfield microscopy. Science China Chemistry. 62, 1072-1081 (2019).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Janczura, J., Weron, A. Ergodicity testing for anomalous diffusion: small sample statistics. The Journal of Chemical Physics. 142 (14), 144103 (2015).
- Kim, D. H., et al. Single particle tracking-based reaction progress kinetic analysis reveals a series of molecular mechanisms of cetuximab-induced EGFR processes in a single living cell. Chemical Science. 8 (7), 4823-4832 (2017).
- Kurzthaler, C., et al. Probing the Spatiotemporal Dynamics of Catalytic Janus Particles with Single-Particle Tracking and Differential Dynamic Microscopy. Physical Review Letters. 121 (7), 078001 (2018).
- Lin, X., Pan, Q., He, Y. In situ detection of protein corona on single particle by rotational diffusivity. Nanoscale. 11 (39), 18367-18374 (2019).
- Wei, L., et al. Sub-diffraction-limit localization imaging of a plasmonic nanoparticle pair with wavelength-resolved dark-field microscopy. Nanoscale. 9 (25), 8747-8755 (2017).
- Cheng, X., Dai, D., Xu, D., He, Y., Yeung, E. S. Subdiffraction-limited plasmonic imaging with anisotropic metal nanoparticles. Analytical Chemistry. 86 (5), 2303-2307 (2014).
- Belyy, V., et al. PhotoGate microscopy to track single molecules in crowded environments. Nature Communication. 8, 13978 (2017).
