Summary
Her viser vi brugen af traditionel mørkfeltmikroskopi til at overvåge dynamikken i guld nanorods (AuNRs) på cellemembran. Placeringen og retningen af enkelte AuNR'er registreres ved hjælp af ImageJ og MATLAB, og auNR'ernes diffusive tilstande er kendetegnet ved enkelt partikelsporingsanalyse.
Abstract
Analyse af nanopartiklers diffusionsdynamik på cellemembran spiller en væsentlig rolle i en bedre forståelse af den cellulære optagelsesproces og giver et teoretisk grundlag for det rationelle design af nanomedicinsk levering. Enkelt partikelsporing (SPT) analyse kunne sonde placeringen og orienteringen af de enkelte nanopartikler på cellemembran, og afsløre deres translationelle og roterende tilstande. Her viser vi, hvordan man bruger traditionel mørkfeltmikroskopi til at overvåge dynamikken i guld nanorods (AuNRs) på levende cellemembran. Vi viser også, hvordan man udtrækker placeringen og orienteringen af AuNR'er ved hjælp af ImageJ og MATLAB, og hvordan man karakteriserer auNR'ernes forskellige tilstande. Statistisk analyse af hundredvis af partikler viser, at enkelte AuNR'er udfører Brownian bevægelse på overfladen af U87 MG cellemembran. Men individuelle lange baneanalyser viser, at AuNR'er har to tydeligt forskellige typer bevægelsestilstande på membranen, nemlig langtrækkende transport og indespærring i begrænset område. Vores SPT-metoder kan potentielt bruges til at studere overfladen eller intracellulær partikelspredning i forskellige biologiske celler og kan blive et kraftfuldt værktøj til undersøgelser af komplekse cellulære mekanismer.
Introduction
Dynamikken i nanopartikler (NPs) på membranen er tæt forbundet med den cellulære optagelsesproces, hvilket er afgørende for forståelsen af cellefunktioner, virale eller bakterielle infektioner og udviklingen af kunstige nanomedicinske leveringssystemer1,2. SPT-teknik (Single Particle Tracking) er et robust værktøj til at karakterisere NPs3,4' heterogene adfærd. Generelt er cellemembran flydende, hvilket betyder, at komponenterne som proteiner og lipider kan bevæge sig sideværts i plasmamembranplanet5,6,7. Den spatiotemporale kompleksitet af membran organisation og struktur kan føre til spatiotemporal heterogenitet af samspillet mellem NPs og membran. Derfor kræver direkte visualisering af NPs bevægelse på membranen både høj rumlig og tidsmæssig opløsning.
Enkelt partikelsporing mikroskopi, der overvåger lokaliseringen af individuelle partikler i levende celler med en rumlig opløsning af snesevis af nanometer og en tidsopløsning på millisekunder er blevet veludviklet til at studere NPs eller membranmolekyler dynamik8,9. Fluorescensbaserede mikroskopiske billeddannelsesteknikker er blevet værdifulde værktøjer til observation af NPs/molekyler i levende cellemiljø9,10,11,12. For eksempel, total intern refleksion fluorescens mikroskopi, som billeder tynde lag (~ 100 nm) af prøven på substratet / opløsning interface med en høj spatiotemporal opløsning har været meget udbredt i undersøgelser af membran molekyler dynamik13,14. De iboende ulemper ved enkelte fluorophorer, såsom lav intensitet og hurtig irreversibel fotobleaching, reducerer imidlertid nøjagtigheden og varigheden af sporing13. Derfor har ikke-fluorescerende plasmoniske NPs, som erstatter fluorescerende sonder, tiltrukket mere og mere opmærksomhed i langsigtede billeddiagnostiske undersøgelser på grund af deres unikke optiske egenskaber15. Baseret på spredningssignaler fra plasmoniske NP-sonder er der anvendt flere former for optisk mikroskopiske billeddannelsesteknologier til at studere mekanismen for biologiske processer, såsom mikroskopi i mørke felter (DFM)16, interferometrisk spredning (iSCAT) mikroskopi17 og differentialinterferenskonsekvensmikroskopi (DICM)18. Derudover kan bevægelses- og rotationsdynamikken i AuNR'er opnås ved hjælp af DFM og DICM18,19,20,21,22. I et SPT-eksperiment registreres objektets bevægelse typisk af det optiske mikroskop og analyseres derefter ved SPT-analysemetoder3. De tidsløste baner og orienteringsvinkler, der genereres af individuelle NPs, er normalt stokastiske og heterogene, så det er nødvendigt at præsentere rigelige dynamiske oplysninger med forskellige analysemetoder.
Her leverer vi en integreret protokol, der overvåger dynamikken i AuNR'er på cellemembran ved hjælp af DFM, udtrækker placeringen og orienteringen af AuNR'er med ImageJ og MATLAB og karakteriserer udbredelsen af AuNR'er med SPT-analysemetoder. Som en demonstration viser vi her, hvordan man bruger SPT-protokollen til at visualisere dynamikken i uændrede AuNRs (CTAB-AuNRs, syntetiseret af cetyltrimethylammonium ammoniumbromidmolekyle som beskyttelsesmiddel) på U87 MG cellemembran. Det er blevet påvist, at CTAB-AuNRs kan adsorbere proteiner i biologisk miljø, bevæge sig på cellemembran og derefter indtaste celler2,20,22. U87 MG-celle er den mest almindelige og mest ondartede tumor i centralnervesystemet, og dens membranreceptorer udtrykkes unormalt. Membranreceptorerne kan interagere med proteiner på AuNR'er, hvilket påvirker auNR'ernes dynamik. Vores protokol gælder generelt for andre SPT-eksperimenter inden for biologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellekultur
- Forbered komplet medium til U87 MG-celler ved at tilsætte føtalt kvægserum (endelig koncentration 10%) og penicillin-streptomycin (endelig koncentration 1%) til det essentielle minimumsmedium (MEM). Brug plast cellekultur parabol for celler subkultur.
- Passage celler 2 til 3 gange om ugen.
- Fjern dyrkningsmediet, og skyl cellelaget med Dulbeccos fosfatbufferede saltvand (D-PBS) 2~3 gange, når det er sammenflydende (80%~90%).
- Der tilsættes 1,0 til 2,0 ml Trypsin-EDTA-opløsning til cellekulturskålen, og cellerne observeres under et omvendt mikroskop, indtil cellerne bliver runde (3~5 min.
- Tilsæt 3,0 mL forberedt komplet medium og spred cellerne ved forsigtigt pipettering.
- Tilføj celleaffjedring (1 mL) til ny kulturret med frisk cellemedium (3 mL) og genbrug cellerne.
- Cellerne skal opbevares ved 37 °C og 5% CO2 i fugtig atmosfære.
2. Forberedelse af mikroskopdias
BEMÆRK: U87 MG-celler af tredje til tiende generation med høj aktivitet anvendes i SPT-eksperimenter.
- Steriliser 22 mm × 22 mm coverslips, der allerede er rengjort med Piranha-opløsning ved nedsænkning i ethanol (99,9%).
- Brug tang til at fjerne dækslet fra ethanolopløsningen (trin 2.1) og steriliser ved at brænde ethanol på flammen. Når al ethanol er brændt, skal du placere coverslips i en plastcellekulturskål (35 x 10 mm) fyldt med 2 mL cellemedium (ingen phenolrød).
- Der tilsættes 50 μL af celleophænget fra trin 1.2.3 på coverlip'en, og træk forsigtigt skålen frem og tilbage og til venstre og højre for at fordele cellerne jævnt. Placer det i en befugtet atmosfære.
- Når U87 MG-celler på coverslip når 20%-40% sammenløb (~12 h), tilsættes 20 μL CTAB-AuNRs (138 pM) i skålen og spredes. Inkuber i befugtet atmosfære i 5 min.
- Der tilsættes 100 μL af kulturmediet (ingen phenolrød) fra skålen i trin 2.4 i rillen på den rillede glasrutsjebane (Figur 1), som er præcleaned med Piranha-opløsning.
- Tag coverlip ud fra fadet og omvendt på toppen af rillen af mikroskopet glas dias(Figur 1). Forsegl med neglelak, lad det tørre og læg det på scenen for at udføre SPT-eksperimenter.
3. Udførelse af enkeltpartikelsporingseksperimenter med darkfield-mikroskopi (figur 1).
- Placer en dråbe olie på den olie-nedsænkede darkfield kondensator (NA 1,43-1,20) og drej på knappen for at gøre kondensatoren kontakte glasset dias.
- Sæt en dråbe olie på toppen af dækglasset, og drej fokusknappen for at få 60x oliedybdemålet (NA 0,7-1,25) til at røre ved olien.
- Tænd lyskilden, og drej lidt på fokusknappen for at fokusere billedplanet.
BEMÆRK: I synsfeltet er baggrunden sort, cellerne er lyse, og CTAB-AuNR'erne (højde-bredde-forhold~2:1, Figur 2) er små farvede (røde, gule eller grønne) spredningspunkter. - Indfang eksempelspredningslys af et CMOS-farvekamera. Klik på "Kameraikon" i softwaren for at optage og eksportere TIFF-format for at gemme billeder.
4. Erhvervelse af data
- Uddrag enkelt langsigtet bane
- Fungere som beskrevet i figur 3 for at konvertere billeder i mørke felter i tidsserier fra tilstanden "RGB-farve" til "8 bit"-tilstand. Klik på Billede | Skriv | 8 bit. Hvis du vil justere kontrasten, skal du klikke på Billede | Juster | Lysstyrke | Kontrast.
- Vælg en målpartikel, og afskær tidsseriebaggrundene ved at bokse og slette baggrunden med "Ctrl+X".
- Åbn vinduet partikeldetektering og partikelkædning ved at klikke på "Plugins | Partikel Tracker Classic | Partikel tracker".
- Indstil Radius til 6, Cutoff til 0 og Percentil til 0,01%.
BEMÆRK: For at detektere partiklerne skal du justere over tre parametre ved hjælp af Preview. Sørg for, at radius er lidt større end den målrettede partikel og mindre end den mindste inter-partikel adskillelse. Percentil er den nedre grænse for intensitetsfordeling, at der skal kandidat partikler. - Indstil kædeområdet til 5 og Forskydning til 10.
BEMÆRK: Hvis du vil forbinde partikel mellem fortløbende tilstødende rammer, skal du justere ovenstående to parametre. Forskydning er de maksimale pixel, som en partikel kan flytte mellem to efterfølgende rammer, og LinkOmråde er det antal fortløbende rammer, der skal overvejes, når det bedst tilsvarende match bestemmes. - Klik på "OK" for at åbne vinduet ParticleTracker Results for at se resultaterne.
- Klik på "Visualiser alle baner" for at undersøge de genererede baner.
- Klik på menuen "Sammenkæd partiklerigen " øverst for at forbinde de fundne partikler med forskellige linkområde- og fraktilparametre, hvis den softwaregenererede bane ikke svarer til AuNR's bevægelige bane.
- Klik på "Gem fuld rapport" for at gemme resultater, hvis den softwaregenererede bane og AuNR's bevægelige bane matches.
BEMÆRK: Et eksempel på udvinding af en enkelt langsigtet bane med billede J er vist i figur 4.
- Udvinding af multibaner
BEMÆRK: Et eksempel på udvinding af multibaner med Fiji er vist i figur 5. Der er flere faser, og hvert trin udgør et trin i sporingsprocessen. Resultatet af hvert trin vises med det samme, hvilket giver brugeren mulighed for at gå tilbage for at justere indstillingerne, når outputtet er utilfredsstillende.- Fungere som beskrevet i figur 3 for at konvertere billeder i mørke felter i tidsserier fra tilstanden "RGB-farve" til "8 bit"-tilstand. Klik på "Billede | Skriv | 8 bit". Klik på "Billede | Juster | Lysstyrke | Kontrast".
- Åbn startpanelet ved at klikke på "Plugins | Sporing af | TrackMate". Klik på "Næste".
- Vælg "LoG-detektoren" i rullemenuen, og klik på "Næste".
- Juster parametrene for detektorkonfigurationspanelet. Angiv Anslået blobdiameter til 10, angiv Tærskel til 0, og vælg "Foretag lokalisering af underpixel".
- Klik på "Næste" for at åbne det første staffagefiltreringspanel.
BEMÆRK: Flere parametre kan justeres for yderligere at optimere målpunkterne. I dette eksempel blev ingen andre parametre justeret. - Klik på "Næste", og vælg "HyperStack displayer" i rullemenuen.
- Klik på "Næste" for at åbne panelet Staffagefarvefiltrering. Indstil kvalitet over 1,88, X over 38,86, Y over 56,54.
- Klik på "Næste", og vælg "Simpel LAPtracker " i rullemenuen. Konfigurer den simple LAP tracker ved at justere tre parametre, det vil sige Linking max distance = 15, Gap-closing max distance = 15 og Gap-closing max frame gap = 5.
BEMÆRK: Sammenkædning-max afstand er den maksimale forskydning af et punkt mellem to rammer. Maks. afstand til lukning af mellemrum er den maksimale forskydning af to segmenter. Mellemrumslukkende maks. rammegab er den største ramme mellem to punkter, der skal bygges bro over. - Klik på "Næste" for at spore. Når du er færdig, skal du fortsætte med at klikke på "Næste".
- Angiv filtre på spor, f.eks.
- Fortsæt med at klikke på "Næste", indtil det endelige lagringspanel er åbent. Vælg "Eksporter spor til XML-fil" i rullemenuen, og klik derefter på "Udfør" for at gemme i csv-format.
- R/G-værdier
BEMÆRK: Spredningsintensiteter af målrettede auNR'er i R- og G-kanalerne opnås fra farve mørkefeltbilleder ved hjælp af en kode skrevet i MATLAB (https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020/tree/master/RGandPolarangle), og ekstraktionsprincippet er præsenteret i figur 6.- Brug funktionen xykoordination.m til at finde den midterste pixelkoordinat for AuNR i hver ramme i henhold til x-y-koordinaten (udtrukket af ImageJ/Fiji).
- Brug funktionen RGextraction.m til at afgrænse en matrix på 3 x 3 pixel, udtrække de 9 spredningsintensitetsværdier for R- eller G-kanaler og beregne en gennemsnitlig værdi (μ, defineret som R eller G).
BEMÆRK: Matrixen på 3 x 3 pixel er centreret om de pixelkoordinater, der hentes fra trin 4.3.1.
- Polær vinkel
BEMÆRK: Polarvinklen er vinklen mellem AuNR's længdegrad og den optiske akse (som vist i figur 1), som kan afspejle AuNR's rumlige (Z-akse) rotationsdynamik.- Brug polaranglens funktion.m til at beregne polarvinklerne (θ) ved hjælp af differentialmetoden med to kanaler22,
.
- Brug polaranglens funktion.m til at beregne polarvinklerne (θ) ved hjælp af differentialmetoden med to kanaler22,
.5. Dataanalyse
BEMÆRK: En systematisk og robust dataanalyseramme er afgørende for SPT-analysemetodernes ydeevne og effektivitet. Den brugerdefinerede software, der er skrevet i MATLAB, bruges (https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020/tree/master/Analysis_parameters). En graf- og analysesoftware (se Materialeoversigt)bruges til at tegne observationsområderne.
- Analyseparametre
- Brug scripts af csv_data_extract_dis_vel_ss.m og csv_data_MSD.m til at beregne dynamiske parametre i henhold til formlerne i tabel 1.
BEMÆRK: Disse parametre bruges til at analysere dynamikken i AuNR'er og består af tre dele. (1) Banerelaterede parametre: forskydning, trinstørrelse, hastighed, gyrationsradius (Rg) og drejevinkel (Ta); 2) MSD-parametre: diffusionskoefficient (Dt)og unormal diffusionseksponering (α) og (3) Rotationsrelaterede parametre: polarvinkel og rotationsdygtighed (σ).
- Brug scripts af csv_data_extract_dis_vel_ss.m og csv_data_MSD.m til at beregne dynamiske parametre i henhold til formlerne i tabel 1.
| Foranstaltninger | Definition | Fysisk betydning | |
| Forskydning |  |
Ændringer i objekters placering | |
| Trinstørrelse |  |
Afstand mellem to tilstødende punkter | |
| Hastighed |  |
Hastighed af objekter bevægelse | |
| Rg |  |
Flytte område af objekter i et bestemt tidsinterval | |
| Ta |  |
Bevægelsesretning af objekter mellem to tilstødende punkter | |
| Msd |  |
Gennemsnitlig bevægelig afstand af objekter i et bestemt tidsinterval | |
| Dt |  |
Objekters diffusionsevne | |
| Α | |
Normal diffusion (α~1) | |
| Polær vinkel |  |
3D-retningsoplysninger om objekter | |
| Σ |  |
Graden af spredning af datasættet for polarvinklen | |
Tabel 1: Tre typer parametre, der anvendes til analyse. Disse omfatter banerelaterede parametre (forskydning, trinstørrelse, hastighed, Rg og Ta), MSD-parametre (MSD, Dt og α) og rotationsrelaterede parametre (polarvinkel og rotationslabilitet).
- Visuel analyse af bane
BEMÆRK: Banevisualisering kan intuitivt præsentere partikelbevægelsens spatiotemporale heterogenitet og banefordelingen (koordinatfordelingen) af dynamiske parametre, såsom tidskortlægningsbane, Rg- og Dt-kortlægningsbane og polarvinkelkortlægningsbane. Kortlægningsbaner blev tegnet ved hjælp af graf- og analysesoftwaren.- Angiv x koordinat som X, y koordinat som Y og klokkeslæt (Rg, Dt, polarvinkel) som Z.
- Klik på "Plot | Scatter plot | Farvetilknytningsplot".
- Tilføj farvelinjen.
- Msd-analyse
BEMÆRK: Partiklernes bevægelsesaktivitet og bevægelsestilstand kan opnås ved MSD-analyse23. Jo større Dt, jo mere aktiv diffusionsbevægelsen af partiklerne. når α~1, udfører partikler normal diffusionsbevægelse, ellers udfører de unormal diffusionsbevægelse.- Msd-τ-tal
- Angiv tidsinterval (τ) som X, MSD-data som Y.
- Klik på "Plot | Scatter plot"
- Tilpas data ved at klikke på "Analyser | Montering | Ikke-lineær kurvetilpasning (Funktion: Allometricl)".
- Msd-τ dobbelt-logaritmisk tal
BEMÆRK: MSD-τ dobbelt-logaritmisk figur, hvis hældning er α og skæringspunkt er Dt, kan intuitivt præsentere partikel bevægelse.- Angiv logaritmisk tidsinterval som X og logaritmisk MSD som Y.
- Klik på "Plot | Scatter plot".
- Tilpas data ved at klikke på "Analyser | Montering | Lineær kurve montering".
- D-τ tal (MUSKEL/4t)
BEMÆRK: D=MSD/4τ, er en funktion af tid τ og anomali faktor α, og D-τ tallet direkte viser ændringen af diffusion koefficient med tiden. Når D stiger med tiden, er α større end 1 og partikler gør superdiffusion bevægelse.- Angiv logaritmisk tidsinterval (τ) som X og logaritmisk D som Y.
- Klik på "Plot | Scatter plot".
- Tilpas data ved at klikke på "Analyser | Montering | Ikke-lineær kurvetilpasning (Funktion: "Allometricl")".
BEMÆRK: Jo kortere baner, jo højere unøjagtighed af diffusion skøn. Generelt blev Dt og α gennem MSD-τ analyse af lang intervaltid (> 30 τ) opnået. Enkel og grov montering vil dog udjævne bevægelsesdetaljer. Derfor bør MSD-τ analyse af kort interval tid (< 10 τ) udføres for at analysere bevægelsesadfærden af partikler på kort tid.
- Msd-τ-tal
- Statistisk analyse
- Statistisk analyse af flere partikler
BEMÆRK: Statistisk analyse af multipartikler kan afspejle partikelernes bevægelsestilstand i et rumligt område, hvilket indirekte angiver det rumlige heterogenitetsmiljø. For eksempel, hvis histogrammet af Dt udviser en storstilet distribution eller multi-toppe distribution, betyder det, at bevægelsesaktiviteter af partikler er heterogene.- Angiv dynamiske parametre (f.eks.
- Klik på "Plot | Histogram".
- Dobbeltklik på histogrammet, og angiv divisionens størrelse eller antallet af divisioner. Klik på "Anvend".
- Statistisk analyse med en enkelt partikel
BEMÆRK: Den statistiske analyse af enkelte partikler kan vise bevægelsesadfærden af individuelle partikler, som også indirekte afspejler spatiotemporal heterogeniteten i det omgivende miljø.- Flere rammer
- Beregn dynamiske parametre(f.eks.
- Klik på "Plot | Histogram".
- Dobbeltklik på histogrammet, og angiv divisionens størrelse eller antallet af divisioner. Klik på "Anvend".
BEMÆRK: Hvis både Ta og trinstørrelse udviser en lille værdifordeling, udfører partiklerne en lille trins super-diffusionsbevægelse.
- Flytning af vinduer
- Beregn dynamiske parametre (f.eks. Rg, Dt) for alle rammer med en enkelt lang bane ved hjælp af flyttevinduesmetode (11 rammer), og kopier til Origin-tabellen og sæt den som Y.
- Klik på "Plot | Histogram".
- Dobbeltklik på histogrammet, og angiv divisionens størrelse eller antallet af divisioner. Klik på "Anvend".
- Flere rammer
- Statistisk analyse af flere partikler
- Analyse af tidsserier
BEMÆRK: Statistisk analyse kan afsløre bevægelsestilstanden for NPs, og tidsserieanalyse kan præsentere bevægelsesadfærden som et supplement. Ved at kombinere flere tidsserieparametre kan det diskriminere NPs bevægelsesadfærd på det tidsmæssige og rumlige niveau.- Angiv tid som X, tidsserieparametre som Y (f.eks. forskydning, polær vinkel og Rg).
- Klik på "Plot | Diagram med flere ruder | Stablet plot | Linje + Symbol".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I protokollen blev de uændrede 40 x 85 nm CTAB-AuNR'er brugt. Som det fremgår af figur 2B, er dets højde for plasmonisk længde på ~650 nm (rød region), og den tværgående resonans er på 520 nm (grøn region). Tidligere litteratur har afsløret, at de optiske egenskaber (såsom LSPR intensitet) af plasmoniske AuNRs vil ændre sig betydeligt med deres diameter20,22. I figur 2Cviste spredningsintensiteten fra CTAB-AuNRs på U87-cellemembranen typisk gaussisk fordeling med smal bredde og var i overensstemmelse med CTAB-AuNR's på glas, hvilket indikerer, at CTAB-AuNR'er, der spores i dette eksperiment, var godt monodisperserede.
Dynamikken i CTAB-AuNRs på membran blev overvåget af DFM (12 fps). Som vist i figur 7blev der opnået mere end 500 baner (banelængden overstiger 300 billeder). Derudover kan der genereres ca. 40 baner pr. celle. Rg af alle 500 baner viste en fordeling af små værdier, den gennemsnitlige Rg var 0,5 μm (SD=0,6 μm), og maks. forskydningen var også mere fordelt ved små værdier (Figur 8). Alle 500 baner kan opdeles i to grupper: langtrækkende diffusion (Rg>0,5 μm, sorte baner) og begrænset diffusion (Rg<0,5 μm, røde baner).
I henhold til CTAB-AuNR's placering og retning beregnes flere parametre til dataanalyse. Der er mange mays at analysere og præsentere parametre under SPT-analyse. Den gennemsnitlige MSD-analyse for ensembletid, der er vist i figur 9A, viser, at CTAB-AuNR'er normalt er diffuse med α~1. Tæthedsfordelingen af Dt-α, der er opnået fra alle baner, afslører imidlertid, at dynamikken i AuNR'er viste en heterogen fordeling med superdifusionsbevægelse, browniansk bevægelse og subdiffusionsbevægelse (Figur 9B).
Ud over statistisk analyse af multipartikler blev der også udført statistiske enkeltpartikler (multirammer). Figur 10 viser to repræsentative langsigtede baner: begrænset (Rg=0,34 μm) og bevægende (Rg= 1,48 μm). Polarkortlægningsbanen viste, at både bevægelsesområdet og polarvinklen på begrænsede AuNR'er var mindre end for bevægelige AuNR'er, hvilket betyder, at jo stærkere samspillet mellem AuNR'er og membran er, desto mere tjener indespærringen af dens translationelle og roterende dynamik. Tilsvarende viste histogrammerne af Ta og polarvinkel af de to AuNR'er forskellige tilstande.
For yderligere at studere bevægelsesadfærden hos AuNR'er blev tidsserieparametrene analyseret, herunder bane, forskydning, polarvinkel og Rg. Som det fremgår af figur 11, blev der over tid præsenteret forskellige mønstre. Sammenlignet med langdistance-diffusionen AuNR var rotationen af den begrænsede AuNR relativt begrænset, og dens polære vinkler var mere koncentrerede, fordelt i området 10° ~ 40°. Selv om den samlede Rg af den bevægelige AuNR var større end den samlede Rg af begrænset AuNR, var tidsserierne for flytningaf AuNR mindre. Ved at kombinere tidsseriefordelingen af banepunkter og forskydning kan det udledes, at begrænsede AuNR-bevægelser i et begrænset område, men dens bevægelsesområde på kort tid er større end den bevægelige AuNR, der er begrænset på membranen. Samlet set er den spatiotemporale heterogene fordeling af translationel og rotationsdynamik forårsaget af den rumlige og tidsmæssige kompleksitet af membranorganisation og struktur.
Figur 1: Skematisk diagram over den optiske kurve for darkfield-mikroskopmikroskopi, forberedelse af mikroskopdias og metoden til forskel på to kanaler til beregning af polarvinkel (θ) for AuNR'er. Skalalinjen i billedet er 2 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Karakterisering af CTAB-AuNRs. (A)TEM-billeder af CTAB@AuNRs. (B) LSPR-frekvenser af CTAB@AuNRs. (C) Fordeling af enkelt partikelintensitet: CTAB@AuNRs på glas (venstre panel), CTAB@AuNRs på plasmonmembran (højre panel). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Forbehandling af darkfield-billeder. Farvebilleder i tidsserier blev konverteret til "8 bit"-tilstand, og deres kontrast blev justeret. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Ekstraktion af en enkelt langsigtet bane med ImageJ. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Udvinding af multibaner med Fiji. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Ekstraktion af R/G-værdier af auNR'er med MATLAB. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Alle 527 baner af CTAB@AuNRs på U87 MG cellemembran spores med Fiji. Der var to grupper: røde baner (Rg<0,5 μm) og sorte baner (Rg>0,5 μm). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: Statistisk analyse af multipartikler af alle 527 baner. Fordeling af Rg (A) og maksimal forskydning (B). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9: MSD-analyse af alle 527 baner. (A) Plot of ensemble-time gennemsnit MSD versus τ. (B) Tæthed plot i α- log (Dt)plan. Farvekoden repræsenterer den lokale tæthed af baner mellem 0 (blå) og 1 (rød). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 10: Statistisk enkelt partikelanalyse. (A-B) To repræsentative langsigtede polarkortlægningsbaner, der blev sporet med ImageJ. Farvekoden repræsenterer polarvinkelværdien mellem 0 (grøn) og 90 (rød). Fordeling af drejevinkel (C-D) og polarvinkel (E-F). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 11: Analyse af tidsserier. (A,C) Tidskortlægningsbaner. Farven fra rød til blå repræsenterer tidsretningen. (B,D) Tidsserie af parametre: forskydning (blå), polarvinkel (grøn) og radius af gyration (Rg, rød). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den præsenterede protokol bruges til at studere dynamikken i AuNR'er på cellemembran. Protokollen består af fire dele, herunder mikroskopisk billeddannelse, dataudtræk, dynamisk parameterberegning og dataanalysemetoder, og hver del er fleksibel og universel. Derfor er der mange mulige fremtidige anvendelser, for eksempel at studere flytning af NP-forbundne membranmolekyler på membran, endokytosedynamik af NP-mærkede receptorer, dynamisk analyse af intracellulære NPs og vesikelbelagte NPs transport langs mikrotubuli osv.
Det grundlæggende trin er at bruge DFM til at forestille sig bevægelsen af AuNR'er på cellemembranen. I øjeblikket er mange billeddannelsesteknologier til analyse af cellemembrandynamik blevet udviklet, hvoraf fluorescensmikroskopi er blevet udbredt24. Fotobleachingegenskaberne for fluorescerende sonder fører imidlertid til manglende evne til at spore partikeldynamik i lange perioder. Her blev der brugt lysstæmmende plasmoniske AuNR'er. Der er udviklet flere billeddannelsesteknikker baseret på spredningskarakteristika for plasmoniske NPs15. Især dfm med skrå belysningstilstand indsamler kun spredt lys fra prøverne, hvilket gør, at det har et højt signal-til-støj-forhold.
Både oversættelses- og rotationsdynamikken i AuNR'er opnås og analyseres. De fleste undersøgelser fokuserer på at undersøge de positionelle udsving i NPs på membranen, og ignorerer virkningerne af orienteringsændringer25. Derudover er cellemembranplanet og billedplanet (x-y-plan) stort set de samme i de fleste tilfælde, og forskellen i samspillet mellem AuNR og cellemembranen er mere bemærkelsesværdig i z-retningen. Derfor, selv uden azimuth vinkler, polarvinklen er værdifuld for analysen af samspillet mellem AuNRs og cellemembran. Baseret på DFM og unikke optiske egenskaber Af AuNRs, dual-channel polarisering DFM bruges til at opnå orientering oplysninger om AuNRs (I1 + I2 
synd2θ)19,26. Ikke desto mindre påvirkes polarvinklernes beregningsnøjagtighed af de maksimale og minimale detektionsintensiteter, som er stærkt påvirket af omgivelserne. Derfor skal der foretages nogle ændringer. Her blev (R-G) brugt til at beregne polarvinklen, og G-værdien, der tjener som intern reference, kunne effektivt reducere de systematiske fejl og øge målingsnøjagtigheden.
De kritiske trin er dataudtræk og dynamisk parameterberegning, hvilket er vigtigt for at analysere dynamikken i NP på membranen. De baner af AuNRs på membranen udvindes med høj rumlig opløsning27,28 fra sekvensanalyse ved hjælp af ImageJ / Fiji. R\G-værdierne og polarvinklerne beregnes med MATLAB (https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020). Flere parametre beregnes på samme måde ved hjælp af MATLAB i henhold til positioner og polære vinkler (Tabel 1). I SPT-analyse er der mange måder at udføre parameteranalyse og -visning på. Derfor er det nødvendigt at bruge så mange analysemetoder og visualiseringsværktøjer som muligt til at analysere dynamikken i NP og derefter opsummere og udtrække et nyt synspunkt fra mange analyseresultater. Normalt er der altid nogle trade-off at gøre, hvilket ikke er et let arbejde.
NPs dynamiske tilstand og bevægelsesadfærd kan analyseres og præsenteres systematisk fra top til bund ved hjælp af omfattende analysemetoder og multivariate præsentationsmåder. Ved hjælp af multipartikler statistisk analyse, kan vi få ensemblet bevægelse tilstand NPs på tværs af hele cellemembranen flyet. De dynamiske undersøgelser af individuelle NPs/molekyler baseret på fluorescensbilleddannelse29 bruger for det meste denne overordnede statistiske metode, fordi kun et stort antal kortsigtede baner kan overvåges. Men ensemblet gennemsnit metode vil glatte og ignorere de enkelte detaljer. Som et supplement anvendes den statistiske enkeltpartikelanalyse til kvantitativt at præsentere den dynamiske tilstand for de enkelte NATIONALEP'er. I mellemtiden er det vigtigt at udføre tidsserieparameteranalyse af individuelle eller segmentbaner, som kan give bevægelsesadfærd for NPs som en funktion af tiden.
Sammenfattende foreslår vi en integreret protokol til undersøgelse af diffusionsdynamikken hos AuNR'er på levende cellemembran med SPT-metode. Dynamikken i AuNRs blev overvåget med enkelt nanopartikel DFM, ekstraheret ved hjælp af ImageJ og MATLAB, og karakteriseret ved omfattende analysemetoder. AuNRs gjorde unormal diffusion bevægelse på U87 MG cellemembran, og dens bevægelse viser spatiotemporal heterogenitet. Denne protokol kan potentielt anvendes til undersøgelser af andre typer komplekse biologiske systemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China med tilskud på 21425519, 91853105 og 21621003.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CTAB coated gold nanorods(CTAB-AuNRs) | Nanoseedz | NR-40-650 | 85 nm * 40 nm |
| Color CMOS camera | Olympus | DP74 | Japan |
| Coverslips | Citoglas | z10212222C | 22*22 mm |
| Dark-field microscopy | Nikon | 80i | upright microscope |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10099141 | |
| Fiji | National Institutes of Health | 2.0.0-rc-69/1.52 p | a distribution of ImageJ |
| Grooved glass slide | Sail brand | 7103 | Single concave |
| Image J | National Institutes of Health | 1.52 j | |
| MATLAB | MathWorks | R2019b | |
| MATLAB Code | https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020 | ||
| Minimum essential medium (MEM) | Gibco | 10-010-CVR | with phenol red |
| Minimum essential medium (MEM) | Gibco | 51200038 | no phenol red |
| Origin | OriginLab | Origin Pro 2018C | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Plastic cell culture dishes | Falcon | 353002 | |
| Plastic cell culture dishes | Falcon | 353001 | 35*10 mm |
| U87 MG cell | American Type Culture Collection | ATCC HTB-14 | a human primary glioblastoma cell line |
References
- Rees, P., Wills, J. W., Brown, M. R., Barnes, C. M., Summers, H. D. The origin of heterogeneous nanoparticle uptake by cells. Nature Communication. 10 (1), 2341 (2019).
- Behzadi, S., et al. Cellular uptake of nanoparticles: journey inside the cell. Chemical Society Reviews. 46 (14), 4218-4244 (2017).
- Shen, H., et al. Single Particle Tracking: From Theory to Biophysical Applications. Chemical Reviews. 117 (11), 7331-7376 (2017).
- Saxton, M. J.
- Kusumi, A., et al. Dynamic organizing principles of the plasma membrane that regulate signal transduction: commemorating the fortieth anniversary of Singer and Nicolson's fluid-mosaic model. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 215-250 (2012).
- Jacobson, K., Liu, P., Lagerholm, B. C. The Lateral Organization and Mobility of Plasma Membrane Components. Cell. 177 (4), 806-819 (2019).
- Sezgin, E., Levental, I., Mayor, S., Eggeling, C. The mystery of membrane organization: composition, regulation and roles of lipid rafts. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 361-374 (2017).
- von Diezmann, A., Shechtman, Y., Moerner, W. E. Three-Dimensional Localization of Single Molecules for Super-Resolution Imaging and Single-Particle Tracking. Chemical Reviews. 117 (11), 7244-7275 (2017).
- Rosenberg, J., Huang, J. Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (155), e59914 (2020).
- Kusumi, A., Tsunoyama, T. A., Hirosawa, K. M., Kasai, R. S., Fujiwara, T. K. Tracking single molecules at work in living cells. Nature Chemical Biology. 10 (7), 524-532 (2014).
- Rocha, J. M., Gahlmann, A. Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules. Journal of Visualized Experiments. (151), e59387 (2019).
- Uphoff, S., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. Visualizing protein-DNA interactions in live bacterial cells using photoactivated single-molecule tracking. Journal of Visualized Experiments. (85), e511177 (2014).
- Pinaud, F., Clarke, S., Sittner, A., Dahan, M. Probing cellular events, one quantum dot at a time. Nature Methods. 7 (4), 275-285 (2010).
- Mehidi, A., et al. Transient Activations of Rac1 at the Lamellipodium Tip Trigger Membrane Protrusion. Current Biology. 29 (17), 2852-2866 (2019).
- Ye, Z., Wang, X., Xiao, L. Single-Particle Tracking with Scattering-Based Optical Microscopy. Analytical Chemistry. 91 (24), 15327-15334 (2019).
- Pan, Q., Zhao, H., Lin, X., He, Y. Spatiotemporal Heterogeneity of Reactions in Solution Observed with High-Speed Single-Nanorod Rotational Sensing. Angewandte Chemie. International Ed. in English. 58 (25), 8389-8393 (2019).
- Taylor, R. W., et al. Interferometric scattering microscopy reveals microsecond nanoscopic protein motion on a live cell membrane. Nature Photonics. 13 (7), 480-487 (2019).
- Chen, K., et al. Characteristic rotational behaviors of rod-shaped cargo revealed by automated five-dimensional single particle tracking. Nature Communication. 8 (1), 887 (2017).
- Xu, D., He, Y., Yeung, E. S. Y. Direct observation of the orientation dynamics of single protein-coated nanoparticles at liquid/solid interfaces. Angewandte Chemie. International Ed. in English. 53 (27), 6951-6955 (2014).
- Lehui, X., Yan, H., Edward, S. Y. Three Dimensional Orientational Imaging of Nanoparticles with Darkfield Microscopy. Analytical Chemistry. 82, 5268-5274 (2010).
- Ge, F., Xue, J., Wang, Z., Xiong, B., He, Y. Real-time observation of dynamic heterogeneity of gold nanorods on plasma membrane with darkfield microscopy. Science China Chemistry. 62, 1072-1081 (2019).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Janczura, J., Weron, A. Ergodicity testing for anomalous diffusion: small sample statistics. The Journal of Chemical Physics. 142 (14), 144103 (2015).
- Kim, D. H., et al. Single particle tracking-based reaction progress kinetic analysis reveals a series of molecular mechanisms of cetuximab-induced EGFR processes in a single living cell. Chemical Science. 8 (7), 4823-4832 (2017).
- Kurzthaler, C., et al. Probing the Spatiotemporal Dynamics of Catalytic Janus Particles with Single-Particle Tracking and Differential Dynamic Microscopy. Physical Review Letters. 121 (7), 078001 (2018).
- Lin, X., Pan, Q., He, Y. In situ detection of protein corona on single particle by rotational diffusivity. Nanoscale. 11 (39), 18367-18374 (2019).
- Wei, L., et al. Sub-diffraction-limit localization imaging of a plasmonic nanoparticle pair with wavelength-resolved dark-field microscopy. Nanoscale. 9 (25), 8747-8755 (2017).
- Cheng, X., Dai, D., Xu, D., He, Y., Yeung, E. S. Subdiffraction-limited plasmonic imaging with anisotropic metal nanoparticles. Analytical Chemistry. 86 (5), 2303-2307 (2014).
- Belyy, V., et al. PhotoGate microscopy to track single molecules in crowded environments. Nature Communication. 8, 13978 (2017).
