이 논문은 ChIP 액체 처리기 플랫폼을 사용하여 특정 히스톤 수정(H3K27ac)과 관련된 DNA 영역의 반자동 마이크로스케일드 ChIP-Seq 프로토콜을 설명하고 태그를 사용하여 라이브러리 준비를 수행합니다. 이 절차는 품질 및 수량 목적에 대한 제어 평가를 포함하고 다른 히스톤 수정 또는 전사 요인에 채택 될 수있다.
염색체 면역 침전물 다음에 시퀀싱 (ChIP-Seq)은 시스 조절 DNA 요소를 식별하는 데 도움이되는 H3K27ac와 같은 특정 히스톤 수정과 관련된 크로마틴 DNA를 프로파일링하는 강력하고 널리 사용되는 접근 방식입니다. ChIP-Seq를 완료하는 수동 프로세스는 노동 집약적이고 기술적으로 어렵고 종종 큰 세포 수(>100,000 세포)가 필요합니다. 여기에 설명된 방법은 이러한 문제를 극복하는 데 도움이 됩니다. 세포 고정, 크로마틴 전단, 면역 침전, 시퀀싱 라이브러리 제제를 포함한 완전한 반자동, 마이크로스케일H3K27ac ChIP-Seq 절차는 세포 수 입력에 대한 48개의 샘플을 배치하여 100,000세포 미만의 세포수를 상세히 설명한다. 반자율 플랫폼은 기술적 변동성을 줄이고 신호 대 잡음 비율을 개선하며 노동력을 대폭 줄입니다. 이 시스템은 반응량을 줄임으로써 효소, 자기 구슬, 항체 및 실습 시간과 같은 고가의 시약의 수를 제한함으로써 비용을 절감할 수 있습니다. ChIP-Seq 방법에 대한 이러한 개선은 매우 재현 가능한 방식으로 제한된 세포 수를 가진 임상 샘플의 대규모 후생 유전학 연구에 적합합니다.
특정 히스톤 수정과 관련된 DNA의 단편을 결정하기 위한 ChIP-Seq 애약의 폭넓은 사용은 활성 증강제, 프로모터, 소음기, 헤테로크로마티닌 및기타1,2,3,4등을포함한 시스 조절 DNA 요소를 식별하는 능력 때문입니다. 게놈 전반에 걸친 비코딩 규제 영역의 식별은 건강과 질병의 유전자 조절을 더 잘 이해하기 위한 귀중한 통찰력을 보여주었습니다4. 실험실에서 이전 작품은 CIP-Seq를 사용하여 Cis–규제 요소가 다른 세포 유형5에서중요한 역할을 할 수 있음을 보여주었습니다. 전사 인자(TF) ChIP 작용제는 질병 관련 위험 단일 뉴클레오티드 다형성6을나타내기 위해 활용되고 있다.
인간 임상 샘플과 ChIP-Seq의 사용은 주로 세포 수 또는 원하는 조직 샘플의 제한으로 인해 도전적이다. 그 결과, 이러한 기술을 개선하고 마이크로스케일링하기 위한 분야에서 공동의 노력이 있었고, 그 결과 CUT&TAG5,7,8,9,10,11,12와 같은 여러 가지 소감이 나타났다. 이 분석은 특정 항체9에의해 결합된 게놈 영역을 태그화 및 격리하기 위해 트랜스포지를 이용한다. 이 기술은 세포 수를 1,000대까지 감소시킬 수 있었고 어떤 경우에는 단일 세포로 감소시킬 수 있었지만, 번역 연구 및 임상 셋업에서 이 기술을 사용하는 것은 이 방법에 대한 라이브 세포를 사용하는 요구 사항으로 인한한계를보이고 있다9,12. 라이브 셀 요구 사항은 임상 샘플을 처리하기 어렵게 만들고 샘플이 동시에 처리되지 않으면 배치 효과를 유발할 수 있습니다. 다른 사람들은 높은 처리량 방식으로 여기에 적응되는 ChIPmentation11의개발을 포함하여 포름알데히드 고정 셀에 대한 마이크로 스케일드 기술을 최적화했습니다. 고정 셀을 사용하면 모든 샘플을 수집하고 후속 처리할 때까지 샘플을 저장하여 배치 효과를 최소화할 수 있습니다.
여기서, 반자동 마이크로스케일드 ChIP-Seq 분석체는 실험적인 실습 시간을 감소시켜 히스톤수정(10)을프로파일링하는 것으로 설명된다. 반자동 방법을 사용하면 고처리량 인 ChIP-Seq 분석법을 허용하여 최대 48개의 샘플을 완전히 처리하고 5일 이내에 시퀀싱할 수 있으며, ChIP 액체 처리기를 사용하여 샘플당 10,000개의 셀이 적습니다. 처리기는 면역 침전(IP) 및 후속 세차스를 자율적으로 완료하여 샘플 간의 가변성을 줄이는 데 도움이 됩니다. 반자동 방법은 48개의 견본을 위한 15 시간 이상 및 기술적인 가변성에 대해 실습 시간을 둘 다 낮춥습니다, 1 차 또는 배양한 세포에 대한 재현 가능하고 빠른 방식으로 실행될 수 있는 대규모 후성 유전학 연구 결과를 가능하게 합니다. 이 프로토콜은 고품질 ChIP-Seq에 대한 프로세스를 처음부터 끝까지 설명합니다. 특정 컴퓨터를 사용할 수 없는 경우 프로토콜은 ChIP-Seq 실험을 수동으로 설정하고 문제 발생시 하는 데 유용한 리소스가 됩니다.
분석세 3개의 다른 1차 인간 면역 세포 모형 및 1개의 배양세포주 (HUT78 – ATCC: TIB-161)로 수행되었다. 명확성을 위해, 프로토콜은 7개의 단부로 분할되었습니다: 초음파 처리를 통해 세포 고정, 염색질 전단, 자동화된 크로마틴 면역 침전, DNA 단편 태그에 의한 도서관 준비, 도서관 증폭, 도서관 정화, DNA 정량화. 완충 레시피는 보충표 1을 참조하십시오.
여기서 설명된 방법은 프로토콜을 자동화 및 마이크로스케일링하여 DNA 정화 전에 태그 작성 라이브러리 준비 프로토콜을 구현하는 ChIPmentation절차(11)에확장된다. ChIP-Seq의 발병 이후, 필요한 세포 수는 히스톤에 대한 약 2천만 세포에서 수백 개의 세포로 크게 감소되었으며, 심지어 단일 세포1, 7,10,12,18,19,20,21로감소하였다. 이러한 새로 개발된 방법은 cis-조절메커니즘이 감도를 높이고 희귀 임상 세포집단을5, 6,12,17로시험할수 있게 함으로써 세포에서 어떻게 작동하는지에 대한 심층적인 이해를허용하였다. 예를 들어, 강력하고 민감한 ChIP-Seq 대안9로CUT&TAG라고 불리는 최근의 인기 있는 절차 중 하나입니다. Tn5 효소가 단백질 A에 동적으로 결합되어 높은 특이성9를가진 ChIP 항체의 Fc 체인을 인식하기 때문에 우수한 신호 대 잡음 비를 생성한다. Tn5 효소의 배경 활성은 효소가 표적 항체9에결합하기 전에 작용하지 않기 때문에 감소된다. 그러나, 임상 적 맥락에서 이 방법의 구현은 비 고정된 살아있는 세포를 필요로 하기 때문에 제한됩니다. 또한, 저혈압 핵에서 DNA 단편을 제거하는 것은 분석 중에 제거될 때 크로마틴에 부정적인 영향을 미칠 수 있다. 큰 코호트가5를수집하는 데 수년이 걸릴 수 있기 때문에 신선하고 살아있는 세포와 함께 일하는 데 필요한 요구 사항은 희귀 한 임상 샘플과 샘플의 큰 코호트에 대한 문제의 원천입니다. 또 다른 유형의 방법인 drop-ChIP는 우아하게 마이크로유체전자 장치를 사용하여 ChIP19를처리하기 전에 액적 기반 태그멘션을 생성한다. 그러나, 고도로 전문화된 미세유체 장치를 사용하고, 단일 세포 ChIP-Seq를 완성할 수 있지만, 또한 살아있는 세포7,8,9,18,19의사용에 국한된다. PLAC-Seq 또는 HiChIP와 같은 ChIP-Seq에 의존하는 새로운 방법은 ChIP-Seq 봉우리22,23사이의 3차원(3D) 상호 작용을 이해하려고 시도합니다. 이러한 3D 방법은 게놈 전반에 걸쳐 cis-regulationy또는 TF 매개 상호 작용을 식별하고 세포 유형, 건강한 조직 및 질병의 맥락에서 유전자 발현 조절에 대한 이해를 더 잘 이해하기 때문에 흥미롭습니다.
초음파 처리된 크로마틴의 품질과 항체의 품질과 같은 프로토콜이 성공하기 위해 고려해야 할 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 전단 효율은 크리마틴이 음초음파처리되지 않으면 분석의 효율이 크게24로감소합니다. 초음파 처리는 필요한 세포 번호로 인해 ChIP-Seq의 도전적인 측면입니다. 프로토콜에 사용되는 초음파 처리기에서 300,000 셀 미만의 효율성이 크게 감소했습니다. 이것은 ChIP-Seq에서 그 수준에서 초음파 처리하는 것은 종종 덜 공정한 효소 조각화를 필요로 하는 도전적인 측면입니다. 그 결과, 초음파 처리는 진정한 마이크로 스케일ChIP-Seq에 대한 주요 제한 요소입니다. 다른 초음파 처리 플랫폼과 시판되는 키트는 크롬을 초음파 처리하기 위해 테스트되었지만 여기에 사용되는 초음파 처리기는 가장 강력하고 재현 가능한 결과를 보였습니다. 초음파 처리기의 또 다른 장점은 많은 수의 샘플을 처리 할 때 비용을 절감 초음파 처리를 실행하기 위해 특수 튜브를 구입할 필요가 없다는 것입니다. 최적의 초음파 처리를 위해, 첫째로, 위에서 설명한 바와 같이 초음파 처리기를 미리 따뜻하게하는 것이 중요합니다. 둘째, 펠릿을 lyse하려면, 더 많은 물리적 제한으로 세포를 분해하기 위해 lysing하는 동안 튜브의 바닥을 만지는 파이펫 팁을 갖는 것이 좋습니다. 셋째, 초음파 처리 전에 모든 기포 형성은 샘플의 초음파 처리 능력을 균등하게 초음파 처리하는 데 방해한다. lysis 중에 형성 된 거품이있는 경우 파이펫으로 제거하는 것이 중요합니다. 이것은 많은 견본을 제거하지 않고 도전할 수 있습니다, 그러나 팁이 거품에 대하여 가볍게 누르면 많은 견본의 손실 없이 천천히 그릴 수 있습니다. 마지막으로, 사이클 수를 결정할 때, 매 3주기마다 샘플이 제거, 정제 및 아가로즈 젤에서 실행되는 시간 과정을 완료합니다. 이는 ChIP 효율이 감소하기 때문에 샘플의 초음파 처리 가 방지합니다. 샘플이 초음파 처리된 경우 큰 조각은 ChIP-Seq품질(24)에부정적인 영향을 미칠 수 있다. 한편, 샘플이 초음파 처리되면 대상 에피토프가 손실될 위험이 있다.
ChIP-Seq의 또 다른 필수적인 부분은 항체의 품질입니다. 어떤 대규모 연구를 실행하기 전에, 사용될 항체를 최적화할 필요가 있다. 목표는 게놈의 알려진 영역의 잡음 비율에 상당히 높은 신호를 얻고 다른 하나는 재현성이다. 항체가 많은 배경 신호를 당기는 경우, 더 큰 입력을 사용하거나 다른 많은/공급 업체를 시도하는 것이 좋습니다. 이렇게 하면 대규모 실험을 시작하기 전에 시간이 추가되지만 필수적인 단계입니다. 신호-잡음을 테스트하려면 항체의 대상으로 알려진 영역과 결석한 것으로 알려진 다른 부위와 qPCR을 사용하는 것이 좋습니다. 그것은 히스톤 수정이 더 강력하고 TF보다 최적화하기 쉬운 것으로 나타났습니다.
전술한 프로토콜은 반자율적이고 미세스케일된 방식으로 고처리량 히스톤 수정 ChIP-Seq를 위한 견고한 방법을 제공한다. 이 방법은 실습 시간의 양을 제한하고 수동 ChIP-Seq에 비해 재현성을 증가시킵니다. 실험실에서 완료된 이전 연구는 기술 복제에 수동 ChIP를 사용하고 Spearman 상관 관계 평균 0.505를얻었지만, 반자동 시스템으로, NK 세포 평균0.66(보충 표 2)을가진 다른 기증자 간의 스피어맨 상관 관계가 있었다. 이것은 또한 약 40 % 적은 실습 시간으로 완료되었습니다. 여기에 설명된 방법은 히스톤 수정(여기에 표시된 H3K27ac,하지만 프로토콜은 다른 사람을 위한 수정이 필요하지 않아야 합니다)에 최적화되었으며 TF ChIP-Seq에 대해 약간의 수정만 필요합니다. 항체의 품질에도 불구하고, 주요 수정은 초음파 처리 시간과 잠재적으로 IP 동안 사용되는 버퍼에 대한 것입니다. 일반적으로 TF ChIP 의 경우 TF:DNA 복합체가 엄격한 초음파 처리6을통해 유지될 가능성이 적기 때문에 크로마틴의 약간 더 긴 단편(약 350-800 bp 범위)으로 더 잘 작동할 수 있다. TF는 히스톤 수정과 다르게 동작할 수 있기 때문에 버퍼는 사용자 지정 혼합 또는 기타 산업 사용 가능한 키트로 변경해야 할 수도 있습니다.
자동화된 ChIP 액체 처리기가 10,000개의 세포에 대해 테스트되었지만, 낮은 크로마틴 농도에서 재현성이 현저한 감소가 있었습니다. 이 때문에, 프로토콜은 100,000 세포 미만에 추천되지 않았고, 100,000 개의 세포가 최적의 조건이었다. 또한 이 프로토콜은 추가 비용이지만 고품질 데이터를 제공하는 산업 ChIP 버퍼를 사용하여 완료되었습니다. 프로토콜은 초음파 처리 조건(시어드 크로마틴이 동일한 범위 내에 보관되는 한), 완충제가 면역 침전(IP; 최적화가 필요할 수 있음)에 맞게 사용자 지정될 수 있거나 ChIP 액체 처리기가 사용되지 않을 수 있다. 프로토콜의 제한은 고가의 투자가 될 수 있고 한 번에 16 개의 샘플을 실행할 수있는 ChIP 액체 처리기의 사용입니다. ChIP 액체 처리기는 소규모 반응으로 제한되며 100만 개 이상의 세포 수는 권장되지 않습니다. 그러나 IP를 완료하고 수동으로 단계를 세척하여 프로토콜없이 완료 할 수 있습니다. IP와 세치가 수작업으로 완료되면 분석 작업을 완료하는 시간이 증가하고 재현성이 저하될 수 있지만 이 가이드는 고품질 ChIP-Seq 실험을 실행하는 데 여전히 유용합니다. 참고로, 다른 액체 처리기는 반자동 ChIP 반응을 실행하도록 조정할 수 있습니다.
요약하자면, IP 및 세척 단계가 자율적으로 완료되기 때문에 이 시스템의 주요 이점은 처리량의 특성입니다. 따라서 ChIP 실험의 순차적 라운드를 완료할 수 있으므로 최대 48개의 샘플을 완전히 처리하고 5일 내에 시퀀싱할 수 있으며 수동 ChIP-Seq 실험에 비해 실습 시간이 제한되어 있습니다. 또 다른 이점은 ChIP-Seq가 매우 재현 가능한 결과를 얻기 어려울 수 있기 때문에 증가된 재현성입니다. 다른 방법은 라이브 셀, 복잡한 마이크로 파이펫팅 시스템 또는 작업을 모두 수작업으로 완료해야 합니다. 이 시스템은 낮은 입력 샘플 (<10,000 셀)에 최적화되어야하며 궁극적으로 단일 셀 ChIP 반응을 허용합니다. 이 시스템은 또한 PLAC-Seq 및 HiChIP22,23과같은 최신 ChIP 방법에 맞게 조정할 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 기술 적인 도움과 건설적인 토론에 대한 Vijayanand 실험실 구성원과 초음파 장치 및 ChIP 액체 처리기 기계 및 프로토콜과 기술 지원을 Diagenode에서 박사 샤론 Squazzo와 제프리 버게트 씨에게 감사드립니다. 이 작품은 NIH 보조금 AI108564, R01HL114093, S10RR027366 (BD FACSAria II), 및 S10OD016262 (일루미나 히세크 2500)에 의해 지원되었다.
200 µl tube strips (8 tubes/strip) + cap strips | Diagenode | C30020002 | Strip tubes for use on the IP Star; ChIP 8-tube strip |
AMPure XP for PCR Purification | Beckman Coulter | A63880 | SPRI beads |
Axygen 0.6 mL MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube | Corning | MCT-060-C | 0.65 mL low binding tube |
Bioruptor Pico Sonicator | Diagenode | B01060010 | Sonicator used in the lab but others can be used |
ChIP DNA Clean & Concentrator (Capped Columns) | Zymo Research | D5205 | DNA clean-up kit |
Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation | ThermoFisher | 10001D | |
EDTA (0.5 M), pH 8.0, RNase-free | ThermoFisher | AM9260G | |
EGTA pH 8.0 | Millipore Sigma | E3889-25G | |
Eppendorf ThermoMixer C | Eppendorf | 2231000667 | |
Formaldehyde solution | Millipore Sigma | 252549-1L | |
Glycine | Millipore Sigma | 50046-250G | |
H3K27ac polyclonal antibody – Premium | Diagenode | C15410196 | |
HEPES (1 M) pH 7.5 | ThermoFisher | 15630080 | |
IDT for Illumina Nextera DNA Unique Dual Indexes | Illumina | 20027213 | |
Illumina Tagment DNA Enzyme and Buffer Small Kit | Illumina | 20034197 | |
IP-Star Compact Automated System | Diagenode | B03000002 | Automated system for ChIP-Seq studies; ChIP liquid handler |
KAPA HiFi HotStart ReadyMix | Roche | KK2601 | PCR mix |
Medium reagent container for SX-8G IP-Star Compact | Diagenode | C30020003 | |
MgCl2 (magnesium chloride) (25 mM) | ThermoFisher | R0971 | |
N,N-Dimethylformamide | Millipore Sigma | D4551-250ML | CAUTION – low flash point |
NaCl (5 M), RNase-free | ThermoFisher | AM9760G | |
PBS (10X), pH 7.4 | ThermoFisher | 70011044 | |
PCR Flex-free 8-tube stripes, attached individual optical caps | USA Scientific | 1402-4700 | 8 strip tubes, 0.2 mL 8-tube strip |
Proteinase Inhibitor Cocktail | Millipore Sigma | P8340 | |
Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade | ThermoFisher | 25530049 | |
PureLink RNase A (20 mg/mL) | ThermoFisher | 12091021 | |
Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent | ThermoFisher | P7581 | Used in the flourescence quantification |
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | ThermoFisher | 4485699 | qPCR |
ROX Reference Dye | ThermoFisher | 12223012 | |
Sodium butyrate | Millipore Sigma | 303410-100G | |
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10,000X Concentrate in DMSO) | ThermoFisher | S11494 | nucleic acid dye |
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain – 10,000X concentrate in DMSO | ThermoFisher | S7563 | |
TE Buffer | ThermoFisher | 12090015 | |
Tips (bulk) | Diagenode | C30040020 | Tips for the IP Star |
True MicroChIP Kit | Diagenode | C01010130 | Contains all the buffers for the IP; ChIP kit |
UltraPure 1M Tris-HCI, pH 8.0 | ThermoFisher | 15568025 | |
UltraPure SDS Solution, 10% | ThermoFisher | 24730020 |