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Biology

Um procedimento de ChIP-Seq semiautônomo para estudos epigenéticos em larga escala

Published: August 13, 2020 doi: 10.3791/61617
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Division of Vaccine Discovery, La Jolla Institute for Immunology

ERRATUM NOTICE

Summary

Este artigo descreve um protocolo chip-seq semiautomado e microescalado de regiões de DNA associadas a uma modificação de histona específica (H3K27ac) usando uma plataforma de manipulador de líquidos ChIP, seguido de preparação da biblioteca usando tagmentação. O procedimento inclui avaliação de controle para fins de qualidade e quantidade e pode ser adotado para outras modificações de histona ou fatores de transcrição.

Abstract

A imunoprecipitação de cromatina seguida de sequenciamento (ChIP-Seq) é uma abordagem poderosa e amplamente utilizada para perfilar DNA de cromatina associado a modificações específicas de histona, como H3K27ac, para ajudar a identificar elementos de DNA cis-regulatórios. O processo manual para completar um ChIP-Seq é intensivo em mão-de-obra, tecnicamente desafiador, e muitas vezes requer números de células grandes (>100.000 células). O método descrito aqui ajuda a superar esses desafios. Um procedimento semiautomático completo de H3K27ac ChIP-Seq, incluindo fixação celular, tesoura de cromatina, imunoprecipitação e preparação da biblioteca de sequenciamento, para lote de 48 amostras para entradas numédegas inferiores a 100.000 células é descrito em detalhes. A plataforma semiautônomo reduz a variabilidade técnica, melhora as relações de sinal para ruído e reduz drasticamente a mão-de-obra. Assim, o sistema pode reduzir os custos permitindo a redução dos volumes de reação, limitando o número de reagentes caros, como enzimas, contas magnéticas, anticorpos e tempo prático necessário. Essas melhorias no método ChIP-Seq se adequam perfeitamente a estudos epigenéticos em larga escala de amostras clínicas com números de células limitadas de forma altamente reprodutível.

Introduction

O amplo uso de ensaios de ChIP-Seq para determinar fragmentos de DNA associados a modificações específicas de histona deve-se, em parte, à sua capacidade de identificar elementos de DNA cis-regulatórios, incluindo intensificadores ativos, promotores, silenciadores, heterocromatina, e outros1,2,3,4. A identificação de regiões reguladoras não codificadas em todo o genoma tem mostrado uma visão valiosa para entender melhor a regulação genética em saúde e doenças4. Trabalhos anteriores do laboratório usaram o ChIP-Seq para mostrar que os elementos cis-regulatórios podem desempenhar papéis importantes em diferentes tipos de células5. Os ensaios de chip do fator de transcrição (TF) têm sido utilizados para mostrar o risco associado à doença polimorfismos de nucleotídeos6.

O uso de ChIP-Seq com amostras clínicas humanas é desafiador, principalmente devido à limitação do número de células ou à amostra de tecido desejada. Como resultado, tem havido um esforço conjunto no campo para melhorar e microescalar essas técnicas e, como resultado, vários ensaios surgiram, como CUT&TAG5,7,8,9,10,11,12. Este ensaio utiliza uma transposase para tagment e isola regiões genômicas vinculadas por um anticorpo específico9. Esta técnica foi capaz de reduzir os números de células para 1.000 e, em alguns casos, para uma única célula, no entanto, o uso dessa técnica em pesquisa translacional e configuração clínica tem mostrado limitações devido aos requisitos de uso de células vivas para este método9,12. A exigência de células vivas torna as amostras clínicas logisticamente difíceis de manusear e pode introduzir efeitos em lote se as amostras não forem processadas ao mesmo tempo. Outros otimizaram técnicas microescaladas para células fixas de formaldeído, incluindo o desenvolvimento de ChIPmentation11, que é adaptado aqui de forma de alto rendimento. O uso de células fixas permite que as amostras sejam armazenadas até a coleta e posterior processamento de todas as amostras juntas para minimizar os efeitos em lote.

Aqui, é descrito um ensaio de ChIP-Seq microescalado semiautônomo que reduz o tempo prático experimental para traçar modificações de histona10. O método semiautomado permite ensaios chip-seq de alto rendimento, permitindo que até 48 amostras sejam totalmente processadas e prontas para sequenciamento em apenas 5 dias, para apenas 10.000 células por amostra usando um manipulador líquido ChIP. O manipulador completa a imunoprecipitação (IP) e lava posteriormente de forma autônoma, o que ajuda a reduzir a variabilidade entre as amostras. O método semiautomado reduz tanto o tempo prático em mais de 15 horas para 48 amostras quanto a variabilidade técnica, permitindo que estudos epigenéticos em larga escala sejam conduzidos de forma reprodutível e rápida para células primárias ou cultivadas. O protocolo explica o processo do início ao fim para chip-seq de alta qualidade. Se as máquinas específicas não estiverem disponíveis, o protocolo ainda será um recurso útil para configurar e problemáticar os experimentos chip-seq manualmente.

O ensaio foi realizado com três diferentes tipos primários de células imunes humanas e uma linha de células cultivadas (HUT78 – ATCC: TIB-161). Para clareza, o protocolo foi dividido em sete seções: fixação celular, cisalhamento de cromatina via sônica, imunoprecipitação de cromatina automatizada, preparação da biblioteca por tagmentação de fragmento de DNA, amplificação da biblioteca, purificação da biblioteca, seguida de quantificação de DNA. Para receitas tampão, consulte a Tabela Suplementar 1.

Protocol

O Conselho de Revisão Institucional (IRB) do Instituto La Jolla de Alergia e Imunologia (LJI; Protocolo IRB não. A SGE-121-0714) aprovou o estudo. Voluntários saudáveis foram recrutados e forneceram amostras de leucemia após consentimento por escrito.

1. Fixação celular

  1. Leve a concentração de suspensão celular para 1 a 2 x 106 células/mL com meio de cultura celular completa em um tubo de 15 mL (<10 mL de suspensão) ou tubo de 50 mL (10-30 mL de células). Se <1 x 106 células, use 0,5 mL do meio em um tubo de 1,5 mL.
  2. Vórtice suavemente da suspensão celular, adicione 10x de fixação celular tampão dropwise (1:10; vol:vol) e gire a uma velocidade baixa por 10 minutos à temperatura ambiente (RT).
  3. Pare a reação com vórtice suavemente e adicione 4,5 M de glycina na proporção de 1:20 (vol:vol). Inverta os tubos algumas vezes e incuba no gelo por pelo menos 5 minutos.
  4. Realize as etapas restantes a 4 °C ou no gelo. Gire os tubos a 800 x g por 5 min a 4 °C e descarte o supernatante.
  5. Resuspenque a pelota suavemente com 5 mL de PBS gelado 1x e incubar por 2 minutos no gelo.
  6. Repita 1,4 e 1,5 com 1 mL de PBS 1x frio e transfira a amostra para um tubo pré-cozido de 1,5 mL (rotulado para armazenamento a longo prazo). Se aplicável, recomenda-se a preparação de alíquotas.
  7. Gire os tubos a 1.200 x g a 4 °C e remova o máximo possível do supernante sem perturbar a pelota celular. Es clique para congelar a pelota em nitrogênio líquido. Armazém a -80 °C.
    ATENÇÃO: Tome a proteção adequada ao manusear nitrogênio líquido.

2. Tesoura de chromatina

NOTA: Este protocolo é otimizado para o esarquiato de pelotas com 0,3 a 3 x 106 células em tubos de baixa ligação de 0,65 mL.

  1. Remova o tubo de amostras com pelotas de células congeladas a partir de -80 °C e armazene em gelo seco para evitar qualquer descongelamento da pelota antes de adicionar o tampão de lise. Este passo é crítico.
  2. Adicione 70 μL de tampão de lise fresco e RT à pelota e mantenha na RT por 1 min.
  3. Resuspenja a pelota por 1 min sem a introdução de quaisquer bolhas e, em seguida, incubar a suspensão celular em RT por 1 minuto antes de colocar a amostra no gelo.
  4. Transfira a pelota resuspended em um tubo de ligação baixa de 0,65 mL e mantenha no gelo.
    NOTA: Para obter a sônica reprodutível, pré-aqueça o sonicador executando-o apenas com tubos em branco durante 3-6 ciclos antes de sonicar as amostras.
  5. Coloque as amostras no suporte do tubo do sonicator e preencha quaisquer lacunas com tubos de equilíbrio preenchidos com 70 μL de água. Deixe as amostras no banho de água por cerca de 1 minuto antes de iniciar a sônica.
  6. Realize a sonicação para ciclos x (dependendo do tipo celular) com 16 s ON / 32 s OFF por ciclo.
    NOTA: Esta etapa exigirá experimentos de validação para determinar o número ideal de ciclos para uma sônica eficiente.
  7. Após cada 3 ciclos, remova as amostras do sonicator, suavemente vórtice e pulso gire os tubos antes de colocá-los de volta no suporte. Certifique-se de que não há pequenas gotículas na parte externa do tubo, pois isso pode causar a formação de bolhas.
  8. Após completar os ciclos necessários, gire amostras a >14.000 x g por 15 min a 4 °C. Transfira o supernatante para um novo tubo de ligação baixa de 0,65 mL pré-resfriado e de baixa ligação e mantenha no gelo.
  9. Descruzar uma fração das amostras sonicadas para verificar a eficiência da sônica.
    1. Transfira 1-7 μL do supernante (equivalente a cerca de 250 ng de cromatina ensaíada) para um tubo PCR de 0,2 mL e faça o volume de até 10 μL com tampão de lise de curto prazo na RT.
    2. Adicione 1 μL RNase A e incubar por 30 min a 37 °C a 800 rpm, depois adicione 1 μL proteinase K.
    3. Incubar por 2h a 55 °C com agitação a 1.000 rpm.
  10. Remova 2 μL da amostra descruzada para quantificação de DNA usando o ensaio de quantificação fluorescente10 (um espectotômetro não é recomendado, pois sabão e proteína degradada podem produzir viés nos resultados).
  11. Execute a amostra restante em um gel de 1,2% de agarose por 1 h a 70 V. Colora com corante de ácido nucleico (1:20.000) e leia o gel usando um transilluminador UV.
  12. Prepare as alíquotas de estocagem de cromatina para armazenamento (diluir a amostra para 25 ng/μL em 20 μL com tampão de lise completa). Armazene toda a cromatina desarmada a -80 °C.

3. ChIP-Seq automatizado para modificação de histona

NOTA: Este protocolo foi projetado para ser executado em um manipulador de líquidos ChIP. Embora o sistema possa usar buffers personalizados, todos os buffers são fornecidos com o kit ChIP. As tiras ChIP com 8 tubos utilizados nesta seção são específicas do manipulador líquido ChIP.

  1. Transfira 16 alíquotas de amostra com 500 ng de cromatina ensapeçada em 20 μL a partir de -80 °C e coloque-os no gelo para descongelar lentamente a cromatina. Uma vez descongelado completamente, vórtice brevemente e pulso-spin.
  2. Preparação de cromatina
    1. Pipeta 100 μL de tampão tC1 suplementado com inibidor de protease 1x e butirato de sódio de 20 mM (tampão tC1 completo) em duas tiras chip 8 tubos.
    2. Transfira 20 μL de cada amostra de cromatina em um tubo apropriado das tiras chip 8 tubos contendo os 100 μL de tampão tC1 completo. Lave os tubos de cromatina adicionando 80 μL tampão tC1 completo aos tubos de cromatina e, em seguida, transfira de volta para o tubo apropriado das tiras chip 8-tube para um volume final de 200 μL.
  3. Preparação do anticorpo
    1. Calcule o volume de anticorpos de tal forma que 0,5 μg de anticorpo esteja em cada tubo.
      Volume de anticorpos = (número de amostras x anticorpos por reação) / concentração de anticorpos
    2. Adicione a quantidade calculada de anticorpos em 500 μL de tampão tBW1. Vórtice rápido e giro de pulso.
    3. Pipeta 70 μL de tBW1 em cada uma das duas tiras chip 8 tubos e adicionar 30 μL do anticorpo + tBW1 a cada um dos tubos. Isso levará o volume total em cada um dos tubos para 100 μL.
  4. Preparação da conta magnética
    1. Vórtice a proteína Uma solução de contas completamente. Para 0,5 μg de anticorpo, pipeta 5 μL de contas em um novo conjunto de tiras chip 8 tubos e giro de pulso.
  5. Encha a última linha do manipulador de líquidos ChIP com tiras de 8 tubos ChIP rotuladas e vazias.
  6. Siga as especificações do programa ChIP-16-IPure-200D para a colocação de todas as tiras na máquina de manipuladora de líquidos ChIP. Adicione os buffers na posição correta, mas use tW4 em vez de tampão tE1.
    NOTA: Organize o dia de tal forma que o manipulador líquido ChIP executará o ChIP durante a noite. O programa será executado por cerca de 16 horas para 16 amostras. Isso marca o fim do primeiro dia.

4. Transposase integração de adaptadores de biblioteca para preparação da biblioteca

  1. Pré-definir um termomixer a 37 °C e 500 rpm. Esfrie um ímã para tiras de tubo de 0,2 mL no gelo.
  2. Para 16 amostras, prepare 440 μL de tampão de tagmentação no gelo. Pipeta 53 μL em uma única nova tira de 8 tubos e mantenha no gelo.
  3. Em uma nova tira de 0,2 mL de 8 tubos, adicione 220 μL de tampão tC1 frio e mantenha no gelo. Os tubos de 8 tiras podem conter esse volume e ainda estar tampados.
  4. Remova o tubo de tira "amostras IP" da máquina manipuladora de líquidos ChIP (linha 12) e tampa os tubos antes de girar o pulso. Capture as contas usando o ímã para tiras de 8 tubos por 2 minutos e remova cuidadosamente o sobrenatante.
  5. Transfira 25 μL do tampão de tagmentação para as contas com um multicanal, remova do ímã e misture suavemente até que as contas sejam homogêneas (cerca de 5 vezes para cima e para baixo com a pipeta definida para 20 μL).
  6. Tampe os tubos e coloque no termomixer pré-aquecido e incubar por 3 min. Aumentar o tempo diminuirá a eficiência da preparação da biblioteca.
  7. Transfira os tubos para um rack de metal refrigerado e adicione 100 μL de tampão tC1 refrigerado a cada amostra. Defina uma pipeta multicanal para 80 μL e misture a amostra até que as contas sejam homogêneas, interrompendo a reação de tagmentação.
  8. Coloque as amostras de volta no manipulador de líquidos ChIP e proceda com o procedimento de lavagem Washing_for_IP-reacts_16_Ipure. Certifique-se de que a lavagem seja realizada duas vezes com tampão tC1 e duas vezes com tW4. A elução deve ser concluída conforme marcado pelo layout do programa, com buffer tE1.
  9. Descruzamento do DNA
    1. Remova as tiras de 8 tubos ChIP na última linha do manipulador líquido ChIP e adicione 2 μL RNase A a cada amostra.
    2. Tampe os tubos, pulsar, misture delicadamente as contas com uma pipeta multicanal até que a mistura fique homogênea e recape os tubos.
    3. Incubar as amostras em um termomixer por 30 minutos a 37 °C e 900 rpm.
    4. Remova as amostras do termomixer, adicione 2 μL de Proteinase K. Siga o mesmo procedimento de 4.9.2 após a adição.
    5. Incubar as amostras em um termomixer por 4h a 55 °C e 1.250 rpm, seguido de 65 °C a 1.000 rpm durante a noite.
      NOTA: Este é o fim do dia 2.

5. Purificação de fragmentos de DNA tagmentado

  1. Rotule dezesseis tubos de 1,5 mL com o número de amostra apropriado e adicione 400 μL de tampão de ligação de DNA do kit de limpeza de DNA a cada um.
  2. Remova as tiras de 8 tubos do termomixer e gire as tiras para garantir que qualquer produto evaporado seja retido. Coloque tiras em um ímã de 8 tiras para capturar as contas.
  3. Transfira 100 μL de DNA descruzado para cada um dos tubos de 1,5 mL. Adicione 100 μL do tampão de ligação de DNA às tiras de 8 tubos para lavar as contas e, em seguida, transfira para o tubo apropriado de 1,5 mL.
  4. Vórtice para cerca de 10 s e pulso-spin os tubos de 1,5 mL.
  5. Carregue as colunas com os 600 μL contendo o buffer de ligação de DNA e a amostra chip.
  6. Gire amostras para 20 s a 10.000 x g e recarregue a coluna com o fluxo-through. Gire novamente com as mesmas condições e descarte o fluxo.através.
  7. Lave as colunas duas vezes com 200 tampão de lavagem de μL (mesma centrifugação da etapa anterior) e descarte o fluxo-through.
  8. Seque as colunas por centrifugação por 2 min a 12.000 x g.
  9. Transfira a coluna para um novo tubo de coleta de 1,5 mL e adicione 9 μL de te buffer quente (pré-aquecido a 55 °C) diretamente à matriz da coluna. Deixe a coluna incubar por 1 min antes da centrifugação por 1 min a 10.000 x g.
  10. Transfira o 9 μL do elute para um novo conjunto apropriado de tiras de 8 tubos.
  11. Complete a elução novamente com 8 μL TE Buffer como antes. Transfira o elto para as tiras apropriadas de 8 tubos (volume final de 17 μL por amostra) e mantenha no gelo.

6. Amplificação e seleção de tamanho das amostras purificadas

  1. As etapas a seguir usam qPCR para determinar o número de ciclos necessários para a amplificação ideal (CtD – Determinação ct)
  2. Prepare o mix de CtD para todas as amostras multiplicando o conteúdo do Buffer de Mistura de CtD pelo número de amostras.
  3. Dispense 3,6 μL de mistura de CtD em uma placa qPCR e adicione 1,4 μL de amostras de DNA tagmentada (~10 % do volume total). Realizar o seguinte qPCR: 98 °C para 3 min, 72 °C para 5 min, 98 °C para 30 s, 26 ciclos de 98 °C para 10 s, 63 °C para 30 s e 72 °C para 30 s.
  4. Prepare o Amplificador para todas as amostras multiplicando o conteúdo do Buffer amp mix pelo número de amostras. Distribua 14 μL de DNA tagmentado em poços separados de uma placa PCR e adicione 2,5 μL de dois primers de índice de sequenciamento (25 μM) a cada amostra (o volume de reação final é de 50 μL).
  5. Misture as amostras por pipeta multicanal e realize o programa de amplificação utilizado no CtD com o número adequado de ciclos.
    NOTA: Este é um bom ponto de parada, pois as amostras amplificadas podem ser armazenadas a -20 °C por algumas semanas. No entanto, a purificação pode ser concluída no mesmo dia. Para 48 amostras, as etapas 3 - 6,5 foram completadas com outros dois lotes separados e, em seguida, amplificadas em um lote conforme descrito abaixo.
  6. Realize a pós-amplificação, seleção de tamanho e quantificação do DNA tagmentado conforme descrito abaixo. Isso geralmente pode ser concluído com 48 amostras (pode ser completado com menos amostras conforme desejado).
    1. Adicione 90 μL de contas paramagnéticas (proporção 1:1.8) em cada poço, misture e deixe incubar em RT por 2 min.
    2. Capture as contas usando um ímã de placa e descarte o supernatante. Lave as contas 3 vezes com 200 μL de etanol fresco de 80% sem interromper a pelota de contas.
    3. Retire qualquer excesso de etanol com 20 μL de pontas após a lavagem final e deixe as contas secarem por 10 minutos ou até que as rachaduras apareçam nas pelotas de contas.
    4. Com a placa ainda no ímã, adicione 40 μL da água pré-aquecida a cada poço. Sele a placa, o vórtice completamente e gire brevemente a placa.
    5. Capture as contas colocando a placa de volta no ímã e transfira o elto de 40 μL para uma nova placa de "amostra". As amostras estão agora purificadas, e os próximos passos enriquecem fragmentos que variam de 200-1.000 bp.
    6. Etapa de QC opcional: Remova 4 μL das amostras e transfira para uma placa QC. Adicione 4 μL de água de volta às amostras. Isso determina a porcentagem de fragmentos grandes.
    7. Adicione 22 μL de contas paramagnéticas (proporção 1:0,55) às amostras, misture cuidadosamente e incubar em RT por 2 min.
    8. Coloque no ímã para capturar as contas por 5 minutos e transfira os supernantes para as colunas 7-12 da placa "amostra". Retire a placa do ímã e adicione 30 μL de contas (proporção final de 1:1.3). Misture cuidadosamente e deixe-o sentar no RT por 2 minutos.
    9. Capture as contas por 5 minutos e depois descarte o supernatante.
    10. Lave todas as contas 3 vezes com 200 μL fresco 80 % de etanol como descrito anteriormente (etapa 6.6.2 – 6.6.3).
    11. Uma vez que as pelotas estejam secas, o DNA eluto com 8 μL de te tampão pré-aquecido para cada poço, enquanto ainda está no ímã.
    12. Remova a placa do ímã, vedação e vórtice completamente. Deixe a placa incubar por 2 minutos no RT, girar de pulso e coloque a placa de volta no ímã por 2 minutos. Transfira o supernante para uma nova placa (Placa 2).
    13. Para recuperação máxima, repita a elução com um buffer de TE pré-aquecido de 8 μL. Coloque as amostras nos poços apropriados, de tal forma que cada amostra tenha 16 μL de biblioteca final.
      NOTA: No final desta etapa deve haver duas placas (uma se nenhuma placa QC foi concluída). A placa QC terá os fragmentos pré-tamanho selecionados e a segunda placa deve ter 48 poços de biblioteca final (16 μL total).

7. Quantifique as bibliotecas finais e amostras de QC usando um ensaio de fluorescência

  1. Quantificação completa de DNA usando um ensaio quantificador de fluorescência ou um método semelhante.
  2. Se a quantificação do QC for concluída, determine a porcentagem de perda da amostra que foram < 1.000 bp. Não deve haver mais do que uma perda de 20% – se houvesse mais, poderia haver um problema com as relações de contas aplicadas.
  3. Determine o tamanho dos fragmentos de cada amostra, de preferência usando uma máquina de eletroforese capilar. Para calcular a concentração molar use a seguinte equação: [Concentração de biblioteca (ng/μL) * 106]/[660 * Tamanho do fragmento mediano (bp)]).
    NOTA: As bibliotecas estão prontas para serem agrupadas (quantidades equimolares) e sequenciadas seguindo os procedimentos de sequenciamento padrão de próxima geração.

Representative Results

Como prova de conceito, o ChIP-Seq foi concluído para seis doadores humanos com três conjuntos de tipos de células imunes: células CD4 T ingênuas (CD4), monócitos clássicos (MO) e células assassinas naturais (NK), enriquecidos pela classificação FACS como descrito antesde 13. O procedimento sublinhado consiste em nove procedimentos distintos representados na Figura 1.

Figure 1
Figura 1: Fluxograma Geral para o procedimento. (A) Um desenho animado do procedimento geral (gerado em BioRender). (B) Fluxograma para todas as etapas principais para o protocolo e o tempo prático e total estimado associado a cada dia. O sequenciamento pode acontecer no final do dia 5 ou mais tarde com várias rodadas. O cronograma também pode ser escalonado ao longo da semana, onde o dia 3-4 sequencial pode ser concluído várias vezes em uma semana para gerar 48 amostras de ChIP. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Após o isolamento celular por citometria de fluxo13,as células classificadas foram centrifugadas e as células fixadas e armazenadas como descrito acima. Uma vez coletadas todas as amostras, as amostras foram colhidas e preparadas para a tesoura cromática em lotes de 12, conforme descrito acima. Para cada amostra, o número de ciclos para alcançar a sônica ideal foi concluídoem 10. A medição quantitativa, bem como as medidas do tamanho do fragmento de cromatina desarmadas mostraram grande reprodutibilidade do nosso método nos três conjuntos de células imunes(Figura 2A). As diferentes células imunes humanas foram sônicas em lotes separados e renderam-se de forma muito consistente com > 70% da amostra entre 100 - 500 bp para 14 ciclos (16 s ON, 32 s OFF por ciclo). Neste ponto, amostras com grandes fragmentos após a sônica (< 70% da amostra entre 100 - 500 bp) foram consideradas como fracassadas. Estas amostras podem ser sonicadas por 1-2 ciclos adicionais ou foram descartadas e substituídas posteriormente por células de outra pelota. Nosso método mostrou que nenhuma das amostras exigia mais sonicação ou foi eliminada, sugerindo robustez absoluta do procedimento.

Figure 2
Figura 2: Exemplos de QC pré-sequenciamento. (A) 1,2% os géis de agarose mostram reprodutibilidade de sonicação. Amostras de sônica para 6 doadores em três tipos de células: células CD4 T ingênuas (CD4), monócitos clássicos (MO) e células assassinas naturais (NK). As amostras foram sônicas para 14 ciclos (16 s ON, 32 s OFF por ciclo). Para cada amostra, cerca de 200 ng de cromatina descrossrada foram carregadas em um gel de 1% de agarose. As amostras foram consideradas boas se mais de 70 % dos fragmentos estiverem dentro de 100-500 bp. (B) Topo - Análise das curvas de amplificação qPCR para determinar o número ideal de ciclos para amplificação (Ct onde há 1/2 a intensidade máxima). As amostras ideais possuem uma TC de cerca de 15 e a amplificação pode ser completada em até 2 ciclos a mais do Ct medido. Fundo - Um exemplo de um conjunto ruim de amostras é mostrado que têm uma Tomografia maior que 18. Estas amostras também apresentaram menor intensidade de fluorescência. (C) Esquerda - Os traços de eletroforese do analisador de fragmentos mostraram a distribuição das bibliotecas final tagmented após amplificação e seleção de tamanho. Amostras com mais de 85 % de biblioteca de fragmentos estão entre 200 e 1.000 bp foram consideradas boas amostras. A medição da intensidade máxima da fluorescência também é considerada como um importante parâmetro QC, de fato se o sinal for baixo, é improvável que a amostra sequencie bem. Direito - Exemplos para amostras positivas em CD4, MO e NK são mostrados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Após quantificação, as amostras foram executadas em um manipulador líquido ChIP com anticorpos H3K27ac, seguido de tagmentação com enzima transposase Tn5. Para determinar o número adequado de ciclos de amplificação por qPCR, foram utilizadas 10% das amostras tagmentada. Para a determinação do número de ciclos para a amplificação das amostras, encontra-se o ciclo em que a intensidade da amostra é metade do máximo médio para determinação do ciclo(Figura 2B). As amostras com valores de TC superiores a 18 não apresentaram bom desempenho pós-sequenciamento e seu valor de TC foi, portanto, indicativo de uma amostra de ChIP reprovada. Essas amostras geralmente também produziram uma menor quantidade de DNA após a amplificação. As amostras (100.000 entradas de células) com um valor de TC igual ou menor que 15 foram ideais e as amostras entre 15 e 18 foram aceitáveis, mas menos consistentes pós-sequenciamento. Para amostras com menos de 100.000 células de entrada, os valores de Tomografia computadorizada foram geralmente encontrados entre 15 e 18, mas não precisavam de mais de 18 ciclos para produzir produto suficiente para sequenciamento.

Após a amplificação de DNA, as bibliotecas foram purificadas e selecionadas de tamanho para obter uma distribuição de tamanho ideal, variando de 200 a 1.000 bp, para o sequenciamento NextGen. A avaliação de tamanho de distribuição em cada uma das bibliotecas foi concluída porque os melhores dados de sequenciamento foram obtidos quando mais de 85% dos fragmentos de DNA variaram entre 200 e 1.000 bp(Figura 2C). Notavelmente, como a mesma quantidade de DNA (medida pela quantificação da fluorescência) foi carregada, notou-se que as amostras com menor intensidade de fluorescência geralmente sequenciavam mal(Figura 2C).

Pós-sequenciamento, foram aplicados controles de qualidade padrão com base nas diretrizes ENCODE ChIP-Seq5,14,15.

Figure 3
Figura 3: Reprodutibilidade das amostras de células imunes. (A) H3K27ac rastreia (Navegador de Genoma UCSC, intensidade máxima, função de alisamento de 4, todos com eixo Y igualmente dimensionado) para 6 doadores (100.000 células por réplica) em cada tipo de célula (CD4, MO e NK). São mostrados quatro loci exemplares, dois com (lócus IL2RA e PTPRC) e dois sem enriquecimento para H3K27ac (CCR4 e MS4A1). (B) Correlação de pearson entre os doadores e parcelas de correlação correspondentes geradas utilizando uma extensão de 300 bp e uma janela de 500 bp dentro do pacote MEDIPS para cada um dos tipos de células replica16. (C) Mesclado arquivos de doadores para cada tipo de célula mostrando faixas H3K27ac (intensidade máxima do Navegador do Genoma UCSC, função de alisamento de 4) em regiões específicas do tipo celular (IL17R para CD4, CCR2 para MO e KLRC1 para NK) e o gene de manutenção da casa B2M, presente em todos os tipos de células. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para controle de qualidade visual, foram preparadas faixas de enriquecimento H3K27ac para exibição no navegador de genoma UCSC. Para quatro loci genéticos, as faixas individuais para cada amostra apresentaram alta qualidade de mapeamento e relação sinal-ruído refletindo a alta consistência e robustez do nosso ensaio(Figura 3A). Os dois loci para o porto esquerdo bem expressos genes nestes tipos de células, enquanto os genes nos dois loci para a direita não são expressos e servidos como controles de fundo13 (Figura 3A). Além disso, o pacote de análise MEDIPS foi utilizado como variável pós-sequenciamento para avaliar o índice de correlação entre as réplicas técnicas (Figura 3B)5,16,17, estabelecendo o grau de correlação para o nível de enriquecimento das leituras para as lixeiras de 500 bp16. Para a maioria das comparações em pares, os índices de correlações de Pearson apresentaram correlação de mais de 90% sugerindo alto nível de consistência entre as réplicas biológicas(Figura 3B). As réplicas com correlação aceitável foram fundidas para aumentar a relação sinal-ruído. Enquanto loci específico do tipo celular mostrou alto enriquecimento nas células apropriadas, um gene de manutenção de casa (B2M) mostrou modificação de histona muito consistente(Figura 3C). Para a análise, a fusão de faixas a partir de réplicas aumentará o enriquecimento, reforçará o sinal específico, inclusive para importantes intensificadores específicos do tipo celular, e reduzirá a variabilidade inter-individual inerente às amostras humanas5.

Embora 100.000 células tenham sido utilizadas para este estudo, houve alta reprodutibilidade para apenas 10.000 células em uma linha de células T cultivadas pelo homem (HUT78). A análise de correlação entre o conjunto de dados chip-seq realizada a partir de amostras com menos de 100.000 células mostrou alta reprodutibilidade e correlação até 10.000 células(Figura 4A).

Figure 4
Figura 4: Reprodutibilidade de amostras de baixa entrada. (A) Exemplos da consistência do H3K27ac ChIP-Seq para células 100.000 até 10.000 em células HUT-78 (uma linha celular de células T). As faixas (Navegador genoma UCSC, intensidade máxima, função de alisamento de 4, todas com eixo Y igualmente dimensionado) mostram o lócus IL4. (B) Correlações pearson das réplicas usando uma extensão de 300 bp e janela de 500 bp dentro do pacote MEDIPS16.  (C) Correlações de Pearson entre os diferentes grupos de números celulares (100.000, 50.000 e 10.000 células) utilizando os mesmos parâmetros MEDIPS como em (B)16. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A análise de correlação de Pearson mostrou alto índice de correlação (83% a 92%), sugerindo manutenção de sinal em amostras de números de células baixas. No entanto, houve aumento do histórico à medida que os números de células foram reduzidos, bem como a queda dos coeficientes de correlação (Figura 4B). Para manter sinais de baixo plano de fundo, foram mescladas duplicatas técnicas e testadas correlação entre grupos(Figura 4C).

Tampão de fixação celular de 10X
Composto Concentração Final
Solução de formaldeído 11%
NaCl 100 mM
EDTA, pH 8.0 1 mM
EGTA, pH 8.0 0,5 mM
HEPES, pH 7.5 50 mM
Tampão de lise completa
Composto Concentração Final
Tris-HCI, pH 8.0 50 mM
EDTA, pH 8.0 10 mM
SDS 0.25%
Butirato de sódio 20 mM
Coquetel inibidor de protease 1X
Tampão de Lysis de curto prazo
Composto Concentração Final
Tris-HCI, pH 8.0 50 mM
EDTA, pH 8.0 10 mM
SDS 0.25%
Mistura de tagmentação
Composto Concentração Final
Tris-HCI, pH 8.0 10 mM
MgCl2 5 mM
N,N-dimetilformamida 10%
Enzima de tagmentação de illumina 1:24 vol:vol
CtD Mix
Composto Por amostra (μL)
Primer de índice NextEra A (25 μM) 0.275
Primer de índice NextEra B (25 μM) 0.275
2X KAPA HiFi HotStart Ready Mix 2.75
1:1000 SYBR Corante verde 0.11
Corante passivo ROX 0.11
Água Encha a 4 μL
Mistura AMP
Composto Por amostra (μL)
2X KAPA HiFi HotStart Ready Mix 27.5
Água Encha até 31 μL

Tabela suplementar 1: Receitas tampão.

Tabela suplementar 2: Correlações amostrais de Spearman e Pearson para os 6 doadores e cada tipo de célula. Clique aqui para baixar esta tabela.

Discussion

O método descrito aqui expande o procedimento de ChIPmentation11, que implementa um protocolo de preparação da biblioteca de tagmentação antes da purificação do DNA, automatizando e microdimensionando o protocolo. Desde o início do ChIP-Seq, os números de células necessários foram reduzidos drasticamente, de cerca de 20 milhões de células para histones até centenas e até mesmo células únicas1,7,10,12,18,19,20,21. Esses métodos recém-desenvolvidos permitiram uma compreensão mais profunda de como os mecanismos cis-reguladoresestão funcionando nas células, aumentando a sensibilidade e permitindo que populações raras de células clínicas sejam testadas5,6,12,17. Por exemplo, um dos procedimentos mais recentes e populares, chamado CUT&TAG, como robusta e sensível Alternativa ChIP-Seq9. Produz uma excelente relação sinal-ruído, pois a enzima Tn5 está covalentemente ligada à proteína A e reconhece a cadeia Fc do anticorpo ChIP com alta especificidade9. A atividade de fundo da enzima Tn5 é reduzida, pois a enzima não está funcional antes de se ligar ao anticorpoalvo 9. No entanto, a implementação desse método em um contexto clínico é limitada, uma vez que requer células vivas não fixas. Além disso, a remoção de fragmentos de DNA do núcleo hipotônico pode ter efeitos negativos sobre a cromatina, uma vez que é removida durante o ensaio. A exigência necessária para trabalhar com células frescas e vivas é uma fonte de problemas para amostras clínicas raras e para grandes coortes de amostras, uma vez que grandes coortes podem levar inúmeros anos para coletar5. Outro tipo de método, drop-ChIP, usa elegantemente um dispositivo de microfluidics para gerar tagmention baseado em gotícula antes de processar o ChIP19. No entanto, utiliza um dispositivo microfluido altamente especializado e, embora seja possível completar chIP-Seq unicelular, também está limitado ao uso de células vivas7,8,9,18,19. Métodos mais novos que dependem do ChIP-Seq, como PLAC-Seq ou HiChIP, tentam compreender as interações de 3 dimensões (3D) entre os picos ChIP-Seq22,23. Esses métodos 3D são emocionantes, pois estão identificando interações cis -regulatóriasou mediadas por TF em todo o genoma e melhor a compreensão da regulação da expressão genética em tipos de interesse celular, em tecidos saudáveis e no contexto da doença.

Existem algumas medidas críticas a serem consideradas para que o protocolo seja bem sucedido, como a qualidade da cromatina sônica e a qualidade do anticorpo. A eficiência da cisalhamento é fundamental, se a cromatina não for bem sônica, a eficiência do ensaio diminui drasticamente24. A sônicação é um aspecto desafiador do ChIP-Seq devido aos números de células necessários. No sonicator usado no protocolo, a eficiência foi drasticamente reduzida sob 300.000 células. Este é um aspecto desafiador no ChIP-Seq quanto ao sonicate sob esse nível muitas vezes exigiria fragmentação enzimática, o que é menos imparcial. Como resultado, a sônica é um fator limitado importante para o verdadeiro ChIP-Seq microescalado. Outras plataformas de sônica e kits disponíveis comercialmente foram testados para cromatina sônica, mas o sonicator usado aqui teve os resultados mais robustos e reprodutíveis. Outra vantagem do sonicator é não ter que comprar tubos especializados para executar a sônica, o que reduz os custos ao lidar com um grande número de amostras. Para a sônica ideal, em primeiro lugar, é importante pré-aquecer o sonicator como descrito acima. Em segundo lugar, para lise a pelota, recomenda-se ter a ponta pipeta tocando a parte inferior do tubo enquanto lise para quebrar as células com mais restrições físicas. Em terceiro lugar, qualquer formação de bolha antes da sônica dificulta a capacidade da amostra de ser sônica uniformemente. Se houver alguma bolha formada durante a lise, é importante removê-las com uma pipeta. Isso pode ser desafiador sem remover muita amostra, mas se a ponta for levemente pressionada contra a bolha, ela pode ser lentamente elaborada sem perda de muita amostra. Por fim, ao determinar o número de ciclos, complete um curso de tempo onde a cada três ciclos, a amostra é removida, purificada e ran ed em um gel de agarose. Evite a sônica excessiva/sob sônica de amostras, pois isso diminui a eficiência do ChIP. Se a amostra estiver sob sonicação, os fragmentos grandes podem ter um efeito negativo sobre a qualidade ChIP-Seq24. Por outro lado, se a amostra for mais sônica, há o risco de o epitope alvo se perder no processo.

Outra parte essencial do ChIP-Seq é a qualidade do anticorpo. Antes de executar qualquer estudo em larga escala, é necessário otimizar o anticorpo que será usado. O objetivo é obter uma relação sinal significativamente alta para ruído de regiões conhecidas do genoma e outra é a reprodutibilidade. Se o anticorpo estiver puxando um monte de sinal de fundo, pode ser recomendado usar uma entrada maior ou tentar um lote/fornecedor diferente. Isso adicionará tempo antes de iniciar um experimento em larga escala, mas é um passo essencial. Para testar o sinal-para-ruído é recomendável usar qPCR com regiões conhecidas por serem um alvo do seu anticorpo e outra região conhecida por estar ausente. Notou-se que as modificações de histonas são mais robustas e fáceis de otimizar do que os TFs.

O protocolo descrito acima fornece um método robusto para chip-seqão de alta produtividade de modificação de histona de forma semiautônomo e microescalada. O método limita a quantidade de tempo prático e aumenta a reprodutibilidade sobre o ChIP-Seq manual. Estudos anteriores concluídos no laboratório utilizaram ChIP manual em réplicas técnicas e obtiveram uma média de correlação de Spearman de 0,505, porém, com o sistema semiautomado, a correlação de Spearman entre diferentes doadores com uma média de células NK de 0,66 (Tabela Suplementar 2). Isso também foi concluído com cerca de 40% menos tempo prático. O método descrito aqui foi otimizado para modificações de histona (H3K27ac mostrado aqui, mas o protocolo não deve precisar de qualquer modificação para outros) e exigiria apenas pequenas modificações para serem implementadas para TF ChIP-Seq. Apesar da qualidade do anticorpo, a principal modificação seria para o tempo de sônicação e potencialmente os buffers utilizados durante o IP. Normalmente, para ensaios TF ChIP, o método pode funcionar melhor com fragmentos ligeiramente mais longos de cromatina (com um alcance de cerca de 350-800 bp) como os complexos TF:DNA são provavelmente menos capazes de ser mantidos através de sônica rigorosa6. Os buffers também podem precisar mudar para um mix personalizado ou outros kits disponíveis da indústria, já que os TFs podem se comportar de forma diferente das modificações de histona.

Embora o manipulador líquido ChIP automatizado tenha sido testado para apenas 10.000 células, houve uma diminuição notável na reprodutibilidade em concentrações de cromatina mais baixas. Devido a isso, o protocolo não foi recomendado para menos de 10.000 células, sendo 100.000 células as condições ideais. O protocolo também foi concluído usando buffers chip da indústria, que era uma despesa adicional, mas forneceu dados de maior qualidade. O protocolo pode ser modificado em relação às condições de sônica (desde que a cromatina ensaboada seja mantida dentro da mesma faixa), os buffers podem ser personalizados para a imunoprecipitação (IP; a otimização pode ser necessária) ou o manipulador líquido ChIP pode não ser usado. Uma limitação do protocolo é o uso do manipulador de líquidos ChIP, que pode ser um investimento caro e só pode executar 16 amostras de uma só vez. O manipulador líquido ChIP está limitado a reações em pequena escala e números de células superiores a um milhão não são recomendados. No entanto, o protocolo poderia ser concluído sem ele, completando as etapas de IP e lavagem manualmente. Se o IP e as lavagens forem completados à mão, o tempo para concluir o ensaio aumentará e a reprodutibilidade poderá diminuir, mas este guia ainda será útil executando um experimento ChIP-Seq de alta qualidade. Note-se que outros manipuladores líquidos podem ser adaptados para executar reações chip semiautomáticas.

Resumindo, os principais benefícios deste sistema são a natureza de alto rendimento, uma vez que as etapas de IP e lavagem são concluídas de forma autônoma. Como tal, rodadas sequenciais de experimentos ChIP podem ser concluídas, permitindo que até 48 amostras sejam totalmente processadas e prontas para sequenciamento em 5 dias, com tempo prático limitado em comparação com experimentos manuais de ChIP-Seq. Outro benefício é o aumento da reprodutibilidade, uma vez que o ChIP-Seq pode ser difícil obter resultados altamente reprodutíveis. Outros métodos requerem células vivas, sistemas complexos de micro-tubulação ou o trabalho a ser concluído manualmente. Este sistema terá que ser otimizado para amostras de baixa entrada (<10.000 células), permitindo, em última análise, reações de ChIP unicelulares. O sistema também é capaz de ser adaptado para os métodos ChIP mais novos, como PLAC-Seq e HiChIP22,23.

Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Agradecemos aos membros do laboratório Vijayanand por ajuda técnica e discussões construtivas e o Dr. Sharron Squazzo e o Sr. Geoffrey Berguet de Diagenode por assistência técnica com a máquina e protocolos de sonicator e chip. Este trabalho foi apoiado pelas bolsas NIH AI108564, R01HL114093, S10RR027366 (BD FACSAria II) e S10OD016262 (Illumina HiSeq 2500).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
200 µl tube strips (8 tubes/strip) + cap strips Diagenode C30020002 Strip tubes for use on the IP Star; ChIP 8-tube strip
AMPure XP for PCR Purification Beckman Coulter A63880 SPRI beads
Axygen 0.6 mL MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube Corning MCT-060-C 0.65 mL low binding tube
Bioruptor Pico Sonicator Diagenode B01060010 Sonicator used in the lab but others can be used
ChIP DNA Clean & Concentrator (Capped Columns) Zymo Research D5205 DNA clean-up kit
Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation ThermoFisher 10001D
EDTA (0.5 M), pH 8.0, RNase-free ThermoFisher AM9260G
EGTA pH 8.0 Millipore Sigma E3889-25G
Eppendorf ThermoMixer C Eppendorf 2231000667
Formaldehyde solution Millipore Sigma 252549-1L
Glycine Millipore Sigma 50046-250G
H3K27ac polyclonal antibody - Premium Diagenode C15410196
HEPES (1 M) pH 7.5 ThermoFisher 15630080
IDT for Illumina Nextera DNA Unique Dual Indexes Illumina 20027213
Illumina Tagment DNA Enzyme and Buffer Small Kit Illumina 20034197
IP-Star Compact Automated System Diagenode B03000002 Automated system for ChIP-Seq studies; ChIP liquid handler
KAPA HiFi HotStart ReadyMix Roche KK2601 PCR mix
Medium reagent container for SX-8G IP-Star Compact Diagenode C30020003
MgCl2 (magnesium chloride) (25 mM) ThermoFisher R0971
N,N-Dimethylformamide Millipore Sigma D4551-250ML CAUTION - low flash point
NaCl (5 M), RNase-free ThermoFisher AM9760G
PBS (10X), pH 7.4 ThermoFisher 70011044
PCR Flex-free 8-tube stripes, attached individual optical caps USA Scientific 1402-4700 8 strip tubes, 0.2 mL 8-tube strip
Proteinase Inhibitor Cocktail Millipore Sigma P8340
Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade ThermoFisher 25530049
PureLink RNase A (20 mg/mL) ThermoFisher 12091021
Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent ThermoFisher P7581 Used in the flourescence quantification
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System ThermoFisher 4485699 qPCR
ROX Reference Dye ThermoFisher 12223012
Sodium butyrate Millipore Sigma 303410-100G
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10,000X Concentrate in DMSO) ThermoFisher S11494 nucleic acid dye
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain - 10,000X concentrate in DMSO ThermoFisher S7563
TE Buffer ThermoFisher 12090015
Tips (bulk) Diagenode C30040020 Tips for the IP Star
True MicroChIP Kit Diagenode C01010130 Contains all the buffers for the IP; ChIP kit
UltraPure 1M Tris-HCI, pH 8.0 ThermoFisher 15568025
UltraPure SDS Solution, 10% ThermoFisher 24730020

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Biologia Edição 162 ChIP-Seq Manipulador de líquidos ChIP tagmentação H3K27ac baixa entrada chipmentação automatizado

Erratum

Formal Correction: Erratum: A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies
Posted by JoVE Editors on 09/14/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies. An author's name was updated.

The name was corrected from:

Pandurangan Vijayanad

to:

Pandurangan Vijayanand

Formal Correction: Erratum: A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies
Posted by JoVE Editors on 05/19/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies. An author's name was updated.

The name was corrected from:

Sara Herrera-da la Mata

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Sara Herrera-de la Mata

Um procedimento de ChIP-Seq semiautônomo para estudos epigenéticos em larga escala
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Cayford, J., Herrera-de la Mata, S., … More

Cayford, J., Herrera-de la Mata, S., Schmiedel, B. J., Chandra, V., Vijayanad, P., Seumois, G. A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies. J. Vis. Exp. (162), e61617, doi:10.3791/61617 (2020).

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