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Summary
이 논문은 ChIP 액체 처리기 플랫폼을 사용하여 특정 히스톤 수정(H3K27ac)과 관련된 DNA 영역의 반자동 마이크로스케일드 ChIP-Seq 프로토콜을 설명하고 태그를 사용하여 라이브러리 준비를 수행합니다. 이 절차는 품질 및 수량 목적에 대한 제어 평가를 포함하고 다른 히스톤 수정 또는 전사 요인에 채택 될 수있다.
Abstract
염색체 면역 침전물 다음에 시퀀싱 (ChIP-Seq)은 시스 조절 DNA 요소를 식별하는 데 도움이되는 H3K27ac와 같은 특정 히스톤 수정과 관련된 크로마틴 DNA를 프로파일링하는 강력하고 널리 사용되는 접근 방식입니다. ChIP-Seq를 완료하는 수동 프로세스는 노동 집약적이고 기술적으로 어렵고 종종 큰 세포 수(>100,000 세포)가 필요합니다. 여기에 설명된 방법은 이러한 문제를 극복하는 데 도움이 됩니다. 세포 고정, 크로마틴 전단, 면역 침전, 시퀀싱 라이브러리 제제를 포함한 완전한 반자동, 마이크로스케일H3K27ac ChIP-Seq 절차는 세포 수 입력에 대한 48개의 샘플을 배치하여 100,000세포 미만의 세포수를 상세히 설명한다. 반자율 플랫폼은 기술적 변동성을 줄이고 신호 대 잡음 비율을 개선하며 노동력을 대폭 줄입니다. 이 시스템은 반응량을 줄임으로써 효소, 자기 구슬, 항체 및 실습 시간과 같은 고가의 시약의 수를 제한함으로써 비용을 절감할 수 있습니다. ChIP-Seq 방법에 대한 이러한 개선은 매우 재현 가능한 방식으로 제한된 세포 수를 가진 임상 샘플의 대규모 후생 유전학 연구에 적합합니다.
Introduction
특정 히스톤 수정과 관련된 DNA의 단편을 결정하기 위한 ChIP-Seq 애약의 폭넓은 사용은 활성 증강제, 프로모터, 소음기, 헤테로크로마티닌 및기타1,2,3,4등을포함한 시스 조절 DNA 요소를 식별하는 능력 때문입니다. 게놈 전반에 걸친 비코딩 규제 영역의 식별은 건강과 질병의 유전자 조절을 더 잘 이해하기 위한 귀중한 통찰력을 보여주었습니다4. 실험실에서 이전 작품은 CIP-Seq를 사용하여 Cis-규제 요소가 다른 세포 유형5에서중요한 역할을 할 수 있음을 보여주었습니다. 전사 인자(TF) ChIP 작용제는 질병 관련 위험 단일 뉴클레오티드 다형성6을나타내기 위해 활용되고 있다.
인간 임상 샘플과 ChIP-Seq의 사용은 주로 세포 수 또는 원하는 조직 샘플의 제한으로 인해 도전적이다. 그 결과, 이러한 기술을 개선하고 마이크로스케일링하기 위한 분야에서 공동의 노력이 있었고, 그 결과 CUT&TAG5,7,8,9,10,11,12와 같은 여러 가지 소감이 나타났다. 이 분석은 특정 항체9에의해 결합된 게놈 영역을 태그화 및 격리하기 위해 트랜스포지를 이용한다. 이 기술은 세포 수를 1,000대까지 감소시킬 수 있었고 어떤 경우에는 단일 세포로 감소시킬 수 있었지만, 번역 연구 및 임상 셋업에서 이 기술을 사용하는 것은 이 방법에 대한 라이브 세포를 사용하는 요구 사항으로 인한한계를보이고 있다9,12. 라이브 셀 요구 사항은 임상 샘플을 처리하기 어렵게 만들고 샘플이 동시에 처리되지 않으면 배치 효과를 유발할 수 있습니다. 다른 사람들은 높은 처리량 방식으로 여기에 적응되는 ChIPmentation11의개발을 포함하여 포름알데히드 고정 셀에 대한 마이크로 스케일드 기술을 최적화했습니다. 고정 셀을 사용하면 모든 샘플을 수집하고 후속 처리할 때까지 샘플을 저장하여 배치 효과를 최소화할 수 있습니다.
여기서, 반자동 마이크로스케일드 ChIP-Seq 분석체는 실험적인 실습 시간을 감소시켜 히스톤수정(10)을프로파일링하는 것으로 설명된다. 반자동 방법을 사용하면 고처리량 인 ChIP-Seq 분석법을 허용하여 최대 48개의 샘플을 완전히 처리하고 5일 이내에 시퀀싱할 수 있으며, ChIP 액체 처리기를 사용하여 샘플당 10,000개의 셀이 적습니다. 처리기는 면역 침전(IP) 및 후속 세차스를 자율적으로 완료하여 샘플 간의 가변성을 줄이는 데 도움이 됩니다. 반자동 방법은 48개의 견본을 위한 15 시간 이상 및 기술적인 가변성에 대해 실습 시간을 둘 다 낮춥습니다, 1 차 또는 배양한 세포에 대한 재현 가능하고 빠른 방식으로 실행될 수 있는 대규모 후성 유전학 연구 결과를 가능하게 합니다. 이 프로토콜은 고품질 ChIP-Seq에 대한 프로세스를 처음부터 끝까지 설명합니다. 특정 컴퓨터를 사용할 수 없는 경우 프로토콜은 ChIP-Seq 실험을 수동으로 설정하고 문제 발생시 하는 데 유용한 리소스가 됩니다.
분석세 3개의 다른 1차 인간 면역 세포 모형 및 1개의 배양세포주 (HUT78 - ATCC: TIB-161)로 수행되었다. 명확성을 위해, 프로토콜은 7개의 단부로 분할되었습니다: 초음파 처리를 통해 세포 고정, 염색질 전단, 자동화된 크로마틴 면역 침전, DNA 단편 태그에 의한 도서관 준비, 도서관 증폭, 도서관 정화, DNA 정량화. 완충 레시피는 보충표 1을 참조하십시오.
Protocol
라호야 알레르기 및 면역학 연구소의 기관 검토 위원회 (IRB) (LJI; IRB 프로토콜 번호 SGE-121-0714) 연구를 승인했습니다. 건강한 자원봉사자들은 서면 동의 후 백혈병 샘플을 모집하고 제공했습니다.
1. 셀 고정
- 15mL 튜브(<10mL 현탁액) 또는 50mL 튜브(10-30mL)의 완전한 세포 배양 배지를 가진 세포 현탁액 농도를 1~2 x 106 셀/mL로 가져옵니다. <1 x 106 셀의 경우 1.5 mL 튜브에서 배지0.5 mL을 사용하십시오.
- 셀 서스펜션을 부드럽게 소용돌이치고, 10배 셀 고정 버퍼 드롭와이즈(1:10; vol:vol)를 추가하고 실온(RT)에서 10분 동안 저속으로 회전합니다.
- 부드럽게 소용돌이에 의해 반응을 중지하고 1:20 (vol:vol)의 비율로 2.5 M 글리신을 추가합니다. 튜브를 몇 번 반전시키고 얼음에 적어도 5 분 동안 배양하십시오.
- 나머지 단계를 4°C 또는 얼음에서 수행합니다. 튜브를 800 x g에서 4 °C에서 5 분 동안 회전시키고 상체를 폐기하십시오.
- 5mL의 얼음 차가운 1x PBS로 펠릿을 부드럽게 재연하고 얼음 위에 2분 동안 배양합니다.
- 1.4 및 1.5를 얼음 차가운 1x PBS로 반복하고 샘플을 미리 냉각된 1.5mL 튜브로 전송합니다(장기 저장을 위해 표시). 해당하는 경우 알리쿼트 준비가 권장됩니다.
- 4°C에서 1,200 x g에서 튜브를 회전시키고 세포 펠릿을 방해하지 않고 가능한 한 많은 상체를 제거합니다. 스냅 액체 질소에 펠릿을 동결. -80 °C에 보관하십시오.
주의: 액체 질소를 취급할 때 적절한 보호를 하십시오.
2. 크로마틴 전단
참고: 이 프로토콜은 0.65 mL 낮은 결합 튜브에서 0.3 ~ 3 x 106 셀을 가진 펠릿의 크로마틴 전단에 최적화되어 있습니다.
- -80°C에서 냉동 셀 펠릿으로 샘플 튜브를 제거하고 용해 버퍼를 추가하기 전에 펠릿의 해동을 피하기 위해 드라이 아이스에 저장하십시오. 이 단계는 매우 중요합니다.
- 70 μL의 신선한 RT 완전 리시스 버퍼를 펠릿에 넣고 RT에서 1분 동안 보관하십시오.
- 어떤 거품의 도입없이 1 분 동안 펠릿을 다시 중단한 다음 얼음에 샘플을 넣기 전에 1 분 동안 RT에서 세포 현탁액을 배양하십시오.
- 재매달된 펠릿을 0.65mL 로우 바인딩 튜브로 옮기고 얼음을 유지합니다.
참고: 재현 가능한 초음파 처리를 얻으려면 시료를 초음파 처리하기 전에 3-6 사이클동안 빈 튜브만으로 실행하여 초음파 처리기를 미리 데우십시오. - 샘플을 초음파 처리기의 튜브 홀더에 넣고 70 μL의 물로 채워진 균형 튜브로 간격을 채웁니다. 초음파 처리를 시작하기 전에 약 1 분 동안 수조에 샘플을 둡니다.
- 사이클당 16s ON/32s OFF로 x 사이클(셀 유형에 따라 다름)에 대해 초음파 처리를 수행합니다.
참고: 이 단계에서는 효율적인 초음파 처리를 위해 최적의 사이클 수를 결정하기 위해 유효성 검사 실험이 필요합니다. - 매 3 주기 후에, 초음파 처리기에서 견본을 제거하고, 부드럽게 소용돌이및 펄스는 홀더에 다시 넣기 전에 관을 회전합니다. 거품 형성을 일으킬 수 있으므로 튜브 외부에 작은 방울이 없는지 확인하십시오.
- 필요한 주기를 완료한 후 4°C에서 15분 동안 >14,000 x g의 샘플을 회전시합니다. 상체를 새로운 사전 냉각된 저바인딩 0.65 mL 로우 바인딩 튜브로 옮기고 얼음을 유지합니다.
- 초음파 처리 된 샘플의 일부를 디크로스하여 초음파 처리 효율을 확인합니다.
- 상체의 1-7 μL(시어드 크로마틴의 약 250ng에 해당)을 0.2mL PCR 튜브로 옮기고 RT에서 단기 용해 버퍼로 최대 10 μL의 부피를 만듭니다.
- 1 μL RNase A를 추가하고 800 rpm에서 37 °C에서 30 분 동안 배양 한 다음 1 μL 단백질 A를 추가합니다.
- 55°C에서 2시간 동안 1,000rpm에서 흔들리면 배양합니다.
- 형광 정량화분석법 10을 사용하여 DNA 정량화를 위한 탈계 시료의 2 μL을 제거합니다(분광계는 비누와 분해된 단백질이 결과에 편향을 생성할 수 있기 때문에 권장되지 않습니다).
- 나머지 샘플을 핵산 염료(1:20,000)로 70 V. 스테인에서 1시간 동안 1.2% 아가로즈 젤로 실행하고 UV 트랜틸루미네이터를 사용하여 젤을 읽는다.
- 저장을 위해 크로마틴 스톡 알리코트 준비(샘플을 20 μL에 20 μL로 희석하여 완전한 리시스 버퍼로 희석). -80°C에 모든 시어드 크로마틴을 보관합니다.
3. 히스톤 수정을 위한 자동 ChIP-Seq
참고: 이 프로토콜은 ChIP 액체 처리기에서 실행되도록 설계되었습니다. 시스템은 사용자 지정된 버퍼를 사용할 수 있지만 모든 버퍼는 ChIP 키트와 함께 제공됩니다. 이 섹션에 사용되는 8개의 튜브가 있는 ChIP 스트립은 ChIP 액체 처리기에 만드실 수 있습니다.
- -80°C에서 20 μL에서 시어드 크로마틴 500 ng로 16개의 시료 알리쿼트를 옮기고 천천히 크로마틴을 해동시키기 위해 얼음 위에 놓습니다. 완전히 해동되면, 소용돌이가 잠시 펄스 스핀.
- 크로마틴 준비
- 1x 프로테아제 억제제와 20mM 나트륨 부티레이트(완전 tC1 버퍼)로 보충된 tC1 버퍼의 파이펫 100 μL이 두 개의 ChIP 8튜브 스트립으로 보충됩니다.
- 각 크로마틴 샘플의 20 μL을 완전한 tC1 버퍼의 100 μL을 포함하는 ChIP 8 튜브 스트립의 적절한 튜브로 옮킨다. 크로마틴 튜브에 80 μL 완전 tC1 버퍼를 추가하여 크로마틴 튜브를 세척한 다음 ChIP 8튜브 스트립의 적절한 튜브로 다시 이송하여 200 μL의 최종 부피를 위해 세척합니다.
- 항체의 준비
- 항체의 0.5 μg가 각 튜브에 있도록 항체의 부피를 계산한다.
항체의 부피 = (반응당 샘플 수 x 항체) / 항체 농도 - 계산된 양의 항체를 tBW1 버퍼의 500 μL에 추가합니다. 빠르게 소용돌이와 펄스 스핀.
- 두 개의 ChIP 8 튜브 스트립 각각에 tBW1의 파이펫 70 μL및 각 튜브에 항체 + tBW1의 30 μL을 추가합니다. 이렇게 하면 각 튜브의 총 부피가 100 μL로 가져옵니다.
- 항체의 0.5 μg가 각 튜브에 있도록 항체의 부피를 계산한다.
- 마그네틱 비드의 준비
- 단백질 A 비드 용액을 철저히 소용돌이시다. 항체의 0.5 μg의 경우, 구슬의 파이펫 5 μL은 ChIP 8 튜브 스트립과 펄스 스핀의 새로운 세트로 들어갑니다.
- ChIP 액체 처리기의 마지막 행을 레이블이 붙은 빈 ChIP 8 튜브 스트립으로 채웁니다.
- ChIP 액체 처리기 기계에 있는 모든 스트립의 배치를 위한 ChIP-16-IPure-200D 프로그램 사양을 따르십시오. 버퍼를 올바른 위치에 추가하지만 tE1 버퍼 대신 tW4를 사용합니다.
참고: ChIP 액체 처리기가 하룻밤 사이에 ChIP를 수행할 수 있도록 하루를 구성합니다. 이 프로그램은 16개의 샘플에 대해 약 16시간 동안 실행됩니다. 이는 1일째가 되는 날입니다.
4. 도서관 준비를 위한 라이브러리 어댑터의 트랜스포사제 통합
- 37°C 및 500 rpm으로 열믹서를 미리 설정합니다. 얼음 에 0.2 mL 튜브 스트립에 대한 자석을 냉각.
- 16개의 시료의 경우 얼음 위에 440μL의 태그션 버퍼를 준비하십시오. 파이펫 53 μL은 하나의 새로운 8 튜브 스트립에 얼음을 유지합니다.
- 새로운 0.2 mL 8 튜브 스트립에 220 μL의 콜드 tC1 버퍼를 추가하고 얼음을 유지합니다. 8 개의 스트립 튜브는이 볼륨을 보유 할 수 있으며 여전히 제한됩니다.
- ChIP 액체 처리기 기계(행 12)에서 "IP 샘플" 스트립 튜브를 제거하고 펄스 회전 전에 튜브를 캡합니다. 자석을 사용하여 구슬을 8튜브 스트립에 2분 동안 캡처하고 상체를 조심스럽게 제거합니다.
- 태그 링 버퍼의 25 μL을 다중 채널로 구슬로 옮기고, 자석에서 제거하고, 구슬이 균일해질 때까지 부드럽게 섞습니다(파이펫이 20 μL로 설정된 약 5배).
- 튜브를 캡하고 예열 된 열믹서에 넣고 3 분 동안 인큐베이션하십시오. 시간을 늘리면 라이브러리 준비의 효율성이 저하됩니다.
- 튜브를 차가운 금속 랙에 옮기고 각 샘플에 100 μL 냉각 tC1 버퍼를 추가합니다. 다중 채널 파이펫을 80 μL로 설정하고 구슬이 균일해질 때까지 샘플을 혼합하여 태그 전달 반응을 중지합니다.
- 샘플을 ChIP 액체 처리기에 다시 넣고 세척 절차를 Washing_for_IP-reacts_16_Ipure 진행한다. tC1 버퍼로 두 번, tW4로 두 번 세탁이 수행되도록 하십시오. 용출은 버퍼 tE1을 사용하는 프로그램 레이아웃으로 표시된 대로 완료되어야 합니다.
- DNA의 교차 연결
- ChIP 액체 처리기의 마지막 행에 있는 ChIP 8-튜브 스트립을 제거하고 각 샘플에 2 μL RNase A를 추가합니다.
- 튜브를 캡, 펄스 스핀, 부드럽게 혼합물이 균일 할 때까지 멀티 채널 파이펫구와 구슬을 혼합하고 튜브를 다시 캡.
- 37°C 및 900 rpm에서 30분 동안 써모믹서에 샘플을 배양합니다.
- 써모믹서에서 샘플을 제거하고, 단백질제 K의 2 μL을 추가한 후 4.9.2와 동일한 절차를 따른다.
- 55°C와 1,250rpm에서 4시간 동안 써모믹서에 샘플을 배양하고, 그 다음으로 1,000rpm에서 65°C가 1,000rpm으로 배양합니다.
참고: 2일째가 됩니다.
5. 태그 DNA 단편 정화
- 161.5mL 튜브에 적절한 샘플 번호가 라벨을 지정하고 DNA 정화 키트에서 DNA 결합 버퍼 400 μL을 각각 추가합니다.
- 열믹서에서 8튜브 스트립을 제거하고 스트립을 펄스 스핀하여 증발된 제품이 유지되도록 합니다. 구슬을 잡기 위해 8 스트립 자석에 스트립을 놓습니다.
- 1.5 mL 튜브 각각에 해독 된 DNA의 100 μL을 전송합니다. DNA 결합 버퍼의 100 μL을 8튜브 스트립에 추가하여 구슬을 씻은 다음 적절한 1.5mL 튜브로 옮겨넣습니다.
- 약 10s에 대한 소용돌이와 1.5 mL 튜브펄스 스핀.
- DNA 결합 버퍼 및 ChIP 샘플을 포함하는 600 μL로 컬럼을 로드합니다.
- 10,000 x g에서 20s의 샘플을 회전시키고 흐름을 통해 열을 다시 로드합니다. 동일한 조건으로 다시 회전하고 흐름을 폐기합니다.
- 200 μL 세척 버퍼(이전 단계와 동일한 원심분리)로 컬럼을 두 번 세척하고 흐름을 폐기합니다.
- 12,000 x g에서2 분 동안 원심 분리하여 컬럼을 건조시하십시오.
- 컬럼을 새로운 1.5mL 수집 튜브로 옮기고 9μL 웜 TE 버퍼(55°C로 예열)를 컬럼 행렬에 직접 추가합니다. 10,000 x g에서 1 분 동안 원심 분리 전에 1 분 동안 컬럼을 인큐베이션할 수 있습니다.
- 엘ute의 9 μL을 적절한 새로운 8튜브 스트립 세트로 옮기습니다.
- 이전과 마찬가지로 8 μL TE 버퍼로 용출을 다시 완료합니다. 엘루트를 적절한 8튜브 스트립(샘플당 최종 부피 17 μL)으로 옮기고 얼음을 유지합니다.
6. 정제 된 샘플의 증폭 및 크기 선택
- 다음 단계는 qPCR을 사용하여 최적의 증폭에 필요한 사이클 수를 결정합니다(CtD – Ct 결정)
- CtD 믹스 버퍼의 내용을 샘플 수로 곱하여 모든 샘플에 대해 CtD 믹스를 준비합니다.
- CtD 믹스의 3.6 μL을 qPCR 플레이트에 분배하고 태그가 붙은 DNA 샘플 1.4 μL(총 부피의 10%)을 추가합니다. 다음 qPCR을 수행: 98°C 3분, 72°C 5분, 30초 동안 98°C, 10초 동안 98°C, 30초동안 63°C, 30대 72°C.
- AMP 믹스 버퍼의 내용을 샘플 수로 곱하여 모든 샘플에 대한 Amp Mix를 준비합니다. 태그DNA 14μL을 PCR 플레이트의 별도 우물에 분배한 다음, 각 시료에 2개의 시퀀싱 인덱스 프라이머(25 μM)의 2.5 μL을 추가합니다(최종 반응 부피는 50 μL).
- 샘플을 멀티채널 파이펫으로 혼합하고 CtD에 사용된 증폭 프로그램을 적절한 사이클 수와 함께 수행합니다.
참고: 증폭된 시료를 몇 주 동안 -20°C에서 저장할 수 있기 때문에 이것은 좋은 정지점입니다. 그러나, 정화는 같은 날에 완료될 수 있다. 48개의 샘플의 경우 3-6.5 단계는 두 개의 다른 별도 배치로 완료된 다음 아래에 설명된 대로 한 배치로 증폭되었습니다. - 아래에 설명된 바와 같이 태그 DNA의 사후 증폭, 크기 선택 및 정량화를 수행합니다. 일반적으로 48개의 샘플로 완료할 수 있습니다(원하는 대로 적은 샘플로 완료할 수 있음).
- 각 우물에 90 μL(1:1.8 비율)을 넣고 혼합하여 RT에서 2분 동안 배양할 수 있도록 합니다.
- 플레이트 자석을 사용하여 구슬을 캡처하고 상체를 폐기합니다. 비드 펠릿을 방해하지 않고 신선한 80 % 에탄올 200 μL로 구슬을 3 번 씻으십시오.
- 최종 세척 후 20 μL 팁으로 여분의 에탄올을 제거하고 비드를 10 분 동안 또는 비드 펠릿에 균열이 나타날 때까지 건조하도록 둡니다.
- 접시를 자석위에 놓아 미리 데운 물의 40 μL을 각 우물에 추가합니다. 플레이트를 밀봉하고, 소용돌이를 철저히 밀봉하고, 플레이트를 잠시 펄스 스핀합니다.
- 접시를 자석에 다시 배치하여 구슬을 캡처하고 40 μL 엘루트를 새로운 "샘플" 플레이트로 옮기습니다. 샘플은 이제 정제되고 다음 단계는 200-1,000 bp에 이르는 조각을 풍부하게 합니다.
- 옵션 QC 단계: 샘플에서 4 μL을 제거하고 QC 플레이트로 옮김합니다. 4 μL 물을 다시 샘플에 추가합니다. 이렇게 하면 큰 조각의 백분율이 결정됩니다.
- 22 μL의 파라자성 구슬(1:0.55 비율)을 샘플에 넣고, 조심스럽게 혼합하고, RT에서 2분 동안 배양합니다.
- 자석위에 놓고 5분 동안 구슬을 포획하고 슈퍼네티츠를 "샘플" 플레이트의 7-12열로 옮기습니다. 자석에서 플레이트를 제거하고 구슬 30 μL을 추가합니다(최종 비율 1:1.3). 조심스럽게 섞어서 2분 동안 RT에 앉으세요.
- 구슬을 5분 동안 캡처한 다음 상체를 폐기합니다.
- 앞서 설명한 대로 200 μL 신선 80% 에탄올로 모든 구슬을 3회 세척합니다(6.6.2단계 – 6.6.3).
- 펠릿이 건조되면 자석에 있는 동안 각 우물에 8 μL 미리 따뜻워진 TE 버퍼로 DNA를 엘테합니다.
- 자석에서 접시를 제거하고 밀봉하고 소용돌이를 완전히 제거합니다. 플레이트가 RT, 펄스 스핀에서 2분 동안 배양하고 플레이트를 자석에 다시 2분 동안 놓습니다. 상체를 새 플레이트(플레이트 2)로 옮기습니다.
- 최대 복구를 위해 미리 따뜻워진 TE 버퍼의 추가 8 μL로 용출을 반복합니다. 각 샘플에 최종 라이브러리의 16 μL이 있도록 샘플을 적절한 우물에 배치합니다.
참고 : 이 단계의 끝에 두 개의 플레이트가 있어야합니다 (QC 플레이트가 완료되지 않은 경우 하나). QC 플레이트에는 미리 크기선택된 조각이 있고 두 번째 플레이트에는 최종 라이브러리(총 16μL)의 48개의 웰이 있어야 합니다.
7. 형광 분석기사용으로 최종 라이브러리 및 QC 샘플을 정량화
- 발광 분석 또는 유사한 방법을 정량화하는 형광을 사용하여 완전한 DNA 정량화.
- QC 정량화가 완료되면 1,000bp< 된 시료 손실 비율을 결정합니다. 약 20% 손실이 없어야 합니다 - 더 많은 손실이 있다면 적용된 비드 비율에 문제가 있을 수 있습니다.
- 바람직하게는 모세관 전기포레시스 기계를 사용하여 각 시료의 파편의 크기를 결정한다. 어금니 농도를 계산하려면 다음과 같은 방정식을 사용하십시오: [라이브러리농도(ng/μL) * 10 6]/[660 * 중간 조각 크기(bp)]))).
참고: 라이브러리를 풀링(평년 금액)하고 표준 차세대 시퀀싱 절차에 따라 시퀀싱할 준비가 되었습니다.
Representative Results
개념의 증거로, ChIP-Seq는13이전에 설명된 바와 같이 FACS 선별에 의해 농축된 순진한 CD4 T 세포(CD4), 고전적인 단핵구(MO) 및 자연 킬러 세포(NK)의 3세트를 가진 6명의 인간 기증자를 위해 완성되었다. 밑줄이 표시된 절차는 그림 1에표시된 9개의 고유한 프로시저로 구성됩니다.
그림 1: 절차에 대한 일반 순서도. (A)전체 절차의 만화 (BioRender에서 생성). (B)프로토콜및 매일 연관된 예상 실습 및 총 시간에 대한 모든 주요 단계에 대한 흐름 차트. 시퀀싱은 5일 이후에 여러 라운드가 있을 때 발생할 수 있습니다. 타임라인은 주 내내 엇갈려서 순차적인 날 3-4를 일주일에 여러 번 완료하여 48개의 ChIP 샘플을 생성할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
유동 세포측정에 의한 세포 격리후(13)선별된 세포는 원심분리및 세포가 위에서 설명한 바와 같이 고정및 저장되었다. 모든 샘플을 채취하면, 샘플은 위에서 설명한 바와 같이 12의 배치로 색채 전단을 위해 lysed 및 준비되었다. 각 샘플에 대해 최적의 초음파 처리에 도달하는 사이클 수가10을완료하였다. 정량적 측정뿐만 아니라 전량적 크로마틴 단편 크기 측정은 면역 세포의 세 세트(도 2A)에대한 우리의 방법의 큰 재현성을 보였다. 다른 인간 면역 세포는 별도의 배치로 초음파 처리되었고 14 사이클 (16 s ON, 사이클 당 32 s OFF)에 대해 100 - 500 bp 사이의 샘플의 > 70 %로 매우 일관되게 항복했습니다. 이 시점에서 초음파 처리 후 큰 조각을 가진 샘플 (100 - 500 bp 사이의 샘플의 70 %<)은 실패한 것으로 간주되었습니다. 이 견본은 1-2 추가 주기동안 초음파 처리하거나 폐기되고 나중에 다른 펠릿에서 세포로 대체될 수 있었습니다. 우리의 방법은 시료중 어느 것도 더 초음파 처리가 필요하지 않거나 제거되지 않은 것으로 나타났으며, 절차의 절대적인 견고성을 시사했습니다.
도 2: 사전 시퀀싱 QC 예. (A)1.2% 아가로즈 젤은 초음파 처리의 재현성을 나타낸다. 순진한 CD4 T 세포(CD4), 클래식 단핵구(MO), 자연 킬러 세포(NK) 등 3가지 세포 유형에서 6명의 기증자를 위한 초음파 처리 샘플. 샘플은 14 사이클 (16 s ON, 사이클 당 32 s OFF)에 대해 초음파 처리되었습니다. 각 샘플에 대해 약 200 ng의 탈교 크로마틴은 1% 아가로즈 젤에 로드되었다. 시료는 단편의 70% 이상이 100-500 bp.(B)상부 - 분석 qPCR 증폭 곡선이 증폭을 위한 최적의 사이클 수를 결정하는 경우 양호한 것으로 간주되었다(Ct 어디 1/2 최대 강도가 있는). 이상적인 샘플은 약 15의 Ct를 가지며, 증폭은 측정된 Ct의 2 주기까지 완료될 수 있다. 화살표는 Ct가 18보다 큰 나쁜 예의 예입니다. 아래쪽 - 18보다 큰 Ct가 있는 가난한 샘플 집합의 예가 표시됩니다. 이 견본은 또한 더 낮은 형광 강렬을 보여주었습니다. (C)왼쪽 - 단편 분석기 전기포진 흔적은 증폭 및 크기 선택 후 최종 태그 라이브러리의 분포를 보였다. 조각 라이브러리의 85% 이상을 가진 샘플은 200-1,000 bp 내에 놓여 있으며 좋은 샘플로 간주되었습니다. 형광의 피크 강도의 측정은 또한 중요한 QC 매개 변수로 간주됩니다, 실제로 신호가 낮은 경우, 샘플은 잘 서열 가능성이 없다. 오른쪽 - CD4, MO 및 NK의 양수 샘플에 대한 예가 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
정량화 후, 샘플은 H3K27ac 항체를 가진 ChIP 액체 처리기에 실행되었고, 그 다음에 Tn5 트랜스포사제 효소로 태그화하였다. qPCR에 의한 적절한 증폭 주기 수를 결정하기 위해 태그가 매겨진 시료의 10%가 사용되었습니다. 시료의 증폭을 위한 사이클 수의 측정을 위해, 우리는 시료의 강도가 사이클 측정을 위한 평균 최대치의 절반인사이클(그림 2B)을찾아낸다. Ct 값이 18이상인 샘플은 사후 시퀀싱을 잘 수행하지 못했고 Ct 값은 실패한 ChIP 샘플을 나타내었습니다. 이 견본은 일반적으로 증폭 후에 DNA의 더 낮은 양을 산출했습니다. Ct 값이 15보다 작거나 15개 미만인 샘플(100,000개의 셀 입력)은 이상적이었고 15에서 18 사이의 샘플은 허용가능하지만 덜 일관된 사후 시퀀싱이었습니다. 입력 셀이 100,000개 미만인 샘플의 경우 Ct 값은 일반적으로 15에서 18 사이로 발견되었지만 시퀀싱을 위해 충분한 제품을 산출하기 위해 18사이클 이상이 필요하지 않았습니다.
DNA 태그 증폭 후, 라이브러리는 정제 및 크기를 선택하여 NextGen 시퀀싱을 위해 200bp에서 1,000bp에 이르는 이상적인 크기 분포를 얻었습니다. DNA 단편의 85% 이상이 200~1,000bp(도2C)사이범위일 때 최적의 시퀀싱 데이터를 획득했기 때문에 각 라이브러리에 대한 크기 분포 평가가 완료되었다. 특히, 동일한 양의 DNA(형광 정량화에 의해 측정됨)가 적재됨에 따라, 일반적으로 낮은 형광 강도를 가진 시료를 적발하였다(도2C).
사후 시퀀싱, ENCODE ChIP-Seq 가이드라인에 따른 표준 품질 관리5,14,15가적용되었다.
그림 3: 면역 세포 샘플의 재현성. (A)H3K27ac 트랙(UCSC 게놈 브라우저, 최대 강도, 4의 스무딩 기능) 각 세포 유형(CD4, MO 및 NK)에서 6명의 기증자(복제당 100,000세포)를 위한 동등하게 스케일링된 Y축을 가진. 4개의 예시적인 loci는, 2개(IL2RA 궤적 및 PTPRC)와 2개의 H3K27ac(CCR4 및 MS4A1)에 대한 농축 없이 표시됩니다. (B)각 셀 유형에 대해 MEDIPS 패키지 내에서 300bp 확장 및 500 bp 창을 사용하여 생성된 기증자와 해당 상관 관계 플롯 간의 Pearson 상관관계는16을복제한다. (C)H3K27ac 트랙(UCSC 게놈 브라우저 최대 강도, 4의 스무딩 기능)을 나타내는 각 세포 유형에 대한 병합 된 기증자 파일 (CD4용 IL17R, MO용 CCR2 및 NK용 KLRC1) 및 모든 세포 유형에 존재하는 하우스 키핑 유전자 B2M. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
시각적 품질 관리를 위해 UCSC 게놈 브라우저에 디스플레이를 위한 H3K27ac 농축 트랙이 준비되었습니다. 4개의 유전자 loci에 대해, 각 샘플에 대한 개별 트랙은 우리의 분석의 높은 일관성과 견고성을 반영하는 높은 매핑 품질과 신호 대 잡음 비율을보였다(그림 3A). 좌측좌항에 대한 두 개의 좌측 좌측 항만은 이들 세포 유형에서 잘 발현된 유전자를 가지고 있으며, 오른쪽에 있는 두 개의 좌측에 있는 유전자는 발현되지 않고 배경대조군(도 3A)으로작용한다. 또한, MEDIPS 분석 패키지는 기술복제(도 3B)5,16,17사이의 상관관계 지수를 평가하기 위해 시퀀싱 후 변수로 사용되었으며, 500bp bins16에대한 읽기 농축 수준에 대한 상관관계의 정도를 확립하였다. 쌍별 비교의 대다수에 대해, Pearson 상관 관계 지수는 생물학적복제(그림 3B)간의높은 수준의 일관성을 시사하는 90% 이상의 상관관계를 보였다. 허용 가능한 상관 관계가 있는 복제를 병합하여 신호 대 잡음 비율을 증가시켰습니다. 세포 형 특이적 loci가 적절한 세포에서 높은 농축을 보였지만, 집 유지 유전자 (B2M)는 매우 일관된 히스톤 수정(도 3C)을보였다. 분석을 위해, 복제로부터 트랙을 병합하면 농축을 증가시키고, 중요한 세포 유형 별 증강을 포함하여 특정 신호를 보강하고, 인간샘플5에내재된 개별 간 가변성을 감소시킨다.
비록 100,000 세포이 연구 결과에 대 한 사용 되었다, 인간의 배양 T 세포주에서 거의 10,000 세포에 대 한 높은 재현성 했다 (HUT78). 100,000세포 미만의 샘플을 통해 수행된 ChIP-Seq 데이터 세트 간의 상관관계 분석은 10,000세포(도4A)까지높은 재현성과 상관관계를 보였다.
도 4: 낮은 입력 샘플의 재현성. (A)허트-78 세포(T 세포 림프종 세포주)에서 100,000까지 세포에 대한 H3K27ac ChIP-Seq의 일관성의 예. 트랙(UCSC 게놈 브라우저, 최대 강도, 4의 스무딩 기능, 모두 똑같이 배율Y축)은 IL4 궤적을 나타낸다. (B)MEDIPS패키지(16)내300bp 연장 및 500bp 윈도우를 이용하여 복제의 피어슨 상관관계. (C)Pearson 상관관계는 (B)16에서와동일한 MEDIPS 파라미터를 사용하여 상이한 세포 수 그룹(100,000, 50,000 및 10,000세포)과 의 상관관계를 갖는다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Pearson 상관 관계 분석은 낮은 세포 수 샘플에서 신호의 유지 를 제안 높은 상관 관계 지수 (83 %에서 92 %)를 보였다. 그러나, 상관계수(도4B)의하락뿐만 아니라 세포수가 감소함에 따라 배경이 증가하였다. 낮은 배경 신호를 유지하기 위해 기술 중복이 병합되고 그룹 간에 상관 관계가 테스트되었습니다(그림4C).
| 10X 셀 고정 버퍼 | |
| 화합물 | 최종 농도 |
| 포름알데히드 솔루션 | 11% |
| 나Cl | 100mM |
| EDTA, pH 8.0 | 1 mM |
| EGTA, pH 8.0 | 0.5 mM |
| 헤페, pH 7.5 | 50mM |
| 완전한 리시스 버퍼 | |
| 화합물 | 최종 농도 |
| 트리스-HCI, pH 8.0 | 50mM |
| EDTA, pH 8.0 | 10mM |
| SDS | 0.25% |
| 나트륨 부티레이트 | 20mM |
| 프로테아제 억제제 칵테일 | 1X |
| 단기 용해 버퍼 | |
| 화합물 | 최종 농도 |
| 트리스-HCI, pH 8.0 | 50mM |
| EDTA, pH 8.0 | 10mM |
| SDS | 0.25% |
| 태그 믹스 | |
| 화합물 | 최종 농도 |
| 트리스-HCI, pH 8.0 | 10mM |
| MgCl2 | 5 mM |
| N,N-디메틸포르마미드 | 10% |
| 일루미나 태그먼트 효소 | 1:24 vol:vol |
| CtD 믹스 | |
| 화합물 | 샘플당(μL) |
| 넥스트에라 인덱스 프라이머 A (25 μM) | 0.275 |
| 넥스트에라 인덱스 프라이머 B (25 μM) | 0.275 |
| 2X KAPA 하이파이 핫스타트 레디 믹스 | 2.75 |
| 1:1000 SYBR 그린 염료 | 0.11 |
| ROX 패시브 염료 | 0.11 |
| 물 | 4 μL로 채우기 |
| AMP 믹스 | |
| 화합물 | 샘플당(μL) |
| 2X KAPA 하이파이 핫스타트 레디 믹스 | 27.5 |
| 물 | 31 μL로 채우기 |
보조 표 1: 버퍼 레시피.
보충 표 2: 6 명의 기증자와 각 세포 유형에 대한 스피어맨 및 Pearson 샘플 상관 관계. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
여기서 설명된 방법은 프로토콜을 자동화 및 마이크로스케일링하여 DNA 정화 전에 태그 작성 라이브러리 준비 프로토콜을 구현하는 ChIPmentation절차(11)에확장된다. ChIP-Seq의 발병 이후, 필요한 세포 수는 히스톤에 대한 약 2천만 세포에서 수백 개의 세포로 크게 감소되었으며, 심지어 단일 세포1, 7,10,12,18,19,20,21로감소하였다. 이러한 새로 개발된 방법은 cis-조절메커니즘이 감도를 높이고 희귀 임상 세포집단을5, 6,12,17로시험할수 있게 함으로써 세포에서 어떻게 작동하는지에 대한 심층적인 이해를허용하였다. 예를 들어, 강력하고 민감한 ChIP-Seq 대안9로CUT&TAG라고 불리는 최근의 인기 있는 절차 중 하나입니다. Tn5 효소가 단백질 A에 동적으로 결합되어 높은 특이성9를가진 ChIP 항체의 Fc 체인을 인식하기 때문에 우수한 신호 대 잡음 비를 생성한다. Tn5 효소의 배경 활성은 효소가 표적 항체9에결합하기 전에 작용하지 않기 때문에 감소된다. 그러나, 임상 적 맥락에서 이 방법의 구현은 비 고정된 살아있는 세포를 필요로 하기 때문에 제한됩니다. 또한, 저혈압 핵에서 DNA 단편을 제거하는 것은 분석 중에 제거될 때 크로마틴에 부정적인 영향을 미칠 수 있다. 큰 코호트가5를수집하는 데 수년이 걸릴 수 있기 때문에 신선하고 살아있는 세포와 함께 일하는 데 필요한 요구 사항은 희귀 한 임상 샘플과 샘플의 큰 코호트에 대한 문제의 원천입니다. 또 다른 유형의 방법인 drop-ChIP는 우아하게 마이크로유체전자 장치를 사용하여 ChIP19를처리하기 전에 액적 기반 태그멘션을 생성한다. 그러나, 고도로 전문화된 미세유체 장치를 사용하고, 단일 세포 ChIP-Seq를 완성할 수 있지만, 또한 살아있는 세포7,8,9,18,19의사용에 국한된다. PLAC-Seq 또는 HiChIP와 같은 ChIP-Seq에 의존하는 새로운 방법은 ChIP-Seq 봉우리22,23사이의 3차원(3D) 상호 작용을 이해하려고 시도합니다. 이러한 3D 방법은 게놈 전반에 걸쳐 cis-regulationy또는 TF 매개 상호 작용을 식별하고 세포 유형, 건강한 조직 및 질병의 맥락에서 유전자 발현 조절에 대한 이해를 더 잘 이해하기 때문에 흥미롭습니다.
초음파 처리된 크로마틴의 품질과 항체의 품질과 같은 프로토콜이 성공하기 위해 고려해야 할 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 전단 효율은 크리마틴이 음초음파처리되지 않으면 분석의 효율이 크게24로감소합니다. 초음파 처리는 필요한 세포 번호로 인해 ChIP-Seq의 도전적인 측면입니다. 프로토콜에 사용되는 초음파 처리기에서 300,000 셀 미만의 효율성이 크게 감소했습니다. 이것은 ChIP-Seq에서 그 수준에서 초음파 처리하는 것은 종종 덜 공정한 효소 조각화를 필요로 하는 도전적인 측면입니다. 그 결과, 초음파 처리는 진정한 마이크로 스케일ChIP-Seq에 대한 주요 제한 요소입니다. 다른 초음파 처리 플랫폼과 시판되는 키트는 크롬을 초음파 처리하기 위해 테스트되었지만 여기에 사용되는 초음파 처리기는 가장 강력하고 재현 가능한 결과를 보였습니다. 초음파 처리기의 또 다른 장점은 많은 수의 샘플을 처리 할 때 비용을 절감 초음파 처리를 실행하기 위해 특수 튜브를 구입할 필요가 없다는 것입니다. 최적의 초음파 처리를 위해, 첫째로, 위에서 설명한 바와 같이 초음파 처리기를 미리 따뜻하게하는 것이 중요합니다. 둘째, 펠릿을 lyse하려면, 더 많은 물리적 제한으로 세포를 분해하기 위해 lysing하는 동안 튜브의 바닥을 만지는 파이펫 팁을 갖는 것이 좋습니다. 셋째, 초음파 처리 전에 모든 기포 형성은 샘플의 초음파 처리 능력을 균등하게 초음파 처리하는 데 방해한다. lysis 중에 형성 된 거품이있는 경우 파이펫으로 제거하는 것이 중요합니다. 이것은 많은 견본을 제거하지 않고 도전할 수 있습니다, 그러나 팁이 거품에 대하여 가볍게 누르면 많은 견본의 손실 없이 천천히 그릴 수 있습니다. 마지막으로, 사이클 수를 결정할 때, 매 3주기마다 샘플이 제거, 정제 및 아가로즈 젤에서 실행되는 시간 과정을 완료합니다. 이는 ChIP 효율이 감소하기 때문에 샘플의 초음파 처리 가 방지합니다. 샘플이 초음파 처리된 경우 큰 조각은 ChIP-Seq품질(24)에부정적인 영향을 미칠 수 있다. 한편, 샘플이 초음파 처리되면 대상 에피토프가 손실될 위험이 있다.
ChIP-Seq의 또 다른 필수적인 부분은 항체의 품질입니다. 어떤 대규모 연구를 실행하기 전에, 사용될 항체를 최적화할 필요가 있다. 목표는 게놈의 알려진 영역의 잡음 비율에 상당히 높은 신호를 얻고 다른 하나는 재현성이다. 항체가 많은 배경 신호를 당기는 경우, 더 큰 입력을 사용하거나 다른 많은/공급 업체를 시도하는 것이 좋습니다. 이렇게 하면 대규모 실험을 시작하기 전에 시간이 추가되지만 필수적인 단계입니다. 신호-잡음을 테스트하려면 항체의 대상으로 알려진 영역과 결석한 것으로 알려진 다른 부위와 qPCR을 사용하는 것이 좋습니다. 그것은 히스톤 수정이 더 강력하고 TF보다 최적화하기 쉬운 것으로 나타났습니다.
전술한 프로토콜은 반자율적이고 미세스케일된 방식으로 고처리량 히스톤 수정 ChIP-Seq를 위한 견고한 방법을 제공한다. 이 방법은 실습 시간의 양을 제한하고 수동 ChIP-Seq에 비해 재현성을 증가시킵니다. 실험실에서 완료된 이전 연구는 기술 복제에 수동 ChIP를 사용하고 Spearman 상관 관계 평균 0.505를얻었지만, 반자동 시스템으로, NK 세포 평균0.66(보충 표 2)을가진 다른 기증자 간의 스피어맨 상관 관계가 있었다. 이것은 또한 약 40 % 적은 실습 시간으로 완료되었습니다. 여기에 설명된 방법은 히스톤 수정(여기에 표시된 H3K27ac,하지만 프로토콜은 다른 사람을 위한 수정이 필요하지 않아야 합니다)에 최적화되었으며 TF ChIP-Seq에 대해 약간의 수정만 필요합니다. 항체의 품질에도 불구하고, 주요 수정은 초음파 처리 시간과 잠재적으로 IP 동안 사용되는 버퍼에 대한 것입니다. 일반적으로 TF ChIP 의 경우 TF:DNA 복합체가 엄격한 초음파 처리6을통해 유지될 가능성이 적기 때문에 크로마틴의 약간 더 긴 단편(약 350-800 bp 범위)으로 더 잘 작동할 수 있다. TF는 히스톤 수정과 다르게 동작할 수 있기 때문에 버퍼는 사용자 지정 혼합 또는 기타 산업 사용 가능한 키트로 변경해야 할 수도 있습니다.
자동화된 ChIP 액체 처리기가 10,000개의 세포에 대해 테스트되었지만, 낮은 크로마틴 농도에서 재현성이 현저한 감소가 있었습니다. 이 때문에, 프로토콜은 100,000 세포 미만에 추천되지 않았고, 100,000 개의 세포가 최적의 조건이었다. 또한 이 프로토콜은 추가 비용이지만 고품질 데이터를 제공하는 산업 ChIP 버퍼를 사용하여 완료되었습니다. 프로토콜은 초음파 처리 조건(시어드 크로마틴이 동일한 범위 내에 보관되는 한), 완충제가 면역 침전(IP; 최적화가 필요할 수 있음)에 맞게 사용자 지정될 수 있거나 ChIP 액체 처리기가 사용되지 않을 수 있다. 프로토콜의 제한은 고가의 투자가 될 수 있고 한 번에 16 개의 샘플을 실행할 수있는 ChIP 액체 처리기의 사용입니다. ChIP 액체 처리기는 소규모 반응으로 제한되며 100만 개 이상의 세포 수는 권장되지 않습니다. 그러나 IP를 완료하고 수동으로 단계를 세척하여 프로토콜없이 완료 할 수 있습니다. IP와 세치가 수작업으로 완료되면 분석 작업을 완료하는 시간이 증가하고 재현성이 저하될 수 있지만 이 가이드는 고품질 ChIP-Seq 실험을 실행하는 데 여전히 유용합니다. 참고로, 다른 액체 처리기는 반자동 ChIP 반응을 실행하도록 조정할 수 있습니다.
요약하자면, IP 및 세척 단계가 자율적으로 완료되기 때문에 이 시스템의 주요 이점은 처리량의 특성입니다. 따라서 ChIP 실험의 순차적 라운드를 완료할 수 있으므로 최대 48개의 샘플을 완전히 처리하고 5일 내에 시퀀싱할 수 있으며 수동 ChIP-Seq 실험에 비해 실습 시간이 제한되어 있습니다. 또 다른 이점은 ChIP-Seq가 매우 재현 가능한 결과를 얻기 어려울 수 있기 때문에 증가된 재현성입니다. 다른 방법은 라이브 셀, 복잡한 마이크로 파이펫팅 시스템 또는 작업을 모두 수작업으로 완료해야 합니다. 이 시스템은 낮은 입력 샘플 (<10,000 셀)에 최적화되어야하며 궁극적으로 단일 셀 ChIP 반응을 허용합니다. 이 시스템은 또한 PLAC-Seq 및 HiChIP22,23과같은 최신 ChIP 방법에 맞게 조정할 수 있습니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 기술 적인 도움과 건설적인 토론에 대한 Vijayanand 실험실 구성원과 초음파 장치 및 ChIP 액체 처리기 기계 및 프로토콜과 기술 지원을 Diagenode에서 박사 샤론 Squazzo와 제프리 버게트 씨에게 감사드립니다. 이 작품은 NIH 보조금 AI108564, R01HL114093, S10RR027366 (BD FACSAria II), 및 S10OD016262 (일루미나 히세크 2500)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 200 µl tube strips (8 tubes/strip) + cap strips | Diagenode | C30020002 | Strip tubes for use on the IP Star; ChIP 8-tube strip |
| AMPure XP for PCR Purification | Beckman Coulter | A63880 | SPRI beads |
| Axygen 0.6 mL MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube | Corning | MCT-060-C | 0.65 mL low binding tube |
| Bioruptor Pico Sonicator | Diagenode | B01060010 | Sonicator used in the lab but others can be used |
| ChIP DNA Clean & Concentrator (Capped Columns) | Zymo Research | D5205 | DNA clean-up kit |
| Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation | ThermoFisher | 10001D | |
| EDTA (0.5 M), pH 8.0, RNase-free | ThermoFisher | AM9260G | |
| EGTA pH 8.0 | Millipore Sigma | E3889-25G | |
| Eppendorf ThermoMixer C | Eppendorf | 2231000667 | |
| Formaldehyde solution | Millipore Sigma | 252549-1L | |
| Glycine | Millipore Sigma | 50046-250G | |
| H3K27ac polyclonal antibody - Premium | Diagenode | C15410196 | |
| HEPES (1 M) pH 7.5 | ThermoFisher | 15630080 | |
| IDT for Illumina Nextera DNA Unique Dual Indexes | Illumina | 20027213 | |
| Illumina Tagment DNA Enzyme and Buffer Small Kit | Illumina | 20034197 | |
| IP-Star Compact Automated System | Diagenode | B03000002 | Automated system for ChIP-Seq studies; ChIP liquid handler |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix | Roche | KK2601 | PCR mix |
| Medium reagent container for SX-8G IP-Star Compact | Diagenode | C30020003 | |
| MgCl2 (magnesium chloride) (25 mM) | ThermoFisher | R0971 | |
| N,N-Dimethylformamide | Millipore Sigma | D4551-250ML | CAUTION - low flash point |
| NaCl (5 M), RNase-free | ThermoFisher | AM9760G | |
| PBS (10X), pH 7.4 | ThermoFisher | 70011044 | |
| PCR Flex-free 8-tube stripes, attached individual optical caps | USA Scientific | 1402-4700 | 8 strip tubes, 0.2 mL 8-tube strip |
| Proteinase Inhibitor Cocktail | Millipore Sigma | P8340 | |
| Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade | ThermoFisher | 25530049 | |
| PureLink RNase A (20 mg/mL) | ThermoFisher | 12091021 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent | ThermoFisher | P7581 | Used in the flourescence quantification |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | ThermoFisher | 4485699 | qPCR |
| ROX Reference Dye | ThermoFisher | 12223012 | |
| Sodium butyrate | Millipore Sigma | 303410-100G | |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10,000X Concentrate in DMSO) | ThermoFisher | S11494 | nucleic acid dye |
| SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain - 10,000X concentrate in DMSO | ThermoFisher | S7563 | |
| TE Buffer | ThermoFisher | 12090015 | |
| Tips (bulk) | Diagenode | C30040020 | Tips for the IP Star |
| True MicroChIP Kit | Diagenode | C01010130 | Contains all the buffers for the IP; ChIP kit |
| UltraPure 1M Tris-HCI, pH 8.0 | ThermoFisher | 15568025 | |
| UltraPure SDS Solution, 10% | ThermoFisher | 24730020 |
References
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생물학 문제 162 ChIP-Seq ChIP 액체 처리기 태그먼트 H3K27ac 낮은 입력 치피먼트 자동화Erratum
Formal Correction: Erratum: A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies
Posted by JoVE Editors on 09/14/2020.
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Formal Correction: Erratum: A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies
Posted by JoVE Editors on 05/19/2021.
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Sara Herrera-da la Mata
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Sara Herrera-de la Mata
